CN105017390A

CN105017390A - 抗菌肽His6K及其应用

Info

Publication number: CN105017390A
Application number: CN201510374795.7A
Authority: CN
Inventors: 周玉岩; 罗科; 张珂卿; 逯佩凤
Original assignee: HINAPHARM PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HINAPHARM PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-06-29
Also published as: CN105017390B

Abstract

本发明公开了抗菌肽His6K及其应用。本发明所提供的抗菌肽His6K为如下a)或b)或c)的多肽：a)氨基酸序列是序列表的序列2所示的多肽；b)含有两个以上单拷贝的多肽；所述单拷贝如序列表的序列2所示；c)含有a)或b)所述多肽的融合多肽。实验证明，本发明提供的抗菌肽His6K具有较好的抑菌活性，为抗菌肽Histonin的抑菌活性的1.5倍。

Description

抗菌肽His6K及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗菌肽His6K及其应用。

背景技术

抗菌肽(Antibacterial peptide)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。1974年，瑞典科学家G.Boman等人向眉纹天蚕蛾(Samia Cynthia)蛹注入大肠杆菌后，在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质。经多年的研究，目前已经从动物、植物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。抗菌肽具有抗细菌、真菌、肿瘤和促进伤口愈合等作用，是生物天然免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽是抗生素的理想替代者，具有极好的市场开发前景。

抗菌肽具有极其广阔的应用前景，但由于在生物体内天然抗菌肽含量很少，提取困难，化学合成抗菌肽成本又太高，很难大规模用于食品和饲料等工业。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是获得抑菌活性较高的抗菌肽。

为解决上述技术问题，本发明提供了名称为抗菌肽His6K的多肽。

本发明所提供的抗菌肽His6K为如下(a)或(b)或(c)的多肽：

a)序列表的序列2所示多肽；

b)含有两个以上单拷贝的多肽；所述单拷贝如序列表的序列2所示；

c)含有a)或b)所述多肽的融合多肽。

其中，序列表的序列2由20个氨基酸组成。

所述抗菌肽His6K可为序列表的序列2所示的多肽。

所述抗菌肽His6K可为序列表的序列5的第86-245位所示的多肽。

所述抗菌肽His6K可为序列表的序列5所示的融合多肽。

为了使抗菌肽His6K便于纯化，可在序列表中序列2所示多肽或序列表序列5第86-245位所示多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述抗菌肽His6K可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行蛋白表达得到。上述抗菌肽His6K的编码基因可通过将序列表中序列4第256—738位所示的DNA序列或序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述抗菌肽His6K的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述抗菌肽His6K的核酸分子可为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：

a1)核苷酸序列是序列表的序列3所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为序列表的序列2的所示多肽的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列表的序列2的所示多肽的DNA分子。

所述抗菌肽His6K的核酸分子还可为如下b1)-b6)任一所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表的序列4第256—738位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表的序列4第1—738位所示的DNA分子；

b3)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为序列表的序列5第86-245位所示的多肽的DNA分子；

b4)与b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为序列表的序列5第1-245位所示的多肽的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列表的序列5第86-245位所示的多肽的DNA分子；

b6)在严格条件下与b2)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列表的序列5第1-245位所示的多肽的DNA分子。

含有编码所述抗菌肽His6K的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的生物材料也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在酵母表达载体pPic9K的多克隆位点(例如限制性内切酶酶切位点XhoI和NotI之间)插入序列表的序列4自5’末端第250位至第738位所示的DNA分子得到重组质粒。所述重组微生物具体可为将所述重组质粒导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌具体可为毕赤酵母，例如毕赤酵母X-33。所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

所述抗菌肽His6K在制备抗微生物制剂中的应用也属于本发明的保护范围。所述抗微生物制剂具体可为抗细菌制剂。所述细菌具体可为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，例如ATCC No.25922的大肠杆菌(Escherichia coli)或ATCC No.25923的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

本发明还保护一种抗微生物制剂，其活性成分可为编码所述抗菌肽His6K的核酸分子或含有编码所述抗菌肽His6K的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的生物材料。所述抗微生物制剂具体可为抗细菌制剂。所述细菌具体可为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，例如ATCC No.25922的大肠杆菌(Escherichia coli)或ATCC No.25923的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

本发明提供的抗菌肽His6K对细菌(特别是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)具有非常好抑菌活性，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为质粒pPic9K-His6K结构示意图。

图2为质粒pPic9K-His6K酶切鉴定结果。

图3为X-33-pPic9K-His6K的PCR扩增产物的分析结果。

图4为抗菌肽His6K诱导表达的聚丙酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)，网址为http://www.atcc.org/。

ATCC No.25922的大肠杆菌(Escherichia coli)，简称为大肠杆菌25922。ATCCNo.25923的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，简称金黄色葡萄球菌25923。大肠杆菌DH5α：Life Technologies公司产品，产品目录号为18258-012。毕赤酵母(Pichia postros)X-33：Life Technologies公司产品，产品目录号为C181-00。酵母表达载体pPic9K：Life Technologies公司产品，产品目录号为V175-20。

MD固体培养基：Teknova公司产品，产品目录号为M1304。

YPD液体培养基：Life Technologies公司产品，产品目录号为A13745-01。

YPD固体培养基：向YPD液体培养基中加琼脂至其含量为20g/L得到的培养基。

BMGY液体培养基：溶质及其浓度为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，1.34％YNB，4x10^-5％生物素，甘油10g/L；溶剂为0.1M磷酸缓冲液；pH6.0。

BMMY液体培养基：溶质及其浓度为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，1.34％YNB，4x10^-5％生物素，0.5％甲醇水溶液(体积百分比)，溶剂为0.1M磷酸缓冲液；pH6.0。

实施例1、抗菌肽的人工合成与抑菌活性测定

一、抗菌肽的人工合成

现有技术中的抗菌肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。人工合成序列表的序列1所示的抗菌肽，将其命名为抗菌肽Histonin。

本发明提供的抗菌肽的氨基酸序列如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列3所示。人工合成序列表的序列2所示的抗菌肽，将其命名为抗菌肽His6K。

二、抗菌肽最小抑菌浓度MIC的测定

分别检测抗菌肽(抗菌肽His6K或抗菌肽Histonin)对各个待测菌(大肠杆菌25922或金黄色葡萄球菌25923)的最小抑菌浓度MIC，具体步骤如下：

1、用LB液体培养基悬浮待测菌，得到菌浓度为1*10⁶CFU/mL的菌悬液。

2、取待测抗菌肽，用水溶解并稀释，得到浓度不同的抗菌肽溶液。

3、取96孔细胞培养板，加入步骤1制备的菌悬液(每孔50μl)，然后加入步骤2制备的抗菌肽溶液(每孔50μl；使抗菌肽在孔中的浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0或16.0μg/mL)，37℃静置培养12h，采用酶标仪检测630nm处的吸光值，抑制细菌生长的最低浓度即为MIC。在96孔细胞培养板中设置阴性对照孔，每个阴性对照孔加入100μl LB液体培养基。实验结果见表1。

结果表明，抗菌肽His6K比抗菌肽Histonin具有更好的抗菌活性。

表1抗菌肽Histonin和抗菌肽His6K的最低抑菌浓度(MIC)

抗菌肽	大肠杆菌25922	金黄色葡萄球菌25923
			抗菌肽Histonin	2μg/ml	1μg/ml
抗菌肽His6K	1.5μg/ml	0.5μg/ml

实施例2、抗菌肽His6K的制备及抑菌活性测定

一、重组质粒的构建

1、合成序列表的序列4自5’末端第244-746位核苷酸所示的双链DNA分子。

2、用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切酵母表达载体pPic9K，回收约9.3kb的载体骨架。

4、将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPic9K-His6K(图1)。重组质粒pPic9K-His6K的酶切鉴定结果见图2(图2中，M为DNA分子量Marker；泳道1为限制性内切酶PmeI和NotI的酶切结果；泳道2为限制性内切酶ClaⅠ酶切结果；泳道3为限制性内切酶SnaBI和NcoI的酶切结果)。经测序，对重组质粒pPic9K-His6K进行结构描述如下：将酵母表达载体pPic9K的XhoI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列4自5’末端第250位至第738位所示的DNA分子。重组质粒pPic9K-His6K中，插入的外源DNA分子与载体骨架上的部分DNA融合，形成了序列表的序列4所示的融合基因，表达序列表的序列5所示的融合多肽。序列表的序列5所示的融合多肽自N末端第1-85位氨基酸残基组成酵母分泌信号肽，第86-245位氨基酸残基组成抗菌肽His6K-2。抗菌肽His6K-2中含有9个酵母信号肽蛋白酶Kex2切点(赖氨酸-精氨酸KR)，抗菌肽His6K-2被切割成8个完整的抗菌肽His6K。

二、重组酵母细胞的获得

1、将重组质粒pPic9K-His6K用SacI酶切，获得线性化质粒。

2、将步骤1得到的线性化质粒电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞(电击参数：1500V、25μF、200Ω、5ms；0.2mm电转化杯)，然后在电转化杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，混匀后30℃静置2小时，然后涂布在MD固体培养基平板上，30℃培养2天。

3、完成步骤2后，挑取阳性转化子，接种于YPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡培养12小时。

4、完成步骤3后，取培养体系，涂布于含不同浓度G418的YPD固体培养基平板(G418浓度分别为0.25、0.50、1.0、2.0或4.0mg/mL)上，筛选得到阳性酵母细胞。

5、取步骤4得到的阳性酵母细胞，提取基因组DNA并作为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定(见图3，箭头标注目的条带)，如果显示约1105bp的条带，该酵母细胞即为重组酵母细胞(命名为X-33-pPic9K-His6K细胞)。

F1(对应酵母基因组DNA中的区段)：5’-GGTGCACCTGTGCCGAAACGC-3’；

R1(对应抗菌肽His6K-2基因的区段)：5’-CTTCTTCAACAACTTACCAACAGG-3’。

三、对照酵母细胞的获得

用酵母表达载体pPic9K代替重组质粒pPic9K-His6K，其它同步骤二，得到对照酵母细胞(命名为X-33-pPic9K细胞)。

四、抗菌肽His6K的制备

1、将X-33-pPic9K-His6K细胞或X-33-pPic9K细胞单克隆接种于3ml BMGY液体培养基，30℃、250rpm振荡培养18小时。

2、将步骤1得到的培养体系1:100(体积比)接种到10ml BMMY液体培养基中，30℃、250rpm振荡培养(培养过程中，每24小时加入100μl甲醇，第一次加入甲醇的时间为培养24小时后)。培养过程中每24小时取样1ml，8000rpm离心10min，收集上清液。

3、将步骤2得到的各个上清液进行SDS-PAGE。结果见图4(图4中，M为蛋白质分子量Marker；泳道2为X-33-pPic9K-His6K细胞培养24h后的上清液；泳道3为X-33-pPic9K-His6K细胞培养48h后的上清液；泳道4为X-33-pPic9K-His6K细胞培养72h后的上清液；泳道5为X-33-pPic9K细胞培养72h后的上清液)；结果表明，抗菌肽His6K存在于培养X-33-pPic9K-His6K得到的上清液中，抗菌肽His6K的分子量为2.3kDa。

五、制备的抗菌肽His6K的抑菌活性测定

1、用LB液体培养基悬浮待测菌(大肠杆菌25922或金黄色葡萄球菌25923)，得到OD_600nm＝0.3的菌悬液。

2、取15μl步骤1得到的菌悬液，与30mL 55℃的LB固体培养基(尚未凝固)混匀后铺平板，平板凝固后，用灭菌的打孔器(直径2.7mm)打孔。

3、完成步骤2后，取平板，在孔中滴加20μl待测上清液(步骤四中的X-33-pPic9K-His6K细胞培养24小时的上清液或步骤四中的X-33-pPic9K-His6K细胞培养48小时的上清液或步骤四中的X-33-pPic9K-His6K细胞培养72小时的上清液或步骤四中的X-33-pPic9K细胞培养72h后的上清液或氨苄青霉素溶液(含2μg氨苄青霉素)，37℃静置培养12小时。

结果表明，X-33-pPic9K-His6K细胞培养72小时的上清液对大肠杆菌25922的抑菌圈直径为1.6cm，而X-33-pPic9K细胞培养72h后的上清液对大肠杆菌25922的抑菌圈直径为0.0cm；X-33-pPic9K-His6K细胞培养72小时的上清液对金黄色葡萄球菌25923的抑菌圈直径达1.9cm，而X-33-pPic9K细胞培养72h后的上清液对金黄色葡萄球菌25923的抑菌圈直径为0.0cm。

结果表明，步骤四制备的抗菌肽His6K对金黄色葡萄球菌25923和大肠杆菌25922均有抑菌活性。

Claims

1.一种多肽，是如下(a)或(b)或(c)：

a)序列表的序列2所示多肽；

c)含有a)或b)所述多肽的融合多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽为序列表的序列5的第86位至第245位所示的多肽。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽为序列表的序列5所示的融合多肽。

4.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：

a1)核苷酸序列是序列表的序列3所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为序列表的序列2所示多肽的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列表的序列2所示多肽的DNA分子。

6.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)-b6)任一所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表的序列4第256—738位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表的序列4第1—738位所示的DNA分子；

7.含有权利要求4或5所述核酸分子的表达盒、表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

8.权利要求1至3中任一所述多肽、权利要求4或5所述核酸分子在制备抗微生物制剂中的应用。

9.一种抗微生物制剂，其活性成分为权利要求1至3中任一所述多肽或含有权利要求4或5所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

10.如权利要求9所述的抗微生物制剂，其特征在于：所述抗微生物制剂为抗细菌制剂。