BR112019002356B1 - Composições microbianas definidas e métodos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições que incluem células de grupos definidos de espécies microbianas (por exemplo, 3, 16, 18, 19, 21 ou 22 espécies microbianas). Também são descritos métodos de uso de composições microbianas que incluem contatar o solo, plantas, partes de planta ou sementes com a composição. As composições microbianas também são usadas nos métodos de degradação de materiais biológicos, tais como materiais biológicos que contenham quitina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N ° 62/381,441, depositado em 30 de agosto de 2016, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] Esta descrição se refere a composições microbianas e métodos de uso delas, particularmente para processos e usos agrícolas. ANTECEDENTES

[003] Como consequência do crescimento populacional, o consumo de alimentos também está aumentando. Por outro lado, a terra agrícola cultivável e a produtividade estão significativamente reduzidas devido à industrialização global, seca, salinidade e aquecimento global (Galaraero et al, In Microbial Strategies for Crop Improvement, Springer Berlin, pp. 1-22, 2009). Esse problema pode ser resolvido com a prática da agricultura sustentável, cujo princípio básico é a redução significativa dos insumos químicos, tais como fertilizantes, inseticidas e herbicidas, com redução da emissão de gases de efeito estufa.

[004] O uso excessivo de fertilizantes químicos na agricultura resulta em um grande número de problemas ambientais porque alguns fertilizantes contêm metais pesados (por exemplo, cádmio e cromo) e alta concentrações de radionuclídeos. Esses fertilizantes no agro- ecossistema constituem a principal fonte de metais pesados e radionuclídeos nas plantas e alguns resultam no acúmulo de poluentes inorgânicos (Savci, Int. J. Env. Sci. Dev. 3:77-80, 2012; Malakoff, Science 281: 190-192, 1998). As estufas e a aquicultura usam especialmente grandes quantidades de fertilizantes químicos durante a alta temporada, o que resulta em recursos hídricos poluídos e a quantidade de produção da lavoura e a qualidade do produto se deterioram. À luz destas desvantagens dos fertilizantes químicos, inóculos microbianos benéficos para plantas são promissores como componentes de estratégias integradas de manuseio de nutrientes. SUMÁRIO

[005] São descritas aqui composições que incluem células de um grupo definido de espécies microbianas (por exemplo, 3 espécies microbianas, 16 espécies microbianas, 17 espécies microbianas, 19 espécies microbianas, 20 espécies microbianas, 21 espécies microbianas ou 22 espécies microbianas). Em algumas modalidades, as composições incluem células de uma ou mais espécies microbianas que possuem características ou atividades funcionais (tais como atividades metabólicas) que incluem, mas não se limitam ao metabolismo do nitrogênio, tolerância ao sal, atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, atividade celulolítica, atividade quitinolítica, produção de fitormônios, atividade do metabolismo do ferro e/ou defosforilação da atividade da matéria orgânica. Em algumas modalidades, as composições incluem células de um ou mais (tais como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais) espécies microbianas que crescem sob condições aeróbicas. Em outras modalidades, as composições incluem células de uma ou mais (tal como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais) espécies microbianas que crescem sob condições anaeróbicas. Em um exemplo não limitante, a composição inclui células de 16 espécies microbianas que crescem sob condições aeróbicas e células de 6 espécies microbianas que crescem sob condições anaeróbicas. Condições de crescimento aeróbico e anaeróbico incluem, mas não estão limitadas àquelas descritas no Exemplo 1 deste.

[006] Em uma modalidade, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus ,Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outra modalidade, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17) Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outras modalidades, as composições incluem células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequências de 16S rDNA que possuem pelo menos 99% de identidade de sequência com cada uma das SEQ ID NOs: 3-24; cada uma das SEQ ID Nos: 3-8, 10, 11, 13-18 e 20-24; cada uma das SEQ ID NOs: 3-7 e 9-24; cada uma das SEQ ID Nos: 37, 10, 11, 13-18 e 20-24; cada uma das SEQ ID Nos: 3-8, 10, 11, 14, 16-18, 20-22 e 24; ou cada uma das SEQ ID NOs: 3-14, 16-22 e 24. Em outra modalidade, a composição inclui a coleção de micróbios contida em um ou mais dos números de depósito da American Type Culture Collection PTA-123288, PTA-123298 e/ou PTA-123289.

[007] Em outras modalidades, a composição inclui células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, pelo menos uma espécie microbiana tolerante a NaCl 5%, pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, menos uma espécie microbiana com atividade celulolítica e/ou quitinolítica, pelo menos uma espécie microbiana com atividade metabólica de ácido málico, pelo menos uma espécie microbiana com atividade de produção de fitormônio (tal como indol (auxina)), pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolização de ferro, pelo menos, uma espécie microbiana com defosforilação da atividade da matéria orgânica ou uma combinação de quaisquer duas ou mais destas.

[008] Também estão descritos métodos de uso das composições descritas que incluem o contato com do solo, plantas, partes de planta e sementes com a composição. As composições microbianas podem ser aplicadas ao solo, planta, partes de planta e/ou sementes sozinhas ou em combinação com componentes adicionais (tais como a quitina, quitosana, glicosamina, aminoácidos e/ou fertilizante líquido).

[009] Em modalidades adicionais, as composições microbianas descritas são utilizadas em métodos de degradação de materiais biológicos, tais como materiais biológicos que contêm quitina. Em alguns exemplos, os materiais que contêm quitina são misturados com uma composição microbiana descrita e fermentados para produzir uma mistura fermentada. A mistura fermentada pode opcionalmente ser separada em frações sólidas e líquidas. Estas frações podem ser subsequentemente utilizadas em aplicações agrícolas em combinação com as composições microbianas descritas ou podem ser utilizadas em processos de degradação adicionais.

[0010] As características anteriores e outras da descrição ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, que prossegue com referência às figuras em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0011] A Figura 1 é um esquema que mostra um processo exemplificador para a biodegradação de um material biológico que contém quitina (exemplificado como resíduo de camarão) com uma composição microbiana descrita.

[0012] A Figura 2 é um gráfico que mostra o Índice de Área Foliar (LAI) no dia 33 da folha verdadeira terminal de plantas de pepino tratadas como indicado.

[0013] A Figura 3 é um gráfico que mostra o peso seco de um broto de milho no dia 17 com os tratamentos indicados.

[0014] A Figura 4 é um gráfico que mostra o rendimento de tomate (tomate verde e vermelho) com os tratamentos indicados.

[0015] A Figura 5 é um gráfico que mostra o rendimento do milho com os tratamentos indicados.

[0016] A Figura 6 é um gráfico que mostra o rendimento total de repolho com os tratamentos indicados.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0017] Quaisquer sequências de ácido nucleico e de aminoácidos aqui listadas ou na listagem de sequências em anexo são mostradas usando as abreviações de letras padronizadas para bases de nucleotídeos e aminoácidos, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. Em pelo menos alguns casos, apenas uma cadeia de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a sequência complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita exibida.

[0018] SEQ ID NOs: 1 e 2 são sequências de ácido nucleico de iniciadores direto e reverso de 16S rDNA, respectivamente.

[0019] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus megaterium.

[0020] A SEQ ID NO: 4 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Lactobacillus casei/paracasei.

[0021] A SEQ ID NO: 5 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Clostridium beijerinckii.

[0022] A SEQ ID NO: 6 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Acetobacter pasteurianus.

[0023] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Lactobacillus buchneri.

[0024] A SEQ ID NO: 8 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus subtilis.

[0025] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Paenibacillus cookii.

[0026] A SEQ ID NO: 10 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Lactobacillus vini.

[0027] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus licheniformis.

[0028] A SEQ ID NO: 12 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Paenibacillus lautus.

[0029] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Oceanobacillus oncorhynchi.

[0030] A SEQ ID NO: 14 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus amyloliquefaciens.

[0031] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus sp.

[0032] A SEQ ID NO: 16 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Pseudomonas putida.

[0033] A SEQ ID NO: 17 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Pseudomonas sp.

[0034] A SEQ ID NO: 18 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Streptomyces griseus.

[0035] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Paenibacillus chibensis.

[0036] A SEQ ID NO: 20 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Bacillus flexus.

[0037] A SEQ ID NO: 21 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Clostridium pasteurianum.

[0038] A SEQ ID NO: 22 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Azotobacter vinelandii.

[0039] A SEQ ID NO: 23 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Virgibacillus halophilus.

[0040] A SEQ ID NO: 24 é uma sequência de nucleotídeos de 16S rDNA de um micróbio identificado como Lactobacillus delbrueckii.

[0041] SEQ ID NOs: 25-66 e 69-136 são sequências de nucleotídeos de iniciadores de oligonucleotídeo específicos para a espécie e sondas.

[0042] SEQ ID NOs: 67-68 são sequências de nucleotídeos de iniciadores de16S rRNA de procariotos universais.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Expressões

[0043] Salvo indicação em contrário, as expressões técnicas são usadas de acordo com o uso convencional. Definições de expressões comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Krebs et al, Lewin's Genes XI, publicado por Jones and Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789); e George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2a. edição, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6).

[0044] As seguintes explicações de expressões e métodos são fornecidas para descrever melhor a presente descrição e para orientar aqueles versados na técnica a praticar a presente descrição. As formas no singular "um"/uma" e "o/a" se referem a um ou mais de um, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a expressão "que compreende uma célula" inclui células únicas ou no plural e é considerada como equivalente à frase "que compreende pelo menos uma célula”. Como usado aqui, "compreende" significa "inclui”. Assim, “que compreende A ou B, significa “que inclui A, B ou A e B", sem excluir elementos adicionais. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo explicações de termos, irá controlar.

[0045] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados para praticar ou testar a tecnologia descrita, os métodos e materiais adequados estão descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

[0046] Para facilitar a revisão das várias modalidades desta descrição, as seguintes explicações de expressões específicas são fornecidas:

[0047] Animal Aquático: Um animal que vive em água salgada ou doce. Em modalidades particulares aqui descritas, um animal aquático inclui artrópodes aquáticos, tais como camarão, krill, copépodes, cracas, caranguejo, lagostas e lagostim. Em outras modalidades, um animal aquático inclui peixe. Um subproduto de animal aquático inclui qualquer parte de um animal aquático, particularmente partes resultantes do processamento comercial de um animal aquático. Assim, em alguns exemplos, subprodutos de animais aquáticos incluem um ou mais de cefalotórax de camarão ou exoesqueleto, exoesqueleto de caranguejo ou lagosta ou pele ou escamas de peixe.

[0048] Contatar: Colocação em associação física direta, incluindo ambas as formas sólida e líquida. Por exemplo, o contato pode ocorrer com um ou mais micróbios (como os micróbios em um consórcio microbiano) e uma amostra biológica em solução. O contato também pode ocorrer com um ou mais micróbios (como os micróbios em um consórcio microbiano) e o solo, plantas e/ou partes de plantas (como folhagem, caule, mudas, raízes e/ou sementes).

[0049] Meio de cultura: Um conjunto de condições de cultura (que em alguns exemplos é um conjunto de condições sintéticas ou que não ocorrem naturalmente) incluindo nutrientes para apoiar a viabilidade, função e/ou crescimento de uma população específica de células, como um ou mais espécies microbianas. Os meios de cultura incluem geralmente componentes tais como uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e um tampão para manter o pH. Componentes adicionais em meios de cultura também podem incluir um ou mais hormônios, fatores de crescimento, inibidores de protease, hidrolisados de proteína, protetores de força de cisalhamento, proteínas, vitaminas, oligoelementos, sais inorgânicos, minerais e/ou lipídeos.

[0050] Cultivar: Crescimento intencional de um ou mais organismos ou células na presença de fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais minerais. Em um exemplo, tal crescimento pode ocorrer em um meio nutritivo sólido ou semissólido, ou em um meio líquido no qual os nutrientes estão dissolvidos ou suspensos. Em um outro exemplo, a cultura pode ocorrer em uma superfície ou por cultura submersa. O meio nutritivo pode ser composto por nutrientes complexos ou pode ser quimicamente definido.

[0051] Fermentação: Processo que resulta na quebra de compostos orgânicos complexos em compostos mais simples, por exemplo, por células microbianas (como bactérias e/ou fungos). O processo de fermentação pode ocorrer sob condições aeróbicas, anaeróbicas ou ambas (por exemplo, em um grande volume em que algumas porções são aeróbicas e outras porções são anaeróbicas). Em algumas modalidades não limitantes, a fermentação inclui a degradação enzimática e/ou não enzimática de compostos presentes em animais aquáticos ou subprodutos de animais, tais como quitina.

[0052] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico, proteína ou organismo) foi substancialmente separado ou purificado a partir de outros componentes biológicos (tais como outras células, resíduos celulares ou outras proteínas ou ácidos nucleicos). Os componentes biológicos que tenham sido "isolados" incluem aqueles componentes purificados por métodos de purificação padronizados. A expressão também abrange ácidos nucleicos recombinantes, proteínas ou micróbios, bem como ácidos nucleicos ou peptídeos quimicamente sintetizados. A expressão "isolado" (ou "enriquecido" ou "purificado") não requer pureza absoluta pode incluir micróbios ou moléculas que são pelo menos 50% isoladas, como pelo menos 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo 100% isoladas.

[0053] Fertilizante líquido: Uma solução ou suspensão aquosa que contém nitrogênio solúvel. Em alguns exemplos, o nitrogênio solúvel em um fertilizante líquido inclui uma fonte orgânica de nitrogênio, como a ureia ou ureia derivada de amônia anidra (tal como uma solução de ureia e nitrato de amônia (UAN)). Amônia aquosa (amônia anidra 2032%) também pode ser usada. Em outros exemplos, o nitrogênio solúvel em um fertilizante líquido inclui sais inorgânicos que contêm nitrogênio, tais como hidróxido de amônia, nitrato de amônia, sulfato de amônia, pirofosfato de amônia, tiossulfato de amônia ou combinações de dois ou mais destes. Em algumas modalidades, o fertilizante líquido inclui uma fonte de nitrogênio que não ocorre naturalmente (tal como pirofosfato de amônia ou tiossulfato de amônia) e/ou outros componentes que não ocorrem naturalmente.

[0054] Misturas comuns de fertilizantes líquidos não naturais são especificadas pelo seu conteúdo de nitrogênio-fosfato-potássio (percentuais de N-P-K) e incluem a adição de outros componentes, como enxofre ou zinco. Exemplos de misturas feitas pelo homem incluem 10-34-0, 10-30-0 com 2% de enxofre e 0,25% de zinco (quelado), 11-37-0, 12-30-0 com 3% de enxofre, 2-4-12, 2-6-12, 4-1010, 3-18-6, 7-22-5, 8-25-3, 15-15-3, 17-17-0 com 2% de enxofre, 18-180, 18-18-0 com 2% de enxofre, 28-0-0 UAN, 9-27-0 com 2% de enxofre e tio-sulfato de potássio.

[0055] Micróbio: Um microrganismo que inclui, mas não se limita a bactérias, arqueobactérias, fungos e algas (como microalgas). Em alguns exemplos, os micróbios são organismos unicelulares (por exemplo, bactérias, cianobactérias, alguns fungos ou algumas algas). Em outros exemplos, a expressão micróbios inclui organismos multicelulares, tais como certos fungos ou algas (por exemplo, fungos filamentosos multicelulares ou algas multicelulares).

[0056] Composição microbiana: Uma composição (que pode ser sólida, líquida, ou pelo menos parcialmente ambas) que inclui células de pelo menos um tipo (ou espécie) de micróbio (ou uma população de células de pelo menos um tipo de micróbio). Em alguns exemplos, uma composição microbiana compreende células de um ou mais tipos (espécies) de micróbios (ou uma ou mais populações de micróbios) em um meio líquido (como um meio de armazenamento, cultura ou fermentação), por exemplo, como uma suspensão no meio líquido. Em outros exemplos, uma composição microbiana inclui células de um ou mais tipos (espécies) de micróbios (ou uma ou mais populações de micróbios) na superfície ou embutidos em um meio sólido ou gelatinoso (incluindo, mas não limitado a uma placa de cultura) ou uma emulsão ou pasta.

[0057] Consórcio microbiano: Uma mistura, associação ou montagem de células de duas ou mais espécies microbianas, que em alguns casos estão em contato físico entre si. Os micróbios de um consórcio podem afetar um ao outro por contato físico direto, por meio de interações bioquímicas ou por ambos. Por exemplo, micróbios em um consórcio podem trocar nutrientes, metabolitos ou gases uns com os outros. Assim, em alguns exemplos, pelo menos alguns dos micróbios em um consórcio são metabolicamente interdependentes. Tais interações interdependentes podem mudar em caráter e extensão ao longo do tempo e com mudanças nas condições de cultura.

II. Composições microbianas

[0058] São descritas aqui composições microbianas que incluem células de um conjunto definido de micróbios ou espécies microbianas. Em algumas modalidades, as composições descritas incluem células de um grupo definido de micróbios (por exemplo, 3 espécies microbianas, 16 espécies microbianas, 19 espécies microbianas, 20 espécies microbianas, 21 espécies microbianas ou 22 espécies microbianas) conforme descrito abaixo. Qualquer uma das composições aqui descritas pode também incluir um ou mais componentes não microbianos, incluindo mas não limitados a uma ou mais fontes de carbono, fontes de nitrogênio, tampões, hormônios, fatores de crescimento, inibidores de protease, hidrolisados de proteínas, protetores de força de cisalhamento, aminoácidos, vitaminas, oligoelementos, sais inorgânicos, minerais e/ou lipídios. Em alguns exemplos, uma ou mais espécies microbianas adicionais também podem ser adicionadas à composição, por exemplo, para fornecer ou suplementar uma atividade desejada da composição.

A. Composições Microbianas Definidas

[0059] São aqui descritas composições que incluem células de um grupo definido de espécies microbianas. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições incluem isolados microbianos que são combinados em uma única composição e, em alguns exemplos, co- cultivados ou co-fermentados.

[0060] Em um exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida; por exemplo, uma espécie microbiana com a Sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341); por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amiloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outro exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus Amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em um exemplo adicional, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado a B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (linhagem R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus {por exemplo , intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii , Lactobacillus casei/ paracasei e Bacillus flexus. Em um outro exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado a B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (linhagem R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus.

[0061] Em outros exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus (por exemplo , intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus e Lactobacillus casei/paracasei. Em outros exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus e Lactobacillus casei/paracasei.

[0062] Em exemplos adicionais, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida; por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis , Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus.

[0063] Em outro exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida; por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus.

[0064] Em outro exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um de Clostridium beijerinckii, Streptomyces griseus e Bacillus flexus.

[0065] Em exemplos particulares, as combinações destas composições são utilizadas para produzir as composições aqui descritas, por exemplo, misturando e co-fermentando duas das composições.

[0066] Aquele versado na técnica reconhecerá que a identificação de micróbios, particularmente ao nível da espécie ou cepa, nem sempre é possível. Como discutido no Exemplo 1, os micróbios nas composições aqui descritas foram analisados por sequenciação de 16S rDNA e sequenciação do genoma completo seguida pela comparação com a sequências em bancos de dados públicos. Entretanto, devido às limitações de informações em bancos de dados de sequência (incluindo pouca ou nenhuma informação para algumas espécies ou cepas e/ou mudanças na nomenclatura ao longo do tempo), pode ser desafiador fornecer espécies definitivas ou identificações de cepa. Assim, em algumas modalidades, as espécies microbianas incluídas nas composições descritas são identificadas pela sua identidade de sequência com as sequências de 16S de rDNA aqui fornecidas (SEQ ID NOs: 3-24).

[0067] Em alguns exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequência de 16S rDNA com pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) para cada uma das SEQ ID NOs: 3-24. Em outro exemplo, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequência de 16S rDNA que possui pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) com cada uma das SEQ ID NOs: 3-8, 10, 11, 13-18 e 20-24. Em outros exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequência de 16S rDNA com pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) com cada uma das SEQ ID Nos: 3-7 e 9-24 ou que incluem ou consistem em células de micróbios com a sequência de 16S rDNA com pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) para cada uma das SEQ ID NOs: 3-7, 10, 11, 13-18 e 2024.

[0068] Em outros exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequência de 16S rDNA com pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) com cada uma das SEQ ID Nos: 3-8, 10, 11, 14, 16-18, 20-22 e 24 ou inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem em micróbios com a sequência de 16S rDNA com pelo menos 95% de identidade de sequência (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade de sequência) para cada uma das SEQ ID NOs: 3-14, 16-22 e 24.

[0069] Em algumas modalidades, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem na coleção de micróbios depositados na American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) em 1 de Julho de 2016 e designadas com o número de depósito PTA-123288, ou PTA-123289, bem como a coleção de micróbios depositada na ATCC em 8 de Julho de 2016 designada com o número de depósito PTA-123298. Em alguns exemplos, a composição inclui células de espécies microbianas que incluem ou consistem nas espécies microbianas em dois ou mais dos depósitos ATCC descritos, por exemplo, espécies microbianas com números de depósito ATCC PTA-123288 e PTA-123289 ou espécies microbianas com números de depósito ATCC PTA-123298 e PTA-123289.

[0070] Em modalidades adicionais, a composição inclui células de uma combinação de espécies microbianas que fornecem características ou atividades metabólicas desejadas (por exemplo, uma ou mais atividades que podem promover o crescimento das plantas). Assim, em alguns exemplos, a composição inclui células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio (como desnitrificação, fixação de nitrogênio e/ou produção de urease), células de pelo menos uma espécie microbiana tolerante ao sal (por exemplo, crescimento em 72 horas em meio que contém 1%, 2,5%, 5%, 7,5% ou 10% de sal), células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade celulolítica e/ou quitinolítica (tal como degradação de GlcNAc, degradação de quitina e/ou degradação de celobiose), células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade metabólica de ácido málico (tal como assimilação de ácido málico), células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de produção de fitormônio (tal como indol (auxina)), células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade metabolizadora de ferro (tal como atividade de ligação ao ferro (sideróforos)), e/ou células de pelo menos uma espécie microbiana com defosforilação da atividade do fosfato orgânico.

[0071] A composição pode incluir células de espécies microbianas com uma ou mais (tais como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, ou todas) das características ou funções acima referenciadas, assim como outras características ou funções desejadas. Em exemplos particulares, a composição microbiana inclui células de três ou mais espécies microbianas, cada uma com pelo menos uma das funcionalidades descritas. Em alguns exemplos, a composição inclui células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio e células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal; ou células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco; ou células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade celulolítica/quitinolítica; ou células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, células de pelo menos um espécies microbianas com atividade celulolítica/quitinolítica e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo do ácido málico; ou células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, células de pelo menos um espécie microbianas com atividade celulolítica/quitinolítica e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo do ácido málico e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade produtora de fitormônio; ou células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, células de pelo menos um espécie microbianas com atividade celulolítica/quitinolítica e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo do ácido málico e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade produtora de fitormônio e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolização do ferro; ou atividade de metabolismo de nitrogênio, células de pelo menos uma espécie microbiana com tolerância ao sal, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de solubilização de sal de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco, células de pelo menos um espécie microbianas com atividade celulolítica/quitinolítica e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolismo do ácido málico e células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade produtora de fitormônio, células de pelo menos uma espécie microbiana com atividade de metabolização de ferro e células de pelo menos uma espécies microbianas com defosforilação da atividade do fosfato orgânico. Estas combinações de espécies microbianas com as atividades especificadas são apenas exemplos, e qualquer combinação fatorial das atividades relatadas é aqui contemplada. Como aqui discutido, uma única espécie microbiana pode ter mais do que uma das atividades listadas, assim, em alguns exemplos, uma composição que inclui células com um dado número das atividades listadas não terá necessariamente células desse número de espécies microbianas diferentes.

[0072] Métodos exemplificadores para determinar as características ou funções metabólicas da célula microbiana e a identificação de espécies microbianas com as características particulares estão descritos no Exemplo 3. Aquele versado na técnica reconhecerá que uma única espécie microbiana pode ter mais do que uma destas características (por exemplo, a Tabela 11, abaixo). Nos exemplos descritos abaixo, as espécies microbianas são identificadas pelo nome; estas identificações incluem espécies microbianas com 16S rDNA com pelo menos 95% (tal como pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo 100%) de identidade de sequência com as sequências associadas a cada uma destas espécies nomeadas aqui reveladas como SEQ ID NOs: 3-24.

[0073] Assim, em algumas modalidades, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, menos 10 ou mais) espécie microbiana com atividade de metabolismo de nitrogênio, por exemplo, pelo menos um de Acetobacter pasteurianus, Azotobacter vinelandii, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus flexus, Virgibacillus halophilus, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus cookii, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17) e Streptomyces griseus. Em outros exemplos, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, ou mais) espécie microbiana tolerante ao sal de NaCl 5%, por exemplo Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp. (intimamente relacionado a B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (linhagem R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus flexus, Lactobacillus casei/paracasei, Paenibacillus lautus {por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Pseudomonas putida e Pseudomonas sp. (intimamente relacionado com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência 16S rRNA com, pelo menos, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17). Em outros exemplos, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou mais) espécie microbiana com atividade de solubilização de fosfato e/ou cálcio e/ou zinco d, por exemplo, pelo menos um de Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus casei/paracasei, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus vini, Lactobacillus delbrueckii e Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12). Em exemplos adicionais, as composições reveladas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, ou mais) espécie microbiana com atividade celulolítica e/ou quitinolítica, por exemplo, um ou mais de Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R- 27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus flexus, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus casei/paracasei, Lactobacillus vini, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionado com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp., cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Paenibacillus chibensis e Streptomyces griseus. Em outros exemplos, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou mais) espécie microbiana com atividade de metabolismo do ácido málico, por exemplo, pelo menos um de Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus flexus, Paenibacillus cookii, Paenibacillus lautus (por exemplo, intimamente relacionadas com Paenibacillus lautus e Paenibacillus sp. (cepa Y412MC10), por exemplo, uma espécie microbiana com a sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12), Paenibacillus chibensis, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17) e Streptomyces griseus. Em exemplos adicionais, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3 ou mais) espécie microbiana com atividade de produção de fitormônio (por exemplo, indol (auxina)), por exemplo, pelo menos um de Clostridium pasteurianum, Lactobacillus vini e Lactobacillus buchneri. Em exemplos adicionais, as composições descritas incluem células de pelo menos uma (tal como pelo menos 2, pelo menos 3 ou mais) espécie microbiana com atividade de metabolização de ferro (por exemplo, atividade de ligação ao ferro), por exemplo, pelo menos um de Clostridium pasteurianum e Clostridium beijerinckii. Composições que incluem células de espécies microbianas com qualquer combinação destas características ou atividades são aqui contempladas.

[0074] Em modalidades adicionais, qualquer uma das composições microbianas aqui descritas pode ainda incluir células de um ou mais (tal como 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, ou todas) de Desulfosporosinus meridiei, Nitrosopumilus sp., Marinobacter briozoorum, Leptospirillum ferrodiazotrofum e Lactobacillus acidophilus.

[0075] As composições descritas podem incluir um ou mais componentes adicionais em adição aos micróbios, incluindo mas não limitados a sais, íons de metal e/ou tampões (por exemplo, um ou mais de KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, MgSO4, FeCl3, NaMoO4, e/ou Na2MoO4), oligoelementos (tais como enxofre, sulfato, sulfito, cobre ou selênio), micronutrientes (como boro (B), zinco (Zn), manganês (Mn), ferro (Fe) , cobre (Cu), molibdênio (Mo), cloro (CI)), vitaminas (tais como vitaminas do complexo B ou vitamina K), açúcares (tais como sacarose, glicose ou frutose), quitina, quitosana, glicosamina, proteína e/ou um ou mais aminoácidos. Componentes adicionais que também podem ser incluídos nas composições incluem HYT B, HYT C e/ou HYT D, um ou mais fertilizantes (por exemplo, fertilizante líquido), um ou mais pesticidas, um ou mais fungicidas, um ou mais herbicidas, um ou mais inseticidas, um ou mais hormônios de planta, um ou mais elicitadores de plantas, ou combinações de dois ou mais destes componentes.

[0076] Em algumas modalidades, as composições descritas estão em um meio líquido (tal como um meio de cultura ou fermentação ou armazenamento) ou inóculo. Em outras modalidades, as composições estão presentes em um meio sólido ou gelatinoso (tal como uma placa de cultura) que contém ou suporta os micróbios. Em outros exemplos, as composições descritas são liofilizadas e podem ser reconstituídas pela adição de líquido (tal como meio de cultura) e crescem em um meio líquido ou por passagem em meio sólido.

[0077] Ainda em outras modalidades, as composições aqui descritas estão presentes em uma formulação seca, tal como um pó seco, pélete ou grânulo. As formulações secas podem ser preparadas pela adição de um osmoprotetor (tal como um açúcar, por exemplo, trealose e/ou maltodextrina) a uma composição microbiana em solução em uma proporção desejada. Esta solução é combinada com um veículo seco ou agente absorvente, tal como farinha de madeira ou argila, na concentração desejada de composição microbiana (tal como 2-30%, por exemplo, 2,5-10%, 5-15%, 7,5-20% ou 15-30%). Os grânulos podem ser criados pela incorporação de ligantes de argila ou polímero que servem para manter os grânulos juntos ou oferecer propriedades físicas ou de degradação específicas. Métodos exemplificadores de formação de grânulos incluem a granulação rotativa, granulação em misturador ou extrusão. Em exemplos adicionais, as formulações secas são produzidas pela pulverização ou imersão de uma composição microbiana líquida aqui descrita em um veículo sólido tal como bentonita ou revestimento da composição microbiana líquida diretamente sobre um grânulo de fertilizante. Em exemplos adicionais, as formulações secas incluem composições que incluem células de uma ou mais espécies microbianas aqui descritas (ou qualquer combinação destas) que tenham sido liofilizadas (secas por congelamento). Métodos adicionais para a preparação de formulações secas, incluindo uma ou mais espécies microbianas, são conhecidos por aquele versado na técnica, por exemplo, como descrito em Formulation of Microbial Pesticides: Beneficial Microrganisms, Nematodes and Seed Treatments, Burges, ed., Springer Science, 1998.

[0078] Em alguns exemplos, a composição é mantida em uma temperatura que suporta o crescimento dos micróbios, por exemplo, em cerca de 25-45°C (tal como cerca de 30-35°C, cerca de 30-40°C ou cerca de 35-40°C). Em outros exemplos, a composição é armazenada em temperaturas nas quais os micróbios não estão crescendo ou estão inativos, como menos de 25°C (por exemplo, 20°C, 15°C, 10°C, 4°C, - 20°C, -40°C, -70°C ou abaixo). Um especialista na técnica pode formular as composições para armazenamento a frio, por exemplo, incluindo estabilizadores (tal como glicerol). Ainda em outros exemplos, a composição é armazenada em temperaturas ambientes, tais como cerca de 0-35°C (por exemplo, cerca de 10-30°C ou cerca de 15-25°C). B. Métodos de Produção de Composições Definidas

[0079] Em algumas modalidades, as composições descritas são produzidas por co-cultura ou co-cultivo de células de duas ou mais espécies microbianas descritas (tal como 2 ou mais 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais 17 ou mais 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais ou 22 ou mais espécies microbianas). Nos exemplos em que menos do que todas as espécies microbianas da composição são co-cultivadas, a composição é produzida pela combinação de dois ou mais subconjuntos co-cultivados (sub-composições) das espécies microbianas na composição. Componentes adicionais (por exemplo, componentes não microbianos) podem estar presentes durante a produção da mistura de espécies microbianas (conjunto completo ou subconjunto(s)) ou podem ser adicionados após a produção da mistura das espécies microbianas na composição.

[0080] Em alguns exemplos, as composições descritas são produzidas por co-cultura de todas as espécies microbianas na composição. Assim, em um exemplo, uma composição descrita produzida por co-cultura de células de cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus Amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outro exemplo, uma composição descrita é produzida pela co- cultura de células de cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em exemplos adicionais, uma composição descrita é produzida por co-cultura de células de cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outro exemplo, uma composição descrita é produzida pela co-cultura de células de cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus.

[0081] Em outro exemplo, uma composição descrita é produzida pela co-cultura de células de cada Lactobacillus delbrueckii, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus. Em outros exemplos, uma composição descrita é produzida pela co-cultura de células de cada um dos Lactobacillus delbrueckii, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei e Bacillus flexus.

[0082] O meio de cultura que pode ser utilizado para produzir estas composições por co-cultura está descrito no Exemplo 2 e inclui, mas não está limitado a um meio que inclui melaço de cana 2% (p/v), 1 x solução salina tamponada com fosfato (PBS), proteínas do soro de leite 0,1% (p/v) e Ferti-Nitro Plus 0,25% (p/v). Em outros exemplos, o meio para co-cultura das células microbianas inclui solução salina tamponada com fosfato (1x), melaço blackstrap (2-10% p/v), proteínas de soro de leite (0,1-0,5% p/v), Ferti-Nitro Plus Plant N (0,25-1,25% p/v), com ou sem extrato de alga marinha (0,0067%), pó de levedura (0,0033% p/v) e/ou espirulina (0,0067% p/v).

[0083] Em outros exemplos, as composições descritas são produzidas pela co-cultura de células de pelo menos dois subconjuntos de espécies microbianas e depois pela combinação das duas co- culturas para produzir a composição. Em um exemplo, a composição é produzida por células co-cultivadas de Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus e Lactobacillus casei/paracasei (grupo de 19 espécies microbianas) e separadamente co-cultivando Clostridium beijerinckii, Streptomyces griseus e Bacillus flexus (grupo de 3 espécies microbianas).

[0084] Em outro exemplo, a composição é produzida pela co-cultura de Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Pseudomonas sp. (intimamente relacionada com P. entomophila, P. fluorescens e P. putida, por exemplo, uma espécie microbiana com sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17), Pseudomonas putida, Bacillus sp. (intimamente relacionado com B. kochii, B. pocheonensis e Bacillus sp. (cepa R-27341), por exemplo, uma espécie microbiana com uma sequência de 16S rRNA com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15), Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus e Lactobacillus casei/paracasei (grupo de 16 espécies microbianas) e separadamente co-cultivar Clostridium beijerinckii, Streptomyces griseus e Bacillus flexus. Após a co-cultura individual das duas misturas sob condições suficientes para o crescimento dos micróbios (tais como as descritas no Exemplo 2), as co-culturas individuais são misturadas para produzir a composição.

[0085] Em alguns exemplos, o meio utilizado para co-cultivar o grupo de 19 espécies microbianas ou o grupo de 16 espécies microbianas inclui melaço de cana 10% (p/v), 1X PBS, proteínas de soro de leite 0,5% (p/v) e Ferti-Nitro Plus 1,25% (p/v). Em alguns exemplos, o meio utilizado para co-cultivar o grupo de 3 espécies microbianas inclui melaço de cana 2% (p/v), 1X PBS, proteínas de soro do leite 0,1% (p/v) e Ferti-Nitro Plus 0,25%. Entretanto, um especialista na técnica pode identificar outros meios que sejam adequados para co-cultura dos micróbios, incluindo várias quantidades dos ingredientes listados, como descrito no Exemplo 2. Após a co-cultura individual das duas misturas sob condições suficientes para o crescimento dos micróbios (tais como os descritos no Exemplo 2), as co-culturas individuais (tais como o grupo de 19 micróbios e o grupo de 3 micróbios, ou o grupo de 16 micróbios e o grupo de 3 micróbios) são misturados para produzir a composição. Em alguns exemplos, as duas co-culturas são misturadas em uma proporção de 10:1 a 1:0,5 (tal como 8:1 a 1:1, 5:1 a 2:1, 3:1 a 1:0,5) do grupo maior (grupo de 19 espécies microbianas ou grupo de 16 espécies microbianas):grupo menor (grupo de 3 espécies microbianas). Em alguns exemplos, a proporção das co-culturas é de cerca de 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1 ou 1:0,5. Em modalidades particulares, a proporção das co-culturas é de cerca de 6,5:1, 1:1, 2:1 ou 1:0,5. Meios de co-cultura e misturas similares podem ser utilizados com co-culturas que são idênticas àquelas listadas acima, mas não incluem Bacillus subtilis.

[0086] Em exemplos adicionais, a composição é produzida cultivando separadamente os micróbios dos números de depósito da ATCC PTA-123288 e PTA-123289 e misturando as culturas individuais para produzir a composição. Ainda em outros exemplos, a composição é produzida cultivando separadamente os micróbios dos números de depósito da ATCC PTA-123298 e PTA-123289 e misturando as culturas individuais para produzir a composição.

III. Processos de Biodegradação

[0087] As composições descritas podem ser utilizadas para degradar materiais biológicos, tais como materiais ricos em quitina, por exemplo, animais aquáticos ou subprodutos de animais aquáticos, insetos ou fungos. Assim, em algumas modalidades, são descritos aqui métodos que incluem a mistura de uma ou mais das composições microbianas descritas com um material biológico que contém quitina para formar uma mistura e fermentação da mistura. Em algumas modalidades, os métodos também incluem a separação da mistura em frações sólidas, aquosas e, opcionalmente, lipídicas (Figura 1).

[0088] Em algumas modalidades, um processo de biodegradação aqui descrito inclui a mistura de uma composição microbiana aqui descrita com um ou mais materiais biológicos que contêm quitina. Materiais biológicos que contêm quitina incluem, mas não estão limitados a animais aquáticos ou subprodutos de animais aquáticos, insetos e fungos. Em alguns exemplos, o material biológico que contém quitina é um animal aquático, tal como um artrópode aquático (por exemplo, um membro da Classe Malacostraca). Os artrópodes aquáticos para uso nos métodos descritos incluem camarão, caranguejo, lagosta, lagostim e krill. Em alguns exemplos, todo o animal aquático (tal como um artrópode aquático) ou subprodutos de animais aquáticos são utilizados nos métodos de biodegradação aqui descritos. Os subprodutos de animais aquáticos incluem qualquer parte de um animal aquático, tal como qualquer parte produzida pelo processamento do animal aquático. Em alguns exemplos, um subproduto de animal aquático é todo ou parte de um exoesqueleto de animal aquático, tal como casca de camarão, caranguejo, lagostim ou de lagosta. Em outros exemplos, um subproduto de animal aquático é uma parte de um animal aquático, por exemplo, cefalotórax de camarão.

[0089] Em outros exemplos, o material biológico que contém quitina inclui fungos, tais como fungos do Filo Zygomycota, Basidiomycota, Ascomycota ou Deuteromycota. Fungos exemplificadores particulares incluem Aspergillus spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Saccharomyces spp. e Schizosaccharomyces spp. Assim, os fluxos de resíduos de padaria, cervejaria e destilador podem fornecer fontes do material biológico que contém quitina. Ainda em outros exemplos, o material biológico que contém quitina inclui insetos que contêm quitina em seus exoesqueletos, como gafanhotos, grilos, besouros e outros insetos. Os subprodutos do processamento de tais insetos também são contemplados como fontes de quitina.

[0090] O material biológico que contém quitina é misturado com uma composição descrita na Seção II acima para formar uma mistura substancialmente homogênea. Em alguns exemplos, o material biológico que contém quitina é triturado, esmagado, picado, moído ou de outro modo disperso antes da mistura com a composição microbiana aqui descrita. Em exemplos particulares, a mistura contém cerca de 1050% (tal como cerca de 10-20%, cerca de 20-30%, cerca de 30-40%, cerca de 25-40%, por exemplo cerca de 25%, cerca de 30%, 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50%) de material que contém quitina (tal como cabeças de camarão) (p/v) em um inóculo que contém cerca de 0,1-5% (tal como cerca de 0,1-1%, cerca de 0,5 -2%, cerca de 1-2%, cerca de 2-3%, cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,5%, cerca de 0,8%, cerca de 1%, cerca de 1,25%, cerca de 1,5%, cerca de 1,75 %, cerca de 2%, cerca de 2,5%, cerca de 3%, cerca de 4% ou cerca de 5%) da composição microbiana (v/v).

[0091] Em alguns exemplos, o inóculo, o material biológico que contém quitina e um açúcar (ou outra fonte de carbono) são misturados em conjunto, por exemplo por rotação ou agitação. Em outros exemplos, um ou mais dos micróbios na composição microbiana é opcionalmente ativado antes da mistura com o material biológico que contém quitina e a fermentação. A ativação não é necessária para os métodos descritos aqui. Ajustes de tempo e/ou temperatura da fermentação podem ser feitos por aquele versado na técnica, dependendo se os micróbios são ativados antes da fermentação. A ativação do(s) micróbio(s) pode ser pela incubação de um inóculo da composição microbiana com uma fonte de carbono (tal como um açúcar, por exemplo, glicose, sacarose, frutose ou outro açúcar) em uma temperatura e por um período de tempo suficientes para os micróbios crescerem. Em alguns exemplos, um inóculo dos micróbios (tal como uma composição microbiana aqui descrita) tem uma concentração de cerca de 0,05 a 5% v/v (por exemplo, cerca de 0,5 a 5%, cerca de 0,5-2%, cerca de 1 a 2% ou cerca de 2-3%) em meio líquido. O inóculo é diluído em uma solução que contém cerca de 0,1-1% de açúcar (por exemplo, cerca de 0,1 a 0,5%, cerca de 0,1 a 0,3%, cerca de 0,2 a 0,6%, ou cerca de 0,5 a 1%, tal como cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4%, cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9% ou cerca de 1%) e incubado em temperatura ambiente, por exemplo, cerca de 20-40°C (tal como cerca de 20°C, cerca de 25°C, cerca de 30°C, cerca de 35°C ou cerca de 40°C) durante cerca de 1 a 5 dias (tal como cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 96 horas ou cerca de 120 horas). Em outros exemplos, a ativação do(s) micróbio(s) pode ser realizada pela incubação de um inóculo da composição microbiana em uma temperatura e por um período de tempo suficiente para os micróbios crescerem, por exemplo, incubação em cerca de 20 a 40°C ( tal como cerca de 25 a 35°C) por 12 horas a 5 dias (tal como 1 a 4 dias ou 2 a 3 dias). Em alguns exemplos não limitantes, os micróbios são considerados como estando ativados quando a cultura atinge uma densidade óptica de > 0,005 a 600 nm.

[0092] Após a mistura do material biológico que contém quitina e a composição microbiana (que está opcionalmente ativada), a mistura é fermentada. Em alguns exemplos, o pH da mistura é medido antes da fermentação. O pH é ajustado em um intervalo selecionado (por exemplo, pH de cerca de 3 a cerca de 4 ou cerca de 3,5 a 4), se necessário, antes da fermentação. A mistura é incubada em uma temperatura de cerca de 20 a 40°C (por exemplo, cerca de 30°a 36°C, tal como cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C ou cerca de 40°C) por cerca de 1 a 30 dias (como cerca de 3 a 28 dias, cerca de 7 a 21 dias, cerca de 3, 5, 7, 10, 14, 16, 20, 24, 28 ou 30 dias). A mistura é agitada periodicamente (por exemplo, agitação não contínua). Em alguns exemplos, a mistura é agitada durante um período de tempo a cada 1 a 7 dias, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias. Em alguns exemplos não limitantes, a fermentação prossegue até que a acidez titulável (TTA) seja de cerca de 3 a 5% e o pH seja cerca de 4 a 5.

[0093] Após a fermentação, a mistura fermentada resultante é separada em pelo menos frações sólidas e líquidas. Em alguns exemplos, a fração sólida é referida como "HYT C" e em alguns exemplos, a fração líquida é referida como "HYT B". Em alguns exemplos, a fermentação é passada do tanque para o equipamento de decantação. O líquido é subsequentemente decantado e centrifugado. Em um exemplo não limitante, a mistura fermentada é centrifugada a 1250 rpm (930xg) durante 15 minutos a cerca de 5°C para obter frações líquida e lipídica (por exemplo, pigmento). A fração líquida (ou aquosa) obtida a partir do processo de biodegradação pode ser armazenada em temperatura ambiente. Em alguns exemplos não limitantes, um açúcar é adicionado à fração líquida, por exemplo a 1 a 10% v/v.

[0094] A fração líquida pode incluir componentes tais como proteína, aminoácidos, glicosamina, oligoelementos (como cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e/ou manganês) e/ou enzimas (como enzimas lácticas, proteases, lipases e/ou quitinases). Em alguns exemplos não limitantes, a fração líquida contém (p/v) cerca de 1 a 5% de aminoácidos totais, cerca de 3 a 7% de proteína, cerca de 0,1 a 2% de nitrogênio, menos do que cerca de 0,2% de fósforo, cerca de 0,5 a 1 % de potássio, cerca de 4 a 8% de carbono, cerca de 0,2 a 1% de cálcio, menos do que cerca de 0,2% de magnésio, menos de cerca de 0,2% de sódio e/ou cerca de 0,1a 0,4% de enxofre. Em exemplos não limitantes adicionais, a fração líquida inclui cerca de 0,01a 0,2% de glicosamina (por exemplo, cerca de 0,1% ou menos). A fração líquida também pode conter um ou mais micróbios (por exemplo, a partir do inóculo usado para iniciar o processo de fermentação) e/ou quantidades residuais de quitosana ou quitina. A fração líquida em alguns exemplos é aqui referida como "HYT B”.

[0095] A fração sólida obtida a partir do processo de biodegradação contém quitina (por exemplo, cerca de 50 a 70% ou cerca de 50 a 60% de quitina). A fração sólida também pode conter um ou mais oligoelementos (como cálcio, magnésio, zinco, cobre, ferro e/ou manganês), proteínas ou aminoácidos, e/ou um ou mais micróbios do inóculo usado para iniciar o processo de fermentação. A fração sólida é, em alguns exemplos, aqui referida como "HYT C". HYT C é opcionalmente micronizada para formar quitina micronizada e quitina residual. Em alguns exemplos não limitantes, a fração sólida contém (p/v) cerca de 9 a 35% de aminoácidos totais, cerca de 30 a 50% de proteína bruta, cerca de 5 a 10% de nitrogênio, cerca de 0,3 a 1% de fósforo, menos do que cerca de 0,3% de potássio, cerca de 35 a 55% de carbono, cerca de 0,5 a 2% de cálcio, menos de cerca de 0,1% de magnésio, cerca de 0,1% a 0,4% de sódio e/ou cerca de 0,2 a 0,5% de enxofre.

[0096] Em alguns exemplos, uma fração lipídica também é separada das frações sólida e líquida. A fração lipídica é a fase superior da fração líquida. A fração lipídica contém compostos tais como esteróis, vitamina A e/ou vitamina E, ácidos graxos (tais como DHA e/ou EHA) e, em alguns exemplos, pigmentos carotenoides (por exemplo, astaxantina). A fração lipídica pode ser usada para uma variedade de propósitos, incluindo, mas não limitados a produção de cosméticos ou produtos nutricionais.

[0097] Em modalidades adicionais, a quitina é fermentada com uma composição microbiana descrita. Em alguns exemplos, a quitina (tal como HYT C ou quitina micronizada e/ou residual produzida como descrito acima) é misturada com um consórcio ou composição microbiana que contém micróbios aqui descritos e hidrolisado de proteína (por exemplo, HYT B) e fermentada para formar uma mistura fermentada. Pelo menos uma porção da quitina na mistura inicial é digerida como resultado da fermentação. Em alguns exemplos, a mistura é incubada em uma temperatura de cerca de 20 a 40°C (por exemplo, cerca de 30°C a 35°C, tal como cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C ou cerca de 40°C) durante cerca de 1 dia a 30 dias (tal como cerca de 2 a 28 dias, cerca de 4 a 24 dias, cerca de 16 a 30 dias, cerca de 10 a 20 dias, ou cerca de 12 a 24 dias). Em alguns exemplos, a mistura é agitada periodicamente (por exemplo, agitação não contínua). Em outros exemplos, a mistura é continuamente agitada. Em um exemplo não limitante, a mistura é agitada durante cerca de 1 a 12 horas diárias (tal como cerca de 2 a 8 horas ou cerca de 4 a 10 horas). O pH da mistura de fermentação pode ser monitorado periodicamente. Em alguns exemplos, o pH é opcionalmente mantido em cerca de 4 a 5. Em alguns exemplos, a fermentação prossegue até que a Acidez Total Titulável (TTA) seja pelo menos cerca de 1 a 10% (tal como cerca de 2 a 8%, cerca de 4 a 8%, ou cerca de 5 a 10%).

[0098] Após a fermentação, a mistura fermentada resultante é separada em pelo menos frações sólidas e líquidas, por exemplo por decantação, filtração e/ou centrifugação. A fração resultante da fermentação de HYT B e quitina com a composição microbiana é referida aqui em alguns exemplos como "HYT D". Em alguns exemplos não limitantes, a fração líquida contém (p/v) cerca de 0,5 a 2% de aminoácidos totais, cerca de 3 a 7% de proteína, cerca de 0,5 a 1% de nitrogênio, menos do que cerca de 0,1% de fósforo, cerca de 0,4 a 1 % de potássio, cerca de 3 a 7% de carbono, menos de cerca de 0,5% de cálcio, menos de cerca de 0,1% de magnésio, menos de cerca de 0,3% de sódio e/ou menos de cerca de 0,3% de enxofre. Além disso, HYT D contém menos do que cerca de 50% de quitina (tal como menos de cerca de 45%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 35% ou menos de cerca de 30% de quitina) e menos do que 2% de glicosamina (tal como menos do que cerca de 1,5% ou menos do que cerca de 1% de glicosamina). Em outros exemplos, HYT D contém cerca de 25 a 50% de quitina e cerca de 0,5 a 2% de glicosamina.

IV. Processos para o Tratamento do Solo, Plantas e/ou Sementes

[0099] As composições microbianas descritas, isoladas ou em combinação com os produtos aqui divulgados (tais como HYT B, HYT C e/ou HYT D), podem ser utilizadas para tratar solo, plantas ou partes de plantas (tais como raízes, caules, folhagem, sementes ou mudas). Os métodos de produção de HYT B, HYT C e HYT D estão descritos na Seção III (acima) e também na Pat. U.S. No. 8.748.124 e Pedido de Patente Publicado No. WO 2012/175738, ambos incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00100] Em alguns exemplos, o tratamento com as composições descritas melhora o crescimento da planta, melhora a tolerância ao estresse e/ou aumenta o rendimento da colheita. Em algumas modalidades, os métodos incluem contatar do solo, plantas (tais como a folhagem da planta, caules, raízes, plântulas ou outras partes da planta) ou sementes com um micróbio ou composição aqui descritos. Os métodos podem também incluir o crescimento de plantas tratadas, partes de plantas ou sementes e/ou plantas de cultivo, partes de plantas ou sementes no solo tratado.

[00101] Os micróbios na composição são opcionalmente ativados antes da aplicação. Em alguns exemplos, a ativação do(s) micróbio(s) é como descrita na Seção III, acima. Em outros exemplos, os micróbios são ativados pela mistura de 100 partes de água e 1 parte da composição microbiana e incubando em cerca de 15-40°C (tal como cerca de 20-40°C, cerca de 15-30°C, ou cerca de 25- 35°C) durante cerca de 12 horas a 14 dias (tal como cerca de 1 a14 dias, 3 a 10 dias, 3 a 5 dias ou 5 a 7 dias). A mistura de ativação opcionalmente também pode incluir 1 parte de HYT B, se a composição microbiana for aplicada em combinação com HYT B.

[00102] Em outras modalidades, os métodos incluem contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com uma composição descrita e um ou mais de HYT B, HYT C e HYT D (tal como um, dois ou todos de HYT B, HYT C e HYT D). HYT B, HYT C e/ou HYT D podem ser aplicados separadamente ao solo, plantas (ou partes da planta) e/ou sementes, por exemplo sequencialmente, simultaneamente ou substancialmente simultaneamente com as composições microbianas descritas.

[00103] Em alguns exemplos, os métodos incluem contatar o solo, plantas (ou parte da planta) ou sementes com uma composição microbiana descrita e um ou mais componentes adicionais incluindo, mas não limitados a quitina, quitosana, glicosamina, proteína, aminoácidos, fertilizante líquido, um ou mais pesticidas, um ou mais fungicidas, um ou mais herbicidas, um ou mais inseticidas, um ou mais hormônios vegetais, um ou mais elicitadores vegetais ou combinações de dois ou mais destes. Os componentes adicionais podem ser incluídos na composição que inclui os micróbios aqui descritos ou podem ser aplicados separadamente ao solo, plantas (ou partes de plantas) e/ou sementes, por exemplo, sequencialmente, simultaneamente ou substancialmente simultaneamente com as composições descritas.

[00104] Em modalidades particulares, a composição microbiana é combinada com um fertilizante líquido (por exemplo, uma solução ou suspensão aquosa que contém nitrogênio solúvel). Em alguns exemplos, o fertilizante líquido inclui uma fonte orgânica de nitrogênio tal como a ureia ou um sal inorgânico que contém nitrogênio tal como hidróxido de amônia, nitrato de amônia, sulfato de amônia, pirofosfato de amônia, tiossulfato de amônia ou suas combinações. A amônia aquosa (20-24,6% de amônia anidra) também pode ser usada como nitrogênio solúvel. Em alguns exemplos, o consórcio ou composição microbiana é combinado com o fertilizante líquido (por exemplo, misturado com o fertilizante líquido) imediatamente antes do uso ou em um curto período antes do uso (por exemplo, dentro de 10 minutos a 24 horas antes do uso, por exemplo 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas ou 24 horas antes do uso). Em outros exemplos, o consórcio ou composição microbiana é combinado com o fertilizante líquido (por exemplo misturado com o fertilizante líquido) pelo menos 24 horas antes do uso (como 24 horas a 6 meses, por exemplo, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos oito semanas, ou pelo menos 12 semanas antes do uso).

[00105] Em alguns exemplos, a quantidade da composição a ser aplicada (por exemplo, por acre ou hectare) é calculada e a composição é diluída em água (ou em alguns exemplos, fertilizante líquido) até uma quantidade suficiente para pulverizar ou irrigar a área a ser tratada (se a composição for um líquido). A composição pode ser aplicada no momento da plantação de sementes em uma concentração de 1,25 a 4,9 litro por hectare (0,5 a 2 litros por acre) (tal como 1,25 L/ha, 2,5 L/ha, 3,7 L/ha ou 4,9 L/ha (0,5 L/acre, 1 L/acre, 1,5 L/acre ou 2 L/acre)). A composição microbiana também pode ser aplicada ao solo (por exemplo, perto das raízes da planta) ou na planta uma ou mais vezes durante o crescimento, na mesma ou em uma quantidade diferente. Em outros exemplos, a composição pode ser misturada com herbicidas diluídos, inseticidas, pesticidas ou produtos químicos reguladores do crescimento das plantas. Se a composição a ser aplicada for um sólido (tal como uma formulação seca), o sólido pode ser aplicado diretamente ao solo, plantas ou partes de plantas ou pode ser suspensa ou dissolvida em água (ou outro líquido) antes do uso.

[00106] As composições microbianas descritas (isoladas ou em combinação com outros componentes aqui descritos) podem ser liberadas de várias maneiras em diferentes estágios de desenvolvimento da planta, dependendo da situação de cultivo e das práticas agrícolas. Em alguns exemplos, uma composição microbiana descrita é misturada com fertilizante líquido e aplicada no momento do plantio das sementes em uma taxa de 1,25 a 4,9 litro por hectare (0,5 a 2 litros por acre) (tal como 1,25 L/ha, 2,5 L/ha, 3,7 L/ha ou 4,9 L/ha (0,5 L/acre, 1 L/acre, 1,5 L/acre ou 2 L/acre)) ou, alternativamente é aplicada individualmente. A composição microbiana e o fertilizante líquido também podem ser aplicados ao solo (por exemplo, perto das raízes da planta) ou na planta uma ou mais vezes durante o crescimento, na mesma ou em uma quantidade diferente. Em outros exemplos, uma composição microbiana descrita e HYT B são misturados e diluídos e aplicados no plantio de sementes em uma concentração de 1,25 a 4,9 litro por hectare (0,5 a 2 litros por acre) (tal como 1,25 L/ha, 2,5 L/ha, 3,7 L/ha ou 4,9 L/ha (0,5 L/acre, 1 L/acre, 1,5 L/acre ou 2 L/acre)) ou, alternativamente, são aplicados individualmente. A composição microbiana e o HYT B também podem ser aplicados ao solo (por exemplo, próximo às raízes da planta) ou na planta uma ou mais vezes durante o crescimento, na mesma ou em uma quantidade diferente.

[00107] Ainda em outros exemplos, uma composição microbiana descrita e componentes adicionais (tais como fertilizante líquido, HYT B ou outros componentes) são diluídos e liberados juntos através de irrigação por gotejamento em baixa concentração conforme as plântulas ou transplantes estão sendo estabelecidos, liberados por irrigação por inundação ou liberados como uma mistura diluída com nutrientes na irrigação aérea ou por gotejamento em estufas para mudas ou plantas estabelecidas, ou alternativamente são aplicados individualmente. Em exemplos adicionais, uma composição microbiana descrita é adicionada a outros tratamentos de solo no campo, como adição a tratamentos com inseticidas, para permitir facilidade de uso. Em outros exemplos, tal como estufas, uma composição microbiana descrita e HYT B são usados individualmente ou em conjunto, combinados com fertilizante líquido (como fertilizante de peixe) e outros nutrientes e injetados em sistemas de irrigação por aspersão de água ou linhas de irrigação por gotejamento no decorrer do crescimento da planta. Em um exemplo de estufa, uma composição microbiana descrita e HYT B são utilizados em conjunto, por exemplo, diluídos e aplicados durante a irrigação aérea ou fertirrigação em uma concentração de 0,25 a 1 litro na germinação de plântulas, seguido por 0,25 a 1 litro de ciclo de crescimento médio com fertirrigação e finalmente 0,25 a 1 litro por fertirrigação 5 a 10 dias no final do ciclo de crescimento.

[00108] Em algumas modalidades, uma composição microbiana descrita e HYT B são aplicadas em conjunto ou individualmente (por exemplo, sequencialmente) para promover o rendimento, vigor, tipicidade, qualidade, desenvolvimento da raiz ou tolerância ao stress em culturas.

[00109] Em todas as culturas, HYT C pode ser adicionado ao solo a uma taxa de cerca de 1,25 a 4,9 kg por hectare 0,5 a 2 kg/acre (tal como cerca de 1,25 kg/ha, 2,5 kg/ha, 3,7 kg/ha ou 4,9 kg/ha (0,5 kg/acre, cerca de 1 kg/acre, cerca de 1,5 kg/acre, ou cerca de 2 kg/acre)) no momento do estabelecimento da cultura ou do plantio, por exemplo, em combinação com uma composição microbiana descrita. Em outros exemplos, o HYT C é adicionado a uma solução de irrigação por gotejamento de uma composição microbiana descrita e o HYT B é adicionado em aplicações de fertilização que contêm uma composição microbiana descrita e HYT B em estufas, tal como os exemplos acima.

[00110] Em modalidades adicionais, HYT D (sozinho ou em combinação com as composições microbianas ou outros componentes aqui descritos) é usado em cerca de 1 a 20 L/hectare (tal como cerca de 1 a 15 L/hectare, cerca de 3 a 10 L/hectare, ou cerca de 3 a 5 L/hectare). Em outros exemplos, o HYT D (sozinho ou em combinação com as composições microbianas ou outros componentes aqui descritos) é usado como um tratamento de sementes para melhorar o rendimento e desempenho da colheita (por exemplo, cerca de 1 a 10 L/kg de sementes, tal como cerca de 1 a 3 L/kg, cerca de 3 a 5 L/kg, ou cerca de 5 a 10 L/kg). Alternativamente, HYT D pode ser usado no solo (sozinho ou em combinação com as composições microbianas ou outros componentes aqui divulgados) em cerca de 1 a 3 L/hectare para aumentar o crescimento da planta, por exemplo, para ajudar as plantas a permanecerem produtivas sob condições de stress.

[00111] Em alguns exemplos, o tratamento do solo, sementes, plantas ou partes de plantas com uma composição descrita aumenta o crescimento da planta (tal como tamanho global da planta, quantidade de folhagem, número de raízes, diâmetro da raiz, comprimento da raiz, produção de brotos, produção de frutos, produção de pólen e/ou produção de sementes) em pelo menos cerca de 5% (por exemplo, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes ou mais). Em outros exemplos, os métodos descritos resultam no aumento da produção da cultura em cerca de 10 a 75% (tal como cerca de 20 a 60% ou cerca de 30 a 50%) em comparação com culturas não tratadas. Outras medidas de desempenho da cultura incluem a qualidade da fruta, rendimento, conteúdo de amido ou sólidos, conteúdo de açúcar ou brix, prazo de validade das frutas ou do produto da colheita, produção de rendimento comercial ou tamanho alvo, qualidade de fruta ou produto, brotamento de grama e resistência a tráfego de pé na grama, polinização e frutificação, floração, número de flores, vida útil da flor, qualidade da floração, enraizamento e massa radicular, resistência ao acamamento, tolerância a estresse abiótico ao calor, seca, frio e recuperação após estresse, adaptabilidade a solos pobres, nível de fotossíntese e ambientação e saúde das plantas. Para determinar a eficácia dos produtos, os controles incluem as mesmas práticas agronômicas sem adição de micróbios, realizadas em paralelo.

[00112] Os métodos e composições descritos podem ser utilizados em conjunto com qualquer cultura (por exemplo, para tratamento direto das culturas ou para tratamento do solo antes ou depois do plantio). Culturas exemplificadoras incluem, mas não se limitam a alfafa, amêndoa, banana, cevada, brócolis, couves, canola, cenouras, cítricos e culturas de árvores frutíferas, milho, algodão, pepino, flores e plantas ornamentais, alho, uvas, lúpulo, plantas hortícolas, alho-poro, melão, dendê, cebola, amendoim e legumes, abacaxi, choupo, pinheiro e árvores lenhosas, batata, framboesa, arroz, gergelim, sorgo, soja, abóbora, morango, cana, girassol, tomate, grama e gramíneas forrageiras, melancia, trigo e eucalipto.

V. Exemplos

[00113] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certas características e/ou modalidades particulares. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes da descrição às características ou modalidades particulares descritas.

Exemplo 1 Isolamento e Identificação de Micróbios

[00114] Esse exemplo descreve o isolamento, identificação e a caracterização dos micróbios.

[00115] Isolamento dos micróbios: Amostras de HYT A (Agrinos AS; 50 mL a 5 L) foram armazenadas em temperatura ambiente longe da luz. Antes da amostragem de um lote HYT A selecionado, o recipiente correspondente foi misturado vigorosamente para garantir que o conteúdo fosse distribuído uniformemente, uma vez que geralmente ocorre uma sedimentação ao longo do tempo. Tipicamente, uma alíquota de 1 a 10 mL foi retida para fins de isolamento microbiano. No caso de Azotobacter, o isolamento foi realizado a partir de amostras de solo (obtidas em N 38° 32' 49.55 ", W 121° 44' 13.54").

[00116] Isolamento através de espalhamento em placas: Das alíquotas retidas de HYT A, 0,1 mL foi coletado assepticamente e misturado com 9,9 mL de água estéril ou Peptone água em um tubo de cultura (diluição a 10-2). Os tubos foram então centrifugados (por exemplo, 60 segundos a 2000 rpm) e diluições em série de 10 vezes em água ou peptona água (até à diluição de 1:10-9) foram preparadas. Cem microlitros de cada diluição foram subsequentemente espalhados em meios semissólidos em placas de Petri de 100 mm usando um espalhador estéril em forma de L. Foram usadas placas contendo Agar Padrão (Standard Method Agar, SMA; BD # 247940), Nutrient Agar (NA; BD # 213000) ou outro meio de crescimento selecionado (Tabela 1). As placas inoculadas foram então incubadas em câmaras com temperatura controlada de 22°C a 35°C. Para isolamento de micróbios anaeróbicos, as placas foram primeiro colocadas em caixas anaeróbicas (por exemplo, BD GasPak™ EZ Container Systems, BD Diagnostics) antes da incubação na(s) temperatura(s) desejada(s). Tabela 1. Meios semissólidos usados para isolar micróbios de HYT A. *NA: nutriente agar (BD #213000); SMA: método padrão agar (BD #247940); YPD: levedura peptona dextrose (BD #242720); AMA: meio agar azotobacter (HIMEDIA #M372); AMAG: meio agar azotobacter suplementado com 10g/L glicose (HIMEDIA #M371); RCM: meio para clostridium reforçado (BD#218081); RMA: meio agar rhizobium (HIMEDIA #M408); PA: meio de Pikovskaya (HIMEDIA #M520); MRS: Lactobacilli MRS (BD# 288210).

[00117] Isolamento de micróbios das amostras do solo: A 30-50 gramas de solo, manitol ou sucrose 1% p/p foi adicionado seguido por 2 mL de água estéril para cada 10 g de solo. Em um almofariz estéril, a lama resultante foi amassada para gerar uma pasta homogênea. A pasta foi subsequentemente transferida para uma placa de Petri e incubada a 27-30°C em uma câmara umidificada por até 1 semana. Uma amostra da substância viscosa que se formou na superfície da pasta do solo foi subsequentemente transferida para meio semissólido isento de nitrogênio, fresco e estéril (ver Exemplo 3 para composição do meio). O crescimento microbiano resultante foi tornado biologicamente puro através de subcultura, como descrito abaixo.

[00118] Preparação de isolados microbianos biologicamente puros: Após a incubação, as placas foram analisadas quanto ao crescimento microbiano. Cepas microbianas foram selecionadas para investigação adicional com base nas características macroscópicas e microscópicas tradicionais das colônias que crescem em meios semissólidos (Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria; Ed., William B. Whitman). Critérios tais como a cor da colônia, densidade ou morfologia (por exemplo, forma, elevação e margem) foram considerados. Para obter colônias bem separadas em meio sólido, foi utilizada a técnica de "streaking out". Resumidamente, os clones microbianos selecionados foram aplicados em meio sólido novo e fresco e deixados crescer até aparecerem colônias bem diferenciadas. Se necessário, múltiplas subculturas foram realizadas até que um clone microbiano biologicamente puro fosse obtido; estes foram denominados "isolados". Testes adicionais foram então realizados no isolado para estudar a morfologia da célula bacteriana. A coloração diferencial de Gram também foi usada para iniciar a classificação do isolado no gênero apropriado mais provável.

[00119] Extração de DNA genômico microbiano: Células bacterianas de diferentes espécies foram cultivadas e coletadas a partir de um caldo líquido otimizado e condições de cultura. O kit de isolamento de DNA PowerSoil (MoBio, Cat # 12888) é usado para preparação de DNA genômico em pequena escala. Para extrações de DNA genômico em grande escala, o lisado celular foi preparado usando o kit GenElute Bacterial Genomic DNA (Sigma, Cat # NA2110) ou o DNA genômico da Qiagen Buffer Set e Genomic-tip 500/G (Qiagen, Cat # 19060 e 10262) de acordo com os métodos recomendados pelo fabricante. O DNA genômico foi então precipitado com igual volume de isopropanol, lavado com 70% etanol, seco ao ar e suspenso novamente em tampão TE.

[00120] Amplificação e sequenciamento de 16S para confirmação da taxonomia: Os genes 16S de extensão total foram amplificados a partir de diferentes espécies bacterianas usando DNA genômico e/ou colônias como o modelo de PCR diretamente. Iniciador direto (27F, 5’-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; SEQ ID NO: 1) e Iniciador reverso (1492R, 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’; SEQ ID NO: 2) foram designados de acordo com Singer et al. (2016) com pequenas modificações. Os produtos de PCR foram sequenciados diretamente usando os iniciadores direto e reverso de PCR. Os traços de sequência de alta qualidade foram pesquisados por BLAST contra a NCBI Nucleotide Collection (nr/nt) Database para confirmação de taxonomia. Sequências de 16S rDNA de extensão completa obtidas são fornecidas aqui como as SEQ ID NOs: 3 a 24.

[00121] Sequenciamento do genoma completo (WGS): O sequenciamento do genoma completo de isolados biologicamente puros foi realizado usando o sistema PacBio RSII (Pacific Biosciences Menlo Park, CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante para a preparação e sequenciamento da biblioteca de sequências. Uma média de 73.000 leituras de 24 kb de comprimento, em média, foi gerada a partir dos isolados microbianos. A montagem de genoma de novo foi realizada com o Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP, Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA).

[00122] Alinhamento do genoma completo: O número de espécies bacterianas nomeadas com genomas completamente sequenciados cresceu rapidamente nos últimos anos, mas permanece pequeno em comparação com o número de sequências de 16S rRNA. No entanto, quando um genoma de referência está disponível, a realização de um alinhamento genômico completo é uma das formas mais definitivas de confirmar uma espécie ou mesmo a correspondência a nível de cepa. Para esse fim, genomas microbianos de alta qualidade foram baixados do RefSeq e alinhados contra sequências do genoma inteiro isolado usando MUMmer (Delcher et al., Nucleic Acids Res. 30:2478-2483, 2002; Kurtz et al, Genome Biol. 5:R12, 2004), que identifica Correspondências Únicas Máximas (Maximal Unique Matches, "MUM"s) entre sequências muito longas.

[00123] Identificação e classificação de genes de 16S rRNA e genes marcadores conservados filogenéticos (pMGs): Foram identificados genes de RNA ribossômico (rRNA) dentro da montagem de novo genoma usando o programa Barrnap (Seemann, 2014), que é um invólucro para a ferramenta NHMMer (Wheeler e Eddy, 2013) incluído com HMMer 3.1. As sequências de 16S rRNA foram então classificadas usando Ribosome Database Project (RDP) Naive Bayesian Classifier, assim como o alinhamento por pareamento com BLASTn (Camacho et al., BMC Bioinformatics 10:421, 2009; Cole et al., Nucleic Acids Research 42(D1):633-642, 2014).

[00124] Como o número de organismos com genomas sequenciados cresceu, tornou-se cada vez mais comum alavancar esses dados para uma classificação taxonômica mais específica. O banco de dados specI contém sequências para 40 genes marcadores filogenéticos conservados (pMGs) que foram selecionados a partir do banco de dados COG (Conserved Orthologous Groups) (Tatsuov et al, Science 278: 631-637, 1997). A maioria deles está relacionada ao processamento de informações genéticas. Existem sequências para vários milhares de espécies de bactérias dentro do banco de dados specI (Mende et al., Nature Methods 10: 881-884, 2013). Portanto, genes codificadores de proteínas foram identificados dentro da sequência genômic isolada montada usando Prodigal (v2.6.2) (Hyatt et al., BMC Bioinformatics 11: 119, 2010), que utiliza limiares heurísticos desenvolvidos em coordenação com especialistas em curadoria genômica do US Department of Energy Joint Genome Institute (JGI). As sequências de codificação traduzidas identificadas por Prodigal foram anotadas pelo programa FetchMGs incluído com specI (v 1.0), que utiliza um conjunto de pontos de corte empiricamente determinados para identificar sequências que pertencem a cada pMG COG dentro de um determinado proteoma. Os genes codificadores cujas sequências traduzidas foram identificadas por FetchMGs como pertencentes a uma das 40 specI pMGs foram então alinhadas contra pMGs de referência não traduzidos da base de dados specI utilizando BLASTn.

[00125] Classificação taxonômica de isolados microbianos: Tradicionalmente, a identificação de microrganismos ao nível da espécie é frequentemente decidida com base em um único gene marcador universal, o gene de 16S rRNA (veja, por exemplo, Stackebrandt et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849, 1994; Janda et al.f J. Clin. Microbiol. 45:2761-2764, 2007). No entanto, a comunidade de microbiologia tem notado que a identidade dos micróbios para os quais a informação do genoma completo se tornou disponível, nem sempre se correlaciona com a identidade determinada pelas abordagens comumente usadas antes do advento do sequenciamento de alto rendimento de última geração. Além disso, a informação completa do genoma não está disponível para todos os micróbios e um grande número de bancos de dados que capturam a paisagem genética microbiana não são validados/selecionados. Portanto, atribuir uma espécie/linhagem a novos isolados microbianos é um desafio.

[00126] Levando em consideração as limitações de identificação taxonômica descritas acima, a abordagem adotada para a atribuição de espécies de cada isolado de micróbios aqui descrita foi uma abordagem multifacetada. Informações genéticas, tais como o sequenciamento do genoma completo, a análise de 40 genes marcadores filogenéticos conservados e a análise do gene de 16S rRNA foram geradas para cada isolado. Dois laboratórios terceirizados que oferecem serviços de identificação taxonômica foram contratados independentemente para fornecer a identificação do gênero e da espécie com base em seus bancos de dados e algoritmos patenteados. Além disso, foram realizadas pesquisas de homologia de sequências do gene de 16S rRNA de extensão completa para cada micróbio em três bancos de dados independentes: banco de dados Greengenes (DeSantis et al, Appl. Environ Microbiol. 72:5069-5072, 2006), banco de dados EZTaxon (Kim et al, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 716-721, 2012), e o banco de dados de informação do National Center for Biotechnology (U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD).

[00127] Uma espécie foi designada para cada isolado se pelo menos três ou mais pesquisas de banco de dados (incluindo bancos de dados patenteados e bancos de dados públicos terceirizados, conforme listado acima) e serviços de identificação retornaram com a designação de espécies idênticas. Para pelo menos três isolados, as pesquisas nos bancos de dados não retornaram designações de espécies idênticas em pelo menos três bancos de dados. Nesses casos, foi feita uma designação baseada no melhor julgamento (Bacillus sp., Pseudomonas sp. e Paenibacillus lautus).

[00128] Com base no exposto acima, as identificações microbianas foram feitas da seguinte forma: • Lactobacillus delbrueckii. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ND02. • Virgibacillus halophilus. Os resultados do 16S BLASTn sugeriram que este isolado poderia ser uma cepa de Virgibacillus halophilus, embora isto não pudesse ser confirmado por quaisquer outros métodos devido à falta de sequências de referência adequadas. Os resultados do 16S BLASTn foram consistentes com a designação a nível do gênero do classificador Bayesiano naive (NBC), mas foram insuficientes para confirmar uma classificação à nível de espécie por si mesma. • Azotobacter vinelandii. Este isolado parece ser uma nova cepa de Azotobacter vinelandii. Isto foi apoiado pela análise de 16S rRNA e outros genes marcadores filogenéticos, assim como alinhamentos do genoma completo para ambas as duas cepas candidatas mais próximas. O grande número de pequenas e grandes diferenças observadas no alinhamento do genoma completo, assim como as numerosas pequenas diferenças entre o 16S e as sequências codificadoras, sugerem que esta pode ser uma nova cepa e potencialmente até mesmo uma nova espécie, embora este isolado fosse claramente mais intimamente relacionado com Azotobacter vinelandii do que com qualquer outra espécie contida em qualquer um dos bancos de dados. • Clostridium pasteurianum. As análises de 16S e alinhamentos do genoma completo apoiaram a identificação deste isolado como nova cepa de Clostridium pasteurianum. O banco de dados specI não contém nenhuma sequência de referência para C. pasteurianum, embora os resultados de specI forneçam suporte adicional ao nível do gênero. • Paenibacillus chibensis. A evidência mais forte para a identificação positiva deste isolado foi a classificação ao nível do gênero de RDP NBC, que atribuiu este isolado ao Paenibacillus com uma probabilidade de 1,0. Ambos os resultados de 16S e specI BLASTn apoiaram designação. Um genoma de referência intimamente compatível não pôde ser encontrado em RefSeq, embora tenha sido observada sintenia persistente entre a montagem do genoma e uma sequência de referência para Paenibacillus sp. Y412MC10. O alinhamento da sequência do gene de 16S rRNA de extensão completa em bancos de dados disponíveis sugere atualmente que este isolado pertence a Paenibacillus chibensis. • Streptomyces griseus. Este isolado era claramente uma cepa de Streptomyces griseus que é extremamente relacionada ao NBRC 13350. Isto foi apoiado pela análise de 16S rRNA e outros genes marcadores filogenéticos, bem como alinhamentos do genoma completo para ambas as duas cepas candidatas mais próximas. O alinhamento do genoma completo revelou várias diferenças espalhadas pelo genoma, no entanto, sugerindo que esse isolado deveria ser classificado como uma cepa separada. • Pseudomonas sp. É claro que este isolado pertence ao gênero Pseudomonas e que é muito intimamente relacionado com Pseudomonas entomophila, mas não tem uma correspondência exata com a cepa L48, a única cepa de Pseudomonas entomophila com um genoma de referência disponível. Este isolado também está intimamente relacionado com P. putida e P. fluorescens. • Pseudomonas putida. Os resultados de algumas análises apoiaram a identificação deste isolado como Pseudomonas putida. Embora este isolado pareça estar intimamente relacionado com a cepa P. putida NBRC 14164, a melhor referência disponível, as análises do genoma completo revelaram numerosas pequenas diferenças em todo o genoma, sugerindo que este isolado deve ser classificado como uma cepa separada. • Oceanobacillus oncorhynchi. As análises de 16S e alinhamentos do genoma completo permitiram a identificação deste isolado como uma nova cepa de Oceanobacillus oncorhynchi. O banco de dados specI não contém nenhuma sequência de referência para O. oncorhynchi, embora os resultados de specI forneçam apoio adicional ao nível do gênero. • Paenibacillus lautus. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como uma cepa de Paenibacillus que está intimamente relacionada, embora não idêntica, à bem caracterizada sp. Y412MC10. Considerando a alta densidade de pequenas diferenças ao longo de todo o alinhamento do genoma completo com a sp. Y412MC10, as numerosas pequenas diferenças observadas nos alinhamentos pareados dos genes marcadores de sp. Y412MC10 e a observação de alinhamentos igualmente bons para sequências de sp. HGF5 e o fato de que Paenibacillus sp. Y412MC10 ainda não foi formalmente nomeado. O alinhamento da sequência do gene de 16S rRNA de extensão completa em bancos de dados disponíveis sugere atualmente que este isolado pertence a espécies de Paenibacillus lautus. • Bacillus licheniformis. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580, possivelmente em todo o caminho até o nível de cepa. Entretanto, este isolado pode ser uma cepa única baseada no rearranjo bastante grande e outras pequenas diferenças reveladas pelo alinhamento do genoma completo, assim como nas mutações pontuais observadas nos resultados de 16S e specI, mas é raro observar um grau tão alto de identidade de sequência entre dois genomas, mesmo na mesma espécie. • Lactobacillus vini. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology não continha nenhuma informação adicional sobre o Lactobacillus mobilis, ou o potencialmente contra específico e igualmente pouco caracterizado Lactobacillus vini (Passoth et al, Microbiology 73: 4354-4356, 2007). Os alinhamentos do genoma completo contra as únicas referências disponíveis para L. vini indicaram um grande número de regiões homólogas, mas a extrema fragmentação das sequências de referência tornou difícil avaliar a relação entre qualquer uma delas e este isolado. O alinhamento da sequência do gene de 16S rRNA de extensão completa em bases de dados disponíveis sugere atualmente que este isolado pertence a espécies de Lactobacillus vini. • Paenibacillus cookii. A evidência mais forte para a identificação positiva deste isolado é a classificação ao nível de gênero da NDP RDP, que atribuiu este isolado a Paenibacillus com uma probabilidade de 1,0. Ambos os resultados de 16S e specI BLASTn apoiaram esta designação. Um genoma de referência intimamente correspondente não pode ser observada no RefSeq, embora tenha sido observada uma sintenia persistente entre a montagem do isolado e uma sequência de referência para Paenibacillus sp. Y412MC10. Um alinhamento de sequência do gene de 16S rRNA de extensão completa em bancos de dados disponíveis, atualmente sugere que este isolado pertence a espécies de Paenibacillus cookii. • Lactobacillus buchneri. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Lactobacillus buchneri, embora os resultados de specI não apoiassem a análise de 16S e os alinhamentos do genoma completo, presumivelmente porque a base de dados não possuía as sequências de referência necessárias. Embora esta amostra pareça estar intimamente relacionada com a cepa L. buchneri CD034, a melhor referência disponível, as análises do genoma completo ainda revelaram dezenas de diferenças, incluindo duas grandes deleções, sugerindo que este isolado deve ser classificado como uma cepa separada. • Bacillus megaterium. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Bacillus megaterium. Embora este isolado pareça estar intimamente relacionado com a cepa de B. megaterium DSM319, a melhor referência disponível, a análise do genoma completo revelou muitas diferenças pequenas através de todo o genoma, sugerindo que este isolado deveria ser classificado como uma cepa separada. • Acetobacter pasteurianus. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Acetobacter pasteurianus. Este isolado parece estar intimamente relacionado com as cepas de A. pasteurianus IFO 3283, as melhores referências disponíveis, mas a análise do genoma completo revelou muitas diferenças pequenas em todo o genoma, mesmo para a correspondência mais próxima, sugerindo que este isolado deve ser classificado como uma cepa separada. • Clostridium beijerinckii. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Clostridium beijerinckii. Embora pareça estar intimamente relacionado com a cepa C. beijerinckii NCIMB 8052, a melhor referência disponível, as análises do genoma completo revelaram muitas diferenças pequenas em todo o genoma, sugerindo que este isolado deve ser classificado como uma cepa separada. • Lactobacillus casei/paracasei. Os resultados de todas as análises apoiaram fortemente a identificação deste isolado como Lactobacillus casei ou Lactobacillus paracasei. Os melhores resultados de todas as análises foram consistentemente de membros destas duas espécies superpostas, ainda que todas as análises tenham revelado muitas diferenças pequenas que abrangem todo o comprimento do genoma, sugerindo que este isolado deve ser classificado como uma cepa separada. • Bacillus flexus. A evidência mais forte para a identificação positiva deste isolado é a classificação a nível de gênero da RDP NBC, que a designou como Bacillus com uma probabilidade de 1,0. Ambos os resultados de 16S e specI BLASTn, bem como os alinhamentos do genoma completo MUMmer, apoiaram esta designação até o nível de gênero. O alinhamento da sequência do gene de 16S rRNA de extensão completa em bancos de dados disponíveis atualmente sugere que este isolado pertence a espécies de Bacillus flexus. • Bacillus sp. As análises de 16S apoiaram fortemente a identificação deste isolado como uma cepa de Bacillus, mas nenhuma das análises foi capaz de designa-la positivamente como uma espécie nomeada. Os resultados de 16S BLASTn sugerem que pode ser uma cepa de Bacillus kochii, mas a falta de sequências genômicas completas nos bancos de dados disponíveis impediu que isso fosse confirmado. • Bacillus subtilis. Os resultados de todas as análises apoiam fortemente a identificação deste isolado como Bacillus subtilis. As taxonomias e nomenclaturas para este gênero e espécie são bastante complexas, embora os resultados de todas as análises tenham sido predominantemente dominados por cepas formalmente classificadas como B. subtilis. Apesar da abundância de dados de sequência e muitas correspondências exatas com genes individuais, uma correspondência exata do genoma não pôde ser identificada, indicando fortemente que este isolado é uma nova cepa de B. subtilis. • Bacillus amyloliquefaciens. Os resultados de todas as análises apoiam fortemente a identificação como Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum, embora a taxonomia para esta espécie seja atualmente bastante complexa. Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sofreu uma renomeação muito recente para Bacillus velezensis (Dunlap et al, Int. J. System. Evol. Microbiol. 65:2104-2109, 2015; Dunlap et al., Int. J. System. Evol. Microbiol. 66: 1212-1217, 2015). Essas mudanças levaram a uma reclassificação parcial e reorganização no RefSeq, embora os identificadores de sequência nas bases de dados de specI e RDP ainda se refiram ao Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum.

Exemplo 2 Crescimento Individual e Co-Cultura de Micróbios

[00129] Preparação do meio de crescimento: Os meios de crescimento testados foram preparados usando sais e reagentes de prateleira. Os meios líquidos foram esterilizados em autoclave a 121°C, 103,4 kpa (15 psi) durante pelo menos 30 minutos ou por filtração através de membranas de filtro de 0,45 μm.

[00130] Estudo da dinâmica de crescimento de cepas individuais em monoculturas: A taxa de crescimento de cada isolado microbiano biologicamente puro foi analisada. Até 3 mL de culturas líquidas foram preparadas para cada isolado a partir das placas principais. Cada isolado foi cultivado durante 1 a 3 dias a 30°C para obter culturas com densidade suficiente no estado logarítmico. Cada isolado foi então subcultivado em placas de microtitulação de 24 poços contendo 1 mL de meio de crescimento (ver abaixo) a uma densidade óptica (OD600) de ~0,05. Usando o Cytation 5 Imaging Reader (BioTek, Winooski, VT USA), o perfil de crescimento de cada isolado foi registado em tempo real (a cada 30 segundos) durante um período de 1 semana sob condições aeróbicas a 30°C. O meio estéril foi usado como controle negativo. Co-cultura de micróbios em experimentos de fermentação

[00131] Biorreatores de agitação contínua: As fermentações foram feitas em biorreatores de 2 litros DASGIP (Eppendorf North America Hauppauge, NY) com um volume de trabalho de 1,5 litros. Os vasos foram esterilizados em autoclave a 121°C, 103,4 kpa (15 psi) durante uma hora. O meio de crescimento foi esterilizado juntamente com os vasos, exceto o PBS que foi esterilizado separadamente e adicionado assepticamente ao biorreator antes da inoculação. O polipropileno glicol 2000 foi utilizado como agente de controle de espuma. Foi adicionado assepticamente ao biorreator antes da inoculação em uma concentração de 0,07% v/v. Os vasos foram inoculados diretamente a partir de frascos de bancos de células de trabalho descongelados em um volume de inoculo de 0,1-0,4 v/v%. A temperatura de fermentação foi controlada a 30°C. Dependendo da fermentação, a concentração de oxigênio dissolvido era às vezes controlada e às vezes não. Quando controlada, o ponto de ajuste do oxigênio dissolvido estava na faixa de 1-25% de saturação de ar. O controle do oxigênio dissolvido foi efetuado usando uma cascata de agitação, depois fluxo de ar para manter o ponto de ajuste. Quando o controle do oxigênio dissolvido não foi utilizado, a agitação foi fixada em um valor entre 200 e 800 rpm e o fluxo de ar foi fixado em um valor entre 0,1 e 0,5 vvm. Da mesma forma, o pH do caldo de fermentação era às vezes controlado e às vezes não. Quando controlado, o ponto de ajuste de pH estava na faixa de 6,3 a 6,9. Os titulantes de pH foram KOH 20% p/p e H3PO4 13,8% p/p. O pH do caldo de fermentação foi verificado diariamente com um medidor de pH offline para corrigir qualquer desvio na sonda de pH do biorreator.

[00132] Biorreator de frasco rotativo: O inóculo microbiano foi misturado com uma suspensão que contém proteína do soro do leite 5,5% p/p e iogurte em água 1,2% p/p ("Cvat") e uma suspensão que contém espirulina 0,1% p/p e extrato de alga marinha em água 0,1% p/p ("A vat"). As suspensões de A vat e C vat foram individualmente preparadas 3 dias antes da mistura com a cultura de semente e incubadas em temperatura ambiente. A cultura de semente, C vat e A vat foram misturados em uma proporção de cerca de 81:9:9. Após a mistura, uma suspensão de componentes adicionais contendo cerca de 70% v/v de melaço, 0,5% v/v de HYT B, 0,003% p/v de goma arábica e 0,02% p/v de levedura de cerveja (S. cerevisiae) foi misturada com mistura da cultura de sementes, C vat e A vat e água adicional a uma proporção de aproximadamente 16:34:50. A mistura foi fermentada durante cerca de 7 dias em temperatura ambiente (cerca de 19-35°C). Após 7 dias, os frascos (1,7 L) foram arejados durante 30 minutos em dias alternados. Foi adicionada água adicional (cerca de 10% v/v ou mais) e a fermentação foi continuada sob as mesmas condições durante cerca de mais 10 dias. Foi adicionada água adicional (cerca de 4% v/v ou mais) e a fermentação continuou durante mais 7 dias, em cujo momento as amostras foram coletadas para análise.

[00133] Análise de população microbiana - PCR digital em gotícula: O sistema de PCR Digital em gotícula (ddPCR) fornece a detecção e quantificação absoluta da presença de um organismo alvo (Dreo et al., Anal. Bioanal. Chem. 406:6513-6528, 2014; Yin et al., Journal of Microbiological Methods 65: 21-31, 2006). Os iniciadores específicos para as 22 espécies bacterianas identificadas no Exemplo 1 foram concebidos utilizando sequência únicas dos genes de 16S e/ou sequência genéticas codificadoras únicas identificadas a partir de montagens de genoma de WGS (Tabelas 2 e 3). O ddPCR foi realizado usando o EvaGreen Supermix ou o Supermix For Probes (BioRAD, Hercules CA EUA) por recomendação do fabricante de QX200 Droplet Digital PCR System (BioRAD, Hercules CA EUA) e os dados de ddPCR foram analisados no QuantaSoft (BioRAD, Hercules CA USA). Tabela 2. Iniciadores direto e reverso para o método de ddPCR EvaGreen Supermix Tabela 3. Oligonucleotídeos para o método de ddPCR Supermix for Probes

[00134] Meio de desenvolvimento para monoculturas: cada um dos micróbios foi isolado em vários meios. Analisamos se uma formulação de meio era suficiente para o crescimento de todos os 22 isolados.

[00135] O crescimento de todos os 22 isolados foi primeiramente testado apenas no melaço. Foi verificado que 5 das 22 cepas demonstraram crescimento detectável. A formulação do meio foi então otimizada para incluir elementos essenciais tais como fosfatos, sódio, potássio e cloro (na forma de solução salina tamponada com fosfato comercialmente disponível). Isso resultou no crescimento de mais 6 isolados. Fontes de aminoácidos, nitrogênio e peptídeos/proteínas na forma de pó de soro de leite de grau alimentício e extrato de soja não GMO produzido enzimaticamente (Ferti-Nitro Plus Plant N; Ferti- Organic, Brownsville, TX EUA) foram então adicionados. Somente o soro de leite não melhorou significativamente o desempenho de crescimento da maioria dos isolados, com exceção de Bacillus sp. O Ferti-Nitro Plus Plant N sozinho estimulou o crescimento de um grande número de micróbios. Junt0s, a proteína de soro de leite e Ferti-Nitro Plus Plant N pareciam ter um efeito sinérgico modesto, estimulando ainda mais o crescimento de A. pasteurianus, O. oncorhynchi, C. pasteurianum, L. delbrueckii e V. halophilus. Os resultados estão resumidos na Tabela 4. Tabela 4. Avaliação do desempenho do crescimento de micróbios individuais em meio com PBS/melaço black strap (-): nenhum crescimento detectado; (+): crescimento baixo; (++): crescimento moderado; (+++): crescimento robusto. (*) Isolados cultivados sob condições anaeróbicas.

[00136] Em outros experimentos, um meio que apoiaria o crescimento de dois isolados - C. pasteurianum e Azotobacter vinelandii - foi explorado. Além disso, pretendia-se desenvolver um meio que melhorasse o crescimento de alguns isolados como O. oncorhynchi e V. halophilus, L. delbrueckii e L. vini, que não apresentaram crescimento robusto no meio detalhado acima.

[00137] Usando informações sobre condições ideais de crescimento para cada isolado (Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria; Ed., William B. Whitman), os dados acima, informações disponíveis publicamente sobre a composição elementar de bactérias (Rittmann e McCarty; Environmental Biotechnology: Principles and Applications; 2001 ISBN 0072345535), e um meio de crescimento recomendado para Azotobacter (1713 Modified Azotobacter Medium I; ATCC), foram testadas várias formulações de meio para o crescimento dos 22 isolados microbianos em monoculturas. Os resultados estão resumidos na Tabela 5.

[00138] Nestes experimentos, o fosfato de potássio foi testado como uma fonte de fósforo e potássio elementar, juntamente com várias concentrações de cloreto de sódio (para atender à exigência de micróbios halofílicos, como O. oncorhynchi e V. halophilus), assim como a exigência de soro e Ferti-Nitro plus Plant N como fonte de (mas não limitado a) aminoácidos e nitrogênio. Além do melaço, os elementos residuais foram suplementados em uma mistura projetada de sais como descrito abaixo. Tabela 5. Avaliação do desempenho do crescimento de micróbios individuais em meio AAM01/melaço (**) AAM01(meio 01 de Agrinos Azotobacter) é compreendido por Sulato ferroso (0,12 g/L); Sulfato de magnésio (0,3 g/L); Cloreto de cálcio (0,1 g/L); Cloreto de manganês (0,001g/L), Molibdato de sódio (0,001 g/L); Ácido cítrico sulfato de potássio (0,12 g/L). (*) Isolados cultivados sob condições anaeróbicas. (-): nenhum crescimento detectado; (+): crescimento baixo; (++): crescimento moderado; (+++): crescimento robusto.

[00139] Nestes experimentos, Azotobacter vinelandii e C. pasteurianum tiveram um bom desempenho. Muitos outros isolados também cresceram com sucesso, no entanto, ao contrário da formulação anterior (por exemplo, PBS/Melaço), nem todas as cepas cresceram consistentemente em um meio.

[00140] Em outros experimentos, o crescimento de isolados de microrganismos individuais foi avaliado em um meio que incluiu levedura em pó (0,021 g/L; YP), goma arábica (0,028 g/L; AG), melaço black strap, soro de leite em pó (1,56 g/L; WP), espirulina (0,029 g/L, SP), extrato de alga marinha (0,029 g/L; KE) e NaCl 0,8% p/v (já que há evidências de que isolados tais como O. oncorhynchi e V. halophilus crescem presença deste sal). Este meio é referido como meio "Extract" aqui. A composição microbiana foi monitorizada ao longo do tempo usando ddPCR, como descrito acima. Os micróbios detectados foram classificados como (+). Micróbios que estavam abaixo do limite de detecção (BDL) do método ddPCR foram pontuados como tal. O resultado deste experimento está resumido na Tabela 6. Tabela 6. Avaliação do desempenho do crescimento de micróbios individuais no meio Extract * Crescimento sob condições anaeróbicas

[00141] O desempenho da fermentação em biorreatores de pequena escala foi investigado com duas formulações de meios. O primeiro meio consistiu em Melaço, PBS, proteína de soro de leite e Ferti-Nitro Plus Plant N (Tabela 4). Ao contrário dos meios baseados em produtos químicos usados na fermentação em escala laboratorial de Azotobacter (tal como AAM01l), nenhum sal com possíveis preocupações de segurança está presente. Muitas formulações de grau de pesquisa de meios ideais para o crescimento de microrganismos recomendam o uso de resíduos de metais, como selênio e molibdênio (que é um potente cofator de enzimas, especialmente para nitrogenases). O meio Extract (Tabela 6), que consiste em melaço e outros extratos naturais, é muito semelhante aos meios atualmente em uso.

[00142] Co-cultura em experimentos de fermentação em pequena escala: Para avaliar as condições de fermentação que suportariam a co-cultura de todas as 22 cepas microbianas, foram utilizados fermentadores em escala de bancada. O produto de fermentação resultante foi analisado quanto à presença e abundância de cada micróbio, 4 a 28 dias após a inoculação. Dois tipos de configurações de biorreatores de fermentação foram utilizados.

[00143] Reator contínuo com tanque de agitação: A primeira configuração do biorreator era um reator contínuo com tanque de agitação (CSTR). Dois biorreatores DASGIP de dois litros contendo 1,5 L de meio foram inoculados com 22 ODs de micróbios (1 OD para cada cepa individual). O meio utilizado nestas experiências era baseado nos resultados da Tabela 3 e continha os seguintes ingredientes: solução salina tamponada com fosfato (1x), melaço black strap (2 a 10% p/v), proteínas de soro de leite (0,1 a 0,5% p/v), Ferti-Nitro Plus Plant N (0,25 a 1,25% p/v), com ou sem extrato de alga marinha (0,0067%), pó de levedura (0,0033% p/v) e espirulina (0,0067% p v). Nestes experimentos, a composição do gás (O2 5% a 21%; N2 95 a 79%), taxa de fluxo de gás (5 a 45 litros/h padronizado), pH (6,3 a 6,7), agitação (200-1100 rpm), e oxigênio dissolvido (sem controle para 25%) foi variada. A temperatura permaneceu constante em 30°C. A quantificação e a análise da composição microbiana no final das corridas de fermentação foram determinadas usando ddPCR com sondas específicas para a cepa, como descrito acima. Os micróbios detectados foram classificados como (+). Micróbios que estavam abaixo do limite de detecção (BDL) do método ddPCR foram classificados como exemplos de resultados são ilustrados na Tabela 7. Tabela 7. Resumo do perfil microbiano na fermentação em co-cultura usando CSTR 1,5L (*) BDL: Abaixo do limite de detecção

[00144] Em outros experimentos, os micróbios que não foram detectados em experimentos de co-cultura contendo todas as 22 cepas (ver acima) foram testados para determinar se poderiam crescer juntos. Para esse fim, o efeito da sequência de inoculação dos ditos micróbios (todos juntos vs. os anaeróbios vs os aeróbios primeiro) assim como os níveis de oxigênio dissolvido no momento da inoculação e durante a fermentação, bem como a composição do meio foram testados. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados através da variação na transferência de massa gasosa usando taxas de fluxo e/ou agitação. A Tabela 8 resume os resultados para a co-cultura de C. beijerinckii (anaeróbio estrito), S. griseus e B. flexus (aeróbios estritos). Como nos experimentos anteriores, a detecção e avaliação do crescimento microbiano foi realizada por ddPCR. Tabela 8. Resumo do projeto experimental e perfil microbiano em experimentos em co-cultura de C. beijerinckii, S. griseus e B. flexus.

[00145] Biorreator de frasco rotatório: O inóculo contendo todos os 22 micróbios foi diluído em Meio Extract e a fermentação de melaço prosseguiu em frascos rotatórios como descrito acima. A composição microbiana foi monitorizada ao longo do tempo usando ddPCR. Os micróbios detectados foram classificados como (+). Micróbios que estavam abaixo do limite de detecção (BDL) do método ddPCR foram classificados como tal. O resultado do experimento está resumido na Tabela 9. Tabela 9. Resumo do perfil microbiano em experimentos de co-cultura dos 22 micróbios em frascos rotatórios durante um período de 28 dias

[00146] Co-cultura em fermentadores em escala comercial: Com base nos requisitos de bactérias para co-cultura ótima e qualidade final do consórcio microbiano (avaliado por ddPCR), as bactérias aeróbicas e/ou anaeróbicas dos grupos descritos acima foram inoculadas em fermentadores de até 300 litros. A inoculação final OD600 para cada cepa foi calculada como estando entre 6,67E-05 e 6,67E-04. Os meios de fermentação incluíam melaço, proteínas do soro do leite, extrato de alga marinha, pó de levedura, espirulina, goma arábica e cloreto de sódio. Hidróxido de amônia e ácido fosfórico foram utilizados como soluções básica e ácida respectivamente para manter o pH entre pH 5,2 e 7,2. A temperatura foi controlada entre 28°C e 35°C e o oxigênio dissolvido foi mantido entre 0% e 25% durante o período de fermentação (até 3 dias). A composição microbiana média dos produtos de fermentação está resumida na Tabela 10. Composição microbiana média em produtos de fermentação n = 16, anaeróbico; n = 10, aeróbico BDL - abaixo do limite de detecção

[00147] Análise da carga microbiana viável por plaqueamento por disseminação em condições aeróbicas e anaeróbicas. A análise da contagem microbiana foi realizada usando uma metodologia de plaqueamento por disseminação para determinar as unidades formadoras de colônia (CFU) na(s) amostra(s). Todas as amostras foram armazenadas em temperatura ambiente em recipientes a prova de luz e ar. Após a mistura vigorosa da amostra para assegurar que o conteúdo estava uniformemente disperso, 1 mL foi retido. A partir dessa alíquota, 0,1 mL foi coletado assepticamente e misturado com 9,9 mL de água estéril em um tubo de cultura (diluição 10-2). O tubo foi então centrifugado (por exemplo, 60 segundos a 2000 rpm) e diluições em série de 10 vezes preparadas em água (até uma diluição de 1:109). Cem microlitros de cada diluição foram subsequentemente espalhados em meio semissólido em placas de Petri de 100 mm usando um espalhador estéril em forma de L. Foram utilizadas placas contendo meios padronizados industriais, tais como Standard Method Agar (SMA; BD # 247940), Nutrient Agar (NA; BD # 213000). As placas inoculadas foram então incubadas em câmaras de temperatura controlada a 22°C a 35°C. Para a avaliação das contagens de micróbios anaeróbicos, as placas foram primeiramente colocadas em caixas anaeróbicas (por exemplo, BD GasPak™ EZ Container Systems, BD Diagnostics) antes da incubação na(s) temperatura(s) desejada(s). Em alguns casos, a alíquota a ser testada foi primeiro incubada em água peptona estéril durante um período de até 3 dias a temperaturas de 35°C, antes da realização das diluições em série e o plaqueamento como descrito acima. Após a incubação, todas as colônias em placas selecionadas foram contadas usando um contador de colônias, como o Quebec® Dark-Field Colony Counter (Reichert) e CFU/mL foram calculadas. O plaqueamento mostrou até 1,1E + 09 CFU mL sob condições aeróbicas e anaeróbicas.

Exemplo 3 Identificação do Potencial de Atividade Metabólica Microbiana

[00148] Ensaio de tolerância ao sal: Todas as cepas no consórcio microbiano demonstraram um crescimento aceitável em meio de Levedura Peptona Dextrose de grau laboratorial (YPD, Difco 242820). Este meio foi, portanto utilizado para determinar a tolerância ao sal de cada isolado usando quantidades variáveis de cloreto de sódio (um padrão para teste de tolerância ao sal) até 5% p/v. Cada isolado foi cultivado em 2 mL de meio sob condições ideais de crescimento: 30°C com agitação (125-175 rpm) para aeróbios e 35°C sem agitação para anaeróbios em câmaras anaeróbicas (BD diagnostics). Em 24, 48 e 72 horas, o crescimento foi registrado para cada cultura com base na equivalência geral aos padrões de MacFarland (disponível na World Wide Web em pro-lab.com/inserts/McFarland.pdf). Qualquer isolado que mostre crescimento em NaCl 5% em 72 horas foi registado como tendo uma tolerância a NaCl > 5%, crescimento a 2,5% é > 2,5% e assim sucessivamente.

[00149] Ensaio de fixação de nitrogênio (N): Meio semissólido isento de nitrogênio contendo sacarose 5,0 g/L, MgSO4 0,2 g/L; KH2PO4 0,8 g/L; FeSO4 0,04 g/L; Na2MoO4 0,005 g/L, CaCO3 2g/L e 15 g/L de Agar foram preparados e esterilizados em autoclave. De uma placa de cultura master, uma única colônia de cada isolado foi transferida para uma placa sem N assepticamente. Usando o método streaking-out, as colônias foram espalhadas em placas frescas sem N. As condições de crescimento variaram com base no isolado: bactérias anaeróbi- cas/microaerofílicas foram incubadas a 35°C em câmaras anaeróbias, enquanto bactérias aeróbias foram incubadas a 30°C. Os tempos de incubação estenderam-se até 1 semana antes de classificar o crescimento. Apenas fixadores de nitrogênio robustos (por exemplo, crescimento robusto) foram classificados como positivos.

[00150] Ensaio de solubilização do sal de cálcio: Meio semissólido de carbonato de cálcio contendo MgSO4 0,3/L; CaCl2 0,1 g/L; FeSO4 0,12 g/L; K2SO4 1 g/L; Sucrose 20g/L; Na2MoO4 0,01g/L; MnCl2 0,01 g/L; extrato de levedura 5 g/L; peptona 10 g/L; CaCO3 2g/L; ágar 15g/L foi preparado e esterilizado em autoclave. De uma placa de cultura master, uma única colônia de cada isolado foi transferida para uma placa de carbonato, assepticamente. Um único traço foi desenhado no meio da placa. As condições de crescimento variaram com base no isolado: bactérias anaeróbicas/microaerofílicas foram incubadas a 35°C em câmaras anaeróbias, enquanto que as bactérias aeróbias foram incubadas a 30°C. Os tempos de incubação prolongaram-se até 1 semana antes da classificação quanto a presença de uma área de clara adjacente às bactérias. Apenas uma área clara óbvia do precipitado de CaC03 foi classificada como positiva.

[00151] Ensaio de solubilização de sal de fosfato: Meio semissólido de fosfato de cálcio contendo MgSO4 0,3/L; CaCl2 0,1 g/L; FeSO4 0,12 g/L; K2SO4 1 g/L; Sucrose 20g/L; Na2MoO4 0,01g/L; MnCl2 0,01 g/L; extrato de levedura 5 g/L; peptona 10 g/L; Ca3(PO4)2 5g/L; ágar 15g/L foi preparado e esterilizado em autoclave. De uma placa de cultura master, uma única colônia de cada isolado foi transferida para uma placa de carbonato, assepticamente. Um único traço foi desenhado no meio da placa. As condições de crescimento variaram com base no isolado: bactérias anaeróbicas/microaerofílicas foram incubadas a 35°C em câmaras anaeróbicas, enquanto bactérias aeróbicas foram incubadas a 30°C. Os tempos de incubação prolongaram-se até 1 semana antes de marcarem a presença de uma área clara adjacente à bactéria. Apenas uma área clara óbvia do precipitado de fosfato de cálcio foi classificada como positiva.

[00152] Ensaio de solubilização do sal de zinco: Para testar as cepas quanto à capacidade de solubilizar o zinco, foram utilizados quatro tipos de zinco no ensaio: Zn5(CO3)2(OH)6 (hidróxido de carbonato de zinco), Zn3(PO4)2 (fosfato de zinco), ZnO (óxido de zinco) e ZnSO4 (sulfato de zinco). Cada tipo de zinco foi então adicionado a 0,2% (p/v) em meios Brain-Heart Infusion (BHI) ou ágar YPD. Para cada cepa, uma única colônia foi então selecionada e espalhada em ambos os meios semissólidos em placas de Petri. Os aeróbicos foram incubados a 30°C e os anaeróbicos foram incubados a 35°C em uma incubadora estática durante 3 dias. As placas foram verificadas após 24, 48 e 72 horas quanto a sinais áreas claras no meio, o que é interpretado como um indicador positivo de solubilização de zinco.

[00153] Análise de mobilização do ferro: Vários micróbios do solo produzem os chamados sideróforos em ambientes com baixas concentrações de ferro - um micronutriente essencial. Esses compostos formam complexos solúveis em água com Fe3+, que podem ser liberados em situações de deficiência de ferro. Ambos os sideróforos de bactérias beneficiam as plantas e os micróbios como fonte localizada de ferro. A análise das sequências do genoma completo para cada um dos 22 isolados foi realizada com foco na detecção de genes codificadores dos sideróforos, vias de biossíntese de sideróforos, assim como receptores e transportadores de sideróforos como Yus, Yfh, Yfi, Asb, Fur, TonB. , ExbB, ExbD, Citrato, Desferrioxamina, Deferoxamina, Ferricromo, Fusarinina, Ornibactina, Crisobactina, Vibriobactina, Micobactina, Pioverdina, Pioquelina, Yersiniabactina, Enterobactina, Acromobactina, Acinetobactina, Azotobactin, Bacilibactina e Anguibactina. Isso permitiu determinar se um dado micróbio possuía ou não o arsenal metabólico para produzir e/ou transportar compostos mobilizadores de ferro.

[00154] Análise do potencial de defosforilação da matéria orgânica microbiana: As bactérias podem libertar uma gama de enzimas microbianas que, através da sua ação sobre a matéria orgânica, podem produzir formas de fosfato acessíveis pelas plantas. Essas enzimas incluem fosfatases não específicas que defosforilam ligações fosfoéster e/ou fosfoanidrido na matéria orgânica, fitases que liberam fósforo do ácido fítico e fosfonatonas e C-P liases que dissociam as ligações C-P nos organofosfonatos. A análise da sequência do genoma completo para cada um dos 22 isolados foi realizada com foco na detecção de genes que codificam essas enzimas em vias metabólicas funcionais. Isso permitiu determinar se um dado micróbio possuía ou não o arsenal enzimático para realizar a defosforilação da matéria orgânica no solo.

[00155] Ensaio de quitinase: Foram realizados ensaios de placa de quitina coloidal essencialmente como descrito por Hsu e Lockwood (Applied Microbiology, 29: 422-426, 1975). Colônias de bactérias (1-3 dias de idade) coletadas de placas-master foram semeadas em placas de quitina coloidal (quitina semi-seca, 5g/L; K2HPO4, 0,7 g/L; KH2PO4, 0,3 g/L; MgSO4.5H2O, 0,5 g/L; FeSO4.7H2O, 0,01 g/L; ZnSO4, 0,001 g/L; MnCl2, 0,001 g/L e agar 15 g/L). As placas foram incubadas por até 1 semana a 30°C para aeróbicos ou a 35°C sob condições anaeróbicas para anaeróbicos. Os isolados positivos para quitinase foram identificados por uma área clara no meio e/ou crescimento microbiano significativo.

[00156] Ensaio de celulase: O ensaio de placa de desoximetilcelulose foi adaptado de Alves et al. (The Open Microbiology Journal, 8: 25-31, 2014). Em resumo, colônias de bactérias (1-3 dias de idade) coletadas de placas-master foram semeadas em meio semissólido (Desoximetilcelulose, 0,5% p/v; agarose 1,5% p/v; Tris-HCl, 50 mM pH 6,8; CaCl2 1 mM). Os isolados de bactéria foram subsequentemente incubados a 30°C para aeróbicos, 35°C sob condições anaeróbicas para anaeróbicos por até 1 semana. Cada placa foi subsequentemente tratada com uma solução de Vermelho do Congo (0,25% p/v em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0) e descorada com NaCl a 0,5% p/v em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. Isolados positivos para celulase foram identificados pela área clara no meio e/ou crescimento microbiano significativo.

[00157] Ensaio de produção de ácido indol-3-acético (IAA): O ensaio de IAA foi realizado em cada isolado microbiano crescido em meio líquido suplementado com 1-5 mg/mL de triptofano. Sete a catorze dias após a inoculação, as culturas foram testadas quanto a produção de IAA utilizando o reagente de Salkowski como descrito em Glickmann et al. (Applied and Environmental Microbiology, fev. 1995, p 793-796). Resumidamente, o meio usado clarificado de cada cultura foi misturado com o reagente de Salkwoski na proporção de 1:1. Após 30 min de incubação, mediu-se a absorbância a 540 nm. A avaliação da produção de IAA foi conduzida usando uma curva padrão previamente preparada usando IAA purificado (Alfa-Aesar, Tewksbury, MA EUA). Além disso, a análise da sequência do genoma completo para cada um dos 22 isolados foi realizada com foco na detecção das vias de biossíntese de auxina.

[00158] Outros ensaios metabólicos: Para atividades metabólicas adicionais, incluindo ensaios de desnitrificação, produção de urease e assimilação do ácido málico, os produtos de identificação API® da bioMerieux foram utilizados de acordo com as recomendações do fabricante (bioMerieux, Inc., Durham, NC USA).

[00159] Os resultados do perfil da atividade metabólica chave são mostrados na Tabela 11. Tabela 11: Atividades metabólicas de isolados microbianos

Exemplo 4. Avaliação da atividade promotora do crescimento de plantas

[00160] Sementes de pepino compradas do The Seed Kingdom foram pré-germinadas durante 4 dias a 22-24°C em uma câmara de crescimento com temperatura e umidade controladas (Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR). A pré-germinação foi realizada em papel de germinação enrolado (Anchor Paper, Saint Paul, MN) impregnado com uma mistura diluída de fertilizante líquido (50 ppm de 20-20-20 NPK (Grow More, Gardena, CA) em água) e consórcio microbiano Agrinos (AMC) variando de 1:1.000 a 1:2.000. O produto AMC é o produto líquido obtido do co-cultivo dos 22 micróbios listados na Tabela 10 usando a co-cultura de escala comercial descrita no Exemplo 2.

[00161] As plântulas estagiadas e sincronizadas foram então transplantadas para um meio de crescimento em solo de envasamento (Sunshine Mix) pré-tratado com fertilizante e micróbios. O pré- tratamento do solo de envasamento consistia em misturas diluídas de fertilizante líquido (50 ppm de NPK) e produto AMC variando entre 1:1000 a 1:2000. Para cada tratamento, 17 a 18 plantas foram usadas. Os potes foram distribuídos aleatoriamente em andares em condições definidas de crescimento: 16 a 24°C e 12 horas de fotoperíodo. Os andares foram regados 2 a 3 vezes por semana com 50 ppm de NPK. Após 33 dias, o Índice de Área Foliar (LAI) da folha verdadeira terminal de cada planta foi medido (Figura 2). Os dados foram analisados por One-way ANOVA (Análise de Variância) para comparar amostras dentro do experimento.

Exemplo 5 Avaliação da Atividade nas Culturas

[00162] Este Exemplo descreve métodos particulares para avaliar a atividade das composições descritas em culturas tais como milho, tomate e repolho. Contudo, aquele versado na técnica apreciará que os métodos que se desviam destes métodos específicos podem também ser utilizados para avaliar a atividade das composições.

[00163] Ensaio com milho (câmara de crescimento): Sementes de milho (Alberta Lea Seeds, Albert Lea, MN) foram mergulhadas em água por 4 horas em temperatura ambiente antes do plantio em solo de envasamento ou meio de crescimento sem solo (Sunshine Mix) pré- tratado com fertilizante e o produto AMC como se segue: Solução de Hoagland modificada (P, 30,97 ppm; K, 39,1 ppm; Ca, 40,0 ppm; Mg, 14,59 ppm; S, 20,143 ppm; Fe, 1,010 ppm; Cu, 0,019 ppm; Co, 0,012 ppm; 2,44 ppm, Mn, 0,494 ppm, Mo, 0,001 ppm e Zn, 0,056 ppm) e diluição 1:1.000 do produto AMC. No plantio de sementes, foram adicionados ao solo 100 mg de formulação de Ureia de liberação lenta. Bandejas com 8 a 9 potes foram incubadas no escuro por 3 dias a 25°C em câmara de crescimento com temperatura e umidade controladas (Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR). As plantas foram então cultivadas por 13 a 16 dias em condições de crescimento: 16-24°C e 12 horas de fotoperíodo. A rega foi realizada 2 a 3 vezes por semana com solução de Hoagland modificada. Os pesos secos da parte aérea foram subsequentemente determinados após 4 dias de secagem a 75°C (Figura 3). Os dados foram analisados por One-way ANOVA (Análise de Variância).

[00164] Ensaios de campo com tomate: A variedade de tomate Sun 6366 foi transplantada para lotes estratificados de 6 m x 1,8 m com água adicional no transplante. O campo foi fertilizado antes do transplante com 201 kg de N/ha e 224 kg de P2O5 e K2O/ha. Duas aplicações separadas de AMC foram aplicadas aos tomates em cada lote. A primeira aplicação ocorreu após o transplante para o campo. AMC foi aplicado através de irrigação por gotejamento (TTAPE, espaçamento de 20 cm entre os emissores) a uma taxa de 2,5 L/ha (1 L/acre). A segunda aplicação de AMC foi diretamente injetada e aplicada 36 dias após o transplante, juntamente com o fertilizante de N na forma de UAN 28, na proporção de 93,9 L/ha (38 L/acre). Os lotes de controle foram tratados exatamente da mesma forma que os experimentais, exceto que nenhum AMC foi usado durante o processo de cultivo.

[00165] Estandes de tomate foram manipulados para ter populações de plantas iguais. Os tomates foram colhidos à mão 2 meses após a última aplicação de AMC. Um total de 6 plantas foram colhidas de uma área de 3,35 m2 no centro do lote. O rendimento e qualidade do tomate (Verde versus Vermelho) foram registrados. Os pesos foram registrados e analisados usando o XCELSTAT2016.4 (Addinsoft Inc. ) (Figura 4).

[00166] Ensaios de campo com milho: A variedade de milho Mycogen 2H723 (Mycogen Seeds, Indianapolis, IN) foi plantada em uma configuração de 4 fileiras com 75 cm entre fileiras e fileiras com 6,1 m de comprimento. O campo foi fertilizado antes do transplante com 201 kg de N/ha e 224 kg de P2O5 e K2O/ha. Duas aplicações divididas de AMC foram aplicadas em cada lote. A primeira aplicação ocorreu após o plantio do campo. O AMC foi aplicado com pulverizador costal em uma taxa de 2,5 L/ha (1 L/acre) e a água foi aplicada no solo por irrigação por gotejamento (TTape, emissores de 20 cm). A irrigação com água foi restrita a 75% dos níveis normais neste estudo. Restrições hídricas foram impostas por cinco semanas, levando à plena floração. A segunda aplicação de AMC foi diretamente injetada e aplicada 35 dias após o plantio. Os lotes de controle de milho receberam fertilização com N adicional no momento da injeção na forma de UAN 28, em uma taxa de 93,9 L/ha (38 L/acre) = 33 kg de N/ha para um total de 234 kg de N/ha ao longo do estudo. Os lotes de AMC não receberam N adicional e terminaram com 201 kg N/ha. O pH do solo é alto na área do campo com médias de 8,1.

[00167] Estandes de milho foram desbastados para uma população de plantas de 34.000 plantas para garantir populações de plantas iguais. O milho foi colhido por uma colheitadeira de milho 5 meses após o plantio. Apenas as 2 fileiras centrais foram colhidas dos lotes de 4 fileiras, representando 9,3 m2 de área no centro do lote, o que proporcionou muitas plantas fronteiriças em volta da área colhida. O grão de milho foi seco até 15% de umidade durante vários dias de pesagem. Os pesos dos grãos foram registados e analisados usando XCELSTAT2016.4 (Addinsoft Inc) (Figura 5).

[00168] Ensaios com repolho em campo: A variedade de repolho Golden Acres foi plantada como semente em lotes estratificados de 4 fileiras de 3,6 metros de comprimento por 3,3 metros de largura (12 pés de comprimento por 11 pés de largura). O campo foi fertilizado antes do plantio com 187 L/ha (20 galões/acre) de 25-7-0-3 S em uma fileira dupla com 40,6 centímetros (16 polegadas) de distância do centro do lote. Adubo adicional foi aplicado como uma aplicação lateral usando UAN (32% de N) a 93,5 L/ha (10 galões/acre), resultando em uma taxa de 40,8 kg (90 lbs) de N, 6,8 kg (15 lbs) de P, 0 kg (0 lbs) 6 de K e 2,7 kg (6 lbs) de S/acre. O produto AMC foi aplicado em uma taxa de 2,5 L/ha (1 L/acre) no sulco no plantio e, no caso do tratamento 2, uma segunda aplicação de AMC (taxa de 2,5 L/ha - 1 L/acre) foi aplicada 42 dias após o plantio. O campo foi irrigado 4 vezes com uma faixa de irrigação de 3,9 a 5,6 metros por hectare (6,3 a 8,9 polegadas por acre) de água/irrigação por um total de 18,6 metros por hectare (29,7 polegadas por acre). A precipitação de chuva forneceu um adicional de 0,27 metros (10,7 polegadas) durante a vida da cultura. A cultura foi pulverizada com uma variedade de inseticidas, herbicidas e fungicidas para proteger os repolhos dos estresses bióticos. O pH do solo era de 8,0.

[00169] Os repolhos possuíam populações iguais e foram colhidos uma vez com 95 dias após a semeadura. Todas as plantas no meio de 2 fileiras do lote foram colhidas a partir de um lote de colheita efetiva de 220 ft2. As cabeças foram classificadas em categorias de tamanho 24 e 18 e pesadas. Pesos graduados e pesos totais foram analisados usando XCELSTAT2016.4 (Addinsoft Inc. ) (Figura 6).

Exemplo 6 Ensaios de raiz

[00170] Sementes de produtos agrícolas tais como, mas não limitadas a milho e tomate são pré-germinadas por 3 dias de 22 a 24°C em câmara de crescimento com temperatura e umidade controladas (Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR). A pré-germinação é realizada em papel germinação enrolado (Anchor Paper, Saint Paul, MN) impregnado com uma mistura diluída de fertilizante líquido (25-100 ppm de 20-20-20 NPK (Grow More, Gardena, CA) em água) e o produto AMC variando de 1:1000 a 1:5000. Plântulas estagiadas e sincronizadas são transplantadas em meio sem solo pré-tratado, tal como areia, lã de rocha, vermiculita ou outras matrizes inertes. O pré-tratamento do meio de crescimento consiste em misturas diluídas de solução nutritiva hidropônica, como Solução Nutritiva Completa de Hoagland (Hoaglund e Arnon, The Water-Culture Method for Growing Plants Without Soil, 1938) e o produto AMC variando de 1:1000 a 1:5000. Pelo menos 12 plantas de cada tratamento, incluindo plantas de controle, são distribuídas aleatoriamente em bandejas de suporte. As plantas são cultivadas em condições padronizadas de estufa por até 45 dias. A anatomia e a morfologia das raízes são analisadas após a conclusão dos experimentos.

Exemplo 7 Viabilidade de micróbios liofilizados

[00171] Liofilização: Micróbios individualmente cultivados ou co- cultivados em meios ótimos (Tabela 12) foram submetidos à liofilização para avaliar a viabilidade. Resumidamente, para monoculturas, os micróbios foram cultivados a 30-35°C sob agitação constante (200 rpm) em uma incubadora com temperatura controlada em volumes de cultura de 5 mL durante 24 horas, sob condições anaeróbicas ou aeróbicas. Para experimentos de co-cultura, os microrganismos foram cultivados em biorreatores de 2 L DASGIP (Eppendorf North America Hauppauge, NY) utilizando meio que contém melaço 2% p/v, soro de leite em pó 0,1% p/v, 0,25% p/v de Ferti-Nitro Plus Plant N (Ferti-Organic, Brownsville, TX EUA), 0-4% p/v de NaCl, KCl 0,02%, Na2HPO4 0,125% p/v e 0,02% de KH2PO4; pH 5,7-7,0 a 30-35°C. Grupos anaeróbicos foram cultivados na ausência de oxigênio.

[00172] A densidade óptica foi determinada para cada cultura a 600 nm. Cada cultura foi posteriormente misturada com solução manitol/ lioprotetor (OPS Diagnostics Lebanon, NJ, EUA) conforme recomendação do fabricante e a suspensão microbiana foi aliquotada em frascos de liofilização (OPS Diagnostics, Lebanon, NJ, EUA) que foram preenchidos até 1/3 a 1/5 do volume e, em seguida, equipados com uma rolha dividida. Após 60 minutos a -80°C, os frascos foram colocados no sistema de liofilização FreeZone 6 (Labconco, Kansas City, MO), vácuo foi aplicado, e a água nas amostras foi deixada sublimar durante a noite (0,04 mBa, -50°C). Após a liofilização, as rolhas divididas foram colocadas nos frascos e foram ainda fixadas com uma banda de alumínio cravada no lugar. As amostras foram armazenadas a 4°C até serem necessárias. Tabela 12. Meios usados para o crescimento de micróbios individuais YPD: levedura peptona dextrose (BD #242720), YPDS: YPD + 8 g/L NaCl, RCM: meio de clostridium reforçado (BD#218081), BHI: Brain Heart Infusion Broth (HiMedia, # LQ077), BHIS: BHI + 45 g/L NaCl, RhX: Meio ATCC: 111 Rhizobium X Medium, MRS: Lactobacilli MRS (BD# 288210); M-HYTA: Melaço, proteínas do soro do leite, extrato de algas, pó de levedura, espirulina e NaCl

[00173] Para avaliar a viabilidade, cada cultura liofilizada foi reidratada e o potencial de crescimento determinado. Meio fresco foi inoculado com cultura reidratada a uma DO600 de 0,1. O crescimento foi monitorado durante um período de 3 dias. Como controle, foram utilizadas culturas não-liofilizadas. Os resultados estão resumidos na Tabela 13. Tabela 13. Crescimento microbiano depois da liofilização e reidratação a(+) indica crescimento após a liofilização. * Cultivado anaerobicamente.

[00174] Tendo em vista as muitas modalidades possíveis às quais os princípios da descrição podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos e não devem ser consideradas como limitantes do escopo da invenção. Pelo contrário, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações a seguir. Nós, portanto, reivindicamos como nossa invenção tudo o que está dentro do escopo e do espírito dessas reivindicações.

Claims (16)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende células de espécies microbianas que incluem ou consistem em cada um de Lactobacillus delbrueckii, Virgibacillus halophilus, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum, Paenibacillus chibensis, Streptomyces griseus, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Bacillus sp., Bacillus amyloliquefaciens, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Bacillus licheniformis, Lactobacillus vini, Paenibacillus cookii, Bacillus subtilis, Lactobacillus buchneri, Bacillus megaterium, Acetobacter pasteurianus, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus casei/paracasei, e Bacillus flexus.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as espécies microbianas incluem ou consistem em micróbios com sequências de 16S rDNA compreendendo cada uma das SEQ ID NOs: 3 a 24.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os micróbios compreendem os números de depósito da American Type Culture Collection PTA-123288 e PTA- 123289.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda células de um ou mais de Desulfosporosinus meridiei, Nitrosopumilus sp., Marinobacter bryozoorum, Leptospirillum ferrodiazotrophum, e Lactobacillus acidophilus.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais de quitina, quitosana, glicosamina, aminoácidos e fertilizante líquido.

6. Método, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com um ou mais de quitina, quitosana, glicosamina e aminoácidos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com um ou mais de HYT B, HYT C e HYT D.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com um fertilizante líquido.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar o solo, plantas, partes de plantas ou sementes com um ou mais fungicidas, um ou mais herbicidas, um ou mais inseticidas, um ou mais hormônios de planta, um ou mais elicitadores de plantas, ou combinações de dois ou mais destes.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ativar a espécie microbiana na composição antes do contato do solo, plantas, partes de plantas ou sementes com a composição.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o solo com a composição para produzir solo tratado e cultivar sementes, plântulas ou plantas no solo tratado.

13. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: misturar uma fonte biológica que contenha quitina com a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para formar uma mistura; fermentar a mistura; e separar a mistura fermentada nas frações sólida, aquosa e lipídica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fonte biológica que contém quitina compreende um animal marinho ou subproduto de animal marinho, um inseto ou um fungo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o animal marinho é um artrópode marinho.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado o artrópode marinho é o camarão, caranguejo ou krill.