CN105008523B - iNOS抑制剂用于增加培养物中病毒产率的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了iNOS抑制剂，包括金精三羧酸、地塞米松和丙戊酸，用于增加培养物中多种病毒的产率的用途，所述病毒包括重组疱疹病毒。
Description
技术领域
本发明总体涉及用于在培养物中产生病毒和重组病毒体(virion)的方法。具体而言，本发明涉及iNOS抑制剂如金精三羧酸、地塞米松和丙戊酸用于增加多种病毒在培养物中的产率的用途，所述病毒包括重组疱疹病毒，其继而能够用作辅助病毒用于产生重组腺伴随病毒病毒体。
背景技术
疱疹病毒在自然界中高度传播并且发现于大多数动物物种中。已经表征了至少100种疱疹病毒，包括来自人的数种，如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和其他人疱疹病毒如HHV6和HHV7。这些病毒是造成多种人类疾病的原因，如皮肤感染、生殖器疱疹、病毒性脑炎等。
HSV-1感染通过诱导胞内信号传导途径而激活宿主防御和先天免疫系统，所述胞内信号传导途径导致具有促炎活性和杀微生物活性的蛋白质的表达，包括细胞因子和干扰素(INF)(Sainz and Halford,J.Virol.(2002)76:11541–11550；Haller等,Virology(2006)344:119–130；Paludan等,Nat.Rev.Immunol.(2011)11:143-154)。INF信号传导是最重要的用于病毒清除的细胞防御机制之一(Brandner&Mueller,Hoppe-Seyler′sZeitschriftfür physiologische Chemie(1973)354:1176；De Vries等,Gene Ther.(2008)15:545-552)。
研究者们已经报道了一氧化氮(NO)针对数种病毒的抗病毒活性，这些病毒包括牛痘病毒、水泡性口炎病毒和日本脑炎病毒等(Bi等,J.Virol.(1995)69:6466-6472；Harris等,J.Virol.(1995)69:910-915；Lin等,J.Virol.(1997)71:5227-5235；Pertile等,AvianDis.(1996)40:342-348)。NO是一种自由基气态分子并且是宿主防御的中介体(mediator)(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91:2446-2452；Karupiah等,Science(1993)261:1445-1448；Rolph等,Virol.(1996)217:470-477；Amaro等,J.Med.Virol.(1997)51:326-331；Lane等,J.Virol.(1997)71:2202-2210)。已知HSV-1既诱导又规避宿主抗病毒应答(Mossman等,J.Virol.(2001)75:750-758)。HSV感染能够诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，其是一种编码产生大量NO的NOS的诱导型同种型的基因。
已经将疱疹病毒及其重组蛋白用于制造多种疫苗。除腺病毒以外，已经显示疱疹病毒为重组腺伴随病毒病毒体的产生提供了完整的辅助病毒功能(Buller,R.M.L.,J.Virol.(1981)40:241-247；Mishra等,Virology(1990)179:632-639)。已经鉴定出AAV复制和包装所需的HSV-1基因的最小集合为早期基因UL5、UL8、UL52和UL29(Weindler等,J.Virol.(1991)65:2476-2483)。这些基因编码HSV-1核心复制机构的组分——解旋酶、引发酶和引发酶辅助蛋白(UL5、UL8和UL52)和单链DNA结合蛋白(UL29)。
重组AAV(rAAV)载体已经成功地用于实现长期、高水平体内转导。尽管取得了上述进展，用于基因治疗的大量临床级高滴度rAAV病毒体的生产依然是挑战性的，因为共转染方案的可扩展性(scalability)有限。该过程需要三种组分的有效细胞递送：(1)包括侧翼为AAV反向末端重复(ITR)的感兴趣的基因的载体；(2)包括AAV rep和cap基因的载体；和(3)使用辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒或使用无病毒辅助质粒提供的基因(参见，Muzyczka,N.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1992)158:97-129)。如此，在基于rHSV的rAAV生产方案中，rAAV的产率受到辅助rHSV载体最大滴度的限制。
一种称为d27.1-rc的复制缺陷型HSV-1载体表达AAV-2 rep和cap基因(Conway等,Gene Ther.(1999)6:986-993)，并且其已经从原始的d27-1病毒经工程改造(Rice等,J.Virol.1989vol.63(8)pp.3399-407)，其不产生ICP27，一种HSV-1复制所需的蛋白质。尽管这种载体是复制缺陷型的，但是它确实表达rAAV复制和包装所需的HSV-1早期基因(Conway等,Gene Ther.(1999)6:986-993)。
通常而言，将一种携带rAAV模板的载体和其他表达AAV rep和cap区的载体共转染至293细胞中以产生rAAV病毒体。两种HSV-1载体均为复制缺陷型的，并且因此只能在ICP27补充细胞系V27中增殖(Rice等,J.Virol.1989vol.63(8)pp.3399-407)。在基于HSV的AAV产生方案中，293细胞需要以较高的感染复数(MOI)12来感染。这代表了某种限制，因为d27-1-衍生载体在V27细胞中的产率通常在1X107蚀斑形成单位(PFU)/ml左右。
为了进一步增加HSV-1滴度，已经调查了数种方法和试剂(参见，例如，Wechuck等,Biotechnol.Prog.(2000)16:493-496；Ozuer等,Biotechnol.Prog.(2002)18:476-482；Erlandsson等,J.Endocrinol.,(2002)175:165-176；Otsuki等,Mol.Ther.(2008)16:1546-1555)。地塞米松和丙戊酸二者抑制了由数种干扰素(IFN)应答性抗病毒基因代表的宿主防御机制，加强了病毒基因的转录水平，并因此改进了HSV-1的病毒增殖和产率(Erlandsson等,J.Endocrinol.(2002)175:165-176；Otsuki等,Mol.Ther.(2008)16:1546-1555)。
尽管已有上述知识，需要更多抑制宿主防御从而改进培养物中病毒产生的方法。如上所解释的，研究者们报道了一氧化氮(NO)针对数种病毒如牛痘病毒、水泡性口炎病毒和日本脑炎病毒等的抗病毒活性(Bi等,J.Virol.(1995)69:6466-6472；Harris等,J.Virol.(1995)69:910-915；Lin等,J.Virol.(1997)71:5227-5235；Pertile等,AvianDis.(1996)40:342-348)。NO是一种自由基气态分子并且是宿主防御的中介体(mediator)(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91:2446-2452；Karupiah等,Science(1993)261:1445-1448；Rolph等,Virol.(1996)217:470-477；Amaro等,J.Med.Virol.(1997)51:326-331；Lane等,J.Virol.(1997)71:2202-2210)。如上所述，HSV感染能够诱导iNOS表达，其是一种编码产生大量NO的NOS的诱导型同种型的基因。
iNOS抑制剂N-甲基-L-精氨酸(L-NMA)的存在对于全部三种这些病毒逆转了对病毒复制的抑制(Karupiah等,Science(1993)261:1445-1448)。关于iNOS抑制剂的综述，参见Southan等,Biochem.Pharmacol.(1996)51:383-394。已经显示另一化合物金精三羧酸(ATA)通过下调iNOS表达并因此减少NO产生来保护巨噬细胞免于由细菌脂多糖诱导的细胞死亡(Chen等,British Journal of Pharmacology(2002)vol.137(7)pp.1011-20)。ATA是一种聚合物的异质混合物，被认为具有数量增加的生物活性，如与多种酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)、氨酰基-tRNA-合成酶、核糖核苷酸还原酶、核糖核酸酶、核酸酶的相互作用，蛋白质合成抑制，对凋亡的防止和阻断少突胶质细胞中由氧化应激诱导的DNA断裂(Tscherne and Pestka,Antimicrob.Agents Chemother.(1975)8:479-487；Mikelens等,Biochemical Pharmacology(1976)25:821-827；Vollgraf等,J.Neurochem.(1999)73:2501-2509)。
也已经报道了金精三羧酸(ATA)防止IFN-介导的转录激活(Tsi等,Mol.Pharmacol.(2002)101:90-101；Chen等,British J.Pharmacol.(2002)137:1011-1020)。已知ATA是Raf/MEK/MAPK途径、IGF-1受体和蛋白激酶C信号转导的激活剂(Beery等,Endocrinology(2001)142:3098-3107；Chen等,J.Biol.Chem.(2001)276:46722-46728)。细胞因子如干扰素的抗病毒抗微生物和抗增殖作用可能是因为它们诱导iNOS表达的能力，iNOS是一种编码一氧化氮合酶(NOS)的同种型的基因，一氧化氮合酶从L-精氨酸的胍基氮产生大量的自由基气体(radical gas)NO(Nathan,C.,FASAB J.(1992)6:3051；Werner-Felmayer等,J.Exp.Med.(1990)172:1599)。已经显示用IFN-γ处理巨噬细胞严重限制鼠痘病毒(ectromelia virus；EV)、牛痘病毒(VV)和HSV-1的复制。
一方面，还已知ATA是一种对抗数种病毒的抗病毒剂，所述病毒包括HIV、疱疹病毒HHV-7、SARS-CoV等(Cushman等,J.Med.Chem.(1991)34:329-3371991；Zhang等,AntiviralRes.(1999)43:23-35；Yap等,Computational Biol.and Chem.(2005)29:212-219；DeClercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31:118-160)。然而，ATA不阻断腺病毒5型(Ad5)在HEK-293细胞中的复制(He,Biochem.Biophys.Res.Comm.(2004)320:1199-1203)。另外，已经报道了ATA出乎预料地增加了对照腺病毒载体在293细胞中的滴度，同时对牛痘病毒具有抗病毒效果(Myskiw等,J.Virol.(2007)81:3027-3032)。
发明内容
本发明通过解决限制病毒生产的问题，如低rHSV产生，其妨碍产生足量rHSV用于多种目的(包括用于疫苗生产以及用于rAAV病毒体以有效基因治疗过程所必需的量生产)的努力，由此克服了现有技术中的缺陷。使用本文描述的方法，能够获得更高滴度的多种病毒，如比传统方法高至少一个数量级。
具体来说，本发明的发明人发现了金精三羧酸(ATA)抑制iNOS并增加HSV产生。如本文实施例中所示，微摩尔浓度的ATA在胎牛血清(FBS)的存在下同时增加了V27细胞中HSV-1/d27-1载体的产率和Vero、V27和293细胞中的野生型(wt)HSV-1病毒。其他iNOS抑制剂，包括地塞米松和丙戊酸，也增加了培养物中的HSV-1滴度。如通过SABiosciencesMicroarray所分析的，已经显示了在HSV+ATA样品中HSV诱导的iNOS表达是减少的。类似地，Affymetrix人类基因组阵列分析确认了HSV上调的全部三种一氧化氮合酶基因(nNOS、iNOS和eNOS)的表达在HSV+ATA样品中是下调的。Affymetrix Gene Array也检测到了炎性IgE和IFN信号传导中牵涉的基因和全身性免疫应答通过HSV-1上调并且在添加ATA之后受到阻抑。另一方面，细胞周期G1/S中主要牵涉的基因、WNT发育中的信号转导通过HSV显著下调并且在添加ATA之后受到上调。
鉴于对用于rAAV病毒体生产以及用于预防、治疗和诊断目的的更高HSV-1滴度的需求，这些结果意义重大。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于产生病毒的方法，包括在包含金精三羧酸的细胞培养物中培养病毒。在某些实施方案中，所述病毒是疱疹病毒，如HSV-1。
在另外的实施方案中，所述疱疹病毒是野生型HSV-1或重组HSV-1载体，如HSV-1d27.1载体。
在进一步的实施方案中，将所述病毒培养在293、HeLa或Vero细胞中，如V27细胞中。
又在另外的实施方案中，本发明涉及用于培养HSV-1 d27.1载体的方法，包括：
(a)用HSV-1 d27.1载体感染V27细胞；和
(b)将感染的V27细胞在包含金精三羧酸、丙戊酸或地塞米松的细胞培养物中培养。
在某些实施方案中，所述细胞培养物进一步包含血清，如胎牛血清。
在进一步的实施方案中，本发明涉及细胞培养物，其包含金精三羧酸和293、HeLa或Vero细胞，如V27细胞。
鉴于本文公开的内容，题述发明的这些和其他实施方案对于本领域技术人员而言将会是容易想到的。
附图简述
图1是显示金精三羧酸(ATA)抑制d27-1感染的V27裂解物中iNOS表达的蛋白质印迹的图示。
图2A-2C显示ATA-HSV方案原理(图2A)和对V27上清中d27-1 HSV-1滴度的优化以确定哪些关于ATA添加的浓度和条件对HSV产率有影响。图2B显示病毒滴度，表示为六孔板(图2B)和T150烧瓶(图2C)中在多种ATA浓度下的DNA酶抗性颗粒(DRP/ml)。
图3显示ATA-HSV方案中血清存在的重要性。ATA-HSV方案中FBS存在的其他优化和重要性在表示为drp/ml和pfu/ml的d27-1 HSV-1滴度上显示。
图4A-4B显示ATA对培养物中野生型HSV KOS和McIntyre株的效果。ATA增加了两种病毒类型在Vero细胞中的产率，然而，ATA似乎抑制了293细胞中的HSV-1 KOS生长。另一方面，wtHSV-1 McIntyre株在293细胞中ATA诱导之后达到了最高滴度。另外，ATA似乎抑制了HeLa细胞中两种类型的HSV-1病毒。
图5A-5B显示HSV储液中ATA对rAAV病毒体生产的效果。当使用在感染过程中添加了20μM ATA制备的HSV储液时，rAAV滴度稍有升高。当在2小时的HSV共感染步骤期间将10μMATA直接掺入293细胞培养基中时，还显示ATA增加了rAAV滴度。
图6显示地塞米松(Dex)对d27-1/GFP HSV-1病毒滴度的效果。大体上，最终滴度d27-1/GFP HSV-1在dex预处理或处理之后与未经处理的对照相比稍有升高。
图7显示通过丙戊酸(VA)预处理对d27-1/GFP HSV-1病毒滴度的效果。与未经处理的对照相比，浓度5mM的VA稍微提升了d27-1/GFP HSV-1的滴度，然而低于和高于5mM的浓度似乎对d27-1/GFP HSV-1滴度具有抑制作用。
发明详述
除非另行指明，本发明的实施会采用化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学中在本领域技术范围内的常规方法。这些技术在文献中得到完整阐释。参见，例如，FundamentalVirology,第2版,卷I&II(B.N.Fields and D.M.Knipe编)；Handbook of ExperimentalImmunology,卷I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell编,Blackwell ScientificPublications)；T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本)；Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)。
本文引用的全部出版物、专利和专利申请，无论是在上文或是在下文中，均通过提述以其整体并入本文。
1.定义
在描述本发明时，下列术语将会被采用，并且意图以如下文所指明的进行定义。
必需注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数的指代物，除非该内容另外指明。因此，例如，提及“疱疹病毒”包括两种或多种这类病毒的混合物等。
术语“重组HSV”、“rHSV”和“rHSV载体”指单纯疱疹病毒(HSV)的分离的、经遗传修饰的形式，其含有并入至病毒基因组中的异源基因。术语“rHSV/rc”或“rHSV/rc病毒”或“rHSV辅助功能载体”意指其中已将AAV rep和/或cap基因并入至该rHSV基因组中的rHSV。术语“rHSV表达病毒”和“rHSV/AAV”指其中已将来自AAV的反向末端重复(ITR)序列并入至该rHSV基因组中的rHSV。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物并且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在该定义之内。全长蛋白质及其片段二者均涵盖在该定义中。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，就本发明而言，“多肽”指包括对天然序列的修饰如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保持了期望的活性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是意外的，如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增中的错误。依赖于使用的表达系统，多肽可以包括或缺乏N-末端甲硫氨酸。另外，多肽可以或可以不包括天然信号序列，如果其天然存在的话。如果信号序列正常情况下不存在，那么蛋白质可以以异源序列产生。
“天然”多肽指与源自自然界的相应分子具有相同氨基酸序列的多肽。这些天然序列能够分离自自然界或者能够通过重组或合成手段产生。术语“天然”序列具体涵盖特定分子天然存在的截短或分泌形式(例如，胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可选剪接形式(alternatively spliced form))和多肽天然存在的等位变体。
“变体”意指如本文定义的与相应的全长天然序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性多肽，缺乏信号肽的多肽，具有或不具有信号肽的多肽的胞外结构域，或本文公开的全长多肽序列的任何其他片段。这些多肽变体包括，例如，其中在全长天然氨基酸序列的N-和/或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常而言，变体与相应的全长天然序列会具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％氨基酸序列同一性，或者至少约82％氨基酸序列同一性，或者至少约83％氨基酸序列同一性，或者至少约84％氨基酸序列同一性，或者至少约85％氨基酸序列同一性，或者至少约86％氨基酸序列同一性，或者至少约87％氨基酸序列同一性，或者至少约88％氨基酸序列同一性，或者至少约89％氨基酸序列同一性，或者至少约90％氨基酸序列同一性，或者至少约91％氨基酸序列同一性，或者至少约92％氨基酸序列同一性，或者至少约93％氨基酸序列同一性，或者至少约94％氨基酸序列同一性，或者至少约95％氨基酸序列同一性，或者至少约96％氨基酸序列同一性，或者至少约97％氨基酸序列同一性，或者至少约98％氨基酸序列同一性以及或者至少约99％氨基酸序列同一性。通常而言，变体多肽的长度为至少约10个氨基酸，如长度为至少约20个氨基酸，例如长度为至少约30个氨基酸，或者长度为至少约40个氨基酸，或者长度为至少约50个氨基酸，或者长度为至少约60个氨基酸，或者长度为至少约70个氨基酸，或者长度为至少约80个氨基酸，或者长度为至少约90个氨基酸，或者长度为至少约100个氨基酸，或者长度为至少约150个氨基酸，或者长度为至少约200个氨基酸，或者长度为至少约300个氨基酸，或更长。
特别优选的变体包括在性质上保守的取代，即，在其侧链中有相关性的氨基酸家族之内发生的那些取代。具体而言，通常将氨基酸分为四个家族：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不荷电极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有些时候被归类为芳族氨基酸。例如，能够合理预见用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸或用结构上相关的氨基酸对某个氨基酸进行的相似保守替代不会对生物活性产生显著影响。例如，感兴趣的多肽可以包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或者甚至多达约15-25或50个保守或非保守氨基酸取代，或者5-50之间的任意数量，只要该分子的预期功能保持完整。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的百分比同一性。当两个DNA或两个多肽序列在分子的限定长度上展现出至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约80％-85％，优选至少约90％，和最优选至少约95％-98％序列同一性时，所述序列彼此“基本上同源”。如本文所使用的，基本上同源也指与指定DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。
总体而言，“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列中精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应性。百分比同一性可以通过直接比较两个分子之间的序列信息来测定，其通过对齐序列、计数两条对齐的序列之间的精确匹配数、除以较短序列的长度并将结果乘以100来进行。可以容易地获得的计算机程序可用于辅助分析，如Atlas of ProteinSequence and Structure M.O.Dayhoff ed.,5 Suppl.3:353-358,National BiomedicalResearch Foundation,Washington,DC中的ALIGH,Dayhoff,M.O.，其将Smith和WatermanAdvances in Appl.Math.2:482-489,1981的局部同源性算法适用于肽分析。用于测定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin Sequence Analysis Package版本8(可从GeneticsComputer Group,Madison,WI获得)中获得，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和Waterman算法。用制造商推荐并记载在上文提到的Wisconsin Sequence AnalysisPackage中的缺省参数方便地利用这些程序。例如，特定核苷酸序列与参考序列的百分比同一性可以使用Smith和Waterman的同源性算法以缺省计分表和6个核苷酸位置的缺口罚分来测定。
在本发明的上下文中另一种建立百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包，其由爱丁堡大学(University of Edinburgh)拥有版权，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行。根据这种程序包套件，Smith-Waterman算法可以在对计分表使用缺省参数的情况下(例如，缺口开启罚分为12，缺口延伸罚分为1，并且缺口为6)应用。在生成的数据中，“匹配”值反映“序列同一性”。其他适合于计算序列之间百分比同一性或相似性的程序通常是本领域已知的，例如，另一比对程序是BLAST，以缺省参数使用。例如，BLASTN和BLASTP可以使用以下缺省参数来使用：遗传编码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截留值＝60；预测值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50序列；分类依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations(GenBank CDS翻译库)+Swiss protein(Swiss蛋白质库)+Spupdate+PIR。这些程序的详细情况是本领域已知的。
可供选择地，同源性能够通过在同源区形成之间稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，接着用单链特异性核酸酶消化，并测定消化片段的大小，由此来测定。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中鉴定，所述实验在例如严格条件下进行，如对于该特定系统所限定的。限定合适的杂交条件属于本领域的技术。参见，例如，Sambrook等，见上文；DNACloning，见上文；Nucleic Acid Hybridization，见上文。
术语“简并变体(degenerate variant)”意指在其核酸序列中含有变化的多核苷酸，其编码与该简并变体所衍生自的多核苷酸编码的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。
“编码序列”或“编码”选定的多肽的序列是当置于合适调节序列控制下时在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止序列可以位于编码序列的3′。
“载体”意指任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，当与适当的控制元件相关联时其能够复制并且其能够将基因序列转移到细胞。因此，该术语包括克隆和表达运载体(vehicle)，以及病毒载体。
“重组载体”意指包括异源核酸序列的载体，其能够在体内表达。
“重组病毒”意指遗传上已经改变的病毒，例如，通过将异源核酸构建体添加或插入至颗粒中。
术语“转基因”指被引入细胞中并能够在合适条件下被转录成RNA并任选地翻译和/或表达的多核苷酸。在一个方面，其赋予其被引入其中的细胞期望的属性，或以其他方式导致期望的治疗或诊断结果。
术语“基因组颗粒(gp)”和“基因组等同物”在涉及病毒滴度使用时，指含有重组AAV DNA基因组的病毒体的数目，而无论感染性或功能性。特定载体制备物中基因组颗粒的数目可通过本领域已知的方法测量，如描述于例如，在Clark等,Hum.Gene Ther.(1999)10:1031-1039；和Veldwijk等,Mol.Ther.(2002)6:272-278中的方法。
术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单元”，在涉及病毒滴度使用时，指感染性重组AAV载体颗粒的数目，如由感染性中心测定法(也称为复制中心测定法)所测量的，如描述于例如McLaughlin等,J.Virol.(1988)62:1963-1973中。
术语“转导单位(tu)”，在涉及病毒滴度使用时，指导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的的数目，如在功能性测定法中测量的，例如描述于例如Xiao等,Exp.Neurobiol.(1997)144:1 13-124；或Fisher等,J.Virol.(1996)70:520-532(LFU测定法)中。
术语“转染”用于指由细胞摄取外源DNA，并且当外源DNA已引入细胞膜内侧时细胞已被“转染”。若干转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等(1973)Virology,52:456,Sambrook等(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold SpringHarbor Laboratories,New York、Davis等(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,和Chu等(1981)Gene13:197。这样的技术可以用来将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。
术语“异源的”，在它涉及核酸序列如编码序列和调控序列时，表示通常不接合在一起，和/或通常不与特定细胞相关联的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源的”区域是在另一核酸分子内或与另一核酸分子附接的核酸片段，其在自然界中没有发现与所述另一分子相关联。例如，核酸构建体的异源区域可以包括侧翼为在自然界中没有发现与编码序列相关联的序列的编码序列。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身在自然界中没有发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞就本发明而言会被认为是异源的。如用于本文，等位基因变异或天然发生的突变事件不造成异源DNA。
“核酸”序列指DNA或RNA序列。该术语囊括的序列包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物，例如，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯(uracil-5-oxyacetic acid methylester)、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、–尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
术语DNA“调控序列”泛指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制的起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。不是所有这些控制序列都需要始终存在，只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。
术语“启动子”在本文中按其普通含义使用，指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列源自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3′方向)编码序列转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻遏型启动子”(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。
“可操作地连接”指元件的排布，其中如此描述的组分经配置以便执行它们通常的功能。因此，可操作地连接于编码序列的调控序列能够实现编码序列的表达。调控序列不需要与编码序列邻接，只要调控序列发挥引导编码序列表达的功能即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在间插的非翻译但转录的序列，而启动子序列仍然可以被认为是与编码序列“可操作地连接”。
当涉及蛋白质或核苷酸序列时，“分离的”意指所指示的分子在基本上不存在其他相同类型的生物学大分子的条件下存在。因此，例如，“编码特定多肽的分离的核酸分子”指基本上不含不编码主题多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而，该分子可以包括一些不有害地影响组合物的基本特征的额外的碱基或部分。
在本申请通篇中，为了描述核苷酸序列在特定核酸分子中的相对位置，例如当特定核苷酸序列被描述为位于相对于另一序列的“上游”、“下游”、“3-撇(3′)”或“5-撇(5′)”，应理解为其是如本领域常规所指的DNA分子的“有义”或“编码”链中序列的位置。
术语“约”，尤其是涉及给定的量时，意指涵盖正负百分之五的偏差。
2.发明的实施方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的配方或过程参数，因为这些当然可以变化。还应理解本文使用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，而不旨在进行限制。
尽管可以使用与本文描述的那些相似或等同的多种方法和材料来实施本发明，本文描述了优选的材料和方法。
本发明的核心在于发现微摩尔浓度的金精三羧酸(ATA)增加HSV-1载体产率。这项发现对于大规模HSV生产以及rHSV和rAAV载体的产生都很重要。除此之外令人惊讶的是，如实施例中所示，rHSV-1储液中ATA的存在不负面影响rAAV产率。这项结果是令人惊讶的，因为已知毫摩尔量和更高浓度的ATA是一种抗病毒剂(Cushman等,J.Med.Chem.(1991)34:329-337；Zhang等,Antiviral Res.(1999)43:23-35；Yap等,Computational Biol.andChem.(2005)29:212-219；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31:118-160)。
如上文所阐释的，研究者们已经报道了一氧化氮(NO)针对几种病毒的抗病毒活性，所述病毒如牛痘病毒、水泡性口炎病毒和日本脑炎病毒等(Bi等,J.Virol.(1995)69:6466-6472；Harris等,J.Virol.(1995)69:910-915；Lin等,1997；Pertile等,Avian Dis.(1996)40:342-348)。NO是一种自由基气态分子，是宿主防御的中介体(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91:2446-2452；Karupiah等,Science(1993)261:1445-1448；Rolph等,Virol.(1996)217:470-477；Amaro等,J.Med.Virol.(1997)51:326-331；Lane等,J.Virol.(1997)71:2202-2210)。HSV感染能够诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，其是一种编码产生大量NO的NOS的诱导型同种型的基因。
如本文所示，ATA阻抑HSV上调的iNOS并由此增加培养物中的HSV滴度。其他iNOS抑制剂，包括地塞米松和丙戊酸，也具有相同的效果。然则在一个实施方案中，这样的iNOS抑制剂的使用增加培养物中重组疱疹病毒的滴度，允许产生与不存在该特定抑制剂条件下产生的相比显著更多的病毒。通过所述方法产生的病毒可用于多种情形中，包括用于预防、治疗和诊断目的，以及用于以足以在用于基因递送和基因治疗的重组病毒体制备中使用的量产生重组构建体。
金精三羧酸(ATA)，即5-((3-羧基-4-羟基苯基)(3-羧基-4-氧代-2,5-环己二烯-1-亚基)甲基)-2-羟基苯甲酸(5-((3-carboxy-4-hydroxyphenyl)(3-carboxy-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)methyl)-2-hydroxybenzoic acid)，是当用甲醛、硫酸和亚硝酸钠处理水杨酸时形成的非硫酸化荷负电芳族聚合物的异质混合物(参见Cushman,等,(1991)J.Med.Chem.34:329-337；Cushman,等,J.Med.Chem.34:337-342)。金精三羧酸具有下式：
ATA的异质混合物据描述抑制蛋白质核酸相互作用(Gonzalez等,Biochim.Biophys.Acta,(1979)562:534-545)；与类固醇受体在核摄取和核结合水平相互作用(Mellon,W.S.,Biochem.Pharmacol.(1984)33:1047-1057；Moudgil等,J.SteroidBiochem.(1985)23:125-132)；抑制DNA聚合酶(Nakane等,Eur.J.Biochem.(1988)177:91-96)；和作为RNA酶抑制剂发挥作用(Skidmore等,Biochem.J.(1989)263:73-80)。
用于向培养物中的病毒添加的ATA可以以酸性形式使用或者可以作为盐提供，如金精三羧酸三钠盐；钙盐；铵盐等。
在本发明方法中会有用的其他物质包括地塞米松(Dex)和丙戊酸(VA)。已经显示Dex在大鼠系膜细胞中在转录和转录后水平抑制iNOS表达(Kunz等,Biochem.J.(1994)304:337-340；Kunz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:255-259)。已经显示Dex增强PC12细胞中的HSV-1 oriL DNA复制。丙戊酸钠，即VA的钠盐，已经显示刺激HSV-1、人巨细胞病毒、HIF-1、人疱疹病毒-8、麻疹病毒和骨髓灰质炎病毒1型的复制(Motamedifar等,Iran.J.Med.Sci.(2006)31:28-32；Kuntz-Simon等,J.Gen.Virol(1995)76:1409-1415；Moog等,J.Gen.Virol(1996)77:1993-1999；Ylisastigui等,AIDS(2004)18:1101-1108；Shaw等,AIDS(2000)14:899-902；Kabiri等Iran J.Med.Sci.(2001)26:55-61)。此外，已经显示丙戊酸抑制iNOS(Guo等,Surgery(2007)142:156-162)。与ATA一样，VA或其盐，如钠、钙、铵盐等，可用于本方法中。
尽管本文例示了使用ATA、Dex和VA以较高滴度产生rHSV-1载体，这些iNOS抑制剂可用于增加多种病毒在培养物中的滴度，例如但不限于如下科的病毒：腺病毒科(Adenoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒科(Caliciviridae)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒、登革热病毒等)；黄病毒科(Flaviviridae)；冠状病毒科(Coronaviridae)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)；双核糖酸病毒科(Birnaviridae)；弹状病毒科(Rhabodoviridae)(例如，狂犬病病毒等)；痘病毒科(Poxviridae)；丝状病毒(Filoviridae)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒甲、乙和丙型，等)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；各种肝炎病毒，如甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒；乳头状瘤病毒和轮状病毒；逆转录病毒；等等。对于这些和其他病毒的描述，参见，例如Virology,3rd Edition(W.K.Joklik ed.1988)；Fundamental Virology,2nd Edition(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.1991)。这些病毒或源自它们的免疫原可用于疫苗和诊断剂的生产。另外，这些病毒中的一些，且具体而言疱疹病毒可用于产生重组载体以供产生用于下文描述的基因递送技术的重组病毒体。
如此，ATA、Dex和VA可用于增加作为疱疹病毒科成员的任何疱疹病毒的产率。这包括马疱疹病毒、牛疱疹病毒(BHV)和人单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型如BHV-1、BHV-2、HSV-1和HSV-2、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、HHV6和HHV7等。疱疹病毒可以源自所述许多毒株中的任一。例如，当使用本发明产生的病毒是HSV时，所述病毒可源自，例如，HSV-1或HSV-2，并且可以来自多种HSV毒株中的任一，如HSV-1毒株KOS、HSV-1毒株McIntyre、HSV-1毒株Patton、HSV-2毒株333、HSV-2毒株G等。另外，产生的病毒可以是野生型病毒，或其衍生物，包括重组病毒和含有来自HSV-1和HSV-2的DNA的类型间重组体(inter-type recombinant)。衍生物优选与HSV-1或HSV-2基因组中的任一或其部分具有至少70％序列同源性，更优选至少80％，甚至更优选至少90或95％。衍生物可以具有通过核苷酸取代修饰的HSV-1或HSV-2基因组的序列，所述取代例如，1、2或3至10、25、50或100个取代。HSV-1或HSV-2基因组可以可替代地或额外地通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在任一末端或两个末端的延伸来修饰。
其他衍生物包括在基因中已经具有突变的毒株，特别是基因中导致病毒减毒的突变。这些病毒的实例包括毒株1716(MacLean等,J.Gen.Virol.(1991)72:632-639)、毒株R3616和R4009(Chou and Roizman,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1992)89:3266-3270)和R930(Chou等,J.Virol.(1994)68:8304-8311)，其全部具有ICP34.5中的突变，毒株d120，其具有ICP4中的缺失(DeLuca等,J.Virol.(1985)56:558-570)，毒株d27-1(Rice and Knipe,J.Virol.(1990)64:1704-1715)其具有ICP27中的缺失，或毒株d92，其具有ICP27和ICP4二者中的缺失(Samaniego等,J.Virol.(1995)69:5705-5715)。描述多种HSV基因时使用的术语可参见，例如，Coffin and Latchman(1996),In:Genetic Manipulation of theNervous System(DS Latchman Ed.)pp 99-114:Academic Press,London。
正如很容易看出的，任何对于预期目的合适的rHSV均可用于本发明。在某些实施方案中，本发明中使用的rHSV是复制缺陷型。对于rAAV病毒体的产生，用不能复制的rHSV感染生产者细胞是优选的，因为与牵涉腺病毒使用的方法相反，rHSV不成为rAAV产物的显著污染物。这可用于通过去掉与去除腺病毒相关的纯化步骤来增加rAAV病毒体的最终产率。在本发明的具体实施方案中，rHSV构建自HSV-1的突变体，在所述突变体中由于ICP27基因中的缺失而不能复制。任何展现出复制缺陷型表型的其他合适的HSV突变体也可用于构建rHSV。
一种用于使用提述方法进行rAAV产生的特别优选的重组突变体HSV-1毒株是HSV-1毒株d27-1。这种毒株可以如例如Conway等,Gene Ther.(1999)6:973 985和美国专利号7,091,029中所述制备，将其通过提述整体并入本文。如上文所阐释的，这种突变载体不产生ICP27并且有利地用于产生rAAV病毒体，因为已知宿主细胞剪接信使RNA受到ICP27的抑制。ICP27也可能影响AAV-2 rep和cap信使的适当剪接。这种载体是复制缺陷型并且显示出与野生型(wt)HSV-1相比降低的细胞毒性。病毒d27-1展现出其他几种对于作为辅助病毒用于rAAV病毒体产生的用途有利的特征。首先，其表达已知为rAAV产生所需的早期基因(Weindler等,J.Virol.(1991)65:2476-2483)。另外，d27.1过表达ICP8，即作为UL29的产物的单链DNA结合蛋白，UL29是对于AAV复制和包装而言关键的HSV-1基因之一(Weindler等,J.Virol.(1991)65:2476-2483)。
AAV基因组是一种线性的、单链DNA分子，含有约4681个核苷酸。AAV基因组通常包含内部、非重复基因组，其各个末端的侧翼为反向末端重复(ITR)。ITR的长度为大约145个碱基对(bp)。ITR具有多种功能，包括提供DNA复制的起点和用于病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大开读框(open reading frame)，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码允许病毒复制和包装至病毒体中的病毒蛋白。具体而言，从AAV rep区表达一个家族的至少四种病毒蛋白，即Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，根据它们的表观分子量命名。AAV cap区域编码至少三种蛋白质，VPI、VP2和VP3。
“AAV rep编码区”意指领域内公认的AAV基因组中编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40的区域。已经显示这些Rep表达产物拥有多种功能，包括识别、结合和切割(nicking)DNA复制的AAV起点，DNA解旋酶活性和调节从AAV(或其他异源)启动子的转录。Rep表达产物共同为复制AAV基因组所需。关于对AAV rep编码区的描述，参见，例如，Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。AAV rep编码区的合适同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，其也已知介导AAV-2DNA复制(Thomson等(1994)Virology204:304-311)。
“AAV cap编码区”意指领域内公认的AAV基因组中编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物的区域。这些Cap表达产物提供包装功能，其共同为包装病毒基因组所需。关于对AAV cap编码区的描述，参见，例如，Muzyczka,N.and Kotin,R.M.(见上文)。
通常有两种rHSV载体会用于产生rAAV病毒体。一种是rHSV辅助功能载体，其中已经将AAV rep和/或cap基因并入了rHSV基因组。另一种是rHSV表达载体，其中已经将来自AAV的ITR序列并入了rHSV基因组并且在感兴趣的基因的侧翼。
如此，在一个实施方案中，iNOS抑制剂能够用于增加含有AAV rep和/或cap基因的第一rHSV载体的产率。所述方法的第一rHSV载体的实施方案包括但不限于基于存在于AAV的多种血清型中的cap基因或其变体的基因构建体，所述AAV的多种血清型包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5和AAV-6、AAV-7和AAV-8、山羊(caprine)和牛AAV(参见，例如，美国公开号20080292595，其通过提述整体并入本文)。同样属于本发明范围的是来自新的AAV血清型的rep和cap基因，和通过对现存血清型的重组和突变进行修饰的那些。AAV辅助功能载体的rep和cap基因能够源自任何已知的AAV血清型，如上文所阐释的。例如，rHSV辅助功能载体可以具有源自AAV-2的rep基因和源自AAV-6的cap基因；本领域技术人员会认识到其他rep和cap基因组合是可能的，限定性特征是支持rAAV病毒体产生的能力。
在某些实施方案中，AAV rep和cap基因在rHSV辅助功能载体中可以通过它们天然的启动子驱动。AAV-2的p5和p19启动子分别调控Rep 78和68以及Rep 52和40的表达。p40启动子调控VP1、VP2和VP3的表达。此外，异源启动子可以用于驱动AAV基因的表达。能够用于所公开的方法的其他启动子的实例包括但不限于SV40早期启动子、CMV启动子、HSV-1胸苷激酶(HSV-1tk)启动子、金属硫蛋白诱导型启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子和鸡β-肌动蛋白启动子。
可以将基因构建体插入HSV基因组中适合于整合rep和cap基因的任意一个或多个位点。在某些实施方案中，所述载体通过将AAV rep和cap基因同源重组至rHSV-1病毒的胸苷激酶(tk)基因座中构建，如Conway等,Gene Ther.(1999)6:986-993和美国专利号7,091,029中所述，将它们通过提述整体并入本文。
如本文所阐释的，rHSV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)，其发挥反式(in trans)功能用于生产性AAV复制和衣壳化(encapsidation)。优选地，rHSV辅助功能载体支持充足的rAAV病毒体产生，而不生成任何可检测的wt AAV病毒体(即，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。这样的载体的实例是rHSV-1 d27.1rc。所述载体和产生该载体的方法记载于本文实施例中，以及Conway等,Gene Ther.(1999)6:986-993；和美国专利号7,091,029，将它们通过提述整体并入本文。
第二rHSV载体被称为rHSV表达载体并且含有来自AAV的ITRs和由一种或多种启动子驱动的一种或多种感兴趣的基因。在一些实施方案中，将感兴趣的基因插入一对ITR之间。通常将异源基因功能性地连接至能够在适当条件下在患者的靶细胞中驱动基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异性或诱导型)。还可以包括终止信号，如聚腺苷酸化位点。
AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。关于AAV-2序列，参见，例如，Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Berns,K.I."Parvoviridae and theirReplication"in Fundamental Virology,2nd Edition,(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)。本发明的载体中使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且可以通过例如核苷酸的插入、缺失或取代来改变。另外，AAV ITR可以源自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8、山羊和牛AAV(参见，例如，美国专利公开号20080292595，将其通过提述整体并入本文)，及其变体。此外，在表达载体中选择的核苷酸序列侧翼的5′和3′ITR不一定需要是相同的或源自相同的AAV血清型或分离株，只要它们如预期地发挥功能，即，允许将感兴趣的序列从宿主细胞基因组或载体切下和拯救(rescue)，以及当AAV rep基因产物存在于细胞中时允许DNA分子整合入受体细胞基因组中。
可以将AAV ITR从病毒基因组或从含有它们的AAV载体切下，并且使用标准连接技术，如Sambrook等(见上文)中描述的那些技术，融合在选择的核酸构建体的5′和3′。例如，连接可以在20mM Tris-Cl pH 7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，33μg/ml BSA，10mM-50mM NaCl，和或者是40μM ATP，0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶于0℃(对于"粘末端"连接)或者是1mM ATP，0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶于14℃(对于"平末端"连接)中完成。分子间"粘末端"连接通常以30-100μg/ml总DNA浓度(5-100nM总终浓度)进行。含有ITRs的AAV载体已经描述于，例如，美国专利号5,139,941。具体而言，其中描述了几种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection("ATCC"))以登录号53222、53223、53224、53225和53226获得。
将选择的多核苷酸序列可操作地连接至指导其在受试者的细胞中转录或表达的调控元件。这样的调控元件可以包含通常与选择的基因关联的调控序列。或者，可以采用异源调控序列。有用的异源调控序列通常包括源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括，但不限于，神经元特异性烯醇化酶启动子、GFAP启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，源自非病毒基因如鼠金属硫蛋白基因的序列也可用于本文。这些启动子序列是可商购的，例如从Stratagene(San Diego,CA)、Invivogen(San Diego,CA)等。
感兴趣的基因可以是可能具有治疗价值的基因。治疗性基因的实例包括但不限于α-1抗胰蛋白酶、因子VIII、因子IX、GAA、促红细胞生成素和PEDF。当希望选择或鉴定成功的转基因表达时，感兴趣的基因可以是报道基因。用作报道子或用于选择的基因的许多实例是已知的，并且可用于本发明。这些包括但不限于编码β-半乳糖苷酶、新霉素、磷转移酶(phosphoro-transferase)、氯霉素乙酰转移酶、胸苷激酶、萤光素酶、β-葡糖醛酸酶、氨基糖苷、磷酸转移酶、潮霉素B、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基、萤光素酶、DHFR/甲氨蝶呤和绿色荧光蛋白(GFP)的基因。
rHSV-1表达病毒可以按照很大程度上与如上所述相同的方式产生，即，通过同源重组至HSV-1tk基因中，如描述于例如Conway等,Gene Ther.(1999)6:986-993和美国专利号7,091,029中的，将其通过提述整体并入本文。
一旦产生，将rHSV载体或任何其他感兴趣的病毒在合适的细胞系中在培养物中增殖。对于疱疹病毒，这样的细胞系包括但不限于Vero细胞、293细胞、HeLa细胞等，其可从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md)获得。如果使用HSV-1 d27.1载体，这种病毒通常会培养在ICP27补充细胞系V27中(Rice等,J.Virol.(1990)64:1704-1715)。可以使用用于所述病毒的任何合适培养基，其具有或不具有血清如胎牛血清，例如但不限于RPMI 1640培养基、Dulbecco′s Modified Eagles培养基(DMEM)、F12培养基或后者的混合物(DF培养基)。如果存在血清，培养物可包括例如2％至20％血清、更通常为5％至15％血清、7％至12％血清，或这些范围内的任意数值，如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。另外，如果使用血清，其可以存在于初始培养物中，和/或存在于添加至培养物的后续新鲜培养基中。
添加至根据本发明的方法中的iNOS抑制剂的量可以变化，并且依赖于使用的特定抑制剂、使用的培养基和要培养的病毒添加至某种程度。例如，当将疱疹病毒在Vero细胞中培养时，初始培养物中的ATA浓度(如果存在)通常会为5μM至500μM，优选10μM至250μM，如20μM至100μM，即，30μM至75μM，如30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或所述这些范围内的任意整数。类似地，初始培养物中的地塞米松的浓度(如果存在)通常会为1μM至500μM，优选5μM至250μM，如1μM至100μM，即，5μM至75μM，如1...5...15...10...20...25...30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或所述这些范围内的任意整数。如果使用丙戊酸，初始浓度会为1mM至500mM，优选5mM至250mM，如1mM至100mM，即，5mM至75mM，如1...5...15...10...20...25...30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或所述这些范围内的任意整数。
在某些实施方案中，将病毒感染的细胞在如上所述的培养基中培养.5小时至24小时，如.75小时至12小时，1小时至5小时，1小时至2小时，或这些范围内的任意小时数或其分数。iNOS抑制剂和/或血清可以或可以不存在于初始培养物中。后续添加新鲜培养基，并且将培养物温育24至120小时，如48至96小时，50至80小时，60至75小时，70至74小时，或这些范围内的任意小时数或其分数。iNOS抑制剂和/或血清可以或可以不存在于后续培养物中，条件是iNOS抑制剂存在于初始培养物和后续培养物之一或二者中。
在一些实施方案中，初始培养物中的iNOS抑制剂以比后续培养物中更高的浓度存在。如此，例如，如果iNOS抑制剂是ATA，其可以以30至75μM的量存在于初始培养物中，并且再以5至25μM存在于后续培养物中。或者，所述抑制剂可以仅存在于初始或后续培养物中。
如下文实施例中所示，使用ATA的一种特别优选的方法包括初始培养物中50μMATA的存在，并且在后续培养物中的ATA量降低至20μM。另外，在ATA的情况下，优选在ATA存在的同时包括血清。如此，如果将ATA添加至初始培养物，有利的是向培养基添加胎牛血清(FBS)。同样地，如果将ATA添加至后续培养物中，FBS的添加对于获得更高病毒产率是必要的。
然后培养病毒以获得期望的病毒滴度。例如，在本文描述的HSV-1 d27-1载体的情况下，ATA使V27细胞上清中的d27-1产率增加了3-5倍，并且滴度能够为至少1x108PFU/ml或4x108DRP/ml。类似地，ATA还使野生型(wt)HSV-1病毒株McIntyre和KOS的产率增加1log，并且293或Vero滴度能够高达1x109DRP/ml。然后收获病毒供进一步的使用。
就本发明的方法而言，用于产生rAAV病毒体的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其能够或已经用作异源DNA分子的受体并且能够在例如悬浮培养物、烧瓶、平板、生物反应器等中生长。所述术语包括已经受到转染的原始细胞的后代。因此，“宿主细胞”如用于本文通常指已经用外源DNA序列转导的细胞。如果在用于制备rAAV病毒体的一种细胞类型中产生了重组疱疹病毒，那么随后将收获的载体转染入另一合适的宿主细胞。来源于稳定的人细胞系(可容易地通过例如美国典型培养物保藏中心以登录号ATCC CRL1573获得)的293细胞是产生rAAV病毒体的优选宿主细胞。具体而言，人细胞系293是已经用腺病毒5型DNA片段转化的人胚肾细胞系(Graham等(1977)J.Gen.Virol.36:59)，并且表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等(1979)Virology94:460)。293细胞系容易转染，并且提供在其中产生rAAV病毒体的特别方便的平台。
通过用rHSV辅助功能构建体在使用rHSV表达载体之前或同时转导宿主细胞，由此将AAV辅助功能引入宿主细胞。由此使用rHSV辅助构建体来提供至少AAV rep和/或cap基因的瞬时转染以补足丢失的对于生产性AAV感染而言必需的AAV功能。AAV辅助构建体缺乏AAVITR，并且能够复制或包装其自身。
在重组AAV复制之后，rAAV病毒体可以使用多种常规纯化方法如柱层析、CsCl梯度等从宿主细胞纯化。例如，可以使用多个柱纯化步骤，如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上的纯化。参见例如，国际公开号WO 02/12455。
然后将所得的含有感兴趣的核苷酸序列的rAAV病毒体用于基因递送，所述基因递送使用本领域公知技术并描述于例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO92/01070(公开于1992年1月23日)和WO 93/03769(公开于1993年3月4日)；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.(1988)8:3988-3996；Vincent等，Vaccines 90(1990)(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3:533-539；Muzyczka,N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158:97-129；Kotin,R.M.Human Gene Therapy(1994)5:793-801；Shelling and Smith,Gene Therapy(1994)1:165-169；和Zhou等，J.Exp.Med.(1994)179:1867-1875。
2.实验
以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅用于说明性目的，而不意图对本发明的范围进行任何方式的限制。
为了确保所用数字方面(例如，量、温度等)的准确性已经付出了努力，但是当然，应该允许一些实验误差和偏差。
材料和方法
细胞
Vero来源的V27细胞(Rice等，J.Virol.(1989)63:3399-3407)和人胚肾细胞(HEK)来源的293细胞(Graham等，J.Gen.Virol.(1977)36:59-74)获得自Applied GeneticTechnologies Corporation(AGTC,Alachua,FL)，Vero和HeLa细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。将所有细胞保持在含有10％胎牛血清(FBS；HyClone)和或者是用于V27细胞的Geneticin(50mg/ml；Invitrogen)或者是用于其他细胞的1％青霉素/链霉素(CellgroMediatech,Manassas,VA)的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM；HyClone,South Logan,UT)中。
HSV-1产生
wtHSV-1 KOS毒株和wtHSV-1 KOS毒株的ICP27缺陷型衍生物：载体d27-1(Riceand Knipe,J.Virol.(1990)64:1704-1715)，rHSV-rep2/cap2和rHSV-EGFP(Kang等，GeneTher.(2009)16:229-239)和它们的产生者ICP27补充性V27细胞系获得自AGTC(Alachua,FL)。wtHSV-1 MacIntyre毒株购自Advanced Biotechnologies Inc.(ABI,Columbia MD)，并且使wtHSV-1 KOS毒株在Vero、293或HeLa细胞系中增殖。通过回收培养上清液在感染后72小时收获了感染性载体颗粒。通过Taqman测定法以DNA酶抗性颗粒/ml为单位测定了HSV-1储液的滴度。经由在DNA酶I(50U/ml最终；Promega)存在下在37℃处理60分钟，接着是在50℃进行蛋白酶K(Invitrogen)消化(1U/ml)60分钟，然后在95℃变性30分钟，由此定量了粗制培养基内的病毒基因组。使用线性化的质粒pZero 195 UL36(获得自AGTC,Inc.,Alachua,FL)生成标准曲线。引物-探针组对于载体基因组UL36序列是特异性的(HSV-UL36F:5’-GTTGGTTATGGGGGAGTGTGG(SEQ ID NO:1)；HSV-UL36 R:5’-TCCTTGTCTGGGGTGTCTTCG(SEQ ID NO:2)；HSV-UL36探针:5’-6FAM–CGACGAAGACTCCGACGCCACCTC-TAMRA(SEQ ID NO:3)。PCR产物的扩增使用下述循环参数实现：1个在50℃持续2分钟的循环，1个在95℃持续10分钟的循环；40个在95℃持续15秒和60℃持续60秒的循环。
ATA实验
ATA(Sigma-A1895金精三羧酸专门级，≥85％(滴定)，粉末)储液按照500μM浓度在100mM碳酸氢钠水溶液中生成。将ATA储液在DMEM+/-10％胎牛血清(FBS,Hyclone,Waltham,MA)中进一步稀释成12-60μM ATA(8.5-21μgATA/ml)的浓度范围。感染复数为0.15(MOI＝0.15)的HSV-1感染(通常为6孔板中6x105细胞)在40％(2/5vol)的总最终培养基体积中进行1-2小时，而剩余的培养基(60％或3/5的总最终体积)在稀释步骤过程中添加。然后将细胞温育72小时，并且收获上清以进行形成单位每毫升(PFU/ml)和DRP/ml滴度测定。
地塞米松(Dex)实验
将地塞米松(Sigma –D4902)在纯酒精中溶解至2mg/ml。将其用DMEM稀释以达到1M浓度并储存在-20℃。
在感染前一天将V27细胞以6x105细胞/孔接种至六孔板中。向所述接种培养基中添加地塞米松以达到1μM的浓度。将其充分混合并添加至孔。
为培养基通气(aspirated)并以每1ml DMEM(无添加物)MOI 0.15(＝细胞接种密度x0.15/pfu滴度的HSV储液)添加感染性HSV-1 d27-1储液。每孔添加1ml的感染性接种物。将其在37℃,5％CO2培养箱中温育1-2小时，在这段时间之后添加1.5ml的DMEM-10％FBS。将培养物返回至培养箱，保持70-74小时。
将游离培养基收获，涡旋振荡，在4℃以1,100xg离心10分钟。将上清转移至新的分装管，涡旋振荡，分成等分试样并将储液在-80℃冷冻。
丙戊酸(VA)实验
将丙戊酸(Sigma–P4543)溶解在水中至1M浓度。将V27细胞在感染前一天以6x105细胞/孔接种在六孔板中。将1M丙戊酸掺入1ml DMEM-10％FBS以达到5μM的浓度。将其充分涡旋振荡并添加至孔。将平板温育六个小时，通气并以每1ml的DMEM(无添加物)MOI 0.15(＝细胞接种密度x0.15/pfu滴度的HSV储液)添加感染性HSV-1 d27-1储液。
每孔添加1ml的感染性接种物，并在37℃,5％CO2培养箱中温育1-2小时，在这段时间之后添加1.5ml的DMEM-10％FBS。将平板返回至培养箱，保持70-74小时。将游离培养基收获，涡旋振荡，在4℃以1,100xg离心10分钟。将上清转移至新的分装管，涡旋振荡，并分成等分试样。将储液在-80℃冷冻。
rAAV产生
将293细胞(2.5x106)用rHSV-rep2/cap2和rHSV-EGFP两种载体同时共同感染，如Kang等，Gene Ther(2009)16:229-239所述。在感染后2-4小时，将感染性培养基用等同于将感染前培养物体积加倍的DMEM+10％FBS交换。在收获时，将细胞团块在-80℃冷冻。DRP滴度通过在96孔块状热循环仪(Applied Biosystems；7500实时PCR系统)中的实时聚合酶链式反应(PCR)定量。使粗制样品经历三个冻融循环，然后在Benzonase(250U/ml)、2mM MgCl2、1％终浓度蛋白质级Tween 80(Calbiochem)存在下温育并且在37℃温育60分钟，然后在50℃用0.25％胰蛋白酶(Gibco)消化60分钟。最后，用DNase I(50U/ml；Promega)在37℃处理30分钟，然后在95℃变性20分钟。将线性化的质粒pDC67/+SV40用于生成标准曲线。所述引物-探针组对于猿猴病毒40(SV40)多聚(A)序列是特异性的：rAAV-F:5’-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3’(SEQ ID NO:4)；rAAV-R:5’-GCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3’(SEQ ID NO:5)；rAAV-探针:5’6-FAM-AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC-TAMRA-3’(SEQ ID NO:6)。PCR产物的扩增使用以下循环参数实现：1个在50℃持续2分钟的循环，1个在95℃持续10分钟的循环；40个在95℃持续15秒和60℃持续60秒的循环。
人基因组阵列
将汇集的293细胞(75cm2烧瓶中2.4x106个细胞)在DMEM+10％FCS中培养大约20小时，然后用一个蚀斑形成单位每细胞(PFU/细胞)的HSV-1 MacIntyre毒株感染90分钟。在感染后90分钟添加浓度为20μM(最终)的ATA。在感染后24小时收获经感染的细胞。使用RNeasyPlus Mini Kit(QIAGEN,Valencia,CA)根据制造商的说明分离了足够质量和数量的总RNA。在Asuragen,Inc的Affymetrix Human U133 Plus 2.0阵列上进行了完整基因组表达的分析(profiling)。提供3μg总RNA作为输入材料。
总的来说，在生物分析仪上评估的RNA质量具有>9的RIN值。阵列杂交和比例缩放因子(scaling factor)在通过质量控制的范围之内。在扫描之后，将原始表达CEL文件用Affymetrix Expression Console vs.1.1.2(affymetrix.com)处理。将每个CEL文件用Robust Multichip Analysis(RMA)处理，并将总结出的表格作为文本文件输出。全部下游基因组和统计分析使用JMP Genomics(第5版)(jmp.com/software/genomics)进行。首先，应用过滤步骤以滤除低表达，具体而言，在8个样品的至少2个中在log2模式下低于6的那些值。在54,675个完整Affy U133 Plus2探针中，41,569(76％)个探针在截留之后得到保留。还发现了良好杂交的两个阳性对照样品，分别为人脑和汇集的人通用参照RNA(pooledhuman universal reference RNA)。对于将来的分析，将这两个样品排除。
Principle Component Analysis揭示了两个截然不同的群体，即使用和不使用HSV处理的样品。因此，第一种主要成分分离(91.7％)通过HSV相对于运载体(Vehicle)的效果得到解释。将数据在每个探针之间进行中值标准化，以具有为0的中值信号。进行ANOVA以在HSV相对于运载体、ATA相对于运载体、HSV+AVA相对于运载体以及HSV+ATA相对于单独的HSV之间寻找显著差异性转录物。没有将多重测试校正(Multiple testing correction)包括在内，并且认为显著性基因的P值低于0.01。
使用自组织图谱(self-organized map)来检查运载体、HSV1以及HSV1+ATA之间表达的模式。期望寻找到通过ATA处理而或者上调或者下调的转录物。发现了在HSV存在下显示出一些刺激的一个独特基因簇，而ATA校正使这些基因回复至运载体基线。类似地，还发现了与运载体相比受到HSV阻抑的一个基因簇，并且后续通过ATA处理激活。这些分别称作簇A和B(参见表1和2)。使用GeneGO软件(genego.com)进一步进行分析以探询这些簇的生物学功能。
RT2ProfilerTMPCR阵列(SABiosciences-QIAGEN)
将6x10e5个293细胞(来自AGTC)用wtHSV-1 McIntyre毒株以MOI 1在DMEM&10％FBS存在下、具有或不具有50uM ATA的条件下感染1-2小时，并且用DMEM&10％FBS稀释至40％(20uM的最终ATA浓度)。24小时之后将一式三份总RNA样品使用Qiagen RNeasy小量试剂盒(Qiagen RNeasy mini kit)收获并在柱上用DNA酶处理并洗脱。将洗脱RNA一式三份样品合并并在260和280nm对洗脱物进行分光光度计O.D.读数以测定浓度。将样品RNA使用SABiosciences RT2第一链试剂盒转换成模板cDNA。然后将该cDNA用于人JAK/STAT信号传导途径PCR阵列(Human JAK/STAT Signaling Pathway PCR Array)(PAHS-039A)。
实施例1
使用ATA抑制V27细胞中HSV诱导的iNOS水平
将Dulbecco’s Modified Eagles培养基(DMEM)(Hyclone,Waltham,MA)中的V27细胞用HSV-1 d27.1载体以1的MOI感染，并用30μM ATA(Sigma,St.Louis,MO)在具有或不具有10％胎牛血清(FBS)的条件下处理。还进行了不含ATA的对照实验。感染后(h.p.i.)24小时获得了V27细胞裂解物，并且对该裂解物运行蛋白质印迹，并通过使用纯化的兔抗iNOS/NOSII型pAb(BD Biosciences,Cat#610332)检测iNOS蛋白。结果示于图1。
如所显示的，HSV感染诱导了那些不包括ATA的培养物中的iNOS表达(泳道4和5)。在30μM ATA存在下iNOS表达得到了抑制(泳道2和3)。10％FBS的存在与否对iNOS表达没有影响。
实施例2
ATA-HSV方案的优化
为了测试ATA是否能够增加V27细胞中的rHSV-1 d27-1(d27-1)载体产率，在感染过程中(步骤1)或稀释步骤中(步骤2)将ATA应用于培养基(图2A)。在最终培养基体积的2/5中进行MOI＝0.15的d27-1感染，并在稀释步骤期间添加剩余3/5的培养基。
ATA处理延迟了V27细胞单层中的细胞裂解或HSV-1噬菌斑形成。收获时，即感染后(hpi)72小时，细胞病变效应(CPE)与不存在ATA条件下的100％CPE相比为20-60％之间。在HSV-1感染步骤期间用ATA的处理(在步骤1的ATA)显示了在72hpi收获时V27细胞上清液中增加的d27-1滴度(图4B)。当在感染步骤期间(ATA I)添加时最优ATA浓度为50μM，并且这在稀释步骤期间通过添加剩余3/5体积的培养基被进一步稀释成20μM ATA的终浓度(f.c.)。在这种情况下，ATA将收获时(72h.p.i.)上清液中的d27-1滴度增加了大约10倍：从4.0±0.3x107DRP/ml或1.4±0.2x107PFU/ml至3.7±0.2x108DRP/ml或1.2±0.3x108PFU/ml(图4B)。
为了确定哪些用于ATA添加的浓度和条件对HSV产率有影响，进行了以下实验。将不同浓度的ATA在如下的两个步骤中添加至在六孔板(图2B)或T150烧瓶(图2C)中的用HSV-1 d27-1载体感染的V27培养物。在方案的步骤1中，在具有10％FBS和0-60μM ATA浓度的2/5最终体积的DMEM中将V27细胞用0.15MOI的rHSV载体感染。将细胞在37℃培养1-2小时以完成步骤1。在步骤2中，通过添加3/5的最终培养基体积，ATA的浓度降低至12-24μM之间的范围。将细胞在37℃培养70-74小时，并收获上清液。将病毒滴度表示为每毫升的DNA酶抗性颗粒(DRP/ml)或每毫升的蚀斑形成单位(pfu/ml)，并如上所述测定。
结果示于图2B和2C中，并且最优ATA浓度为粗体。可以看到，在六孔板(图2B)和T150烧瓶(图2C)二者中无论是步骤1或是步骤2添加了ATA的培养物都具有比没有ATA的情况显著更高的HSV滴度。另外，最高滴度见于步骤1中50μM的ATA浓度，在步骤2降低至20μM(图2B)，尽管全部ATA浓度均产生了比缺乏ATA的那些培养物更高的病毒滴度。
进行了额外的实验来确定最佳条件和存在或不存在FBS对HSV滴度的影响。在含ATA培养基中，血清的存在，具体而言10％胎牛血清(FBS)，对于ATA诱导的HSV-1滴度产率是最重要的参数。在稀释步骤期间将ATA补充至无血清培养基中(在步骤2的ATA)引起了病毒滴度的降低，其中“DRP”滴度降低至对照水平以下，并且PFU/ml滴度低得不可检测(belowdetection)(图3)。当在感染步骤1期间以3μM浓度起始来补充ATA时，看到了在无血清培养基中甚至更富戏剧性的影响，DRP/ml和PFU/ml滴度二者均低于检出限。
在这项实验中，在感染前一天将V27细胞以6x105个细胞/孔接种至六孔板。HSV 2x感染溶液如下制备：将HSV-1 d27.1储液以2x滴度添加至DMEM(无FBS)，细胞会以最终MOI0.15受到感染。制备了数种2xATA溶液组合，含有DMEM中或为100μM或为40μM的ATA，并且不含FBS或具有20％FBS。
将HSV 2x感染溶液与体积相等的DMEM-/+20％FBS或期望的2xATA溶液-/+20％FBS混合，涡旋振荡，并在步骤1中添加每孔1ml的感染性接种物。如果孔在步骤1中含有ATA，那么浓度为50μM并且将所有孔温育1-2小时。在步骤2中，添加了额外的1.5ml DMEM组合-/+40μM ATA和-/+20％FBS。如果孔含有ATA，无论是在步骤1或步骤2中，那么最终ATA浓度为20μM。将板放回温育箱，持续70-74小时，在这段时间后收获游离培养基，涡旋振荡，并以1,100xg在4℃离心10分钟。将上清液转移至新的分装管，涡旋振荡，分成等分试样，并将储液冷冻在-80℃。
实施例3
ATA-HSV方案中血清存在的重要性
进行额外的实验以测定最优条件和FBS的存在或不存在对HSV滴度的影响。在含ATA培养基中，血清的存在，具体而言10％胎牛血清(FBS)，对于ATA诱导的HSV-1滴度产率是最重要的参数。在稀释步骤期间将ATA补充至无血清培养基中(在步骤2的ATA)引起了病毒滴度的降低，其中“DRP”滴度降低至对照水平以下，并且PFU/ml滴度低得不可检测(belowdetection)(图3)。当在感染步骤1期间以3μM浓度起始来补充ATA时，看到了在无血清培养基中甚至更富戏剧性的影响(数据未显示)，DRP/ml和PFU/ml滴度二者均低于检出限。
在这项实验中，在感染前一天将V27细胞以6x105个细胞/孔接种至六孔板。HSV 2x感染溶液如下制备：将HSV-1 d27.1储液以2x滴度添加至DMEM(无FBS)，细胞会以最终MOI0.15受到感染。制备了数种2xATA溶液组合，含有DMEM中或为100μM或为40μM的ATA，并且不含FBS或具有20％FBS。将HSV 2x感染溶液与体积相等的DMEM-/+20％FBS或期望的2xATA溶液-/+20％FBS混合，涡旋振荡，并在步骤1中添加每孔1ml的感染性接种物。如果孔在步骤1中含有ATA，那么浓度为50μM并且将所有孔温育1-2小时。在步骤2中，添加了额外的1.5mlDMEM组合-/+40μM ATA和-/+20％FBS。如果孔含有ATA，无论是在步骤1或步骤2中，那么最终ATA浓度为20μM。将板放回温育箱，持续70-74小时，在这段时间后收获游离培养基，涡旋振荡，并以1,100xg在4℃离心10分钟。将上清液转移至新的分装管，涡旋振荡，分成等分试样，并将储液冷冻在-80℃。
实施例4
ATA对培养物中野生型HSV滴度的影响
图4A显示了两种wtHSV-1毒株，即KOS和McIntyre，在以下允许wtHSV-1增殖的细胞系中的上清滴度：293细胞、HeLa和Vero细胞。使用ATA-HSV方案使wtHSV-1毒株KOS和McIntyre在293、HeLa和Vero细胞中增殖，在所述方案中在步骤1添加50μM ATA，并且在步骤2之后的终浓度稀释至20μM ATA。如上所述在三天之后收获含有病毒的上清液。ATA增加了Vero细胞中两种病毒类型的产率。在293细胞中在ATA诱导之后wtHSV-1 McIntyre毒株达到了最高滴度，然而，ATA似乎抑制了293细胞中的HSV-1 KOS生长。最后，ATA还显示出在HeLa细胞中抑制两种类型的HSV-1病毒。双因素ANOVA；Bonferroni检验；-ATA对比+ATA：***：p<0.001,ns:p>0.05；n＝4次独立实验。
对于统计学计算，在6孔板中进行了具有一组十次独立实验(n＝10)的较大研究，其中在感染步骤(步骤1)期间添加或未添加ATA，比较了复制缺陷型d27-GFP以及还有wtHSV-1 McIntyre毒株，从而研究ATA是否也能够增加wtHSV-1毒株中的滴度(图4B)。在感染步骤(步骤1)期间以50mM添加ATA至汇集的细胞单层，对于d27-1为V27细胞或对于wtHSV-1 McIntyre为293细胞，并将细胞用载体以MOI＝0.15感染，而在1小时后将ATA稀释至最终20mM的浓度。在ATA添加之后，d27-1滴度从5.4x107DRP/ml或1.1x108DRP/ml(**P<0.01)显著增加6.1倍，并且wtHSV-1 McIntyre从3.3x108DRP/ml或1.0x109DRP/ml(***P<0.001)显著增加9.1倍，如通过双因素ANOVA和Bonferroni检验所分析的(图4B)。
实施例5
在HSV储液中ATA对生产或rAAV病毒体的作用
为了测定HSV生产过程中ATA的存在是否影响了使用HSV载体产生的rAAV病毒体的产率，进行了以下实验，显示rAAV滴度受到在293细胞中产生的rHSV-1储液中存在的ATA残余物的影响(图5A)。rAAV-GFP载体通过使用在不同浓度ATA浓度下(12μM或20μM f.c.)制备的含有ATA的rHSV-1储液在293细胞60mm板中共感染rHSV-rep2/cap2和rHSV-EGFP载体来产生(参见材料和方法)。当使用在感染(ATA步骤1)期间添加了20μM ATA制备的rHSV-rep2/cap2储液时，对比于“无ATA”对照，rAAV DRP/ml滴度稍许增加了1.3倍(*p<0.05)，其中rAAV生产期间的ATA浓度为大约3μM。当使用以12μM ATA制备的rHSV-rep2/cap2储液时，检测到rAAV滴度没有显著增加(图5A)。单因素ANOVA；Tukey’s检验：*p<0.05；20μM ATA对比无ATA；n＝4次独立实验。
在另一实验中，当在2小时的rHSV-rep2/cap2和rHSV-EGFP共感染步骤期间将10μMATA直接掺入293细胞培养基中时，显示ATA增加了rAAV滴度。这种效果在ATA浓度高于20μM时没有观察到(图5B)。
实施例6
ATA作用机制
为了通过人类基因组阵列阐明ATA作用机制和Vero和V27是猴来源细胞系的事实，在数种人细胞系中测试了wtHSV-1增殖(图4A-4B)。在以下三种细胞系中比较了两种野生型HSV-1(wtHSV-1)毒株KOS和McIntyre的增殖：人胚肾293(293细胞)、人宫颈癌HeLa细胞和非洲绿猴肾上皮Vero细胞。按照ATA I方案计划在含有10％FBS的培养基中进行所述实验，其中在感染步骤期间补充了50μM ATA，并且进一步稀释至20μM ATA浓度(参见材料和方法)。在人来源的293细胞中，通过ATA仅使wtHSV-1 McIntyre病毒滴度显著增加，从1.4x108DRP/ml增加至1.2x109DRP/ml(***p<0.001)。在Vero细胞中，ATA仅在wtHSV-1 KOS毒株中显著增加了滴度，从1.7x108DRP/ml增加多至9.1x108DRP/ml(***p<0.001；两种统计学：双因素ANOVA，Bonferroni检验；n＝4)。令人惊讶的是，在HeLa细胞中，ATA似乎抑制了KOS和McIntyre HSV-1两种毒株的增殖。
为了鉴定对于wtHSV-1 McIntyre感染而言的细胞应答基因签名，使用AffymetrixHuman U133 Plus 2.0Array进行转录分型(transcriptional profiling)，其中293细胞为经模拟物处理、经ATA处理(ATA)、经wtHSV-1 McIntyre-感染(HSV)或经ATA处理并经wtHSV-1 McIntyre感染(HSV&ATA)24小时。通过感染或ATA处理诱导的基因表达变化通过将针对每种探针的基因表达水平与未经感染的细胞样品中相对应的水平相参照来鉴定。当与未经处理的细胞基因谱相比时，单独的HSV-1感染对293细胞的基因细胞表达谱有强烈影响。
首先，应用一个过滤步骤以滤除低表达，并且在总共54,675个Affy U133Plus2探针中，在截留之后剩余41,569(76％)个探针。主要组分分析揭示了两种完全不同的群体，即使用和未使用HSV处理的样品。进行ANOVA以在HSV相对于运载体、ATA相对于运载体、HSV+AVA相对于运载体以及HSV+ATA相对于单独的HSV之间寻找显著差异性转录物。认为显著性基因的P值低于0.01。使用自组织图谱来检查运载体、HSV1以及HSV1+ATA之间表达的模式。发现了一簇截然不同的基因，簇A和簇B(表1和2)，其显示了由HSV-1引起的转录谱中的变化，而它们通过ATA的校正将这些基因带回运载体基线。
在GeneGo中分析了这些簇的生物学功能。簇A(表2)代表58个探针，其显示了在HSV-1中的上调和在添加ATA之后的阻抑。这些基因主要涉及炎性IgE和IFN信号传导，以及全身性免疫应答(general immune response)。簇B(表1)代表152个探针，其显示了通过HSV-1的下调和后续通过将它们带回运载体基线的ATA上调。这簇中的基因主要涉及细胞周期G1/S、PTEN中的信号转导和WNT发育。例如，在HSV-1存在下ATA上调来自细胞周期进展途径的CDC25A、CDKN1A、CDKN1C、CCNK、CNNM2基因和来自Ras/Raf/MEK途径的基因，如FOXC1、FOXD3、FOXO3(参见，表1)。
表3A和3B显示HSV ATA样品中的nNOS、iNOS和eNOS表达降低，如通过AffymetrixGen Array所分析的，以及HSV+ATA样品中的iNOS表达降低，如通过Qiagene SAB Jak-StatRT–PCR微阵列所分析的。
实施例7
地塞米松对HSV产率的影响
为了测定iNOS抑制剂地塞米松是否也增加了培养物中的rHSV产率，进行了以下实验(图6)。显示地塞米松(Dex)对d27-1/GFP HSV-1病毒滴度的影响。整体而言，最终滴度d27-1/GFP HSV-1在dex预处理或处理之后与未经处理的对照相比稍有提升。
感染前一天将V27细胞以6x105个细胞/孔接种至六孔板，并在次日，将不同浓度的地塞米松(dex)添加至孔的2/5体积的DMEM-10％FBS培养基中，或者在HSV-1感染之前(预处理)，或者在感染期间(处理)。在37℃温育1-2小时之后，添加3/5体积的DMEM-10％FBS。将培养物放回温育箱，并在70-74小时之后收获上清。数据显示为以pfu/ml为单位的滴度的平均值±S.D.(n＝2)。
实施例8
丙戊酸对HSV产率的影响
为了测定iNOS抑制剂丙戊酸是否也增加了培养物中的rHSV产率，进行了以下实验。图7显示通过丙戊酸(VA)预处理对d27-1/GFP HSV-1病毒滴度的影响。与未经处理的对照相比，浓度5mM的VA稍许提升了d27-1/GFP HSV-1的滴度，然而低于和高于5mM的浓度似乎对d27-1/GFP HSV-1滴度具有抑制性影响。
感染前一天将V27细胞以6x105个细胞/孔接种至六孔板，并在次日，将不同浓度的VA添加至孔。将板温育6小时，通气，并添加2/5体积的含有感染性HSV-1 d27-1储液的培养基，并在37℃温育1-2小时，这段时间之后添加3/5体积的DMEM 10％FBS培养基。将培养物放回温育箱，并在70-74小时之后收获上清。
如在前述实施例中所示，微摩尔浓度的ATA增加了HSV-1载体产率。这一发现对于大规模HSV生产以及rHSV和rAAV载体生产二者而言都是重要的。除此之外并且令人惊讶的，rHSV-1储液中ATA的存在没有负面影响rAAV产率。这一结果是令人惊讶的，因为已知毫摩尔量和更高浓度的ATA是一种抗病毒剂(Cushman等，J.Med.Chem.(1991)34:329-337；Zhang等，Antiviral Res.(1999)43:23-35；Yap等，Computational Biol.and Chem.(2005)29:212-219；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31:118-160)。在无血清培养基中，发明人还观察到了微摩尔浓度的ATA的一种可能的抗病毒效果，但是在没有血清存在的条件下(10％FBS)。
还如本文所示，ATA处理延迟了V27细胞单层中的HSV-1蚀斑形成和细胞裂解以及细胞病变效应(CPE)，其证明了抗凋亡性质。ATA在增加HSV-1产率方面的作用机制似乎包括HSV-1生产所需的因素的变化和负责病毒清除的细胞固有抗病毒免疫应答的降低。从以上人类基因组阵列分析发现了单独的HSV-1感染对293细胞的基因表达谱具有强烈影响，并且ATA的效果多半在经HSV-1和ATA二者处理的细胞中观察到。细胞周期G1/S、PTEN中的信号转导和WNT发育中牵涉的基因通过HSV-1显著下调并在添加ATA之后上调。
炎性IgE和IFN信号传导中主要涉及的基因，以及全身性免疫应答通过HSV-1上调，并在添加ATA之后受到阻抑。在HSV-1存在下，ATA上调了来自细胞周期进展途径的CDC25A、CDKN1A、CDKN1C、CCNK、CNNM2基因和来自Ras/Raf/MEK途径的基因，包括FOXC1、FOXD3、FOXO3。
ATA能够增加HSV-1产率的发现是重要的，因为需要HSV-1载体的更高产率以用于大规模生产以供基因治疗和其他应用。
因此，描述了使用iNOS抑制剂用于增加病毒产率的方法。尽管已经较为详细地描述了题述发明的优选实施方案，应理解的是可在不背离本文限定的发明宗旨和范围的前提下进行显而易见的改变。
表1. 簇B基因列表：受到HSV阻抑并通过HSV+ATA上调的基因
表2.簇A基因列表：通过HSV上调并通过HSV+ATA下调的基因
表3A.通过Affymetrix Gen Array分析的HSV+ATA样品中nNOS、iNOS和eNOS表达降低；NOS1＝nNOS,NOS2＝iNOS,NOS3＝eNOS
表3B.HSV+ATA样品中iNOS表达的降低
通过SABiosciences(QIAGEN)Jak-Stat RT–PCR微阵列分析
Claims (9)
1.一种用于产生疱疹病毒的方法，包括在包含金精三羧酸和血清的细胞培养物中培养所述病毒，其中所述疱疹病毒是单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，其中所述病毒在293或Vero细胞中培养，且其中所述金精三羧酸的浓度为5μM至75μM，并且其中金精三羧酸以增加所述疱疹病毒产率的量存在。
2.权利要求1的方法，其中所述HSV-1是野生型HSV-1。
3.权利要求1的方法，其中所述HSV-1是重组HSV-1载体。
4.权利要求3的方法，其中所述重组HSV-1载体是HSV-1d27.1载体。
5.权利要求1的方法，其中将所述病毒在V27细胞中培养。
6.一种用于培养HSV-1d27.1载体的方法，包括：
(a)用HSV-1d27.1载体感染V27细胞；和
(b)将所述感染的V27细胞在以增加HSV-1d27.1载体滴度的量包含浓度为5μM至75μM的金精三羧酸的细胞培养物中培养，其中所述细胞培养物进一步包含血清。
7.权利要求6的方法，其中所述血清是胎牛血清。
8.一种细胞培养物，其包含浓度为5μM至75μM的金精三羧酸、血清、疱疹病毒，还包含293或Vero细胞，其中所述疱疹病毒是单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，且其中金精三羧酸以增加所述疱疹病毒在所述细胞培养物中的产率的量存在。
9.权利要求8的细胞培养物，其包含V27细胞。
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