CN105021687B - 一种检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用三电极体系通过示差脉冲伏安法对待检测液中的丙烯酰胺进行检测，根据丙烯酰胺的线性方程得到待检测液中丙烯酰胺的浓度，其中，三电极体系中的工作电极为特征单链DNA修饰的金电极，所述特征单链DNA的序列为5'‑TTTTT TTTTTGGGGG‑(CH2)6‑SH‑3’。本发明利用示差脉冲伏安法，进行丙烯酰胺的高灵敏检测，对丙烯酰胺的检测限可达到，操作简单、检测快速、灵敏度高且选择性好，具有相当广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种基于特征单链DNA电化学传感利用差分脉冲伏安法检测丙烯酰胺浓度。
背景技术
丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常，如微核形成、姐妹染色单体交换、多倍体、非整倍体和其他有丝分裂异常等，显性致死试验阳性。并证明丙烯酰胺的代谢产物环氧丙酰胺是其主要致突变活性物质。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，包括乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体等。国际癌症研究机构(IARC)1994年对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2类致癌物(2A)即人类可能致癌物，其主要依据为丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为其致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。因此，丙烯酰胺的分析检测显得尤为重要。迄今为止，丙烯酰胺的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱耦合质谱法、荧光光谱法等。但这些方法有前处理过程繁琐、分析时间长、仪器及药品成本高等不足。因此，建立简单、快速且灵敏度高的丙烯酰胺检测方法逐渐成为研究重点。
丙烯酰胺进入体内后，会在体内与DNA上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致基因突变等遗传物质损伤。因此可以以特征单链DNA作为传感平台，利用电化学技术检测丙烯酰胺，迄今为止，将特征单链DNA修饰金电极用于丙烯酰胺检测的相关报道仍未见。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，用经过特征DNA修饰过的电极，利用示差脉冲伏安法检测丙烯酰胺，有助于提高丙烯酰胺检测的灵敏度。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是研究了一种丙烯酰胺检测的方法。
本发明还有一个目的是通过利用差分脉冲伏安法，将修饰电极作为工作电极采用三电极体系检测丙烯酰胺的含量，建立了一种简单、快速且灵敏度高的丙烯酰胺检测新方法。
本发明还有一个目的是在三电极体系中使用经特征DNA修饰的电极为工作电极，它将电化学信号传导的高灵敏性和特征DNA的高亲和性相结合。本三电极体系传感器制备简便、易修饰、灵敏高、测试费用低、适于联机化、稳定性好和结合目标物范围广等优点。
本发明还有一个目的是使用一种序列更短，更廉价的特征DNA，得到更高的电流信号。
为此，本发明提供了一种检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法，包括，
使用三电极体系通过示差脉冲伏安法对待检测液中的丙烯酰胺进行检测，根据丙烯酰胺的线性方程得到待检测液中丙烯酰胺的浓度，其中，三电极体系中的工作电极为特征单链DNA修饰的金电极，所述特征单链DNA的序列为5’-TTTTT TTTTTGGGGG-(CH2)6-SH-3’。
优选地，所述的检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法，包括以下步骤：
S1：制备所述工作电极，丙烯酰胺的浓度为0-20nmol/L的多份标准溶液；
S2：采用所述工作电极，利用示差脉冲伏安法对步骤一种配置的每份标准溶液分别进行检测，得到每份标准溶液的示差脉冲伏安曲线，在此过程中分别记录每份丙烯酰胺标准溶液的示差脉冲伏安曲线中电流强度的峰值；
S3：以S2中得到的每份标准溶液的示差脉冲伏安曲线对应的电流强度的峰值与丙烯酰胺浓度为0nmol/L时的标准溶液的电流强度的峰值的差值作为纵坐标，以每份标准溶液的浓度为横坐标绘制标准标准曲线并计算得到两者间的线性方程；
S4：采用所述工作电极，利用示差脉冲伏安法对待检测液进行检测，得到待检测液的示差脉冲伏安曲线，将待检测液的示差脉冲伏安曲线对应的电流强度的峰值与丙烯酰胺浓度为0nmol/L的标准溶液的电流强度的峰值的差值代入到所述线性方程中，计算得到待检测液中丙烯酰胺的浓度。
优选地，所述S1中丙烯酰胺的标准溶液的制备方法为：向第一磷酸缓冲溶液中加入浓度为2μmol/L的丙烯酰胺标准溶液，分别得到含有丙烯酰胺的终浓度为0nmol/L的溶液a、含有丙烯酰胺的终浓度为3nmol/L的溶液b、含有丙烯酰胺的终浓度为5nmol/L的溶液c、含有丙烯酰胺的终浓度为10nmol/L的溶液d，含有丙烯酰胺的终浓度为15nmol/L的溶液e，含有丙烯酰胺的终浓度为20nmol/L的溶液f，所述溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f为六种标准溶液；其中所述第一磷酸缓冲溶液的pH为8.0，其浓度为0.2mol/L。
优选地，所述S1中制备所述工作电极的方法为：
S1.1：金电极的预处理，将金电极依次放置在含有粒度分别为1μm、0.3μm、0.05μm的抛光粉的抛光布上抛光至镜面，随后将所述金电极依次放置在丙酮、浓度为0.5mol/L的硫酸溶液和超纯水中超声1分钟，并在每次超声结束后使用超纯水冲洗0.5分钟，备用；
S1.2：配制含有所述特征单链的DNA的第二磷酸缓冲溶液，向0.2mol/L所述第一磷酸缓冲溶液中加入所述特征单链的DNA，使所述特征单链的DNA在所述第一磷酸缓冲溶液中浓度为5×10-6mol/L，并且调节pH至7，即得含有所述特征单链的DNA的第二磷酸缓冲溶液；
S1.3：在预处理后的金电极上滴加7μL的含有所述特征单链DNA的第二磷酸缓冲溶液，在4℃的冷柜中干燥，干燥后，得到特征单链DNA修饰的金电极。
优选地，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S2.1：将所述三电极体系分别置入所述六种标准液中，在室温下搅拌2min，静止2min；
S2.2：扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s；
S2.3：分别测量并记录所述六种标准溶液的电流强度的峰值，建立所述溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f共5种标准溶液的示差脉冲伏安曲线。
优选地，所述三电极体系的参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极。
本发明的有益效果为：
1、本发明采用能与丙烯酰胺特异性结合的特征单链DNA修饰工作电极，构建相关的传感界面作为三电极体系传感器用于检测，提高了检测丙烯酰胺的灵敏性，最低可以检测出1.45nmol/L的丙烯酰胺；
2、本发明作为基于特征单链DNA的电化学检测丙烯酰胺的一种方法，大大降低了检测成本，操作简单方便；
3、本发明一步快速检测丙烯酰胺，三电极体系传感器制备完成后，仅需数分钟就可以实现一步检测出丙烯酰胺。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“DNA”即为是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸。而脱氧核糖与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA的核酸分子。
术语“单链DNA”是指双链DNA经热或碱处理后由双螺旋结构变为单链结构。单链DNA在分子流体力学性质、吸收光谱、碱基反应性质等方面都和双链DNA不同。
“工作电极”又称研究电极，是指所研究的反应在该电极上发生。一般来讲，对工作电极的基本要求是：工作电极可以是固体，也可以是液体，各式各样的能导电的固体材料均能用作电极。所研究的电化学反应不会因电极自身所发生的反应而受到影响，并且能够在较大的电位区域中进行测定；电极必须不与溶剂或电解液组分发生反应；电极面积不宜太大，电极表面最好应是均一平滑的，且能够通过简单的方法进行表面净化等。采用固体电极时，为了保证实验的重现性，必须注意建立合适的电极预处理步骤，以保证氧化还原、表面形貌和不存在吸附杂质的可重现状态。在液体电极中，汞和汞齐是最常用的工作电极，它们都是液体，都有可重现的均相表面，制备和保持清洁都较容易，同时电极上高的氢析出超电势提高了在负电位下的工作窗口记被广泛用于电化学分析中。
附图说明
图1为本发明中不同浓度的丙烯酰胺标准溶液的差分脉冲伏安曲线图；
图2为本发明中丙烯酰胺标准液浓度值与电流差值的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
本发明实施例提供一种检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法，包括：
使用三电极体系传感器通过示差脉冲伏安法对样品溶液中的丙烯酰胺进行检测，根据丙烯酰胺的示差脉冲伏安曲线得到样品溶液中丙烯酰胺的浓度，其特征在于，其中，三电极体系中的工作电极为特征单链DNA修饰的金电极，所述特征单链DNA的序列为5’-TTTTTTTTTTGGGGG-(CH2)6-SH-3’。
本发明是采用示差脉冲伏安法对丙烯酰胺进行检测，
示差脉冲伏安法在线性扫描波形上，叠加一振幅恒定和脉宽固定的连续脉冲，扫描过程中，基电位从初始电位扫描到终止电位，在电位脉冲开始之前和结束时进行电流采样，将这两个采样电流的差值对电位作图，即为DPV曲线，主要用于电化学分析，减少因杂质氧化还原反应导致的背景电流，具有更好的检测灵敏度和更低的检测极限，相对于其他方法，所述示差脉冲伏安法成本较低，操作简单。
为达到上述目的，本发明采用了如下机理：鸟嘌呤能与丙烯酰胺作用，两者结合可以使鸟嘌呤氧化强度改变，利用示差脉冲伏安测试鸟嘌呤氧化信号的变化可以用来检测检测丙烯酰胺的浓度。本发明设计一段3’末端含有巯基的特征单链DNA，运用Au-S键共价原理，利用滴加修饰方法，使特征单链DNA成功修饰于金电极上，因特征单链DNA中含有鸟嘌呤，在进行空白溶液测试时，具有强的电化学信号，但当加入丙烯酰胺溶液后，丙烯酰胺与鸟嘌呤作用，使得电化学信号改变，通过信号的变化即可测量丙烯酰胺的浓度。
所述的检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法，包括以下步骤：
S1：制备所述工作电极，丙烯酰胺的浓度为0-10nmol/L的多份标准溶液；
S2：采用所述工作电极，利用示差脉冲伏安法对步骤一种配置的每份标准溶液分别进行检测，得到每份标准溶液的示差脉冲伏安曲线，在此过程中分别记录每份丙烯酰胺标准溶液的示差脉冲伏安曲线中电流强度的峰值；
S3：以S2中得到的每份标准溶液的示差脉冲伏安曲线对应的电流强度的峰值与丙烯酰胺浓度为0nmol/L时的标准溶液的电流强度的峰值的差值作为纵坐标，以每份标准溶液的浓度为横坐标绘制标准标准曲线并计算得到两者间的线性方程；
S4：采用所述工作电极，利用示差脉冲伏安法对待检测液进行检测，得到待检测液的示差脉冲伏安曲线，将待检测液的示差脉冲伏安曲线对应的电流强度的峰值与丙烯酰胺浓度为0nmol/L的标准溶液的电流强度的峰值的差值代入到所述线性方程中，计算得到待检测液中丙烯酰胺的浓度。
所述S1中丙烯酰胺的标准溶液的制备方法为：向第一磷酸缓冲溶液中加入浓度为2μmol/L的丙烯酰胺标准溶液，分别得到含有丙烯酰胺的终浓度为0nmol/L的溶液a、含有丙烯酰胺的终浓度为3nmol/L的溶液b、含有丙烯酰胺的终浓度为5nmol/L的溶液c、含有丙烯酰胺的终浓度为10nmol/L的溶液d，含有丙烯酰胺的终浓度为15nmol/L的溶液e，含有丙烯酰胺的终浓度为20nmol/L的溶液f，所述溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f为六种标准溶液；其中所述第一磷酸缓冲溶液的pH为8.0，其浓度为0.2mol/L。
所述S1中制备所述工作电极的方法为：
S1.1：金电极的预处理，将金电极依次放置在含有粒度分别为1μm、0.3μm、0.05μm的抛光粉的抛光布上抛光至镜面，随后将所述金电极依次放置在丙酮、浓度为0.5mol/L的硫酸溶液和超纯水中超声1分钟，并在每次超声结束后使用超纯水冲洗0.5分钟，备用；
S1.2：配制含有所述特征单链的DNA的第二磷酸缓冲溶液，向0.2mol/L所述第一磷酸缓冲溶液中加入所述特征单链的DNA，使所述特征单链的DNA在所述第一磷酸缓冲溶液中浓度为5×10-6mol/L，并且调节pH至7，即得含有所述特征单链的DNA的第二磷酸缓冲溶液；
S1.3：在预处理后的金电极上滴加7μL的含有所述特征单链DNA的第二磷酸缓冲溶液，在4℃的冷柜中干燥，干燥后，得到特征单链DNA修饰的金电极。
所述步骤S2具体包括以下步骤：
S2.1：将所述三电极体系分别置入所述六种标准液中，在室温下搅拌2min，静止2min；
S2.2：扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s；
S2.3：分别测量并记录所述六种标准溶液的电流强度的峰值，建立所述溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f共5种标准溶液的示差脉冲伏安曲线。
所述三电极体系的参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极。
实施例二：
电化学工作站：CHI760E；
三电极体系：工作电极为经特征单链DNA修饰的金电极，辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极；
缓冲溶液：pH值为8.0，浓度为0.2mol/L的第一磷酸缓冲溶液；
标准储备溶液：2μmol/L标准丙烯酰胺溶液；
金电极在修饰前已做过处理：将金电极依次放置在含有粒度分别为1μm、0.3μm、0.05μm的抛光粉的抛光布上抛光至镜面，随后将所述金电极依次放置在丙酮、浓度为0.5mol/L的硫酸溶液和超纯水中超声1分钟，并在每次超声结束后使用超纯水冲洗0.5分钟。
金电极的修饰：在金电极上滴加7μL含有浓度为5×10-6mol/L的所述特征单链DNA的第二磷酸缓冲溶液，并在4℃的冰箱中干燥，干燥后即得所述特征单链DNA修饰的金电极，所述特征单链DNA的序列为5’-TTTTT TTTTTGGGGG-(CH2)6-SH-3’。
测定方法：向第一磷酸缓冲溶液中加入浓度为2μmol/L的丙烯酰胺标准溶液，分别得到含有丙烯酰胺的终浓度为0nmol/L的溶液a、含有丙烯酰胺的终浓度为3nmol/L的溶液b、含有丙烯酰胺的终浓度为5nmol/L的溶液c、含有丙烯酰胺的终浓度为10nmol/L的溶液d，含有丙烯酰胺的终浓度为15nmol/L的溶液e，含有丙烯酰胺的终浓度为20nmol/L的溶液f，所述溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f为六种标准溶液；其中所述第一磷酸缓冲溶液的pH为8.0，其浓度为0.2mol/L。
将所述三电极体系分别置入所述六种标准液中，在室温下搅拌2min，静止2min；扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s；分别测量并记录所述六种标准溶液的电流强度的峰值，建立所述溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f共5种标准溶液的示差脉冲伏安曲线。
如图1所示，其中曲线b、c、d、e和f分别为溶液b、c、d、e和f五种标准溶液差分脉冲伏安曲线图。
以所述五种标准液的氧化峰的电流值与空白缓冲溶液氧化峰之间的电流值的差值作为纵坐标Y，以丙烯酰胺的浓度作为横坐标X，建立丙烯酰胺标准液浓度值与电流差值的线性关系图，如图2；
从图2可得知基于特征单链DNA电化学传感的电流强度的差值与丙烯酰胺溶液浓度有良好的线性关系，且Y＝0.066+0.38X，式中Y为电流差值I0-I，单位为μA，X为丙烯酰胺浓度，单位为nmol/L，相关系数R2为0.999。修饰电极对丙烯酰胺的检测限为1.45nmol/L。
样品溶液的测定：将所述三电极体系传感器浸没在10mL的所述第一磷酸缓冲溶液中，在所述第一磷酸缓冲液中加入1mL含有未知浓度的丙烯酰胺溶液，搅拌3min，静止3min，扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s，测量并记录相应的氧化峰电流值，通过所述丙烯酰胺示差脉冲伏安曲线，计算出丙烯酰胺溶液的浓度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (1)
1.一种检测溶液中丙烯酰胺浓度的方法，包括：
电化学工作站：CHI760E；
三电极体系：工作电极为经特征单链DNA修饰的金电极，辅助电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极；
缓冲溶液：pH值为8.0，浓度为0.2mol/L的第一磷酸缓冲溶液；
标准储备溶液：2μmol/L标准丙烯酰胺溶液；
金电极在修饰前已做过处理：将金电极依次放置在含有粒度分别为1μm、0.3μm、0.05μm的抛光粉的抛光布上抛光至镜面，随后将所述金电极依次放置在丙酮、浓度为0.5mol/L的硫酸溶液和超纯水中超声1分钟，并在每次超声结束后使用超纯水冲洗0.5分钟；
金电极的修饰：在金电极上滴加7μL含有浓度为5×10-6mol/L的所述特征单链DNA的第二磷酸缓冲溶液，并在4℃的冰箱中干燥，干燥后即得所述特征单链DNA修饰的金电极，所述特征单链DNA的序列为5’-TTTTT TTTTT GGGGG-(CH2)6-SH-3’；
测定方法：向第一磷酸缓冲溶液中加入浓度为2μmol/L的丙烯酰胺标准溶液，分别得到含有丙烯酰胺的终浓度为0nmol/L的溶液a、含有丙烯酰胺的终浓度为3nmol/L的溶液b、含有丙烯酰胺的终浓度为5nmol/L的溶液c、含有丙烯酰胺的终浓度为10nmol/L的溶液d，含有丙烯酰胺的终浓度为15nmol/L的溶液e，含有丙烯酰胺的终浓度为20nmol/L的溶液f，所述溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f为六种标准溶液；其中所述第一磷酸缓冲溶液的pH为8.0，其浓度为0.2mol/L；
将所述三电极体系分别置入所述六种标准溶液中，在室温下搅拌2min，静止2min；扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s；分别测量并记录所述六种标准溶液的电流强度的峰值，建立所述溶液b、溶液c、溶液d、溶液e和溶液f共5种标准溶液的示差脉冲伏安曲线；
以所述五种标准溶液的氧化峰的电流值与空白缓冲溶液氧化峰之间的电流值的差值作为纵坐标Y，以丙烯酰胺的浓度作为横坐标X，建立丙烯酰胺标准溶液浓度值与电流差值的线性关系图；
可得知基于特征单链DNA电化学传感的电流强度的差值与丙烯酰胺溶液浓度有良好的线性关系，且Y＝0.066+0.38X，式中Y为电流差值I0-I，单位为μA，X为丙烯酰胺浓度，单位为nmol/L，相关系数R2为0.999；修饰电极对丙烯酰胺的检测限为1.45nmol/L；
样品溶液的测定：将所述三电极体系传感器浸没在10mL的所述第一磷酸缓冲溶液中，在所述第一磷酸缓冲液中加入1mL含有未知浓度的丙烯酰胺溶液，搅拌3min，静止3min，扫描示差脉冲图谱，设置扫描初始电位为0V，终止电位为1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s，等待时间为2s，测量并记录相应的氧化峰电流值，通过丙烯酰胺示差脉冲伏安曲线，计算出丙烯酰胺溶液的浓度。
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