BR112015015767B1 - Uso de consórcio de micro-organismos, método para reduzir amônia e/ou metano em esterco ou solo e uso de esterco como fertilizante - Google Patents

Uso de consórcio de micro-organismos, método para reduzir amônia e/ou metano em esterco ou solo e uso de esterco como fertilizante Download PDF

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Abstract

BACTÉRIAS E CONSÓRCIOS PARA A REDUÇÃO DE EMISSÃO DE AMÔNIA E/OU METANO EM ESTERCO OU NO SOLO. A presente invenção refere-se a uma nova bactéria contendo uma sequência parcial de ácido nucleico 16S rDNA tendo mais de 85% de identidade de sequência com a sequência apresentada como SEQ ID NO:1, ou seu complemento e a um consórcio de microorganismos para melhorar esterco ou solo.

Description

[001] A presente invenção refere-se a novas bactérias, a um con sórcio contendo estas bactérias e ao uso do consórcio para redução de emissão de amônia e/ou metano em esterco.
[002] Esterco é matéria orgânica e pode ser usado como fertilizante orgânico em agricultura. Esterco contribui para a fertilidade do solo, por adição de matéria orgânica e nutrientes, como nitrogênio, que são aprisionados pelas bactérias no solo. Esterco contém nitrogênio (N) nas formas inorgânica e orgânica. N orgânico não é disponível para crescimento de culturas até que seja mineralizado em amônio (NH4+). N de amônio é altamente construtor e disponível para absorção por planta, mas uma parte é imobilizada por biomassa microbiana, e bactérias nitrificantes convertem NH4+ em nitrato (NO3-), que é sujeito à perda por lixiviação ou desnitrificação, e subsequente perda para a atmosfera. Amônia volátil (NH3) no esterco é transformada a partir de NH4+ e pode ser perdida para a atmosfera após aplicação à terra. Nitrogênio perdido para a atmosfera não é disponível para produção de cultura. Além disso, emissão de amônia (NH3) da produção pecuária causa efeitos ambientais indesejáveis. Além do efeito indesejável de NH3, esterco também inclui metano (CH4). Metano é um gás do efeito estufa e é de conhecimento geral que a emissão de CH2 na atmosfera deve ser reduzida.
[003] Existe assim a necessidade de um produto que possa ser adicionado ao esterco para melhorar a qualidade do mesmo fornecendo um montante crescente de nutrientes, como nitrogênio, disponível para culturas.
[004] Existe necessidade de um produto que possa ser adiciona do ao esterco para fornecer uma qualidade fertilizante melhor para as plantas cultivadas.
[005] Além disso, existe a necessidade de um produto que possa ser adicionado ao esterco para ajudar a reduzir a emissão de amônia e/ou metano no esterco ou no solo.
[006] É um objetivo desta invenção, entre outros, prover um con sórcio de micro-organismos que possa ser adicionado ao esterco, para melhorar a qualidade do mesmo.
[007] Também é outro objetivo desta invenção prover um consór cio de micro-organismos que possa processar o esterco de modo que a emissão de amônia e/ou metano seja reduzida.
[008] Ainda é outro objetivo desta invenção prover um consórcio de micro-organismos que pode ser usado para melhorar o esterco de modo que a disponibilidade de nitrogênio para plantas aumenta.
[009] Também é um objetivo desta invenção prover um consórcio de micro-organismos que possa ser adicionado ao solo, para melhorar a fertilidade do solo.
[0010] É outro objetivo desta invenção, prover uma bactéria que faz parte do consórcio que pode fazer com que os objetivos acima sejam atingidos.
[0011] Este objetivo, entre outros, é atingido, pelo menos parcial mente, se não completamente, pelas bactérias ou consórcio reivindicados no anexo.
[0012] Especialmente, este objetivo é atingido pelo menos parci almente, se não completamente, por uma bactéria contendo uma sequência parcial de ácido nucleico 16S rDNA tendo mais de 85% de identidade de sequência com as sequências apresentadas como SEQ ID NO:1, ou seu complemento. O inventor surpreendentemente descobriu uma nova bactéria que está presente em um consórcio. A bactéria do consórcio e o consórcio proporcionam uma qualidade melhorada ao esterco de maneira que menos amônia e/ou metano são emi- tidos do esterco, em comparação com esterco onde este consórcio não é adicionado.
[0013] O 16S rDNA parcial pode ser encontrado usando o método de sequenciamento de 16S rDNA descrito em Hall, L., Doerr, K.A., Wohlfiel, S.L., Roberts, G.D., 2003. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory (Avaliação do Sistema MicroSeq para identificação de micobactérias por sequenciamento de DNA ribossômico 16S e sua integração em uma rotina clínica de laboratório de micobacteriologia), J. Clinic. Microbiol. 4, 1447-1453, cuja referência é aqui incorporada em sua totalidade. O PCR foi realizado em suspensão bacteriana com os seguintes iniciadores de reação (primers) (sequências na direção 5' a 3') 16S500F (tggagagtttgatcctggctcag) e 16S500R (taccgcggctgctggcac).
[0014] Identidade de sequência, neste contexto, é definida como o número de nucleotídeos, ou aminoácidos, alinhados, idênticos, consecutivos, ao longo do comprimento total das referidas sequências dividido pelo número de nucleotídeos, ou aminoácidos do comprimento total das sequências e multiplicado por 100%. Por exemplo, uma sequência com 80% de identidade com a SEQ ID No. 1 inclui ao longo do comprimento total de 550 aminoácidos da SEQ ID No. 1 440 aminoácidos idênticos, alinhados, consecutivos, isto é, 440/550 * 100% = 80%.
[0015] A invenção refere-se a uma bactéria recém-descoberta. Uma árvore filogenética foi medida usando o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means) (Método de Agrupamento por Pares não Ponderado, com o uso de Médias Aritméticas) fornecido pelo programa Bionumerics (da Applied Maths) medindo os tamanhos de base de ribotipos por PCT. Foi verificado que a bactéria que tem uma sequência de 16S rDNA incluindo a SEQ ID NO:1 pertence ao gênero Bacteroidetes. Em uma modalidade, a in- venção se refere a uma bactéria em que a bactéria é uma bacteroide- tes sp.
[0016] Em outra modalidade a invenção se refere a uma bactéria depositada no CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Centro de Biodiversidade Fúngica) em 27 de dezembro de 2012 de acordo com o Tratado de Budapeste), com o número de depósito CBS 134116, em que CBS 134116 é uma bacteroidetes.
[0017] Em ainda outra modalidade, a bactéria tem uma identidade de sequência que é pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % igual à the sequência apresentada como SEQ ID NO:1. Em uma modalidade preferida, a bactéria tem uma identidade de sequência que é pelo menos 99,7, 99,8, 99,9, 100% igual à sequência apresentada como SEQ ID NO:1.
[0018] Em um aspecto, a invenção se refere a um consórcio con tendo uma bactéria como descrita acima. O consórcio pode incluir adi-cionalmente levedura do gênero Candida, preferivelmente Candida boidinii C. Ramírez e/ou Candida ethanolica Rybárová, Stros & Kocko- vá-Kratochvílová, e/ ou pode incluir adicionalmente as bactérias Lactobacillus rhamnosus/casei, Acetobacter pasteurianus/lovaiensus e/ ou Rhodococcus facians/yunnanensis.
[0019] O consórcio pode incluir adicionalmente outras bactérias de ácido láctico e outras bactérias de ácido acético.
[0020] Em uma modalidade, o consórcio inclui uma ou mais bacté rias selecionadas no grupo que consiste de Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus paracasei, Bacillus subtilis sensu stricto, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atro- phaeus, Bacillus vallismorits, Bacillus mojavensis, Bacillus tequilensis, Bacillus siamensis, e Bacillus methylotrophicus. Em uma modalidade preferida, o consórcio inclui todas estas bactérias.
[0021] Em uma modalidade, o consórcio melhora o esterco e re- duz a emissão de amônia e/ou metano em comparação com esterco onde nenhum consórcio de acordo com esta invenção é adicionado. Por esterco entendem-se excrementos de animais, podendo estes estar em um estado semilíquido, como lama.
[0022] Em uma modalidade, o consórcio melhora o solo e reduz a emissão de amônia e/ou metano em comparação com solo onde nenhum consórcio de acordo com esta invenção é adicionado. Por solo entende-se a camada fina de cobertura solta de partículas minerais que recobre a superfície da terra, tais como a camada de terra que recobre as terras agrícolas onde as lavouras são cultivadas.
[0023] Em outra modalidade, a invenção se refere a um consórcio depositado no CBS (Centraal Bureau for Schimmelcultures (Centro de Biodiversidade Fúngica)), com o número de depósito CBS134115.
[0024] Em outra modalidade, o consórcio de acordo com a inven ção inclui adicionalmente um sacarídeo, preferivelmente um monossa- carídeo e/ou dissacarídeo. Considera-se que o sacarídeo proporciona um ambiente para as bactérias e levedura no consórcio, que provê uma composição de bactérias e leveduras com uma relação tal que a produção de amônia e/ou metano no esterco decresce. Considera-se que o consórcio provê um ambiente no esterco, que não é favorável para as bactérias produtoras de amônia.
[0025] Em ainda outra modalidade, o sacarídeo é derivado de uma fonte de cana ou beterraba e é preferivelmente um melaço de cana.
[0026] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de SEQ ID NO:1 para detector ou identificar uma bactéria tendo a sequência de ácido nucleico ou pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1.
[0027] Em outro aspecto, a invenção se refere a um consórcio de micro-organismos que inclui micro-organismos que proporcionam redução da emissão de amônia e/ou metano (NH3) no esterco, como po- de ser verificado no consórcio depositado no CBS com o número de depósito CBS 134115.
[0028] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma bacté ria de acordo com a invenção ou um consórcio de acordo com a invenção, para a redução de nitrogênio no esterco. O uso pode ser realizado, por exemplo, pulverizando uma solução contendo a bactéria ou o consórcio de acordo com a invenção no esterco. Isto pode ser realizado, por exemplo, usando um método e produto descritos no pedido de patente NL 2009019 do qual a referência é aqui incorporada em sua totalidade.
[0029] O esterco é, preferivelmente, esterco animal, proveniente de, por exemplo, porcos, vacas, aves domésticas ou cavalos.
[0030] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma bac téria de acordo com a invenção ou de um consórcio de acordo com a invenção, para a redução de nitrogênio no solo. O uso pode ser realizado, por exemplo, pulverizando uma solução contendo a bactéria ou o consórcio de acordo com a invenção no solo.
[0031] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para reduzir a emissão de amônia e/ou metano no esterco compreendendo adicionar as bactérias ou o consórcio de acordo com a invenção ao esterco e incubar as referidas bactérias ou consórcio por um tempo suficiente permitindo reduzir a formação de amônia e/ou metano no esterco.
[0032] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para reduzir a emissão de amônia e/ou metano no solo compreendendo adicionar as bactérias ou o consórcio de acordo com a invenção ao solo e incubar as referidas bactérias ou consórcio por um tempo suficiente para reduzir a formação de amônia e/ou metano no solo.
[0033] Outro aspecto de acordo com a invenção é o uso de ester co de acordo com a invenção como um fertilizante orgânico.
[0034] O consórcio ou as bactérias do consórcio de acordo com a invenção contribuem para uma emissão reduzida de amônia. Considera-se que mais nitrogênio está em uma fase que pode ser usada por plantas, como plantas de cultivo. É surpreendentemente verificado que o consórcio e as bactérias de acordo com a invenção podem ser usados para melhorar o esterco ou solo e que além de ser obtida redução de amônia, também as propriedades fertilizantes do esterco ou solo de acordo com a invenção são melhoradas.
[0035] As vantagens e modalidades descritas para vários aspectos da invenção podem ser válidas para os outros aspectos de acordo com a invenção.
[0036] A presente invenção será adicionalmente descrita em deta lhes no seguinte exemplo de modalidades preferidas da invenção.
Figura 1
[0037] Dendrogramas de análises de agrupamentos baseadas em similaridades de pares do novo filo de bactérias Bacteroidetes (figura 1A) (CBS 134116). Os números acima mostram o montante de similaridade medido por método de agrupamento baseado em similaridade (similarity-based clustering) usando o método de agrupamento por pares não ponderado (Unweighted pair-grouping (UPGMA))
Exemplo 1 Teste de emissão de amônia em esterco de uma fazenda de suínos
[0038] Em duas edificações de criação de suínos foi realizada me dições de emissão de amônia. Em uma edificação, foi utilizado o dispositivo descrito no pedido de patente NL2009019 para tratar os dejetos semilíquidos (lama) proveniente dos suínos. O consórcio depositado no CBS com o no. CBS 134115, foi pulverizado na lama excretada pelos suínos na edificação 1. A edificação 2 incluiu lama que não foi tratada com o consórcio.
[0039] Em cada edificação foram mantidos 80 suínos 80 e a medi ção foi realizada ao longo de um período de 12 semanas. Todo dia a composição contendo o consórcio foi pulverizada na edificação 1 durante 12 semanas. Emissão de NH3 foi medida durante 24 horas usando a norma NEN 2826 (NEN 2826, 1999: Luchtkwaliteit. Uitworp door stationaire puntbronnen. Monsterneming en bepaling van het gehalte aan gasvormig ammoniak (Qualidade do ar. Descarga a partir de fontes pontuais fixas. Amostragem e determinação de amoníaco gasoso)) colhendo amostras usando uma garrafa de lavagem de gases contendo um líquido de absorção. As medições de amônia foram realizadas com um método de absorção e análise química a úmido.
[0040] As amostras foram colhidas durante vários ciclos de sema nas dos suínos e durante vários meses do ano.
[0041] A Tabela 1 mostra os resultados da emissão de amônia. O esterco que foi tratado com o consórcio depositado no CBS com o no. CBS 134115 mostrou uma redução média de 35% na emissão de amô- nia do esterco em comparação com o esterco da construção 2. As medições foram feitas em várias estações (verão, inverno e outono) e também em diferentes estágios de crescimento dos suínos (12semanas no total, e cada período de duas semanas conta como 1 estágio).
[0042] Na configuração da medição, a quantidade de animais, as idades e o peso dos animais foram similares nas duas edificações de criação dos animais. Tabela 1
Figure img0001
Exemplo 2 Teste de emissão de metano em esterco para uma fazenda de suínos
[0043] Um procedimento (setup) semelhante ao do exemplo 1 foi realizado. O metano foi medido colhendo uma amostra e usando o método pulmão de acordo com a norma NEN-EN, durante 24h.
[0044] Houve uma redução média de metano de 19% encontrada em duas fazendas diferentes.
[0045] A Tabela 2 mostra os resultados em uma fazenda da medi ção de metano na pocilga 1, onde foi adicionada a mistura de consórcio ao esterco, em comparação à pocilga 2 (controle), onde não foi acrescentada mistura de consórcio.
Figure img0002
Exemplo 3 Identificação de consórcio
[0046] Uma amostra do consórcio depositado no CBS com o nú mero de NR CBS 134115 foi analisada para identificar seus componentes. A análise foi realizada por BCCMTM/LMG Identification Service (Serviço de Identificação) em Gent, Bélgica.
[0047] Uma alíquota da amostra (algumas gotas) foi colhida as- septicamente e foi uniformemente espalhada:
[0048] Meio LMG nr. 66 (MRS) e incubada anaerobicamente a 37°C por 1 dia,
[0049] Meio LMG nr. 37 (RCM) e incubada anaerobicamente a [] °C por 1 dia,
[0050] Meio LMG nr. 13 e incubada aerobicamente a 28°C por 1 dia,
[0051] Meio LMG nr. 185 (TSA) e incubada aerobicamente a 28°C por 2 dias.
[0052] Nos diferentes meios, foram observados diferentes tipos de colônia que foram purificados para análises adicionais.
[0053] Quatro das colônias purificadas (t1, t2, t6, e t7) foram sub metidas à impressão digital genética (DNA fingerprinting) usando AFLPTM. AFLPTM é uma técnica baseada em PCR para impressão digital do genoma integral via amplificação seletiva de fragmentos de restrição (Vos et al., Nucleic Acids Research (Pesquisa de ácidos nuclei- cos) 23: 4407-4414 (1995)). Foi usada a combinação de primer E01/T11 (Keygene).
[0054] Análise de agrupamento da impressão digital genética AFLPTM DNA com as impressões digitais genéticas AFLPTM DNA de referência dos táxons de bactérias de ácido láctico (incluindo bifido- bactérias) identificou as culturas como Lactobacillus rhamnosus (t1), Lactobacillus casei (t2), Lactobacillus ghanensis (t6), e Lactobacillus paracasei (t7). Deve-se notar que dados de literatura indicam que o tipo de cepa de Lactobacillus casei pertence às espécies Lactobacillus zeae. Entretanto, a comissão judicial do comitê internacional de proca- tiotos sistêmicos normatizou que o nome Lactobacillus zeae não deve ser usado (Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 1764-1765, (2008)).
[0055] Duas das colônias purificadas (t3 e t4) foram submetidas a análise de sequência parcial de 16S rDNA. DNA total foi preparado de acordo com o protocolo de Niemann et al. (J. Appl. Microbiol. 82: 477484 (1997)). Um fragmento do gene 16S rDNA (correspondente às posições 8-1541 no Sistema de numeração de Escherichia coli tem) foi amplificado por PCR usando iniciadores (primers) conservados. O produto da PCR foi purificado usando o kit NucleoFast® 96 PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Alemanha). Reações de sequenciamento foram realizadas usando o kit de purificação BigDye® XTerminatorT (Applied Biosystems, USA). Montagem da sequência foi realizada usando o pacote de programas BioNumerics (Applied Maths, Bélgica).
[0056] Análise filogenética foi realizada usando o pacote de pro gramas Bionumerics (Applied Maths, Bélgica) após inclusão da sequência de consenso em um alinhamento de pequenas sequências de subunidades ribossômicas coletadas da biblioteca internacional de sequência de nucleotídeos EMBL.
[0057] Uma matriz de similaridade foi criada por cálculo de homo- logia com uma penalidade para lacunas de 0%; bases desconhecidas foram descartadas. Desta forma, uma similaridade de >97%, sendo significativa para identificação de possíveis espécies, foi verificada com várias espécies Bacillus validamente descritas. Entretanto, as altas similaridades de sequência (99,1-100%, com base em uma sequência parcial) obtidas com todas as espécies validamente descritas do complexo B.subtilis (um conjunto de espécies altamente relacionadas, atualmente abrangendo B. subtilis sensu stricto, B. amyloliquefa- ciens, B. atrophaeus, B. vallismorits, B. mojavensis, B. tequilensis, B. siamensis, e B. methylotrophicus), indicam que aquela das culturas (t3) pertence a uma destas espécies. Para a outra cultura, uma similaridade de >97%, sendo significativa para identificação de possíveis espécies, foi verificada com várias espécies validamente descritas de Lactobacillus. Entretanto, as altas similaridades de sequência (99,699,7, com base em uma sequência parcial) obtidas com as cepas do tipo de L. casei (99.7%) e L. zeae (99.6%), indicam que esta cultura (t4) pertence a uma destas espécies, em particular a L. casei.
[0058] Para uma análise adicional da amostra, uma alíquota foi colhida assepticamente e uma diluição em série (decimal) em água fisiológica foi feita. Alíquotas de 0,1 ml foram uniformemente espalhadas em:
[0059] Meio LMG nr. 185 (TSA) e incubadas aerobicamente a 28°C por 3 dias.
[0060] Um tipo de colônia adicional (t8) foi observado e purificado para posterior análise pelo método de sequência parcial de 16S rDNA como descrito acima. Desta forma, uma similaridade de >97%, sendo significativa para identificação de possíveis espécies, foi verificada com várias espécies Lactobacillus validamente descritas. Entretanto, as altas similaridades de sequência (99,6-99,9%, com base em uma sequência parcial) obtidas com as cepas do tipo das duas subespécies de L.paracasei, indicam que esta cultura (t8) pertence a esta espécie.

Claims (4)

1. Uso de um consórcio de micro-organismos, depositado no CBS com o número de depósito NR CBS 134115, caracterizado pelo fato de ser para a redução de emissão de amônia e/ou metano em esterco ou solo.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o esterco é esterco animal.
3. Método para reduzir amônia e/ou metano em esterco ou solo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de adicionar um consórcio de micro-organismos, depositado no CBS com o número de depósito NR CBS 134115, a esterco ou solo e incubar as referidas bactérias ou consórcio por um tempo suficiente para permitir a redução da formação de amônia e/ou metano no esterco.
4. Uso de esterco que compreende um consórcio de micro-organismos, depositado no CBS com o número de depósito NR CBS 134115, caracterizado pelo fato de ser como um fertilizante orgânico.
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