TW201446965A - ｉＮＯｓ抑制劑於病毒培養中增加病毒產量之用途 - Google Patents

Abstract

本發明說明iNOS抑制劑於培養中增加各種病毒產量之用途，iNOS抑制劑包括金精三羧酸、地塞米松以及丙戊酸，各種病毒包括重組皰疹病毒。

Description

iNOS抑制劑於病毒培養中增加病毒產量之用途

本發明大體上是有關於在培養中生產病毒以及重組病毒粒子(virion)的方法。具體而言，本發明是有關於iNOS抑制劑在培養中增加各種病毒產量的用途，iNOS抑制劑為諸如金精三羧酸、地塞米松(dexamethasone)以及丙戊酸(valproic acid)，各種病毒包括重組皰疹病毒，其復而用作為輔助者供生產重組腺相關病毒病毒粒子(adeno-associated virus virion)。

皰疹病毒在自然界中被大量傳播且於大多數動物物種中被發現到。已鑑定出至少100種皰疹病毒，包括數種來自人類的皰疹病毒，諸如單純皰疹病毒-1(HSV-1)以及單純皰疹病毒-2(HSV-2)、水痘病毒(varicella zoster virus,VZV)、EB病毒(EBV)、細胞巨大病毒(CMV)以及其他人類皰疹病毒，諸如HHV6與HHV7。這些病毒是各種人類疾病(諸如皮膚感染、生殖器皰疹、病毒性腦炎與類似疾病)的主因。

HSV-1感染會藉由引起細胞內訊號傳遞路徑來使得帶有促發炎性與殺微生物活性的蛋白質(包括細胞激素與干擾素(INF))表現而活化宿主防禦作用與固有免疫系統(Sainz and Halford,J.Virol.(2002)76：11541-11550；Haller et al.,Virology(2006)344：119-130；Paludan et al.,Nat.Rev.Immunol.(2011)11：143-154)。就病毒清除來說，INF訊號傳遞是 最為重要的細胞防禦機制之一(Brandner & Mueller,Hoppe-Seyler's Zeitschriftfür physiologische Chemie(1973)354：1176；De Vries et al.,Gene Ther.(2008)15：545-552)。

研究人員已報導一氧化氮(NO)對抗數種病毒的抗病毒活 性，前述病毒尤其包括牛痘病毒(vaccinia virus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)，以及日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)(Bi et al.,J.Virol.(1995)69：6466-6472；Harris et al.,J.Virol.(1995)69：910-915；Lin et al.,J.Virol.(1997)71：5227-5235；Pertile et al.,Avian Dis.(1996)40：342-348。NO是一種自由基氣體分子且為宿主防禦作用的一個媒介因子(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91：2446-2452；Karupiah et al.,Science(1993)261：1445-1448；Rolph et al.,Virol.(1996)217：470-477；Amaro et al.,J.Med.Virol.(1997)51：326-331；Lane et al.,J.Virol.(1997)71：2202-2210。 HSV-1已知會引起並避開宿主抗病毒反應(Mossman et al.,J.Virol.(2001)75：750-758)。HSV感染能夠引起誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)表現，一種編碼生產大量NO之NOS的誘導型同型的基因。

皰疹病毒以及自其衍生的重組蛋白已被用於製造一些疫 苗。除了腺病毒以外，皰疹病毒已證實提供完全輔助病毒功能供生產重組腺相關病毒病毒粒子之用(Buller,R.M.L.,J.Virol.(1981)40：241-247；Mishra et al.,Virology(1990)179：632-639)。AAV複製以及包裝所需的最少HSV-1基因套組已被鑑定為早期基因UL5、UL8、UL52以及UL29(Weindler et al.,J.Virol.(1991)65：2476-2483)。這些基因編碼HSV-1核心複製機制的組份解螺旋酶、導引酶與導引酶輔助蛋白(U_L5、U_L8與U_L52)，以及單股DNA結合蛋白(U_L29)。

重組AAV(rAAV)載體已成功地用於在活體內達到長期、高 度轉導。儘管有以上優點，生產大量臨床級高滴定濃度rAAV病毒粒子供基因療法之用仍將具有挑戰性，因為共轉染方法的規程可擴充性有限。該過程需要三種組份的有效細胞遞送：(1)載體，包括兩側為AAV反向末端重複序列(ITR)的感興趣基因；(2)載體，包括AAV rep與cap基因；以及(3)使 用輔助病毒或使用無病毒輔助質體而提供的基因，輔助病毒為諸如腺病毒或單純皰疹病毒(參見Muzyczka,N.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1992)158：97-129)。因此，在以rHSV為基礎的rAAV製造規程中，rAAV的產量受到輔助rHSV載體的最大滴定濃度所囿限。

複製缺陷型HSV-1載體(稱為d27.1-rc)表現AAV-2 rep與cap 基因(Conway et al.,Gene Ther.(1999)6：986-993)且其是由不生產ICP27的原有d27-1病毒進行工程化而來(Rice at al.,J.Virol.1989 vol.63(8)pp.3399-407)，ICP27是一種HSV-1複製所需的蛋白質。儘管這個載體為複製缺陷型，它表現rAAV複製及包裝所需的HSV-1早期基因(Conway et al.,Gene Ther.(1999)6：986-993)。

典型地，一個帶有rAAV模板的載體以及表現AAV rep與cap 區的另一個載體被共感染至293細胞中，俾以生產rAAV病毒粒子。HSV-1載體均為複製缺陷型且因而僅能在ICP27補足細胞株中增殖(Rice at al.,J.Virol.1989 vol.63(8)pp.3399-407)。在以HSV為基礎的AAV生產規程中，需要以較高感染多重性(MOI)12的HSV-1來感染293細胞。這代表著一種限制，因為d27-1衍生的載體在V27細胞中的產量通常約為1 X 10⁷溶血斑形成單元(PFU)/ml。

已研究數種方法以及試劑以進一步增加HSV-1滴定濃度 (參見例如Wechucket al.,Biotechnol.Prog.(2000)16：493-496；Ozuer et al.,Biotechnol.Prog.(2002)18：476-482；Erlandsson et al.,J.Endocrinol.,(2002)175：165-176；Otsuki et al.,Mol.Ther.(2008)16：1546-1555)。地塞米松以及丙戊酸抑制由數個干擾素(IFN)-反應性抗病毒基因作為代表的宿主防禦機制、放大病毒基因的轉錄位準，且因而增進病毒增殖與HSV-1產量(Erlandsson et al.,J.Endocrinol.(2002)175：165-176；Otsuki et al.,Mol.Ther.(2008)16：1546-1555)。

儘管有以上知識，需要更多方法來抑制宿主防禦作用以在 培養中增進病毒生產。如上說明，研究人員已報導一氧化氮(NO)對抗數種病毒的抗病毒活性，前述病毒尤其為諸如牛痘病毒、水泡性口炎病毒，以 及日本腦炎病毒(Bi et al.,J.Virol.(1995)69：6466-6472；Harris et al.,J.Virol.(1995)69：910-915；Lin et al.,J.Virol.(1997)71：5227-5235；Pertile et al.,Avian Dis.(1996)40：342-348)。NO是一種自由基氣體分子且為宿主防禦作用的一個媒介因子(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91：2446-2452；Karupiah et al.,Science(1993)261：1445-1448；Rolph et al.,Virol.(1996)217：470-477；Amaro et al.,J.Med.Virol.(1997)51：326-331；Lane et al.,J.Virol.(1997)71：2202-2210)。如上所述，HSV感染可引起iNOS的表現，一種編碼生產大量NO之NOS的誘導型同型的基因。

對這所有三種病毒來說，iNOS抑制劑N-甲基-L-精胺酸 (L-NMA)的存在推翻病毒複製的抑制(Karupiah et al.,Science(1993)261：1445-1448)。關於iNOS抑制劑的回顧，參見Southan et al.,Biochem.Pharmacol.(1996)51：383-394。另一種化合物金精三羧酸(ATA)已被證實藉由下調iNOS表現且因而減少NO生產而保護巨噬細胞免於遭受由細菌脂多醣引起的細胞死亡(Chen et al.,British Journal of Pharmacology(2002)vol.137(7)pp.1011-20)。ATA為聚合物的異質混合物，公認有越來越多的生物活性，諸如與一些酵素(諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶(RNA-依賴性DNA聚合酶)、胺基醯基-tRNA-合成酶、核苷酸還原酶、核糖核酸酶核酸酶)的交互作用、蛋白質合成抑制、在寡樹突細胞中預防由氧化壓力引起之細胞凋亡以及阻止DNA片段化(Tscherne and Pestka,Antimicrob.Agents Chemother.(1975)8：479-487；Mikelens et al.,Biochemical Pharmacology(1976)25：821-827；Vollgraf et al.,J.Neurochem.(1999)73：2501-2509)。

金精三羧酸(ATA)亦已被證實會預防IFN-媒介的轉錄活化(Tsi et al.,Mol.Pharmacol.(2002)101：90-101；Chen et al.,British J.Pharmacol.(2002)137：1011-1020)。ATA已知為Raf/MEK/MAPK路徑、IGF-1受體及蛋白激酶C訊號傳遞的一種活化因子(Beery et al.,Endocrinology(2001)142：3098-3107；Chen et al.,J.Biol.Chem.(2001)276：46722-46728)。細胞激素(諸如干擾素)的抗病毒抗微生物與抗增生作用可能是因為它們引 起iNOS基因表現，iNOS基因是一種編碼生產大量自由基氣體NO之一氧化氮合成酶(NOS)同型的基因，NO是由L-精胺酸之胍基氮而來(Nathan,C.,FASAB J.(1992)6：3051；Werner-Felmayer et al.,J.Exp.Med.(1990)172：1599)。已顯示以IFN-γ治療巨噬細胞會嚴厲地限制鼠痘病毒(EV)、牛痘病毒(VV)以及HSV-1的複製。

另一方面，ATA也已知是一種對抗數種病毒的抗病毒劑， 上述病毒包括HIV、皰疹病毒HHV-7、SARS-CoV與其他病毒(Cushman et al.,J.Med.Chem.(1991)34：329-3371991；Zhang et al.,Antiviral Res.(1999)43：23-35；Yap et al.,Computational Biol.and Chem.(2005)29：212-219；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31：118-160)。但是，ATA不會阻斷第5型腺病毒(Ad5)在HEK-293細胞中複製(He,Biochem.Biophys.Res.Comm.(2004)320：1199-1203)。此外，ATA已被報導出乎意料地增加對照腺病毒載體於293細胞中的滴定濃度，同時對牛痘病毒具有抗病毒效用(Myskiw et al.,J.Virol.(2007)81：3027-3032)。

因此，本發明藉由解決限制病毒生產的問題(諸如低產量的rHSV，其阻礙生產足量rHSV供各種用途的努力，包括疫苗生產，以及對rAAV病毒粒子生產來說有效基因療法規程所需數量)來克服先前技藝中的缺點。使用本文所述方法，可得到較高滴定濃度的各種病毒，諸如以比習知方法高出至少一個量級。

具體而言，發明人在本文中發現金精三羧酸(ATA)抑制iNOS並增加HSV生產。如本文實例中所示，微莫耳濃度的ATA在胎牛血清(FBS)存在下同時增加HSV-1/d27-1載體於V27細胞中的產量以及野生型(wt)HSV-1病毒於Vero、V27與293細胞中的產量。其他iNOS抑制劑，包括地塞米松以及丙戊酸也在培養中增加HSV-1滴定濃度。HSV-引起的iNOS表現也證實在HSV+ATA樣品中被降低，如藉由SABiosciences Microarray所分析。相同地，Affymetrix人類基因組陣列分析確認經HSV上調的所有 三種一氧化氮合成酶基因(nNOS、iNOS以及eNOS)的表現會被下調n HSV+ATA樣品。Affymetrix Gene Array也偵測到，涉及發炎性IgE與IFN訊號傳遞的基因以及一般性免疫反應被HSV-1上調且在添加ATA之後受到壓抑。另一方面，主要涉入細胞週期G1/S、WNT發育之訊號轉導的基因明顯受到HSV下調並在添加ATA之後被上調。

這些結果值得注意，因為就rAAV病毒粒子生產，以及供預防性、治療性和診斷性用途來說需要較高HSV-1滴定濃度。

因此，在一個具體例中本發明是有關於一種用於生產病毒的方法，其包含在含有金精三羧酸的細胞培養物中培養病毒。在某些具體例中，該病毒為皰疹病毒，諸如HSV-1。

在其他具體例中，該皰疹病毒為野生型HSV-1或重組HSV-1載體，諸如HSV-1 d27.1載體。

在其他具體例中，該病毒被培養在293、HeLa或Vero細胞中，諸如V27細胞。

在又其他具體例中，本發明是有關於一種培養HSV-1 d27.1載體的方法，包含：(a)以HSV-1 d27.1載體感染V27細胞；以及(b)在包含金精三羧酸、丙戊酸或地塞米松的細胞培養物中培養經感染的V27細胞。

在某些具體例中，該細胞培養物進一步包含血清，諸如胎牛血清。

在更多具體例中，本發明是有關於一種細胞培養物，其包含金精三羧酸以及293、HeLa或Vero細胞，諸如V27細胞。

鑑於本文揭示內容，對於習於技藝者而言可容易思及本發明的此等與其他具體例。

圖1為西方墨點的一個代表圖，顯示金精三羧酸(ATA)在經d27-1感染之V27溶解產物中抑制iNOS表現。

圖2A-2C顯示ATA-HSV規程闡述(圖2A)以及在V27上清液中最佳化d27-1 HSV-1滴定濃度以決定就ATA添加來說哪個濃度與條件對於HSV產量有衝擊。圖2B顯示於六孔盤(圖2B)以及T150燒瓶(圖2C)中在不同ATA濃度下表示為DNase抗性粒子(DRP/ml)的病毒滴定濃度。

圖3顯示血清存在於ATA-HSV規程中的重要性。FBS存在於ATA-HSV規程中的額外最佳化以及重要性顯示於d27-1 HSV-1滴定濃度上，其表示為drp/ml與pfu/ml。

圖4A-4B顯示ATA對於野生型HSV KOS以及麥金泰(McIntyre)病毒株在培養中的影響。ATA在Vero細胞中增加兩種病毒類型的產量，但是ATA在293細胞中似乎抑制HSV-1 KOS生長。另一方面，wtHSV-1麥金泰病毒株於293細胞中在ATA誘導後達到最高滴定濃度。此外，ATA在HeLa細胞中似乎抑制兩種類型的HSV-1病毒。

圖5A-5B顯示ATA在HSV原液中對於rAAV病毒粒子生產的影響。當使用以在感染期間添加之20μM ATA製備的HSV原液時，rAAV滴定濃度略為增加。當10μM ATA於2小時HSV共感染步驟期間直接加入293細胞培養基中，ATA亦顯示增加rAAV滴定濃度。

圖6顯示地塞米松(Dex)對於d27-1/GFP HSV-1病毒滴定濃度的影響。最終滴定濃度d27-1/GFP HSV-1大體上在dex預處理或處理之後相比於未經處理對照略為升高。

圖7顯示經丙戊酸(VA)預處理對於d27-1/GFP HSV-1病毒滴定濃度的影響。濃度為5mM的VA略為升高d27-1/GFP HSV-1的滴定濃度，但是相比於未經處理對照時，低於和高於5mM的濃度對於d27-1/GFP HSV-1滴定濃度似乎具有抑制性效用。

除非另有指明，否則本發明之實施將採用技藝技術中之化 學、生化學、重組DNA技術與免疫學的習知方法。此等技術在文獻中經充分說明。參見，例如Fundamental Virology,2nd Edition,vol.I & II(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.,Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)。

無論在上文或下文，本文引用的所有公開資料、專利案與 專利申請案，以其整體併入本文做為參考資料。

1.定義

在說明本發明時，將採用下列術語，且欲如下文所指來加以定義。

必須注意，除非內文另有清楚指明，否則如本說明書以及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一」、「一種」與「該」包括複數指涉對象。因此，例如提及「皰疹病毒」包括兩種或更多種此等病毒及類似病毒的混合物。

術語「重組HSV」、「rHSV」以及「rHSV載體」意指經單離，遺傳上經修飾形式的單純皰疹病毒(HSV)，其含有被併入病毒基因組的異源性基因。術語「rHSV/rc」或「rHSV/rc病毒」或「rHSV輔助功能載體」表示一種rHSV，其中AAV rep及/或cap基因已被併入rHSV基因組。術語「rHSV表現病毒」以及「rHSV/AAV」表示rHSV，其中AAV的反向末端重複(ITR)序列已被併入rHSV基因組中。

術語「多肽」及「蛋白質」意指胺基酸殘基的聚合物且不欲限制產物的最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、集合體及類似物含括在此定義內。全長蛋白質及其片段均被該定義所涵括。該等術語也包括多肽的表現後修飾，例如糖化、乙醯化、磷酸化與類似修飾。此外，為本發明之目的，「多肽」意指包括修飾的蛋白質，修飾為諸如對天然序列的刪除、添加與置換(通常在自然界為守恆性)，只要蛋白質維持所要活性即可。 這些修飾可以是經過仔細考量的(如透過定位突變)，或可能是偶發性(諸如透過生產蛋白質的宿主的突變，或因為PCR擴增所致的錯誤)。多肽可包括或缺乏N端甲硫胺酸，取決於使用的表現系統。另外，多肽可或可不包括天然訊號序列，若其為天然存在的話。若訊號序列一般不存在，則該蛋白質可帶有異源性序列而被產出。

「天然」多肽意指與自然界衍生而來之對應分子具有相同胺基酸序列的多肽。此等天然序列可從自然界單離而來或可以藉由重組或合成方式生產。術語「天然」序列具體含括該多肽之天然存在的經截斷或經分泌形式的特定分子(例如細胞外域序列)、天然存在的變體形式(例如選擇性剪接形式)以及天然存在的對偶基因變體。

「變體」表示如本文定義之活性多肽，其在有或沒有訊號肽的情況下與本文揭示之對應全長天然序列、缺乏訊號肽的多肽、多肽的細胞外域、或全長多肽序列之任何其他片段具有至少約80%胺基酸序列同一性。此等多肽變體包括，例如其中在全長天然胺基酸序列的N端及/或C端添加或刪除一或多個胺基酸殘基的多肽。通常，變體與對應全長天然序列具有至少約80%胺基酸序列同一性，或者至少約81%胺基酸序列同一性、或者至少約82%胺基酸序列同一性、或者至少約83%胺基酸序列同一性、或者至少約84%胺基酸序列同一性、或者至少約85%胺基酸序列同一性、或者至少約86%胺基酸序列同一性、或者至少約87%胺基酸序列同一性、或者至少約88%胺基酸序列同一性、或者至少約89%胺基酸序列同一性、或者至少約90%胺基酸序列同一性、或者至少約91%胺基酸序列同一性、或者至少約92%胺基酸序列同一性、或者至少約93%胺基酸序列同一 性、或者至少約94%胺基酸序列同一性、或者至少約95%胺基酸序列同一性、或者至少約96%胺基酸序列同一性、或者至少約97%胺基酸序列同一性、或者至少約98%胺基酸序列同一性，以及或者至少約99%胺基酸序列同一性。通常，變體多肽具有至少約10個胺基酸的長度，諸如至少約20個胺基酸的長度，例如至少約30個胺基酸的長度、或者至少約40個胺基酸的長度、或者至少約50個胺基酸的長度、或者至少約60個胺基酸的長度、或者至少約70個胺基酸的長度、或者至少約80個胺基酸的長度、或者至少約90個胺基酸的長度、或者至少約100個胺基酸的長度、或者至少約150個胺基酸的長度、或者至少約200個胺基酸的長度，或者至少約300個胺基酸的長度或更多。

尤佳的變體包括彼等在自然界中為守恆性的置換，亦即彼等取代發生在一個在其側鏈有所關聯之胺基酸家族內的置換。具體而言，胺基酸一般被分成四個家族：(1)酸性-天冬胺酸以及麩胺酸；(b)鹼性-離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性-丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；以及(4)未帶電極性-甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸以及酪胺酸有時被分類為芳香族胺基酸。例如，可合理預測以異白胺酸或纈胺酸單獨取代白胺酸、以麩胺酸取代天冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸或以結構相近胺基酸相似守恆地取代胺基酸將不會對生物活性有重大影響。例如，感興趣多肽可包括至多約5至10個守恆性或非守恆性胺基酸置換，或至多約15至25個或50個守恆性或非守恆性胺基酸置換，或任何介於5至50個的數目，只要分子的所要功能維持不變即可。

「同源性」意指兩個多核苷酸或兩個多肽分子之間的同一性百分比。當兩個DNA或兩個多肽序列在分子的某個限定長度內表現出至少約50%、較佳至少約75%、更佳至少約80%-85%、較佳至少約90%，以及最佳至少約95%-98%序列同一性，該等序列為彼此「實質上同源」。如本文所用，實質同源也意指對特定DNA或多肽序列顯示完全同一性的序列。

一般而言，「同一性」分別意指兩個多核苷酸或多肽序列的核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸的確切比對。同一性百分比可以藉由透過排列序列直接比較兩個分子之序列資訊、計算兩個排列序列之間的確切匹配數目、除以較短序列的長度，以及將結果乘以100來決定。易於獲得之電腦程式可用來輔助分析，諸如ALIGN,Dayhoff,M.O.的Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff ed.,5 Suppl.3：353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC，其採用Smith and Waterman Advances in Appl.Math.2：482-489,1981的局部同源性演算法供肽分析之用。用於決定核苷酸序列同一性的程式可在Wisconsin Sequence Analysis Package第8版(得自Genetics Computer Group,Madison,WI)中取得，例如BESTFIT、FASTA以及GAP程式，其亦依賴Smith與Waterman演算法。此等程式簡單地採用由製造商所建議的預設參數並說明於上面所提及之Wisconsin Sequence Analysis Package中。例如，特定核苷酸序列與參考序列的同一性百分比可以使用Smith與Waterman的同源性演算法，使用預設計分表以及六個核苷酸位置的空位罰分來決定。

在本發明上下文中，另一個建立同一性百分比的方法是使用著作權為愛丁堡大學的程式MPSRCH套裝軟體程式，其由John F.Collins與Shane S.Sturrok所發展，且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)發售。由這系列的套裝軟體，可採用Smith-Waterman演算法，其中使用預設參數供計分表用(例如空位開放罰分為12、空位延伸罰分為一，而空位為六)。由「匹配」數值產生的數據反映「序列同一性」。計算兩個序列間之同一性或相似性百分比的其他適當程式為技藝中一般熟知，例如另一個排列程式為BLAST，以預設參數來使用。例如，使用下列預設參數來使用BLASTN與BLASTP：遺傳代碼=標準；篩檢=無；股=兩者；截斷點=60；預期=10；矩陣=BLOSUM62；種類=50個序列；藉由=高計分來分選；資料庫=非冗餘，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。這些程式的細節為技藝中充分熟知。

或者，同源性可以藉由多核苷酸在同源區之間形成穩定雙股的條件下雜交，接著藉由以單股特異性核酸酶予以消化，以及經消化片段之大小測定來決定。實質上同源的DNA序列可以在例如針對特定系統定義之嚴苛條件下於南方雜交實驗中被鑑定。界定適當雜交條件落在技藝技術中。參見例如Sambrook et al.，上文；DNA Cloning，上文；Nucleic Acid Hybridization，上文。

術語「簡併性變體」欲為一種在其核酸序列中含有變化的多核苷酸，該核酸序列編碼具有與該簡併性變體衍生而來之多核苷酸編碼之多肽相同胺基酸序列的多肽。

「編碼序列」或「編碼」選定多肽之序列為當受到適當調控序列控制下，在活體內經轉錄(在DNA的情況下)以及經轉譯(在mRNA的情況下)成多肽的核酸分子。編碼序列的邊界是由5’(胺基)端處的起始密碼子以及在3’(羧基)端的轉譯中止密碼子所界定。轉錄中止序列位在編碼序列的3’。

「載體」表示任何遺傳要素，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏質體、染色體、病毒、病毒粒子等，其在與適當控制要素締合時能夠複製並其可將基因序列轉移給細胞。因此，該術語包括選殖以及表現載具，以及病毒載體。

「重組載體」表示包括能夠在活體內表現之異源性核酸序列的載體。

「重組病毒」表示經遺傳改變的病毒，例如藉由添加或插入異源性核酸構築體至粒子中。

術語「轉基因」意指在適當條件下被引入細胞中並能轉錄成RNA且轉譯且視情況轉譯及/或表現的多核苷酸。在一個態樣中，其賦予其所引入之細胞所要特性，或以其他方式產生所要治療或診斷結果。

提到病毒滴定濃度時所使用的術語「基因組粒子(gp)」以及「基因組等效物」，意指含有重組AAV DNA基因組之病毒粒子數目，而與感染性或功能性無關。在特定載體製品中的基因組粒子數目可藉由技藝 中已知的程序來測量，諸如描述於例如Clark et al.,Hum.Gene Ther.(1999)10：1031-1039；以及Veldwijk et al.,Mol.Ther.(2002)6：272-278中。

提到病毒滴定濃度時所使用的術語「感染單元(iu)」、「感染性粒子」或「複製單元」，意指感染性重組AAV載體粒子如藉由感染性中心分析(亦以之為複製中心分析)所測量的數目，如McLaughlin et al.,J.Virol.(1988)62：1963-1973中所述。

提到病毒滴定濃度時所使用的術語「轉導單元(tu)」，意指造成功能性轉基因產物生成的感染性重組AAV載體粒子數目，如藉由諸如Xiao et al.,Exp.Neurobiol.(1997)144：1 13-124中；或Fisher et al.,J.Virol.(1996)70：520-532(LFU分析)中所述的功能分析所測量。

術語「轉染」用於意指細胞攝入外來DNA，且當外源性DNA已被引入細胞膜內側時，細胞已「被轉染」。一些轉染技術為技藝中普遍熟知。參見，例如Graham et al.(1973)Virology,52：456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier，以及Chu et al.(1981)Gene13：197。此等技術可用於將一或多個外源性DNA部分引入適當宿主細胞中。

術語「異源性」當其與核酸序列(諸如編碼序列以及控制序列)有關時，表示通常不接合在一起，及/或通常不與特定細胞締合的序列。因此，核酸構築體或載體的「異源性」區域是核酸在另一核酸分子內或附接至另一核酸分子的區段，該另一核酸分子在自然界中通常未被發現是與其他分子相締合。例如，核酸構築體的異源性區域可能包括編碼序列，兩側為在自然界中未被發現與編碼序列相締合的序列。異源性編碼序列的另一個實例是構築體，其中該編碼序列本身在自然界中未被發現(例如具有與天然基因不同之密碼子的合成序列)。同樣地，經通常不存在於細胞內之構築體轉形的細胞就本發明目的而言被視為異源性。對偶基因變異或天然突變事件如本文所用不會產生異源性DNA。

「核酸」序列意指DNA或RNA序列。術語取得包括DNA及RNA之已知鹼基任一者的序列，諸如，但不限於4-乙醯基胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷酸、丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-胺基-甲基-2-硫尿嘧啶、貝他-D-甘露糖基辮苷(queosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-異戊基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、氧基丁氧核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-羥乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶，以及2,6-二胺基嘌呤。

術語DNA「控制序列」全體意指啟動子序列、聚腺苷酸化訊號、轉錄中止序列、上游調節域、複製源點、內部核醣體進入位點(「IRES」)、增強子，以及類似序列，其全體提供用以在受體細胞內複製、轉錄以及轉譯編碼序列。並非所有此等控制序列都一定需要存在，只要所選編碼序列能夠在適當宿主細胞中複製、轉錄並轉譯即可。

術語「啟動子」在本文中以其一般意義使用，意指一個包含DNA調節序列的核苷酸區域，其中該調節序列是衍生自能夠結合RNA聚合酶並起始下游(3’-方向)編碼序列轉錄的基因。轉錄啟動子可包括「誘導型啟動子」(其中可操作地連結至啟動子之多核苷酸序列的表現是受到分析物、輔因子、調節蛋白等誘導)、「壓抑型啟動子」(其中可操作地連結至啟動子之多核苷酸序列的表現是受到分析物、輔因子、調節蛋白等誘導)，以及「組成性啟動子」。

「可操作地連結」意指要素的排列，其中所述該等組分經組態以執行其慣常功能。因此，可操作地連結至編碼序列的控制序列能夠 影響編碼序列的表現。控制序列不需要與編碼序列為連續的，只要它們發揮導引編碼序列表現的功能即可。因此，舉例而言，干擾未轉譯但已轉錄的序列可能出現在啟動子序列以及編碼序列之間，且該啟動子序列可能仍被視為「可操作地連結」至該編碼序列。

當意指蛋白質或核苷酸序列時，「經單離」表示指定分子以實質上不存在相同類型的其他生物巨分子的方式存在。因此，舉例而言，「編碼特定多肽之經單離核酸分子」意指實質上不含不編碼標的多肽之其他核酸分子的核酸分子；但是，該分子可包括一些不會有害地影響組成之基本特性的額外鹼基或部分。

就說明核苷酸序列(具體而言是本申請案通篇中的核酸分子)相對位置之目的來說，諸如當特定核苷酸序列被描述為相對另一序列位於「上游」、「下游」、「3-端(3’)」或「5-端(5’)」時，應理解為以DNA分子之「意義」或「編碼」股來說的序列位置，在技藝中被認為是習知的。

術語「約」，尤其是意指給定數量時，表示含括加上或減去五個百分比的偏差。

2.實施本發明的模式

在詳細說明本發明之前，應理解本發明不限於特定配方或步驟參數，更確切地說當然是可加以變化的。應理解本文使用的術語僅為說明本發明的特定具體例之用，且不意欲具有限制性的。

儘管一些類似於本文所述者的方法以及材料可用於實施本發明，本文將說明較佳材料及方法。

本發明主要是發現呈微莫耳濃度的金精三羧酸(ATA)會增加HSV-1載體產量。這個發現對於大規模HSV生產，以及rHSV以及rAAV載體生產而言至關重要。此外且更出乎意料的是，如實例中所示，ATA在rHSV-1原液中的存在不會負面地影響rAAV產量。這個結果出人意表，因為呈毫莫耳數量以及較高濃度的ATA已知是一種抗病毒劑(Cushman et al.,J.Med.Chem.(1991)34：329-337；Zhang et al.,Antiviral Res.(1999) 43：23-35；Yap et al.,Computational Biol.and Chem.(2005)29：212-219；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31：118-160)。

如上所釋，研究人員已報導一氧化氮(NO)對抗數種病毒(尤其是諸如牛痘病毒、水泡性口炎病毒，以及日本腦炎病毒)的抗病毒活性(Bi et al.,J.Virol.(1995)69：6466-6472；Harris et al.,J.Virol.(1995)69：910-915；Lin et al.,1997；Pertile et al.,Avian Dis.(1996)40：342-348)。 NO是一種自由基氣體分子，是宿主防禦作用的一個媒介因子(Croen K.D.,J.Clin.Invest.(1993)91：2446-2452；Karupiah et al.,Science(1993)261：1445-1448；Rolph et al.,Virol.(1996)217：470-477；Amaro et al.,J.Med.Virol.(1997)51：326-331；Lane et al.,J.Virol.(1997)71：2202-2210)。HSV感染能夠引起誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)表現，一種編碼生產大量NO之NOS的誘導型同型的基因。

如本文所示，ATA在培養中壓抑受HSV上調的iNOS並從而增加HSV滴定濃度。額外的iNOS抑制劑(包括地塞米松以及丙戊酸)也具有相同的效用。在一個具體例中，於是使用此等iNOS抑制劑在培養中增加重組皰疹病毒滴定濃度、容許比在特定抑制劑不存在下生產者生產明顯更多病毒。藉由該方法所生產的病毒可用於各種上下文中，包括用於預防性、治療性以及診斷性用途，以及用於生產足量的重組構築體供使用於製備基因遞送與基因療法用的重組病毒粒子。

金精三羧酸(ATA)，5-((3-羧基-4-羥基苯基)(3-羧基-4-側氧基-2,5-環己二烯-1-基亞基)甲基)-2-羥基苯甲酸，是當以甲醛、硫酸與亞硝酸鈉來處理水楊酸時所形成的一種非硫化帶負電芳族聚合物的異質性混合物(參見Cushman,et al.,(1991)J.Med.Chem.34：329-337；Cushman,et al.,J.Med.Chem.34：337-342)。金精三羧酸具有下式：

ATA的異質性混合物被描述為抑制蛋白質核酸交互作用(Gonzalezet al.,Biochim.Biophys.Acta,(1979)562：534-545)；與類固醇受體在細胞核攝入以及細胞核結合層次上交互作用(Mellon,W.S.,Biochem.Pharmacol.(1984)33：1047-1057；Moudgilet al.,J.Steroid Biochem.(1985)23：125-132)；抑制DNA聚合酶(Nakaneet al.,Eur.J.Biochem.(1988)177：91-96)；以及作為RNAase抑制劑(Skidmoreet al.,Biochem.J.(1989)263：73-80)。

除了病毒以外，培養中的ATA可呈酸性形式來使用或可呈鹽形式提供，諸如金精三羧酸三鈉鹽；鈣鹽；銨鹽等。

可與本發明方法一起使用的額外物質包括地塞米松(Dex)以及丙戊酸(VA)。Dex在大鼠腎小球環間膜細胞中已顯示在轉錄以及轉錄後層次會抑制iNOS表現(Kunz et al.,Biochem.J.(1994)304：337-340；Kunz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93：255-259)。Dex亦已被證實在PC12細胞中會提高HSV-1 oriL DNA複製。丙戊酸鈉，VA的鈉鹽，已被證實會刺激HSV-1、人類細胞巨大病毒、HIF-1、人類皰疹病毒-8、麻疹病毒以及小兒麻痺病毒的複製(Motamedifar et al.,Iran.J.Med.Sci.(2006)31：28-32；Kuntz-Simon et al.,J.Gen.Virol(1995)76：1409-1415；Moog et al.,J.Gen.Virol(1996)77：1993-1999；Ylisastigui et al.,AIDS(2004)18：1101-1108；Shaw et al.,AIDS(2000)14：899-902；Kabiri et al.Iran J.Med.Sci.(2001)26：55-61)。此外，丙戊酸已被證實會抑制iNOS(Guo et al., Surgery(2007)142：156-162)。如同ATA，VA或其鹽(諸如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽等)可用於本發明中。

儘管在本文中例示使用ATA、Dex以及VA以較高的滴定濃度生產rHSV-1載體，但這些iNOS抑制劑可用於增加各種病毒在培養中的滴定濃度，諸如但不限於下列的病毒科：腺病毒科(Adenoviridae)、小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)(例如小兒麻痺病毒等)；杯狀病毒科(Caliciviridae)；披衣病毒科(Togaviridae)(例如風疹病毒、登革熱病毒等)；黃熱病毒科(Flaviviridae)；冠狀病毒科(Coronaviridae)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；桿狀病毒科(Rhabodoviridae)(例如狂犬病病毒等)；痘病毒科(Poxviridae)；絲狀病毒科(Filoviridae)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒等)；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如A型、B型與C型流感病毒等)；本揚病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；各種肝炎病毒，諸如HAV、HBV與HCV；乳頭狀瘤病毒以及輪狀病毒；逆轉錄病毒等。有關這些以及其他病毒的說明參見，例如Virology,3rd Edition(W.K.Joklik ed.1988)；Fundamental Virology,2nd Edition(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.1991)。此等病毒或自其衍生之免疫原可用於生產疫苗以及診斷劑。此外，這些病毒中的一些病毒(具體而言為皰疹病毒)可用於生產重組載體供生產重組病毒粒子用以下述之基因投遞技術。

因此，ATA、Dex以及VA可用於增加皰疹病毒科成員的任一皰疹病毒的產量。這尤其包括馬皰疹病毒、牛皰疹病毒(BHV)以及人類單純皰疹病毒(HSV)第1型與第2型(諸如BHV-1、BHV-2、HSV-1以及HSV-2)、水痘病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、細胞巨大病毒(CMV)、HHV6與HHV7。該等皰疹病毒可以衍生自許多病毒株的任一者。舉例而言，當使用本發明所生產之病毒為HSV時，則該病毒可能衍生自例如HSV-1或HSV-2，且可能是來自不同HSV病毒株的任一者，諸如HSV-1 KOS株、HSV-1麥金泰株、HSV-1 Patton株、HSV-2 333株、HSV-2 G株與類似病毒 株。此外，所生產的該等病毒可以是野生型病毒或其衍生病毒，包括重組病毒以及型內(inter-type)重組體(含有HSV-1與HSV-2的DNA)。衍生病毒與HSV-1或HSV-2基因組或其部分較佳具有至少70%序列同源性、更佳至少80%、又更佳至少90或95%。衍生病毒可具有HSV-1或HSV-2基因組的序列，該序列經核苷酸置換(例如1、2或3至10、25、50或100個置換)而被修飾。HSV-1或HSV-2基因組或者或另外經一或多個插入及/或刪除及/或在一端或兩端經延伸而被修飾。

其他衍生病毒包括在基因中已具有突變的病毒株，該等突變具體而言是在基因中減弱病毒的突變。此等病毒的實例包括包括1716株(MacLean et al.,J.Gen.Virol.(1991)72：632-639)、R3616與R4009株(Chou and Roizman,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1992)89：3266-3270)以及R930株(Chou et al.,J.Virol.(1994)68：8304-8311)(其全部在ICP34.5中帶有突變)、d120株(其在ICP4中帶有刪除)(DeLuca et al.,J.Virol.(1985)56：558-570)、d27-1株(Rice and Knipe,J.Virol.(1990)64：1704-1715)(其在ICP27中帶有刪除)或d92株(其在ICP27與ICP4中均帶有刪除)(Samaniego et al.,J.Virol.(1995)69：5705-5715)。說明不同HSV基因時所使用的術語如同在例如Coffin and Latchman(1996)於Genetic Manipulation of the Nervous System(DS Latchman Ed.)pp 99-114：Academic Press,London中所發現。

顯而易見的是，適於所欲目的之任一種rHSV可用於本發明中。在某些具體例中，用於本發明中的rHSV為複製缺陷型。為生產rAAV病毒粒子，經不能夠複製的rHSV感染生產者細胞較佳，因為相對於涉及使用腺病毒的方法，rHSV不會成為rAAV產物的明顯汙染物。這可供藉由排除與移除腺病毒相關之純化步驟來增加rAAV病毒粒子的最終產量。在本發明的特定具體例中，由HSV-1突變體構築該rHSV，其中該突變體因為ICP27基因中的一個刪除而無法複製。任何其他表現複製缺陷型表現型的適當HSV突變體亦可用來構築該rHSV。

使用本發明方法用於rAAV生產的一個尤佳重組突變HSV-1病毒株為HSV-1 d27-1株。這個病毒株可以如在例如Conway et al., Gene Ther.(1999)6：973 985以及U.S.專利第7,091,029號(以其整體併入本文做為參考資料)中所述來製備。如上所釋，這個突變載體不生產ICP27且有利於用來生產rAAV病毒粒子，因為信息RAN的宿主細胞剪接已知受到ICP27所抑制。ICP27也可能影響AAV-2 rep與cap信息的適當剪接。這個載體為複製缺陷型且相較於野生型(wt)HSV-1顯示細胞毒性降低。該病毒d27-1表現出有利於用作為輔助病毒供rAAV病毒粒子生產用的數種其他特徵。首先，其表現對rAAV生產而言已知為必需的早期基因(Weindler et al.,J.Virol.(1991)65：2476-2483)。此外，d27.1過度表現ICP8，ICP8是單股DNA結合蛋白，其為UL29的產物，UL29是AAV複製以及包裝所必需之HSV-1基因的一者(Weindler et al.,J.Virol.(1991)65：2476-2483)。

AAV基因組是一個線性、單股DNA分子，含有約4681個核苷酸。AAV基因組通常含有內部、非重複基因組，兩側在每一端為反向末端重複序列(ITR)。ITR長度為約145個鹼基對(bp)。ITR具有多種功能，包括提供DNA複製源點，以及病毒基因組的包裝訊號。基因組的內部非重複部分包括兩個大的開放閱讀框架，已知為AAV複製(rep)以及蛋白殼(cap)基因。rep以及cap基因編碼容許病毒複製並包裝成病毒粒子的病毒蛋白。具體而言，一個具有至少四個病毒蛋白的家族是由AAV rep區Rep 78、Rep 68、Rep 52以及Rep 40所表現，這是依據它們的表觀分子量來命名。AAV cap區編碼至少三個蛋白質，VP1、VP2以及VP3。

「AAV rep編碼區」表示AAV基因組經技藝認定的區域，其編碼複製蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52與Rep 40。這些Rep表現產物已被證實具有一些功能，包括DNA複製之AAA源點的辨識、結合與刻痕、DNA解螺旋酶與調節AAV(或其他異源性)啟動子的轉錄。Rep表現產物整體對於複製AAV基因組來說是必要的。關於AAV rep編碼區的說明，參見例如Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97-129；以及Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy5：793-801。AAV rep編碼區的適當同源物包括人類皰疹病毒6(HHV-6)rep基因，其亦已知為媒介AAV-2 DNA複製(Thomson et al.(1994)Virology204：304-311)。

「AAV cap編碼區」表示AAV基因組經技藝認定的區域，其編碼蛋白殼蛋白VP1、VP2及VP3，或其功能性同源物。這些Cap表現產物提供整體對於包裝病毒基因組來說為必要的包裝功能。關於AAV cap編碼區的說明，參見例如Muzyczka,N.and Kotin,R.M.(上文)。

通常兩個rHSV載體用於生產rAAV病毒粒子。一者為rHSV輔助功能載體，其中AAV rep及/或cap基因已被併入rHSV基因組中。另一者為rHSV表現載體，其中AAV的ITR序列已被併入rHSV基因組且位在感興趣基因的兩側。

因此，在一個具體例中，iNOS抑制劑可用來增加含有AAV rep及/或cap基因之第一rHSV載體的產量。本方法之第一rHSV載體的具體例包括，但不限於以在不同AAV血清型中發現到的cap基因為主之基因構築體，AAV血清型包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5與AAV-6、AAV-7以及AAV-8、山羊與牛AAV(參見，例如美國公開案第20080292595號，以其整體併入本文做為參考資料)，及其變體。亦落在本發明範疇內為新穎AAV血清型的rep及cap基因，且彼等藉由現有血清型的重組或突變而被修飾者。AAV輔助功能載體的rep及cap基因可衍生自已知AAV血清型的任一者，如上所釋。例如，rHSV輔助功能載體具有一個衍生自AAV-2的rep基因與一個衍生自AAV-6的cap基因；習於技藝者將能理解其他rep及cap基因組合是可行的，限制性特徵為協助rAAV病毒粒子生產的能力。

在某些具體例中，rHSV輔助功能載體中的AAV rep及cap基因可受其天然啟動子所驅動。AAV-2的P5以及p19啟動子分別控制Rep 78與68以及Rep 52與40的表現。P40啟動子控制VP1、VP2以及VP3的表現。此外，異源性啟動子可用來驅動AAV基因的表現。可用於所揭示之方法中的其他啟動子的實例包括，但不限於SV40早期啟動子、CMV啟動子、HSV-1胸腺核苷激酶(HSV-1 tk)啟動子、金屬硫蛋白誘導型啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子以及雞β-肌動蛋白啟動子。

基因構築體可以插入HSV基因組之適於rep及cap基因併入的任何一個位點或數個位點。在某些具體例中，該載體是藉由AAV rep及 cap基因同源重組至rHSV-1病毒的胸腺核苷激酶(tk)基因座中來構築，如Conway et al.,Gene Ther.(1999)6：986-993以及美國專利第7,091,029號(以其整體併入本文做為參考資料)中所述。

如本文所釋，該rHSV輔助功能載體編碼「AAV輔助功能」序列(亦即rep及cap)，其以反向(trans)的方式作用以供生產性AAV複製與包殼化(encapsidation)。較佳地，該rHSV輔助功能載體維持有效率的rAAV病毒粒子生產而不會產生任何可偵測到的wt AAV病毒粒子(亦即含有功能性rep及cap基因的AAV病毒粒子)。這樣一種載體的實例為rHSV-1 d27.1rc。該載體以及生成該載體的方法在本文中描述於實例內，以及於Conway et al.,Gene Ther.(1999)6：986-993；與美國專利第7,091,029號(以其整體併入本文做為參考資料)內。

第二rHSV載體稱為rHSV表現載體且含有AAV的ITR，其中一或多個感興趣基因受一或多個啟動子驅動。在一些具體例中，感興趣的基因被插入一對ITR之間。異源性基因通常在功能上連結至能夠驅動患者之目標細胞在適當條件下基因表現的異源性啟動子(組成性、細胞特異型或誘導型)。中止訊號(諸如聚腺苷酸化位點)也可以被納入。

AAV ITR區域的核苷酸序列為已知的。關於AAV-2序列參見，例如Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Berns,K.I."Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology,2nd Edition,(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)。本發明載體中所用的AAV ITR不需要帶有一個野生型核苷酸序列，且可以例如藉由插入、刪除或置換核苷酸而被改變。此外，AAV ITR可以衍生自數種AAV血清型中的任一者，包括(但不限於)AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7與AAV-8，山羊與牛AAV(參見例如美國公開案第20080292595號。以其整體併入本文做為參考資料)，及其變體。此外，在表現載體中位在選定核苷酸兩側的5’與3’ITR不必然是相同的或衍生自相同的AAV血清型或分離株，只要它們如所需要般發揮功能即可，亦即容許從宿主細胞基因組或載體切除與救回 感興趣基因，並在AAV rep基因產物存在於受體細胞中時容許DNA分子併入該受體細胞基因組中。

AAV ITR可以使用標準接合技術從病毒基因組或含有相同與經融合5’與3’選定核酸構築體的AAV載體被切下，標準接合技術為彼等於Sambrook et al.，上文中所述者。例如，接合可以在20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，與40μM ATP,0.01-0.02(Weiss)單位T4 DNA接合酶於0℃下(用於"黏端"接合)或1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)單元T4 DNA接合酶在14℃下(用於"鈍端"接合)中完成。分子間「黏端」接合通常在30-100μg/ml總DNA濃度(5-100nM總最終濃度)下進行。含有ITR的AAV載體已描述於例如美國專利第5,139,941號中，具體而言，其中已描述一些AAV載體，其可以寄存編號53222、53223、53224、53225與53226得自美國典型培養物保存中心(「ATCC」)。

選定多核苷酸序列可操作地連結至控制要素，控制要素指引該選定多核苷酸序列在個體細胞中的轉錄或表現。此等控制要素可包含通常與選定基因締合的控制序列。另外，可採用異源性控制序列。可供使用的異源性控制序列通常包括彼等衍生自編碼哺乳動物或病毒基因的序列者。實例包括，但不限於神經元特異性烯醇酶啟動子、GFAP啟動子、SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子；腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)；單純皰疹病毒(HSV)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)啟動子(諸如CMV立即早期啟動子區(CMVIE))、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成啟動子、雜合啟動子以及類似者。另外，也可以在本文中使用衍生自非病毒基因的序列，諸如鼠類金屬硫蛋白基因。此等啟動子序列在商業上可得自於，例如Stratagene(San Diego,CA)、Invivogen(San Diego,CA)以及其他公司。

感興趣基因可以是可能具有治療價值的基因。治療性基因的實例包括，但不限於α-1抗胰蛋白酶、因子VIII、因子IX、GAA、紅血球生成素以及PEDF。當選擇或鑑別成功轉殖表現是所需要時，感興趣基 因可以是報導子基因。可用作為報導或供篩選的基因的許多實例為已知的，且可用於本發明中。這些包括，但不限於編碼下列的基因：β-半乳糖苷酶、新黴素、磷酸-轉移酶、氯黴素乙烯基轉移酶、胸腺核苷激酶、螢光酶、β-葡萄醣醛酸酶、胺基糖苷、磷酸轉移酶、潮黴素B、黃呤嘌-鳥嘌呤磷酸核糖基、螢光酶、DHFR/甲氨蝶呤，以及綠色螢光蛋白(GFP)。

rHSV-1表現病毒可以與上述更為相同的方式生成，亦即藉由同源重組至HSV-1 tk基因中，如在例如Conway et al.,Gene Ther.(1999)6：986-993以及美國專利第7,091,029號(以其整體併入本文做為參考資料)中所述。

在生產之後，於適當細胞株在培養中增殖rHSV載體或感興趣的任何其他病毒。就皰疹病毒而言，此等細胞株包括，但不限於Vero細胞、293細胞、HeLa細胞以及類似細胞，可得自於美國典型培養物保存中心Rockville,Md。若使用HSV-1 d27.1載體，則此病毒一般培養在ICP27-補足細胞株V27中(Rice et al.,J.Virol.(1990)64：1704-1715)。在有或沒有血清(諸如胎牛血清)的情況下，可針對上述病毒使用任何適當培養基，諸如，但不限於RPMI 1640培養基、杜貝可改良伊格培養基(DMEM)、F12培養基或後者的培養物(DF培養基)。若血清存在，則培養物可包括，例如2%至20%血清，更一般為5%至15%血清、7%至12%血清，或這些範圍內的任何數值，諸如5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%，及類似數值。此外，若使用血清，其可存在於初始培養物中，及/或後續添加至培養物的新鮮培養基中。

在本發明方法中被添加的iNOS抑制劑數量可以改變且在某些程度上取決於所使用的特定抑制劑、使用的培養基以及培養的病毒。例如，當皰疹病毒培養於Vero細胞中時，ATA(若存在的話)在初始培養物中的濃度通常為5μM至500μM，較佳10μM至250μM，諸如20μM至100μM，亦即30μM至75μM，諸如30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或此等所述範圍內的任何整數。同樣地，地塞米松(若存在的話)在初始培養物中的濃度通常為.1μM至500μM，較佳.5μM至250μM，諸如1μM 至100μM，亦即5μM至75μM，諸如1...5...15...10...20...25...30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或此等所述範圍內的任何整數。若使用丙戊酸，則初始濃度將為.1mM至500mM，較佳.5mM至250mM，諸如1mM至100mM，亦即5mM至75mM，諸如1...5...15...10...20...25...30...35...40...45...50...55...60...65...70...75等，或此等所述範圍內的任何整數。

在某些具體例中，經病毒感染的細胞起初培養於如上所述的培養基中超過歷時.5小時至24小時，諸如.75小時至12小時、1小時至5小時、1小時至2小時，或此等所述範圍內任何整數的小時或其部分。iNOS抑制劑及/或血清可或可不存在於初始培養基中。接著添加新鮮培養基並培育培養物歷時24至120小時，諸如48至96小時、50至80小時、60至75小時、70至74小時，或此等所述範圍內任何整數的小時或其部分。iNOS抑制劑及/或血清可或可不存在於後續培養物中，前提為該iNOS抑制劑存在於初始培養物或後續培養物中之一者或兩者中。

在一些具體例中，初始培養物中的iNOS抑制劑以比後續培養物中還高的濃度存在。因此，例如若iNOS抑制劑為ATA，則其於初始培養物中以30至75μM的數量存在，而在後續培養物中以5至25μM的數量存在。或者，抑制劑可僅存在於初始培養物或後續培養物中。

如下面實例中所示，一個使用ATA的尤佳方法包括於初始培養物中存在50μM的ATA，其中ATA在後續培養物中的數量降低至20μM。此外，在ATA的情況下，偏好在ATA存在的同時納入血清。因此，若ATA添加至初始培養物中，對培養基添加胎牛血清(FBS)是有利的。同樣的，若ATA添加至後續培養物中，則添加FBS對於獲得較高病毒產量來說是必須的。

接著培養該等病毒以獲得所要滴定濃度的病毒。例如，在本文所述HSV-1 d27-1載體的情況下，ATA在V27細胞上清液中增加d27-1產量3-5倍，而滴定濃度可為至少1 x 10⁸ PFU/ml或4 x 10⁸ DRP/ml。同樣地，ATA也增加野生型(wt)HSV-1病毒麥金泰株與KOS株的產量達1個對 數，而293或Vero滴定濃度可高至1 x 10⁹ DRP/ml。接著收取該等病毒以供進一步使用。

為本發明之目的，用於生產rAAV病毒粒子的適當宿主細胞包括微生物、酵母菌細胞、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞，其可被，或已被用作為異源性DNA分子的受體且能夠在例如懸浮培養物、燒瓶、盤、生物反應器或類似者中生長。該術語包括原細胞的後代，它們已被轉染。因此，「宿主細胞」如本文所用通常意指經外源性DNA序列轉導的細胞。若重組皰疹病毒在某個用於製造rAAV病毒粒子的細胞類型中被生產，則所收取的載體接著被轉染至另一個適當宿主細胞中。源自於穩定人類細胞株的293細胞(可透過例如以寄存編號ATCC CRL1573由美國典型培養物保存中心輕易獲得)為較佳的宿主細胞以生產rAAV病毒粒子。具體而言，人類細胞株293為人類胚腎細胞株，其經腺病毒第5型DNA片段轉形(Graham et al.(1977)J.Gen.Virol.36：59)，並表現腺病毒E1a與E1b基因(Aiello et al.(1979)Virology94：460)。293細胞株容易地經轉染，且提供生產rAAV病毒粒子的尤其便利平台。

AAV輔助功能藉由使用rHSV表現載體以rHSV輔助功能構築體在之前或同時轉染宿主細胞而被引入宿主細胞。因而rHSV輔助構築體用以提供至少暫時表現AAV rep及/或cap基因，以輔助缺失的AAV功能，該AAV功能對於生產性AAV感染為必要的。AAV輔助構築體缺少AAV ITR且本身既無法複製且自身也無法包裝。

在重組AAV複製之後，rAAV病毒粒子可以由宿主細胞中使用不同習知純化方法予以純化，習知純化為諸如管柱層析、CsCl梯度以及類似技術。舉例而言，可使用複數個管柱純化步驟，諸如在陰離子交換管柱、親和力管柱及/或陽離子交換管柱上的純化。參見，例如國際公開案第WO 02/12455號。

含有感興趣核苷酸序列的所得rAAV病毒粒子接而可使用技藝中已知且在例如美國專利第5,173,414號與第5,139,941號；國際公開案第WO 92/01070號(1992年1月23日公開)與第WO 93/03769號(1993年3月4 日公開)；Lebkowski et al.,Molec.Cell.Biol.(1988)8：3988-3996；Vincent et al.,Vaccines 90(1990)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter,B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3：533-539；Muzyczka,N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158：97-129；Kotin,R.M.Human Gene Therapy(1994)5：793-801；Shelling and Smith,Gene Therapy(1994)1：165-169；以及Zhou et al.,J.Exp.Med.(1994)179：1867-1875中所述的技術供基因遞送。

2.實驗

下面是實施本發明的特定具體例的實例。提供該等實例僅供說明之用，且不意欲在任何方面限制本發明之範疇。

已盡力確保關於所用數字(例如數量、溫度等)的準確性，但應考量到一些實驗誤差以及偏差。

材料與方法 細胞

Vero-衍生的V27細胞(Rice et al.,J.Virol.(1989)63：3399-3407)以及人類胚腎細胞(HEK)-衍生的293細胞(Graham et al.,J.Gen.Virol.(1977)36：59-74)是得自於Applied Genetic Technologies Corporation(AGTC,Alachua,FL),Vero與HeLa細胞是購自於美國典型培養物保存中心(ATCC,Manassas,VA)。所有細胞維持在杜貝可改良伊格培養基(DMEM；HyClone,South Logan,UT)中，該培養基含有10%胎牛血清(FBS；HyClone)以及用於V27細胞之遺傳黴素(50mg/ml；Invitrogen)或用於其他細胞之1%盤尼西林/鏈黴素(Cellgro Mediatech,Manassas,VA)。

HSV-1生產

wtHSV-1 KOS株以及wtHSV-1 KOS株：載體d27-1的ICP27-缺陷型衍生物(Rice and Knipe,J.Virol.(1990)64：1704-1715)、 rHSV-rep2/cap2與rHSV-EGFP(Kang et al.,Gene Ther.(2009)16：229-239)及其生產者ICP27-補足V27細胞株是得自於AGTC(Alachua,FL)。wtHSV-1麥金泰株購自於Advanced Biotechnologies Inc.(ABI,Columbia MD)而wtHSV-1 KOS株在Vero、293或HeLa細胞株中增殖。在感染後72小時藉由回收培養物上清液收取感染性載體粒子。呈DNase抗性粒子/ml(DRP/ml)的HSV-1原液滴定濃度是藉由Taqman分析來測定。粗培養基中的病毒基因組是經由於DNase I(50U/ml最終；Promega)存在下在37℃下處理60分鐘，接著在50℃下蛋白酶K(Invitrogen)消化(1U/ml)60分鐘，然後在95℃下變性30分鐘來量化。線性化質體pZero 195 UL36(得自AGTC,Inc.,Alachua,FL)用來生成標準曲線。引子-探針組對載體基因組UL36序列具有特異性(HSV-UL36 F：5’-GTTGGTTATGGGGGAGTGTGG(SEQ ID NO：1)；HSV-UL36 R：5’-TCCTTGTCTGGGGTGTCTTCG(SEQ ID NO：2)；HSV-UL36探針：5’-6FAM-CGACGAAGACTCCGACGCCACCTC-TAMRA(SEQ ID NO：3)。PCR產物的擴增是使用下列循環參數來進行：在50℃下歷時2分鐘1個循環，在95℃下歷時10分鐘1個循環；在95℃下歷時15秒鐘40個循環，以及60℃歷時60秒鐘。

ATA實驗

ATA(Sigma-A1895金精三羧酸專門級，85%(滴定濃度)，粉末)原液是如在100mM碳酸氫鈉水溶液中的500μM濃度而生成。ATA原液於DMDM+/-10%胎牛血清(FBS,Hyclone,Waltham,MA)中進一步稀釋成12-60μM ATA的濃度範圍(8.5-21μgATA/ml)。以0.15的感染多重性(MOI=0.15)在40%(2/5 vol)的總最終培養基體積中進行HSV-1感染(在6孔盤中通常6x10⁵細胞)歷時1-2小時，且在稀釋步驟期間添加剩餘培養基(60%或3/5總最終體積)。接著培育細胞72小時並收取上清液以進行每毫升形成單元(PFU/ml)以及DRP/ml滴定濃度分析。

地塞米松(Dex)實驗

地塞米松(Sigma-D4902)在絕對酒精中溶解成2mg/ml。這用DMEM予以稀釋而達到1M濃度並儲存於-20℃下。

在以6x10⁵細胞/孔感染前之日，將V27細胞植入6孔盤中。添加地塞米松至種植培養基中以達到1μM的濃度。充分混合並添加至孔。

抽吸培養基並以每1ml DMEM(無添加物)之MOI為0.15(=細胞種植密度x 0.15/pfu HSV原液的滴定濃度)添加感染性HSV-1 d27-1原液。每孔添加1ml感染性接種物。這在37℃、5% CO₂培養箱中培育歷時1-2小時，之後添加1.5ml的DMEM-10% FBS。將培養物送回培養箱歷時70-74小時。

收取游離培養基、渦捲，在4℃下以1,100 x g離心10分鐘。將上清液轉移至一個新的分配管、渦捲、分成等分試樣並將原液儲存於-80℃下。

丙戊酸(VA)實驗

丙戊酸(Sigma-P4543)在水中溶解成1M濃度。在以6x10⁵細胞/孔感染前之日將V27細胞植入6孔盤中。添加1M丙戊酸至1ml DMEM-10% FBS中以達到5μM的濃度。充分渦捲並添加至孔。培養盤6小時，抽吸並添加每1ml DMEM(無添加物)之MOI 15的感染性HSV-1 d27-1原液(=細胞種植密度x 0.15/pfu HSV原液的滴定濃度)。

每孔添加1ml感染性接種物並在37℃、5% CO₂培養箱中培育歷時1-2小時，之後添加1.5ml的DMEM-10% FBS。將盤送回培養箱歷時70-74小時。收取游離培養基、渦捲，並在4℃下以1,100 x g離心10分鐘。將上清液轉移至一個新的分配管、渦捲並分成等分試樣。將原液儲存於-80℃下。

rAAV生產

如Kang et al.,Gene Ther(2009)16：229-239所述，以rHSV-rep2/cap2與rHSV-EGFP載體同時共感染293細胞(2.5 x10⁶)。感染後2-4小時，感染性培養基被換成與兩倍感染前培養物體積相同的DMEM+10% FBS。在收取時，將細胞丸粒冷凍在-80℃下。藉由即時聚合酶鏈反應(qPCR)在96孔組熱循環器(Applied Biosystems；7500 Real Time PCR system)中量化DRP滴定濃度。粗樣品經過三個冷凍與解凍的循環，接著在核酸酶(Benzonase)(250U/ml)、2mM MgCl₂、1%最終濃度蛋白級Tween 80(Calbiochem)存在下培育並在37℃下培育歷時60分鐘，然後在50℃下藉由0.25%胰蛋白酶(Gibco)消化歷時60分鐘。最後，在37℃下以DNase I(50U/ml；Promega)處理歷時30分鐘，然後在95℃下變性歷時20分鐘。線性化質體pDC67/+SV40被用來生成標準曲線。引子-探針組對猿病毒40(SV40)聚(A)序列具有特異性：rAAV-F：5’-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3’(SEQ ID NO：4)；rAAV-R：5’-GCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3’(SEQ ID NO：5)；rAAV-探針：5’6-FAM-AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC-TAMRA-3’(SEQ ID NO：6)。PCR產物的擴增是使用下列循環參數來進行：在50℃下歷時2分鐘1個循環，在95℃下歷時10分鐘1個循環；在95℃下歷時15秒鐘40個循環，以及60℃歷時60秒鐘。

人類基因組分析

匯聚的293細胞(2.4x10⁶個細胞於75cm²培養瓶中)培養於DMEM+10% FCS中歷時約20小時且接著以每個細胞一個溶血斑形成單元(PFU/細胞)的HSV-1麥金泰株感染歷時90分鐘。在感染後90分鐘添加濃度20μM(最終)的ATA。在感染後24小時之時收取經感染細胞。品質與數量充足的總RNA是使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN,Valencia,CA)依據製造商指示從懸浮液被分離出來。整體基因組表現概況分析是在Asuragen, Inc的Affymetrix Human U133 Plus 2.0 Array上進行。提供3μg總RNA做為輸入材料。

整體來說，在生物分析儀上所評估的RNA品質具有RIN值>9。陣列雜交以及比例因數在及格品管範圍內。在掃描之後，未經處理的運算式CEL檔案是使用Affymetrix Expression Console vs.1.1.2(affymetrix.com)來進行處理。各個CEL檔案是使用Robust Multichip Analysis(RMA)來進行處理以及如文字檔案輸出歸納表。所有下游基因組與統計分析是使用JMP Genomics(第5版)(jmp.com/software/genomics)來進行。首先，將過濾步驟施用於濾出低表現，具體而言在8個樣品的至少兩個中那些以log²模式來說低於6的數值。在54,675總Affy U133 Plus2探針中，41,569(76%)個探針維持低於截斷值。也看到兩個正對照樣品(分別是人類腦與集中人類萬用參考RNA)充分雜交。就進一步分析而言，排除這兩個樣品。

主成分分析揭示兩個不同群體，經HSV以及未經HSV處理的樣品。因而HSV對媒劑的效應解釋了第一個主成分分離(91.7%)。數據經各個探針的中位數常規化而具有0的中位數訊號。進行ANOVA以找出HSV對媒劑、ATA對媒劑、HSV+AVA對媒劑，以及HSV+ATA對單獨HSV之間的明顯差異轉錄本。未納入多重測試校正，且值得注意的基因被認為是少於0.01的p-值。

使用自組織映射圖來檢驗在媒劑、HSV1以及HSV1+ATA中的表現概況。想要找出因為ATA處理而被上調或下調的特定轉錄本。一個有所不同的基因簇顯示在HSV存在下發現有一些刺激，而ATA校正使這些基因回到媒劑基線。同樣地，也發現一個相較於媒劑因為HSV而受到壓抑，而之後經以ATA處理而被活化的基因簇。這些分別被稱為簇A與B(參見表1與2)。使用GeneGO軟體(genego.com)進行後續分析來探求這些基因簇的生物功能。

RT² Profiler^TM PCR陣列(SABiosciences-QIAGEN)

在有或沒有50uM ATA的情況下，於DMEM & 10% FBS存在下在MOI 1下以wtHSV-1麥金泰株感染6x10e5個293細胞(來自AGTC)且1-2小時並以DMEM & 10% FBS稀釋至40%(最終ATA濃度為20uM)。在24小時之後使用Qiagen RNeasy迷你套組收取三重複的總RNA樣品並在管柱上以DNase處理且溶離。合併洗脫物RNA三重複樣品並在260與280nm下對洗脫物進行光譜儀O.D.讀值以測定濃度。樣品RNA是使用SABiosciences RT2第一股套組而被轉換成模板cDNA。cDNA接著用於人類JAK/STAT Signaling Pathway PCR Array(PAHS-039A)中。

實例1 在V27細胞中使用ATA之HSV-誘導之iNOS含量的抑制

在有或沒有10%胎牛血清(FBS)存在的情況下，於杜貝可改良伊格培養基(DMEM)(Hyclone,Waltham,MA)中於MOI為1下以HSV-1 d27.1載體感染V27細胞並以30μM ATA(Sigma,St.Louis,MO)處理。亦進行沒有ATA的對照實驗。在感染後24小時(h.p.i.)收取V27細胞溶解產物並對溶解產物進行西方墨點分析，而iNOS蛋白是藉由使用經純化兔抗-iNOS/NOS第II型pAb(BD Biosciences,Cat# 610332)來進行偵測。結果顯示於圖1中。

如所示，HSV感染在彼等不含有ATA的培養物中引起iNOS表現(道4與5)。iNOS表現於30μM ATA的存在下受到抑制(道2與3)。10% FBS的存在或不存在對於iNOS表現沒有影響。

實例2 ATA-HSV規程的最佳化

為了要測試ATA能否在V27細胞中增加rHSV-1 d27-1(d27-1)載體產量，於感染步驟(步驟1)或稀釋步驟(步驟2)期間將ATA施加至 培養基(圖2A)。在2/5的最終培養體積中進行MOI=0.15的d27-1感染而在稀釋步驟期間添加其餘3/5培養基。

ATA處理在V27細胞單層中延遲了HSV-1溶血斑形成或細胞溶解。相較於在ATA不存在下的100%細胞病變效應(CPE)，在收取、感染後72小時(hpi)的CPE介於20-60%。在HSV-1感染步驟(ATA在步驟1)期間以ATA處理，顯示於72 hpi時收取之V27細胞懸浮液中增加d27-1滴定濃度(圖4B)。當在感染步驟(ATA I)期間添加時最佳ATA濃度為50μM，而這在稀釋步驟期間藉由添加剩餘3/5體積的培養基而進一步稀釋成最終濃度(f.c.)為20μM ATA。在這個情況下，ATA增加在收取時(72 h.p.i.)的上清液的d27-1滴定濃度約10倍：從4.0±0.3 x10⁷DRP/ml或1.4±0.2x10⁷PFU/ml至3.7±0.2 x10⁸DRP/ml或1.2±0.3 x10⁸ PFU/ml(圖4B)。

為了要測定ATA添加的濃度以及條件對於HSV產量是否有影響，進行下列實驗。不同濃度的ATA以如下述兩步驟被添加至在六孔盤(圖2B)或T150培養瓶(圖2C)中經HSV-1 d27-1載體感染的V27培養物。在規程的步驟1中，以0.15 MOI的rHSV載體在加上10% FBS以及0-60μM ATA濃度的2/5最終體積DMEM中感染V27細胞。在37℃下培養細胞1-2小時以完成步驟1。在步驟2中，藉由添加3/5最終培養基體積將ATA濃度降低至12-24μM的範圍。在37℃下培養細胞70-74小時並收取上清液。病毒滴定濃度表示為每ml的Dnase抗性粒子(DRP/ml)或溶血斑形成單元(pfu/ml)且如上所述進行測定。

結果顯示於圖2B與2C中且最佳ATA濃度標示為粗體。如可見，在六孔盤(圖2B)與T150培養瓶(圖2C)中，在步驟1或步驟2中添加ATA之培養物具有比沒有ATA明顯更高的HSV滴定濃度。此外，最高的滴定濃度在步驟1中ATA濃度為50μM，在步驟2中降低至20μM時看到(圖2B)，儘管所有濃度的ATA產生比缺少ATA的培養物還高的病毒滴定濃度。

進行其他實驗來決定FBS存在或不存在對HSV滴定濃度的最佳條件以及效用。血清存在(具體而言10%胎牛血清(FBS))在含有ATA的培養基中對於ATA誘發HSV-1滴定濃度產量是最為重要的參數。在稀釋步 驟(ATA在步驟2)期間，ATA補充至無血清培養基中造成病毒滴定濃度降低，而「DRP」滴定濃度降低至低於對照濃度且PFU/ml滴定濃度低於偵測(圖3)。在無血清培養基中看到一個更為戲劇化的效用，當ATA從3μM濃度開始於感染步驟1期間被補充，則DRP/ml以及PFU/ml滴定濃度低於偵測下限。

在這個實驗中，V27細胞在感染前當天以6x10⁵細胞/孔被種入六孔盤中。如下製備HSV 2x感染溶液：將HSV-1 d27.1原液以細胞以最終MOI 0.15被感染的2x滴定濃度添加至DMEM(無FBS)中。製備在DMEM中含有100μM或40μM ATA且沒有FBS或有20% FBS的數個2xATA溶液組合。

HSV 2x感染溶液與等體積DMEM -/+ 20% FBS或所要2xATA溶液-/+ 20% FBS混合，渦捲並在步驟1中添加1ml感染性接種物/孔。若在步驟1中孔含有ATA，則濃度為50μM且培育所有孔歷時1-2小時。在步驟2中，添加額外1.5ml的DMEM組合-/+ 40μM ATA以及-/+20% FBS。若孔含有ATA(不論在步驟1或步驟2中)，最終ATA濃度為20μM。將盤送回培養箱70-74小時，之後收取游離培養基，渦捲且在4℃下以1,100 x g離心10分鐘。將上清液轉移至新的分配管、渦捲、分成等分試樣並將原液儲存於-80℃下。

實例3 於ATA-HSV規程中血清存在的重要性

進行其他實驗來決定FBS的存在或不存在對於HSV滴定濃度的最佳條件以及效用。血清存在(具體而言10%胎牛血清(FBS))在含有ATA的培養基中對於ATA誘發HSV-1滴定濃度產量是最為重要的參數。在稀釋步驟(ATA在步驟2)期間，ATA補充至無血清培養基中造成病毒滴定濃度降低，而「DRP」滴定濃度降低至低於對照濃度且PFU/ml滴定濃度低於偵測(圖3)。在無血清培養基中看到一個更為戲劇化的效用，當ATA從3μM 濃度開始於感染步驟1期間被補充，則DRP/ml以及PFU/ml滴定濃度低於偵測下限(數據未示出)。

在這個實驗中，V27細胞在感染前當天以6x10⁵細胞/孔被種入六孔盤中。如下製備HSV 2x感染溶液：將HSV-1 d27.1原液以細胞以最終MOI 0.15被感染的2x滴定濃度添加至DMEM(無FBS)中。製備在DMEM中含有100μM或40μM ATA且沒有FBS或有20% FBS的數個2xATA溶液組合。HSV 2x感染溶液與等體積DMEM -/+ 20% FBS或所要2xATA溶液-/+ 20% FBS混合，渦捲並在步驟1中添加1ml感染性接種物/孔。若在步驟1中孔含有ATA，則濃度為50μM且培育所有孔歷時1-2小時。在步驟2中，添加額外1.5ml的DMEM組合-/+ 40μM ATA以及-/+20% FBS。若孔含有ATA(不論在步驟1或步驟2中)，最終ATA濃度為20μM。將盤送回培養箱70-74小時，之後收取游離培養基，渦捲且在4℃下以1,100 x g離心10分鐘。將上清液轉移至新的分配管、渦捲、分成等分試樣並將原液儲存於-80℃下。

實例4 在培養中ATA對於野生型HSV滴定濃度的效用

圖4A顯示wtHSV-1病毒株(KOS株以及麥金泰株)在容許wtHSV-1增殖的下列細胞株中的上清液滴定濃度；293細胞、HeLa與Vero細胞。使用ATA-HSV規程，wtHSV-1 KOS株以及麥金泰株在293、HeLa與Vero細胞中增殖，其中在步驟1添加50μM ATA且在步驟2後的最終濃度被稀釋至20μM ATA。三天後如所述收取含有病毒的上清液。ATA增加兩種病毒型在Vero細胞中的產量。wtHSV-1麥金泰株在ATA誘導之後於293細胞中達到最高滴定濃度，但是ATA在293細胞中似乎會抑制HSV-1 KOS生長。最後，ATA似乎也會在HeLa細胞中抑制兩種HSV-1病毒。雙因子ANOVA；Bonferroni檢定；-ATA對+ATA：***：p<0.001，ns：p>0.05；n=4個獨立實驗。

關於統計計算，在6孔盤中於感染步驟(步驟1)期間有或沒有添加ATA的情況下進行一個較大的十組獨立實驗(n=10)，其與複製缺陷型d27-GFP還有wtHSV-1麥金泰株相比對，以供研究ATA能否也在wtHSV-1株中增加滴定濃度(圖4B)。在感染步驟(步驟1)期間以50mM將ATA添加至匯聚的細胞單層，V27細胞用於d27-1或293細胞用於wtHSV-1麥金泰，且細胞以MOI=0.15經載體感染，同時ATA於1小時後被稀釋至最終20mM濃度。在ATA添加之後，d27-1滴定濃度從5.4 x10⁷DRP/ml或1.1 x10⁸DRP/ml明顯增加6.1倍(**P<0.01)，而wtHSV-1麥金泰從3.3 x10⁸ DRP/ml或1.0 x10⁹ DRP/ml明顯增加9.1倍(***P<0.001)，如藉由雙因子ANOVA與Bonferroni檢定所分析(圖4B)。

實例5 HSV原液中的ATA對於生產或rAAV病毒粒子的效用

為了要決定ATA的存在於HSV生產期間是否會影響使用HSV載體生產之rAAV病毒粒子產量，進行下列實驗，顯示rAAV滴定濃度受到來自在293細胞中生產之rHSV-1原液之ATA殘餘物影響(圖5A)。rAAV-GFP載體是藉由在293細胞60mm盤中使用含ATA之rHSV-1原液(在不同濃度ATA濃度下製備，12μM或20μM f.c.)共感染rHSV-rep2/cap2以及rHSV-EGFP載體而生成(參見材料與方法)。當使用rHSV-rep2/cap2原液(其是使用在感染(ATA步驟1)期間添加20μM ATA而製備)時，rAAV DRP/ml滴定濃度相對於「無ATA」對照略為增加1.3倍(*p<0.05)，而ATA濃度在rAAV生產期間為約3μM。當使用rHSV-rep2/cap2原液(其是使用12μM ATA而製備)時，偵測到沒有顯著rAAV滴定濃度增加(圖5A)。單因子ANOVA；Tukey氏檢定：*p<0.05；20μM ATA對無ATA；n=4個獨立實驗。

在另一個實驗中，當在2小時rHSV-rep2/cap2與rHSV-EGFP共感染步驟期間將10μM ATA直接摻入293細胞培養基中，ATA顯示增加rAAV滴定濃度。當ATA濃度高於20μM時，未觀察到這個效用(圖5B)。

實例6 ATA作用機制

為了要藉由人類基因組陣列來闡明ATA作用機制以及Vero與V27為猴衍生的細胞株，在數個人類細胞株中測試wtHSV-1增殖(圖4A-4B)。在下列三種細胞株中比較兩種野生型HSV-1(wtHSV-1)病毒株(KOS與麥金泰)的增殖：人類胚腎293(293細胞)、人類子宮頸癌HeLa細胞以及非洲綠猴腎上皮Vero細胞。遵循ATA I規程方案在含10% FBS的培養基中進行實驗，其中在感染步驟期間補充50μM ATA並進一步稀釋成20μM ATA濃度(參見材料與方法)。在人類衍生293細胞中，僅有wtHSV-1麥金泰病毒滴定濃度因為ATA而明顯增加，從1.4x10⁸DRP/ml至1.2 x10⁹DRP/ml(***p<0.001)。在Vero細胞中，ATA僅在wtHSV-1 KOS株中明顯增加滴定濃度，從1.7x10⁸DRP/ml至高到9.1x10⁸DRP/ml(***p<0.001；兩種統計學：雙因子ANOVA，Bonferroni檢定；n=4)。出乎意料地，在HeLa細胞中，ATA似乎會抑制KOS以及麥金泰HSV-1病毒株的增殖。

為了鑑定對wtHSV-1麥金泰感染的細胞反應基因特徵，使用Affymetrix Human U133 Plus 2.0 Array以293細胞完成轉錄型態分析，該293細胞為經假處理、經ATA-處理(ATA)、經wtHSV-1麥金泰-感染(HSV)或經ATA處理與經wtHSV-1麥金泰感染(HSV&ATA)歷時24小時。因為感染或ATA處理引起的基因表現變化是藉由參照各個探針對相應未感染細胞樣品之基因表現程度來進行鑑定。當相較於未經處理的細胞基因型態時，單獨HSV-1感染對293細胞的基因表現型態有強烈影響。

首先，將過濾步驟施用於濾出低表現且出自於54,675總Affy U133 Plus2探針，41,569(76%)個探針維持低於截斷值。主成分分析揭示兩個不同群體，經HSV以及未經HSV處理的樣品。進行ANOVA以找出HSV對媒劑、ATA對媒劑、HSV+AVA對媒劑以及HSV+ATA對單獨HSV之間的明顯差異轉錄本。值得注意的基因被認為是少於0.01的p-值。使用自組織映射圖來檢驗在媒劑、HSV1以及HSV1+ATA中的表現概況。發現 一個獨特的基因簇，簇A與簇B(表1與2)，其顯示因為HSV-1所致的轉錄型態差異及其等受到ATA校正而使得此等基因回復到媒劑基線。

在GeneGo中分析這些基因簇的生物功能。簇A(表2)呈現58個探針，顯示在HSV-1中的上調以及在添加ATA之後的壓抑。此等基因主要涉入發炎性IgE與IFN信號傳遞，以及一般性免疫反應。簇B(表1)呈現152個探針，顯示受到HSV-1而下調以及之後藉由使它們回到媒劑基線而ATA上調。這個簇中的基因主要涉入細胞週期G1/S、PTEN中的訊號轉導以及WNT發育。舉例而言，在HSV-1存在下，ATA上調細胞週期進展路徑的CDC25A、CDKN1A、CDKN1C、CCNK、CNNM2基因以及Ras/Raf/MEK路徑的基因，諸如FOXC1、FOXD3、FOXO3(參見表1)。

表3A與3B顯示在HSV ATA樣品中的nNOS、iNOS與eNOS表現降低，如藉由Affymetrix Gen Array分析，而在HSV+ATA樣品中的iNOS表現降低，如藉由Qiagene SAB Jak-Stat RT-PCR Microarray分析。

實例7 地塞米松對HSV產量的效用

為了要確定iNOS抑制劑地塞米松是否也在培養中增加rHSV產量，進行下列實驗(圖6)。顯示地塞米松(Dex)對d27-1/GFP HSV-1病毒滴定濃度的效用。如相較於未經處理對照，最終滴定濃度d27-1/GFP HSV-1一般在dex預處理或處理之後略為上升。

在以6x10⁵細胞/孔感染前當天將V27細胞植入六孔盤中，且次日在HSV-1感染(預處理)或在感染期間(處理)以2/5體積的DMEM-10% FBS培養基將不同濃度之地塞米松(dex)添加至孔中。在37℃下培育1-2小時後，添加3/5體積的DMEM-10% FBS。將培養物放回培養箱並在70-74小時後收取上清液。數據顯示為滴定濃度的平均值+S.D.，以pfu/ml計(n=2)。

實例8 丙戊酸對HSV產量的效用

為了要確定iNOS抑制劑丙戊酸是否也在培養中增加rHSV產量，進行下列實驗(圖6)。圖7顯示藉由丙戊酸(VA)預處理對d27-1/GFP HSV-1病毒滴定濃度的效用。如相較於未經處理對照，濃度5mM的VA略為提高d27-1/GFP HSV-1的滴定濃度，但低於5mM的濃度對d27-1/GFP HSV-1滴定濃度似乎有抑制效用。

在以6x10⁵細胞/孔感染前當天將V27細胞植入六孔盤中，且次日將不同濃度之VA添加至孔中。培育盤6小時，抽吸並添加含有感染性HSV-1d27-1原液的2/5體積培養基，且在37℃下培育1-2小時，之後添加3/5體積的DMEM 10% FBS培養基。將培養物放回培養箱並在70-74小時後收取上清液。

如先前實例中所示，呈微莫耳濃度的ATA增加HSV-1載體產量。這個發現對於大規模HSV生產，以及rHSV與rAAV載體生產來說至關重要。此外且出乎意料的是，在rHSV-1原液中，ATA的存在並不會負面地影響rAAV產量。這個結果令人驚訝，因為呈毫莫耳數量以及更高濃度的ATA已知是抗病毒劑(Cushman et al.,J.Med.Chem.(1991)34：329-337；Zhang et al.,Antiviral Res.(1999)43：23-35；Yap et al.,Computational Biol.and Chem.(2005)29：212-219；De Clercq,Advents,Advances,and Adventures Med.Res.Rev.(2011)31：118-160)。在無血清培養基中，發明人也觀察到呈微莫耳濃度的ATA的可能抗病毒效用，但不是在有血清存在(10% FBS)的情況下。

亦如本文所示，ATA處理在V27細胞單層中延遲HSV-1溶血斑形成與細胞溶解和細胞病變效用(CPE)，而細胞病變效用是抗細胞凋亡特性的證據。ATA於增加HSV-1產量的作用機制似乎是包含改變HSV-1生產所需的因子並降低因為病毒清除所致的細胞固有抗病毒免疫反應。由上面的Human Genome Array分析，發現僅只HSV-1感染對於293細胞的基因表現型態有強烈影響，而ATA的效用主要在經HSV-1與ATA兩者處理的細 胞中觀察到。涉入細胞週期G1/S、PTEN中的訊號轉導，以及WNT發育的基因受到HSV-1而明顯下調並在ATA添加之後上調。

主要涉及發炎性IgE與IFN訊號傳遞以及一般性免疫反應的基因受到HSV-1而上調並在ATA添加之後受到壓抑。在HSV-1存在下，ATA上調細胞週期進展路徑的CDC25A、CDKN1A、CDKN1C、CCNK、CNNM2基因，以及Ras/Raf/MEK路徑的基因，包括FOXC1、FOXD3、FOXO3。

ATA可增加HSV-1產量的發現至為重要，因為就基因療法以及其他應用來說，對於大規模生產更高產量的HSV-1載體有需求。

因此，說明使用iNOS抑制劑增加病毒產量的方法。儘管已稍微詳細地說明本發明的較佳具體例，應了解可在不偏離如本文定義之本發明精神與範圍的情況下做出明顯變化。

Claims (14)

1. 一種生產病毒的方法，包含在含有金精三羧酸(aurintricarboxylic acid)的細胞培養物中培養該病毒。
2. 如請求項1之方法，其中該病毒為皰疹病毒。
3. 如請求項2之方法，其中該皰疹病毒為單純皰疹病毒-1(HSV-1)。
4. 如請求項3之方法，其中該HSV-1為野生型HSV-1。
5. 如請求項3之方法，其中該HSV-1為重組HSV-1載體。
6. 如請求項5之方法，其中該重組HSV-1載體為HSV-1 d27.1載體。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該病毒培養於293、HeLa或Vero細胞中。
8. 如請求項7之方法，其中該病毒培養於V27細胞中。
9. 一種培養HSV-1 d27.1載體的方法，包含(a)以HSV-1 d27.1載體感染V27細胞；以及(b)在含有金精三羧酸、丙戊酸或地塞米松(dexamethasone)的細胞培養物中培養該被感染的V27細胞。
10. 如請求項10之方法，其中該細胞培養物包含金精三羧酸。
11. 如請求項9或10之方法，其中該細胞培養物進一步包含血清。
12. 如請求項11之方法，其中該血清為胎牛血清。
13. 一種包含金精三羧酸與293、Hela或Vero細胞的細胞培養物。
14. 如請求項13之細胞培養物，其包含V27細胞。