CN105039369A - 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因 - Google Patents

穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因 Download PDF

Info

Publication number
CN105039369A
CN105039369A CN201510552681.7A CN201510552681A CN105039369A CN 105039369 A CN105039369 A CN 105039369A CN 201510552681 A CN201510552681 A CN 201510552681A CN 105039369 A CN105039369 A CN 105039369A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mevalonate
decarboxylase gene
gene
diphosphate decarboxylase
mvd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510552681.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王晓云
钟国跃
陈蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201510552681.7A priority Critical patent/CN105039369A/zh
Publication of CN105039369A publication Critical patent/CN105039369A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因，具有SEQ？ID？NO:1序列。本发明所提供的MVD基因可以用于制备相应的DNA探针；可以用于穿心莲内酯合成途径的改造，提高活性成分合成量；可以转入生物反应器，生产相应的代谢成分。以上发明，对于穿心莲内酯相关产品的开发和利用，促进相关医药产业的可持续发展，具有重要的应用价值。

Description

穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物基因。
技术背景
穿心莲内酯是从爵床科植物穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees)中提取的次生代谢产物，被誉为天然、安全的中药抗生素。临床上已经开发出多种针剂，被卫生部及国家中医药管理局列为急诊科必备药品之一。穿心莲的起源中心是印度和斯里兰卡，目前种源严禁出口。我国引种穿心莲的历史较短，遗传基础狭窄，具有较高的遗传脆弱性。在穿心莲内酯的生物合成途径中，甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶(mevalonatedisphosphatedecarboxylase，MVD)可以提供穿心莲内酯合成的前体物质，对产量高低起决定作用。本发明提供了穿心莲MVD基因，本发明所提供的MVD基因可以用于制备相应的DNA探针；可以用于穿心莲内酯合成途径的改造，提高活性成分合成量；可以转入生物反应器，生产相应的代谢成分。以上发明，对于穿心莲内酯相关产品的开发和利用，促进相关医药产业的可持续发展，具有重要的应用价值。
说明书内容
本发明目的在于提供穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因及其表达的蛋白。
本发明穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因，其具有如SEQIDNO:1所述序列。
所述基因对应的蛋白质，其序列如SEQIDNO:2。
本发明的有益效果是：提供了穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因，为后续设计引物、构建载体和遗传转化研究提供了便利，为今后进一步通过途径调控提高植物中穿心莲内酯合成量，或者利用合成生物学方法生产穿心莲内酯，促进相关中医药产业的发展奠定了坚实的基础。
附图说明
图1提取获得的穿心莲总RNA
具体实施方式
实施例1
1材料与方法
所有引物均由苏州泓迅生物科技有限公司合成。总RNA提取所用化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他分子生物学试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR产物和阳性单克隆测序由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行。穿心莲种植在江西中医药大学神农园。
1.1提取总RNA
取穿心莲新鲜的茎和叶约0.5g，加入3ml总RNA提取液[含有2％CTAB，5％PVPK25，100mMTris-HCl(pH8.0)，25mMEDTA(pH8.0)，2MNaCl，5％β-巯基乙醇。将提取液在65℃水浴30min以上]，迅速用研钵研磨粉碎，在65℃水浴10min，再加入3ml氯仿∶异戊醇(24∶1)。10000rpm离心10min后，取上清600μl，加入150μlLiCl，4℃过夜。10000rpm离心20min后，弃上清，再离心1min，吸干上清。在沉淀中加入超纯水50μl，3MNaCl5μl，96％乙醇125μl，颠倒混匀，在-70℃沉淀30min。在4℃温度下10000rpm离心20min后，弃上清，用600μl70％乙醇洗涤两遍，将沉淀溶解在30μl超纯水中。用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
采用Roche逆转录试剂盒(TranscriptorcDNASynth.Kit2)获得cDNA，每个样品的总体积20μl。首先在12μl总RNA中加入1μlAnchored-oligo(dT)18Primer，轻轻混匀后，在65℃反应10min；然后再加入4μlBuffer，0.5μlRNaseInhibitor，2μldNTPmix，0.5μl反转录酶，轻轻混匀，在55℃放置30min后，转为85℃反应5min，4℃终止反应。
1.2克隆MVD基因
采用Invitrogen公司的PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit合成cDNA第一链。
根据银杏(GinkgobolibaL.)MVD基因(ACCESSIONAY757921)全长序列[庞永珍.银杏黄酮和萜类化合物生物合成途径中重要相关基因的克隆和研究.2005年复旦大学博士学位论文.]，搜索穿心莲转录组拼接序列数据库。设计一对引物，ApMVD-F：5'-ATGGCGGCTGAGAAATGGGTG-3'和ApMVD-R：5'-TCACTTGGGAAACCCGGTTTC-3'，从穿心莲的cDNA中扩增全长。
以cDNA第一链为模板，采用TaKaRa公司高保真DNA聚合酶扩增目标序列，反应总体积为50.0μl，包括1μlcDNA，0.25μlTakaraPrimeSTARHSDNAPolymerase，5μl10×buffer，4μldNTPMIX(各2.5mM)，ApMVD-F和ApMVD-R引物(10μM)各1.5μl，36.75μlddH2O。反应程序为95℃预变性1min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min终止反应。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测割胶回收后，采用Axygen离心柱型PCR产物纯化及胶回收试剂盒回收扩增产物，取2μl，添加2.5μl连接缓冲液(SolutionI)后，与0.5μl克隆载体pMD18-T进行连接，总体积5μl。
在4℃冰箱连接过夜(8～12h)后，转化大肠杆菌DH5а，涂布在LB平板上(含有50mg/L氨苄青霉素)，37℃倒置培养6～9h。挑取单克隆到LB液体培养基(含有50mg/L氨苄青霉素Amp)内，待到液体培养基变浑浊(大约2h)，以培养大肠杆菌的菌液为模板，用目的片段的上、下游引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆，用M13Primers进行DNA测序。由苏州泓迅生物科技有限公司进行测序。
1.3甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶酵母表达质粒的构建
利用引物对pYES2/25Q-MVD-F(5'-TAGGTACCATGGCGGCTGAGAAATG-3')和pYES2/25Q-MVD-R(5'-AGTCTAGATGGCCCATAGGGTTCACT-3')，从阳性单克隆中扩增MVD基因的开放阅读框。上游引物的5′端引入了KpnI(GGTACC)酶切位点，下游引物的5′端引入了XbaI(TCTAGA)酶切位点。PCR扩增条件为94℃3min；94℃30s，67℃30min,72℃2min，33cycles；72℃10min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物，切胶回收略大于1kb的条带。
用限制性内切酶KpnI和XbaI分别酶切回收的产物和pYES2/25Q酵母表达质粒。用PCR产物清洁试剂盒纯化回收的两种产物，用T4DNA连接酶进行连接。电击法将连接产物转化到酿酒酵母中。
用PCR法鉴定阳性单克隆菌落，获得可表达甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶的酵母菌。
2结果与分析
2.1总RNA提取
利用无液氮法，提取获得了质量较好的穿心莲总RNA(图1)。
2.2全长ORF扩增
在1200bp附近有一条明显的条带。胶回收后，进行TA克隆，测序，获得1条MVD基因的全长开放阅读框，长1260bp，编码由419个残基组成的氨基酸序列。
ATGGCGGCTGAGAAATGGGTGCTCTCCGTGACGGCGCAGACGCCGACCAACATCGCCGTCATCAAGTACTGGGGGAAGCGCGACGAGGACAGGATTCTTCCCATTAACGACAGCATTAGCGTCACTCTCGACCCCGATCACCTCTGCACCACCACCTCCGTCGCAGTTAGCCCCGCTTTCACTCACGATCGTATTTGGCTCAACGGCAAGGAGGTCTCTCTTTCTGGAAGCAGATTTCAGAATTGCTTGAGAGAAATTCGGTCACGTGCTAGTGATGTCGAGGACAAGGAGAAGGGCATTAAGATTGCAAAAGAGGACTGGGAGAAACTGCATGTACATATTGTTTCCTATAACAATTTTCCTACTGCTGCCGGATTGGCGTCATCAGCTGCGGGCTTGGCATGCCTGGTCTTCTCATTGGCTAAGCTAATGAATGTGAAAGAAGACCACAGTCAACTGTCTGCTATTGCAAGGCAAGGCTCAGGGAGTGCATGCCGCAGCCTGTTTGGTGGATTCGTCAAGTGGGTTATGGGAAAAGAGGAAAATGGCAGTGACAGCATTGCTGTCCAACTTGCAGATGAAAAGCACTGGGATGATCTTGTTATCATCATTGCAGTGGTAAGCTCGCGACAGAAGGAGACCAGTAGTACCTCTGGGATGCGTGATTCCGTTGAAACCAGTGCACTTATCAAATATAGAGCAAAGGAAGTAGTACCAAAACGAGTAATAGAGATGGAGGAAGCGATACAAAAGCGTGATTTTCCATCATTTGCCCGGCTGGCATGTGCGGACAGTAATCAGTTTCATGCTGTTTGTCTTGATACCTCACCGCCTATTTCTTACATGAATGATACATCTCATAGGATTATCAGCTGTGTTGAGAAATGGAATCGTCATGAAGGAACTCCTCAGGTTGCCTATACCTTCGATGCCGGCCCAAATGCAGTACTAATTTCGCATAACAGAAGCACCGCTGCTGACCTGCTTAAGAGGCTGCTCTTTTACTTCCCCCCTCAATCAGACACTGATTTGAACAGTTACGTCATCGGAGACAAGACAATATTGAAAGATGCCGGCATCCAGGGAATTAAAGACATTGATGGTTTAGCTCCACCCCCAGAAGTTAAAGAGAATAGTTCGAGCCAAAGGTACAAGGGAGAGGTCAGTTATTTCATCTGCACGAGGCCTGGAAGAGGCCCGGCAGTATTAACAGACGAAAGCCAATCCCTTATCAACCCCGAAACCGGGTTTCCCAAGTGA。
编码相应蛋白的氨基酸序列为：
MAAEKWVLSVTAQTPTNIAVIKYWGKRDEDRILPINDSISVTLDPDHLCTTTSVAVSPAFTHDRIWLNGKEVSLSGSRFQNCLREIRSRASDVEDKEKGIKIAKEDWEKLHVHIVSYNNFPTAAGLASSAAGLACLVFSLAKLMNVKEDHSQLSAIARQGSGSACRSLFGGFVKWVMGKEENGSDSIAVQLADEKHWDDLVIIIAVVSSRQKETSSTSGMRDSVETSALIKYRAKEVVPKRVIEMEEAIQKRDFPSFARLACADSNQFHAVCLDTSPPISYMNDTSHRIISCVEKWNRHEGTPQVAYTFDAGPNAVLISHNRSTAADLLKRLLFYFPPQSDTDLNSYVIGDKTILKDAGIQGIKDIDGLAPPPEVKENSSSQRYKGEVSYFICTRPGRGPAVLTDESQSLINPETGFPK。
2.3酵母表达重组菌的获得
经过电击转化后，获得了可表达MVD蛋白的基因重组酵母工程菌，保存于YPD培养基中。本发明基因编码表达的MVD蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:2。

Claims (2)

1.穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因，其具有如SEQIDNO:1所述序列。
2.权利要求1所述基因对应的蛋白质，其序列如SEQIDNO:2。
CN201510552681.7A 2015-09-02 2015-09-02 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因 Pending CN105039369A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510552681.7A CN105039369A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510552681.7A CN105039369A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105039369A true CN105039369A (zh) 2015-11-11

Family

ID=54446341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510552681.7A Pending CN105039369A (zh) 2015-09-02 2015-09-02 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105039369A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328485A (zh) * 2007-06-21 2008-12-24 日立造船株式会社 编码杜仲的甲羟戊酸途径的酶的基因

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101328485A (zh) * 2007-06-21 2008-12-24 日立造船株式会社 编码杜仲的甲羟戊酸途径的酶的基因

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MA,Y.等: "mevalonate diphosphate decarboxylase [Salvia miltiorrhiza]", 《GENBANK: AEZ55675.1》 *
VISHWAKARMA,R.K.等: "Bacopa monnieri mevalonate diphosphate decarboxylase mRNA, partial cds", 《GENBANK: JN116821.1》 *
VUDEM,D.等: "TSA: Andrographis paniculata, transcriptome shotgun assembly", 《GENBANK: GBJB00000000》 *
王晓云 等: "穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达", 《中国中药杂志》 *
王杰华等: "四种穿心莲二萜内酯类化合物的生物转化", 《第二军医大学学报》 *
邢朝斌 等: "刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析", 《西北植物学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3536792A1 (en) Recombinant yeast and use thereof
CN105481955A (zh) 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT2.1及其编码基因与应用
CN109593745A (zh) 一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体
CN110117582B (zh) 融合蛋白、其编码基因及在生物合成上的应用
CN103981112A (zh) 一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株
CN103232979B (zh) 一种发形霞水母硫氧还蛋白及其编码基因与应用
CN103146709A (zh) 云南红梨PybHLH基因及其原核表达载体和应用
Suzuki et al. Extracellular production of an RNA aptamer by ribonuclease-free marine bacteria harboring engineered plasmids: a proposal for industrial RNA drug production
CN105039369A (zh) 穿心莲甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因
CN102898512B (zh) 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途
Wang et al. Cloning and characterization of a phosphomevalonate kinase gene from Sanghuangporus baumii
CN102533574A (zh) 一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法
CN105602914B (zh) 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用
CN113512542B (zh) 一种鼠李糖苷酶突变体及其制备方法和应用
CN105063069A (zh) 穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因
CN109022406A (zh) 一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1及其应用
CN106701800B (zh) 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用
CN109022404A (zh) 一种新型冷适应性褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用
CN102086455A (zh) 絮凝酵母絮凝基因、其表达产物及其用途
CN107217064A (zh) 超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白
CN103484470A (zh) 管状蠕虫半乳糖凝集素及其制备方法
Shi et al. Characterization of Three Genes Encoding the Subunits of Light‐Independent Protochlorophyllide Reductase in Chlorella protothecoides CS‐41
CN102344915A (zh) 具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用
CN103333910B (zh) 制备鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白的方法
CN105755030A (zh) 一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151111