CN105028211A - 一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，按下列步骤进行：一是无菌花芽体系的建立，二是愈伤组织诱导培养，三是愈伤组织的继代培养，四是愈伤组织的分化培养，五是试管苗的生根培养，六是再生植株的炼苗和移栽。本发明涉及一种以竹子的花芽为外植体的植物组培方法，是对以竹子花芽为外植体经愈伤组织诱导建立再生体系的有益尝试，采用本方法能够使外植体诱导出愈伤组织，并建立再生体系，为该竹子育种及遗传转化研究创造有利条件。本方法简单易行、利于推广，实施条件宽松，效果显著。

Description

一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法。
背景技术
绿竹（BambusaoldhamiiMcClure）属于禾本科竹亚科箣竹属，为优良的笋材两用竹种。笋期5-11月，较长的笋期和较大的产量使其具有很高的经济效益。另外，其竹材纤维长，劈篾性好，是造纸建筑的好材料。然而传统的母竹移栽、埋鞭、扦插等方法，效率低，成本高。这一直都限制了优良竹种的大规模推广。因此，采用合适的外植体，利用植物组织培养的技术来建立优良竹种的离体快速繁殖和再生体系一直是科学研究的方向。
竹类植物的组织培养起步于1968年，到现在已经先后对20余属80多个竹种开展了组培研究，而且应用于生产实践中。迄今为止，建立竹子再生体系所用的外植体大多是种胚、花药、花序、笋、芽、茎段、叶鞘等，关于花芽再生的报道极少，有关对绿竹通过花芽再生途径来实现植株的再生的研究未见有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明利用绿竹的无菌花芽为外植体，经过愈伤组织诱导、增殖、分化、试管苗生根，移栽，建立其再生体系的方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：
1）无菌花芽的获得
选取健壮、生长力旺盛、无病斑的绿竹植株，切下侧芽，经消毒处理后，在解剖显微镜下切下无菌芽尖为外植体，将芽尖接种在增殖培养基中，基本培养基为MS(MurashigeandSkoog)，添加的外源激素为6-BA即6-苄基腺嘌呤，浓度为1mg·L-1；培养条件：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃，随着继代次数增加，竹子出现试管开花，取开花植株的花芽作为外植体，无菌花芽在原培养基中继代培养；
2）愈伤组织诱导培养
诱导愈伤组织所用的花芽选用步骤1）已经建立好的无菌花芽体系，将0.05-0.1cm长的花芽接种于诱导培养基中：愈伤组织诱导基本培养基为MS培养基，添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D浓度为2mg·L-1，并在诱导培养基中添加500mg·L-1的水解酪蛋白、500mg·L-1的脯氨酸和500mg·L-1的谷氨酰胺；pH为5.7；诱导条件为：暗培养，温度25±2℃；
3）愈伤组织增殖培养
一个月后，将诱导出的致密愈伤组织转移到新的培养基中增殖培养，愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：暗培养，温度25±2℃；
4）分化培养
将经过增殖培养的致密愈伤组织接种在分化培养中进行分化，分化培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
5）生根培养
将从分化培养基分化出的再生植株长到3-5cm时移入生根培养基中进行生根；生根培养基为MS培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
6）再生植株的移栽
一个月后，选取根长势粗壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室20000lux强光下炼苗一周，然后取出试管苗，用30-40℃温水洗净根部的培养基，将植株移栽于混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室。
所述的是一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中消毒处理是指用清洗剂清洗干净，用体积分数为0.005的次氯酸钠溶液浸泡10min，次氯酸钠溶液中添加有吐温-20，吐温-20的添加量为每50ml次氯酸钠溶液中添加一滴，然后用无菌水冲洗4-5次。
所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中无菌芽尖的长度为5-10mm。
所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤6）中温水的温度为30-40℃，混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成。
本发明利用花芽离体培养可在短期内获得性状丰富的单倍体，大大地缩短了育种周期，提高了选择效率。利用花芽诱导的胚性愈伤组织作为转基因受体，有望得到纯合的、后代不会发生性状分离的转基因植株，加快竹类育种进程。通过建立较为完善的绿竹花芽无菌体系，采用绿竹花芽为实验材料，方便可行，不受外界环境制约，便于建立绿竹的再生体系，为竹子后期的研究奠定了基础。
附图说明
图1为花芽正在诱导的白色致密的愈伤组织图；
图2为变绿的愈伤组织分化形态图；
图3为愈伤组织分化出绿色芽形态图；
图4为绿竹再生苗生根形态图；
图5为炼苗移栽后的植株形态图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，并给出具体实施方式。
实施例
利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，按下列步骤进行：
1）无菌花芽的获得
选取健壮、生长力旺盛、无病斑的绿竹植株，切下侧芽，用体积分数为0.005的次氯酸钠溶液浸泡10min，次氯酸钠溶液中添加有吐温-20，吐温-20的添加量为每50ml次氯酸钠溶液中添加一滴，然后用无菌水冲洗4-5次，在解剖显微镜下切下5-10mm的无菌芽尖为外植体，将芽尖接种在增殖培养基中，基本培养基为MS(MurashigeandSkoog)，添加的外源激素为6-BA即6-苄基腺嘌呤，浓度为1mg/L；培养条件：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃。随着继代次数增加，竹子出现试管开花，取开花植株的花芽作为外植体，无菌花芽在原培养基中继代培养；
2）愈伤组织诱导培养
诱导愈伤组织所用的花芽选用步骤1）已经建立好的无菌花芽体系，将0.05-0.1cm长的花芽接种于诱导培养基中，如图1所示。愈伤组织诱导基本培养基为MS培养基，添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D浓度为2mg·L-1，并在诱导培养基中添加500mg·L-1的水解酪蛋白、500mg·L-1的脯氨酸和500mg·L-1的谷氨酰胺；pH为5.7；诱导条件为：暗培养，温度25±2℃；
3）愈伤组织增殖培养
一个月后，将诱导出的致密愈伤组织转移到新的培养基中增殖培养，如图2所示。愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：暗培养，温度25±2℃；
4）分化培养
将经过增殖培养的致密愈伤组织接种在分化培养中进行分化，如图3所示。分化培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
5）生根培养
将从分化培养基分化出的再生植株长到3-5cm时移入生根培养基中进行生根，如图4所示。生根培养基为MS培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
6）再生植株的移栽
一个月后，选取根长势粗壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室20000lux强光下炼苗一周，然后取出试管苗，用30-40℃的温水洗净根部的培养基，将植株移栽于混合培养基质中，混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，如图5所示，生长稳定时移栽至温室。
本发明以花芽建立绿竹再生体系，并同时采用此方法诱导出愈伤组织并进行分化，试管苗生根率及移栽成活率可达到100%，得到绿竹高效再生体系，通过无菌花芽体系的建立，确保有充足的花芽作为外植体，克服了绿竹种子难获得所引起的外植体取材困难问题，更加方便可行。
本发明通过花芽建立绿竹再生体系是以花芽为外植体，在激素的诱导下经过脱分化过程形成愈伤组织，再通过愈伤组织的增殖与分化形成再生植株，这些愈伤组织不仅可以用于快速繁殖，而且可以用于转基因。本发明不仅为绿竹组织培养快速繁殖增添了新途径，同时也为其转基因研究奠定了基础。

Claims (4)

1.一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：
1）无菌花芽的获得
选取健壮、生长力旺盛、无病斑的绿竹植株，切下侧芽，经消毒处理后，在解剖显微镜下切下无菌芽尖为外植体，将芽尖接种在增殖培养基中，基本培养基为MS，添加的外源激素为6-BA即6-苄基腺嘌呤，浓度为1mg·L-1；培养条件：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃，随着继代次数增加，竹子出现试管开花，取开花植株的花芽作为外植体，无菌花芽在原培养基中继代培养；
2）愈伤组织诱导培养
诱导愈伤组织所用的花芽选用步骤1）已经建立好的无菌花芽体系，将0.05-0.1cm长的花芽接种于诱导培养基中：愈伤组织诱导基本培养基为MS培养基，添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D浓度为2mg·L-1，并在诱导培养基中添加500mg·L-1的水解酪蛋白、500mg·L-1的脯氨酸和500mg·L-1的谷氨酰胺；pH为5.7；诱导条件为：暗培养，温度25±2℃；
3）愈伤组织增殖培养
一个月后，将诱导出的致密愈伤组织转移到新的培养基中增殖培养，愈伤组织增殖培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：暗培养，温度25±2℃；
4）分化培养
将经过增殖培养的致密愈伤组织接种在分化培养中进行分化，分化培养基同诱导培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
5）生根培养
将从分化培养基分化出的再生植株长到3-5cm时移入生根培养基中进行生根；生根培养基为MS培养基，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；
6）再生植株的移栽
一个月后，选取根长势粗壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室20000lux强光下炼苗一周，然后取出试管苗，用30-40℃温水洗净根部的培养基，将植株移栽于混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室。
2.根据权利要求1所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中消毒处理是指用清洗剂清洗干净，用体积分数为0.005的次氯酸钠溶液浸泡10min，次氯酸钠溶液中添加有吐温-20，吐温-20的添加量为每50ml次氯酸钠溶液中添加一滴，然后用无菌水冲洗4-5次。
3.根据权利要求1所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中无菌芽尖的长度为5-10mm。
4.根据权利要求1所述的一种利用绿竹花芽进行快速高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤6）中温水的温度为30-40℃，混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成。
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