CN105039472B - 一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：选用pPIC9K‑G‑CSF(15‑75)‑GS115工程菌做菌株进行发酵培养；发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；对过滤后上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；对疏水层析产物进行阴离子交换和凝胶过滤，最后所得的G‑CSF(15‑75)的纯度达到99％以上，比活性达到了1.5×108IU/mg，为G‑CSF(15‑75)的工业化大生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人粒细胞刺激因子多肽的纯化方法。
背景技术
粒细胞刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF)具有促进粒系造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能的作用。它能够在骨髓移植中促进中性白细胞的增殖，并对癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏症，以及再生障碍性贫血伴随的中性粒白细胞缺乏症有明显的疗效。
John F.Reidhaar-Olson研究发现G-CSF的Leu15，Glu19，Gln25，Leu31，Lys34，Lys40，Leu47，Val48，Leu49，Leu54对蛋白活性起重要作用。二硫键对于蛋白受体二聚化，激活下游信号传导有重要作用，发明人构建的G-CSF多肽(15-75)覆盖G-CSF活性重要的氨基酸序列，含有完整的二硫键，利于保持其活性。但现有技术的纯化方法应用于所述G-CSF多肽(15-75)，纯度较低。
发明内容
本发明提供一种重组粒细胞刺激因子G-CSF(15-75)多肽的纯化方法，该方法包括以下步骤：
1)选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；
2)发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；
3)对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；
4)对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液；
5)对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞刺激因子多肽。
所述步骤1)的工程菌为保藏号为CGMCC NO:10713的巴斯德毕赤酵母菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年4月13日，分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
所述步骤3)的疏水层析其柱填料为phenyl sepharose 6 fast flow(high sub)，具体实施步骤为：
样品预处理：接收步骤2)所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体NaCl或者硫酸铵调节cd至50ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为8.0-18.5ml/min，上样结束后用平衡缓冲液复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集主峰。
步骤3)所述的平衡缓冲液为10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0，加固体NaCl调节cd50ms/cm；所述的洗脱缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5。
所述步骤4)的阴离子交换其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯，具体实施步骤为：
样品预处理：接收步骤3)所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为1-4ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液平衡5-10倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为8.5-19.8ml/min，上样结束后用平衡缓冲液复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
所述步骤4)的平衡缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5；所述的洗脱缓冲液为100mmol/L HAc-NaAc，pH5.0。
所述步骤5)的凝胶过滤其柱填料为Sephacryl s-100HR，具体操作步骤为：平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为0.3-1.17ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时泵流速为0.3-1.17ml/min，样品上样量为柱体积的0.5％-4％。；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱，调节泵流速为0.3-1.17ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
所述步骤5)的HAc-NaAc缓冲液为10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0。
本发明取得的有益效果：
(1)本发明的纯化方法主要用于G-CSF(15-75)多肽的纯化。
(2)采用了层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效率，大大降低生产成本，最后所得的G-CSF(15-75)多肽纯度达到99.8％以上，比活性达到了7.3×107IU/mg。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的详述，但具体实施例并不对本发明做任何限制。选用pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115作为工程菌进行发酵培养，收集发酵上清，12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜后进行纯化。
实施例1：
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯(SKI-10)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为10ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(100mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)，调节泵流速为8ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例2：
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体NaCl调节cd 50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体NaCl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，DEAE Sepharose Fast Flow填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5)，调节泵流速为20.0ml/min，平衡8倍柱床体积；
上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为10ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)平衡5个柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(100mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0)洗脱，调节泵流速为8ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例3
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯(SKI-10)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(100mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
实施例4
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L PB缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯(SKI-10)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(100mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例5
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，聚苯乙烯-二乙烯苯(SKI-10)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(100mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％。；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例6
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阳离子柱层析(XK50/30层析柱，CM Sepharose Fast Flow填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用乙酸调pH至5.0，加水稀释至cd为2ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(100mmol/L PB，pH8.5)，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阳离子交换纯化后目的蛋白直接上样。上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％。；
洗脱：上样完毕后，用Tris-HCl洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例7
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，Source 30Q填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至cd为3ms/cm。
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5)，调节泵流速为20ml/min，平衡8倍柱床体积；
上样：上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5)平衡5个柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0)洗脱，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用HAc-NaAc缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％。；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱(10mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例8
疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)填料)具体实施步骤为：
样品预处理：过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，使用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)，调节泵流速为20.0ml/min,平衡8倍柱床体积，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：以15ml/min流速上样,上样结束后，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc缓冲液，pH5.0，加固体Nacl调节cd 50ms/cm)平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)洗脱，调节泵流速为10ml/min，开始洗脱，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
阳离子柱层析(XK50/30层析柱，Source30S填料)具体实施步骤为：
样品预处理：所得疏水层析后蛋白溶液，用乙酸调pH至5.0，加水稀释至cd为2ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)平衡8倍柱体积，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为15ml/min，上样结束后用平衡缓冲液(10mmol/L HAc-NaAc，pH5.0)复平衡5个柱床体积；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)，调节泵流速为10ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryl s-100HR填料)具体实施步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5)平衡5-10个柱体积，平衡时泵流速为1.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阳离子交换纯化后目的蛋白直接上样，上样时泵流速为1.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％。；
洗脱：上样完毕后，用Tris-HCl液洗脱(10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.5)，调节泵流速为1.0ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
实施例9
阴离子柱层析(XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料)步骤为：
使用平衡缓冲液(20mmol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液)，调节泵流速为30.0ml/min，平衡8倍柱床体积；
样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其pH值为8.2，然后超滤浓缩至复性体积的1/10，即为上样液；
上样：上样时泵流速为8.0ml/min。上样结束后用平衡缓冲液平衡3个柱床体积；
洗脱：使用预洗液(20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗，调节泵流速为30.0ml/min，洗脱2个柱床体积，将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7.8NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL)中，开始目标峰洗脱，收集OD280大于0.3洗脱峰；
阳离子柱层析(XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料)步骤为：
平衡：使用平衡缓冲液(20mmol/L pH4.5 HAc-NaAc缓冲液)，调节泵流速49.9ml/min，平衡9倍柱床体积；
上样：上样液为上步得到的OD280大于0.3的洗脱液，调节泵流速30.0-49.9ml/min，开始上样，上样结束后，换至平衡缓冲液中，平衡4个柱床体积，至记录笔回至基线，用预洗液(20mmol/L pH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15MNaCL缓冲液)进行预洗，调节泵流速为30.0ml/min，至杂质峰洗下为止，换至洗脱液(50mmol/L pH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰，收集OD280大于0.3的洗脱峰。
反相填料层析
采用Pharmacia公司的预装型SOURCE 5RPC 4.6/150柱(粒径5μm，4.6×150mm、柱温度2-6℃，流速1.0ml/min)。配制洗脱液A为含100mmolNaCl溶液10mmol pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，洗脱液B为含100mmolNaCl、50％乙腈的10mmol pH＝8.0Tris-HCl缓冲液。先用洗脱液A洗脱；再用梯度20％-80％洗脱液B洗脱，15-35分钟收集样品峰。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩后保存在2-8℃条件下。
表1 实施例组各项指标考察结果
| 收率 | 电泳纯度 | HPLC纯度 | 内毒素 | 比活(IU/mg) | |
| 实施例1 | 72.2％ | 100％ | 99.8％ | 符合规定 | 1.5×108 |
| 实施例2 | 70.5％ | 96.9％ | 98.8％ | 符合规定 | 1.3×108 |
| 实施例3 | 86.5％ | 87.1％ | 89.6％ | 不符合规定 | 0.9×108 |
| 实施例4 | 63.7％ | 96.4％ | 98.2％ | 符合规定 | 1.1×108 |
| 实施例5 | 59.9％ | 96.6％ | 98.5％ | 符合规定 | 1.2×108 |
| 实施例6 | 64.2％ | 94.2％ | 92.6％ | 符合规定 | 0.9×108 |
| 实施例7 | 60.4％ | 96.5％ | 97.4％ | 符合规定 | 1.0×108 |
| 实施例8 | 58.2％ | 95.6％ | 96.7％ | 符合规定 | 1.0×108 |
| 实施例9 | 60.7％ | 96.1％ | 96.8％ | 符合规定 | 1.0×108 |
表1表明，只有实施例1的纯度和活性最好，为理想的纯化方法，蛋白纯度达到99.8％，比活性为1.5×108IU/mg，具有进一步的开发价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选用pPIC9K-G-CSF15-75-GS115工程菌做菌株进行发酵培养；
2）发酵培养液12000rpm，离心10min，上清液过0.45μm滤膜；
3）对过滤上清进行疏水层析纯化处理，得到疏水层析产物；
4）对疏水层析产物阴离子交换，得到阴离子交换液；
5）对阴离子交换液进行凝胶过滤，得到重组人粒细胞集落刺激因子多肽；
其中，步骤3）疏水层析柱填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow high sub，疏水层析平衡缓冲液为10 mmol/L HAc-NaAc，pH 5.0，加固体NaCl 调节电导率 50ms/cm；洗脱缓冲液为10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5；
步骤4）阴离子交换层析柱其柱填料为聚苯乙烯-二乙烯苯SKI-10，阴离子层析平衡缓冲液为10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5；洗脱缓冲液为100 mmol/L HAc-NaAc，pH5.0；
步骤5）凝胶过滤柱填料为Sephacryl s-100HR，凝胶层析洗脱缓冲液为10 mmol/LHAc-NaAc，pH 5.0。
2.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的工程菌为保藏号为CGMCC NO:10713的巴斯德毕赤酵母菌。
3.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于步骤3）具体实施步骤为：
样品预处理：接收步骤2）所得过滤后的发酵上清液，用乙酸调pH至5.0，加固体NaCl 调节电导率至50ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：上样时泵流速为8.0-18.5 ml/min，上样结束后用5个柱床体积平衡缓冲液复平衡；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集主峰。
4.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的步骤4）具体实施步骤为：
样品预处理：接收步骤3）所得疏水层析后蛋白溶液，用氢氧化钠调pH至8.5，加水稀释至电导率为1-4ms/cm；
平衡：设置检测波长280nm，用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡，平衡时泵流速为20.0ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将疏水层析峰直接上样，上样时泵流速为8.5-19.8 ml/min ，上样结束后用5个柱床体积平衡缓冲液复平衡；
洗脱：上样完毕后，用洗脱缓冲液洗脱，调节泵流速为5.5-10.2ml/min，根据UV值的变化收集目的峰。
5.如权利要求1所述的重组粒细胞集落刺激因子多肽的纯化方法，其特征在于，所述的步骤5）具体操作步骤为：
平衡：设置检测波长280nm，用5-10个柱体积HAc-NaAc缓冲液平衡，平衡时泵流速为0.3-1.17 ml/min，待UV值稳定后，紫外校零；
上样：将阴离子交换纯化后目的蛋白直接上样, 上样时泵流速为0.3-1.17ml/min，样品上样量为柱体积的0.5%-4%；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc缓冲液洗脱，调节泵流速为0.3-1.17 ml/min，根据UV值的变化收集目的蛋白溶液。
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