BR122020002822B1 - Método para cultivar um vetor de hsv-1 d27.1 - Google Patents

Abstract

Descreve-se o uso de inibidores da iNOS, incluindo o ácido aurintricarboxílico, a dexametasona e o ácido valproico, para aumentar a produção de uma variedade de vírus na cultura, incluindo os vírus do herpes recombinantes.

Description

Dividido do BR112015016328-9, depositado em 07.01.2014. CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se, em geral, aos métodos para produzir vírus e vírions recombinantes na cultura. Em particular, a invenção diz respeito ao uso dos inibidores de iNOS, tais como o ácido aurintricarboxílico, a dexametasona e o ácido valproico, para aumentar a produção de uma variedade de vírus na cultura, incluindo os vírus do herpes recombinantes, que podem, por sua vez, ser usados como auxiliadores para a produção de vírions de vírus adenoassociados recombi- nantes.

ANTECEDENTES

[0002] Os vírus do herpes estão altamente disseminados na natureza e são encontrados na maior parte das espécies de animais. Pelo menos 100 vírus do herpes foram caracterizados, incluindo diversos de seres humanos, tais como o vírus do herpes simples 1 (HSV-1) e o vírus do herpes simples 2 (HSV-2), o vírus varicela zoster (VZV), o vírus Epstein-Barr (EBV), o citomegalovírus (CMV) e outros vírus do herpes humanos, tais como o HHV6 e o HHV7. Estes vírus são responsáveis por uma variedade de doenças humanas, tais como as infecções da pele, o herpes genital, a encefalite viral, e similares.

[0003] A infecção por HSV-1 ativa a defesa e o sistema imune natural do hospedeiro por indução das vias de sinalização intracelulares que resultam na expressão das proteínas com atividades pró-inflamatórias e microbicidas, incluindo as citocinas e os interferons (INF) (Sainz e Halford, J. Virol. (2002) 76:11541-11550; Haller e col., Virology (2006) 344:119-130; Paludan e col., Nat. Rev. Immunol. (2011) 11:143-154). A sinalização do INF é um dos mecanismos de defesa celular mais importantes para a depuração viral (Brandner e Mueller, Hoppe-Seyler's Zeitschriftfür physiologische Chemie (1973) 354:1176; De Vries e col., Gene Ther. (2008) 15:545-552).

[0004] Os investigadores têm descrito a atividade antiviral do óxido nítrico (NO) contra diversos vírus, tais como o vírus da vacínia, o vírus da estomatite vesicular, e o vírus da encefalite japonesa, entre outros (Bi e col., J. Virol. (1995) 69:6466-6472; Harris e col., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin e col., J. Virol. (1997) 71:5227-5235; Pertile e col., Avian Dis. (1996) 40:342-348. O NO é uma molécula gasosa de radical livre e é um mediador da defesa do hospedeiro (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91 :2446-2452; Karupiah e col., Science (1993) 261:1445-1448; Rolph e col., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro e col., J. Med. Virol. (1997) 51:326-331; Lane e col., J. Virol. (1997) 71:2202-2210. Sabe-se que o HSV-1 tanto induz quanto burla as respostas antivirais do hospedeiro (Mossman e col., J. Virol. (2001) 75:750-758). A infecção por HSV é capaz de induzir a expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS), um gene que codifica uma isoforma induzível da NOS que produz grandes quantidades de NO.

[0005] Os vírus do herpes e as proteínas recombinantes a partir deles têm sido usados na fabricação de diversas vacinas. Além dos ade- novírus, os vírus do herpes têm sido mostrados proporcionar funções de vírus auxiliar completas para a produção de vírions de vírus adeno- associados recombinantes (Buller, R.M.L., J. Virol. (1981) 40: 241-247; Mishra e col., Virology (1990) 179:632-639). O grupo mínimo de genes de HSV-1 requeridos para a replicação e o acondicionamento do AAV foi identificado como os genes iniciais UL5, UL8, UL52 e UL29 (Weindler e col., J. Virol. (1991) 65:2476-2483). Estes genes codificam os componentes do mecanismo de replicação do núcleo de HSV-1 - a helicase, a primase e as proteínas acessórios de primase (UL5, UL8 e UL52) e a proteína de ligação ao DNA de fita simples (UL29).

[0006] Os vetores de AAV recombinante (rAAV) têm sido usados com êxito para obter a transdução de alto nível, de longa duração, in vivo. Apesar dos avanços acima mencionados, a produção de grandes quantidades de vírions de rAAV de título alto, de grau clínico, para a terapia gênica, continua a ser desafiadora devido a limitações na esca- labilidade do protocolo de cotransfecção. O processo requer a distribuição celular eficiente de três componentes: (1) um vetor incluindo o gene de interesse flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV; (2) um vetor incluindo os genes rep e cap de AAV; e (3) genes proporcionados usando um vírus auxiliador, tal como o adenovírus ou o vírus do herpes simples, ou usando plasmídios auxiliadores sem vírus (ver, Muzyczka, N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1992) 158:97-129). Desse modo, nos protocolos de fabricação de rAAV baseados em rHSV, a pro-dução de rAAV é limitada pelo título máximo de vetores de rHSV auxiliador.

[0007] Um vetor de HSV-1 deficiente de replicação, chamado d27.1-rc, expressa os genes rep e cap de AAV-2 (Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:986-993) e foi engenheirado a partir do vírus d27-1 original (Rice e col., J. Virol. 1989 vol. 63 (8) pp. 3399-407), que não produz ICP27, uma proteína requerida para a replicação de HSV-1. Embora este vetor seja defeituoso de replicação, ele de fato expressa os genes iniciais de HSV-1 requeridos para a replicação e o acondicionamento de rAAV (Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:986-993).

[0008] Tipicamente, um vetor contendo o molde de rAAV e o outro vetor expressando as regiões de rep e cap de AAV são coinfectados nas células 293 para produzir os vírions de rAAV. Ambos os vetores de HSV-1 são deficientes de replicação e podem, portanto, somente ser propagados em uma linhagem celular complementar de ICP27, V27 (Rice e col., J. Virol. 1989 vol. 63 (8) pp. 3399-407). No protocolo de produção de AAV baseado em HSV, as células 293 necessitam ser infectadas com o HSV-1 em uma maior multiplicidade de infecção (MOI) de 12. Isto representa uma limitação porque as produções de vetores derivados de d27-1 nas células V27 são tipicamente em torno de 1 X 107 unidades formadoras de placas (PFU)/ml.

[0009] Diversos métodos e reagentes têm sido investigados para aumentar adicionalmente os títulos de HSV-1 (ver, p.ex., Wechucke col., Biotechnol. Prog. (2000) 16:493-496; Ozuer e col., Biotechnol. Prog. (2002) 18:476-482; Erlandsson e col., J. Endocrinol., (2002) 175: 165176; Otsuki e col., Mol. Ther. (2008) 16:1546-1555). Tanto a dexameta- sona quanto o ácido valproico inibiram o mecanismo de defesa do hospedeiro representado por diversos genes antivirais sensíveis ao interferon (IFN), aumentaram o nível transcricional de genes virais e, desse modo, melhoraram a propagação viral e a produção de HSV-1 (Erlands- son e col., J. Endocrinol. (2002) 175:165-176; Otsuki e col., Mol. Ther. (2008) 16:1546-1555).

[00010] Apesar dos conhecimentos acima mencionados, são necessários mais métodos para inibir a defesa do hospedeiro, para melhorar a produção viral na cultura. Conforme explicado acima, os investigadores descreveram a atividade antiviral do óxido nítrico (NO) contra diversos vírus, tais como o vírus da vacínia, o vírus da estomatite vesicular, e o vírus da encefalite japonesa, entre outros (Bi e col., J. Virol. (1995) 69:6466-6472; Harris e col., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin e col., J. Virol. (1997) 71:5227-5235; Pertile e col., Avian Dis. (1996) 40:342-348. O NO é uma molécula gasosa de radical livre e é um mediador da defesa do hospedeiro (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91 :2446-2452; Karupiah e col., Science (1993) 261:1445-1448; Rolph e col., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro e col., J. Med. Virol. (1997) 51:326-331; Lane e col., J. Virol. (1997) 71:2202-2210). Conforme descrito acima, a infecção por HSV pode induzir a expressão da iNOS, um gene que codifica uma isoforma induzível da NOS que produz grandes quantidades de NO.

[00011] A presença do inibidor da iNOS N-metil-L-arginina (L-NMA) inverteu a inibição da replicação viral para todos os três destes vírus (Karupiah e col., Science (1993) 261:1445-1448). Quanto a uma revisão dos inibidores da iNOS, ver, Southan e col., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:383-394. Outro composto, o ácido aurintricarboxílico (ATA), mostrou proteger os macrófagos da morte celular induzida por lipopolis- sacarídeo bacteriano, por infrarregulação da expressão da iNOS e, desse modo, diminuindo a produção de NO (Chen e col., British Journal of Pharmacology (2002) vol. 137 (7) pp. 1011-20). O ATA é uma mistura heterogênea de polímeros, atribuída com um número crescente de ati-vidades biológicas, tais como a interação com diversas enzimas, incluindo as DNA polimerases, as RNA polimerases, transcriptase invertida (DNA polimerase dependente de RNA), a aminoacil-tRNA-sintetase, a ribonucleotídeo redutase, a ribonucleases nuclease, a inibição da síntese de proteínas, a prevenção da apoptose e o bloqueio da fragmentação do DNA em oligodendrócitos induzida por estresse oxidativo (Tscherne e Pestka, Antimicrob. Agents Chemother.(1975) 8:479-487; Mikelens e col., Biochemical Pharmacology (1976) 25:821-827; Vollgraf e col., J. Neurochem.(1999) 73:2501-2509).

[00012] O ácido aurintricarboxílico (ATA) também foi descrito impedir a ativação transcricional mediada pelo IFN (Tsi e col., Mol. Pharmacol. (2002)101:90-101; Chen e col., British J. Pharmacol. (2002) 137:10111020). O ATA é conhecido como um ativador da via de Raf/MEK/MAPK, receptor de IGF-1 e sinalização da cinase proteica C (Beery e col., Endocrinology (2001) 142:3098-3107; Chen e col., J. Biol. Chem. (2001) 276:46722-46728). As ações antimicrobianas e antiproliferativas antivi- rais das citocinas, tais como os interferons, podem ser devidas à sua capacidade de induzir a expressão de iNOS, um gene que codifica uma isoforma da óxido nítrico sintase (NOS) que produz grandes quantidades do gás radical, NO, a partir do nitrogênio de guanidino da L-arginina (Nathan, C., FASAB J. (1992) 6:3051; Werner-Felmayer e col., J. Exp. Med. (1990) 172:1599). Mostrou-se que o tratamento dos macrófagos com o IFN-Y restringe gravemente a replicação do vírus da ectromelia (EV), do vírus da vacínia (VV) e do HSV-1.

[00013] Por um lado, o ATA é também conhecido como um agente antiviral contra diversos vírus, incluindo o HIV, o vírus do herpes HHV- 7, o SARS-CoV e outros (Cushman e col., J. Med. Chem. (1991) 34:3293371991; Zhang e col., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap e col., Computational Biol. and Chem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160). O ATA, entretanto, não bloqueou a replicação do adenovírus tipo 5 (Ad5) nas células HEK-293 (He, Biochem. Biophys. Res. Comm. (2004) 320:11991203). Além disso, o ATA foi descrito aumentar inesperadamente o título de um vetor de adenovírus de controle nas células 293, ao mesmo tempo tendo efeitos antivirais sobre o vírus da vacínia (Myskiw e col., J. Virol. (2007) 81:3027-3032).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00014] A presente invenção, desse modo, supera as deficiências na técnica anterior por enfrentar os problemas que limitam a produção viral, tais como a baixa produção de rHSV, que dificulta os esforços de produzir quantidades suficientes de rHSV para uma variedade de propósitos, incluindo para a produção de vacinas, bem como para a produção de virion de rAAV em quantidades necessárias para os procedimentos eficientes da terapia gênica. Usando os métodos descritos neste documento, podem ser obtidos maiores títulos de uma variedade de vírus, tal como pelo menos uma ordem de magnitude maior do que os métodos tradicionais.

[00015] Em particular, os inventores neste documento descobriram que o ácido aurintricarboxílico (ATA) inibe a iNOS e aumenta a produção de HSV. Conforme mostrado nos exemplos aqui contidos, as concentrações micromolares de ATA, na presença de soro bovino fetal (FBS), aumentaram tanto a produção do vetor de HSV-1/d27-1 nas células V27 quanto o vírus HSV-1 do tipo selvagem (wt) nas células Vero, V27 e 293. Os outros inibidores da iNOS, incluindo a dexametasona e o ácido valproico, também aumentaram os títulos de HSV-1 na cultura. A expressão de iNOS induzida pelo HSV foi mostrada ser reduzida nas amostras de HSV+ATA, como analisadas pelo Microarranjo da SABios- ciences. Similarmente, a análise do arranjo de genoma humano Affyme- trix confirmou que a expressão de todos os três genes de óxido nítrico sintase (nNOS, iNOS e eNOS) suprarregulados pelo HSV foi infrarregu- lada nas amostras de HSV+ATA. O Arranjo de Gene Affymetrix também detectou que os genes envolvidos na sinalização inflamatória de IgE e IFN, e nas respostas imunes gerais foram suprarregulados pelo HSV-1 e suprimidos após a adição de ATA. Por outro lado, os genes principalmente envolvidos no ciclo celular G1/S, na transdução de sinal, no desenvolvimento de WNT, foram significativamente infrarregulados pelo HSV e suprarregulados após a adição do ATA.

[00016] Estes resultados são significativos por causa da demanda por maiores títulos de HSV-1 para a produção de vírions de rAAV, bem como para os propósitos profiláticos, terapêuticos e diagnósticos.

[00017] Consequentemente, em uma modalidade, a invenção é dirigida a um método para produzir um vírus, compreendendo cultivar o vírus em uma cultura de células que compreende o ácido aurintricarbo- xílico. Em certas modalidades, o vírus é um vírus do herpes, tal como o HSV-1.

[00018] Nas modalidades adicionais, o vírus do herpes é um HSV-1 do tipo selvagem ou um vetor de HSV-1 recombinante, tal como um vetor de HSV-1 d27.1.

[00019] Nas modalidades adicionais, o vírus é cultivado nas células 293, HeLa ou Vero, tais como as células V27.

[00020] Ainda nas modalidades adicionais, a invenção é dirigida a um método para cultivar um vetor de HSV-1 d27.1 compreendendo: (a) infectar as células V27 com um vetor de HSV-1 d27.1; e (b) cultivar as células V27 infectadas em uma cultura de células compreendendo o ácido aurintricarboxílico, o ácido valproico ou a dexametasona.

[00021] Em certas modalidades, a cultura de células adicionalmente compreende o soro, tal como o soro bovino fetal.

[00022] Nas modalidades adicionais, a invenção é dirigida a uma cultura de células compreendendo o ácido aurintricarboxílico e as células 293, HeLa ou Vero, tais como as células V27.

[00023] Estas e outras modalidades da presente invenção prontamente ocorrerão para aqueles de habilidade na técnica em vista da divulgação aqui contida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00024] A Figura 1 é uma representação de um Western blot mostrando que o ácido aurintricarboxílico (ATA) inibe a expressão de iNOS nos lisados de V27 infectados com d27-1.

[00025] As Figuras 2A-2C mostram o fundamento lógico do protocolo de ATA-HSV (Figura 2A) e a otimização dos títulos de d27-1 HSV-1 nos sobrenadantes de V27, para determinar quais concentrações e condições para a adição do ATA têm impacto sobre as produções de HSV. A Figura 2B mostra os títulos virais expressos como partículas resistentes de DNase (DRP/ml) em diversas concentrações de ATA, em placas de seis poços (Figura 2B) e frascos de T150 (Figura 2C).

[00026] A Figura 3 mostra a importância da presença do soro no protocolo de ATA-HSV. A otimização adicional e a importância da presença do FBS no protocolo de ATA-HSV foram mostradas sobre os títulos de d27-1 HSV-1 expressos como drp/ml e pfu/ml.

[00027] As Figuras 4A-4B mostram o efeito do ATA sobre as cepas KOS e McIntyre de HSV do tipo selvagem, na cultura. O ATA aumentou a produção de ambos os tipos de vírus nas células Vero, entretanto, o ATA pareceu inibir o crescimento de KOS de HSV-1 nas células 293. Por outro lado, a cepa McIntyre de wtHSV-1 atingiu os mais altos títulos após a indução pelo ATA nas células 293. Além disso, o ATA pareceu inibir AMBOS os tipos de vírus HSV-1 nas células HeLa.

[00028] As Figuras 5A-5B mostram o efeito do ATA nos estoques de HSV sobre a produção de Vírions de rAAV. Os títulos de rAAV foram ligeiramente aumentados quando se utilizou o estoque de HSV preparado com 20 μM de ATA, adicionados durante a infecção. O ATA foi também mostrado aumentar o título de rAAV quando 10 μM de ATA foram introduzidos diretamente nos meios de células 293, durante 2 h da etapa de coinfecção com HSV.

[00029] A Figura 6 mostra o efeito da dexametasona (Dex) sobre o título viral de d27-1/GFP HSV-1. Os títulos finais d27-1/GFP HSV-1 foram, em geral, ligeiramente elevados após os pré-tratamentos ou os tratamentos com a dex, em comparação com o controle não tratado.

[00030] A Figura 7 mostra o efeito do pré-tratamento por ácido val- proico (VA) sobre o título viral de d27-1/GFP HSV-1. O VA em uma concentração de 5 mM elevou ligeiramente o título de d27-1/GFP HSV-1, entretanto, as concentrações abaixo e acima de 5 mM pareceram ter um efeito inibidor sobre o título de d27-1/GFP HSV-1, em comparação com o controle não tratado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00031] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação ao contrário, métodos convencionais da química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e imunologia, dentro da habilidade da técnica. Tais práticas são explicadas totalmente na literatura. Ver, p.ex., Fundamental Virology, 2a Edição, vol. I e II (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adição atual); Sambrook, e col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

[00032] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados neste documento, supra ou infra, são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade.

DEFINIÇÕES

[00033] Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e são pretendidos para serem definidos conforme indicado abaixo.

[00034] Deve ser observado que, conforme usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes plurais, a não ser que o conteúdo claramente dite de outro modo. Dessa maneira, por exemplo, a referência a "um vírus do herpes" inclui uma mistura de dois ou mais tais vírus, e similares.

[00035] Os termos "HSV recombinante", "rHSV" e "vetor de rHSV" referem-se às formas geneticamente modificadas, isoladas, do vírus do herpes simples (HSV) contendo genes heterólogos incorporados no ge- noma viral. Pelo termo "rHSV/re" ou "vírus rHSV/re" ou "vetor de função auxiliadora de rHSV" pretende-se um rHSV no qual os genes rep e/ou cap de AAV tenham sido incorporados no gene do rHSV. Os termos "vírus de expressão de rHSV" e "rHSV/AAV" significam um rHSV no qual as sequências da repetição terminal invertida (ITR) de AAV tenham sido incorporadas no genoma do rHSV.

[00036] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" referem-se a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo do produto. Desse modo, os peptídeos, os oli- gopeptídeos, os dímeros, os multímero, e similares estão incluídos na definição. Tanto as proteínas quanto os fragmentos de tamanho natural estão incluídos pela definição. Os termos também incluem as modificações após a expressão do polipeptídeo, por exemplo, a glicosilação, a acetilação, a fosforilação e similares. Ademais, para os propósitos da presente invenção, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como remoções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser intencionais, como através de mutagênese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devidos à amplificação por PCR. Dependendo do sistema de expressão usado, um polipeptídeo pode incluir ou carecer de uma metionina N terminal. Adicionalmente, um polipeptídeo pode ou não incluir a sequência de sinal nativa, se uma estiver naturalmente presente. Se uma sequência de sinal não estiver normalmente presente, a proteína pode ser produzida com uma sequência heteró- loga.

[00037] Um polipeptídeo "nativo" refere-se a um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que a molécula correspondente derivada da natureza. Tais sequências nativas podem ser isoladas da natureza ou podem ser produzidas por meio recombinante ou sintético. O termo sequência "nativa" especificamente inclui as formas truncadas ou secretadas que ocorrem naturalmente da molécula específica (p.ex., uma sequência de domínio extracelular), as formas variantes que ocorrem naturalmente (p.ex., as formas alternativamente emendadas) e as variantes alélicas que ocorrem naturalmente do polipeptídeo.

[00038] Por "variante" pretende-se um polipeptídeo ativo, como definido neste documento, tendo pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência nativa de tamanho natural correspondente, um polipeptídeo não tendo o peptídeo de sinal, um domínio extracelular de um polipeptídeo, com ou sem um peptídeo de sinal, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de polipeptí- deos de tamanho natural como divulgada neste documento. Tais variantes de polipeptídeos incluem, por exemplo, os polipeptídeos onde um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou removidos, na extremidade de N e/ou de C da sequência de aminoácidos nativa de tamanho natural. Normalmente, uma variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 82% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 83% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 84% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 85% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 86% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 87% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 88% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 89% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 91% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 92% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 93% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 94% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 95% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 96% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 97% de identidade da sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 98% de identidade da sequência de aminoácidos e alternativamente pelo menos cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência nativa de tamanho natural correspondente. Normalmente, os polipeptídeos variantes são pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, tal como pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, p.ex., pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.

[00039] As variantes particularmente preferidas incluem as substituições que forem de natureza conservativa, i.e., as substituições que ocorram dentro de uma família de aminoácidos que sejam relacionados em suas cadeias laterais. Especificamente, os aminoácidos são, em geral, divididos em quatro famílias: (1) ácidos -- aspartato e glutamato; (2) básicos -- lisina, arginina, histidina; (3) apolares -- alanina, valina, leu- cina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados -- glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treo- nina, tirosina. A fenilalanina, o triptofano, e a tirosina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que uma substituição isolada da leucina pela isoleucina ou pela valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito principal sobre a atividade biológica. Por exemplo, o polipeptídeo de interesse pode incluir até cerca de 5-10 substituições de aminoácidos conservati- vas ou não conservativas, ou mesmo até cerca de 15-25 ou 50 substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas, ou qualquer número entre 5-50, desde que a função desejada da molécula permaneça intacta.

[00040] A "homologia" refere-se à porcentagem de identidade entre duas porções de polinucleotídeos ou duas de polipeptídeos. Dois DNA, ou duas sequências de polipeptídeos, são "substancialmente homólogos" um ao outro quando as sequências exibirem pelo menos cerca de 50% , preferivelmente pelo menos cerca de 75%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%-98% de identidade da sequência sobre um comprimento definido das moléculas. Conforme usadas neste documento, substancialmente homólogas também se referem às sequências que mostram identidade completa com o DNA ou a sequência de polipeptídeos especificada.

[00041] Em geral, a "identidade" refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeo com nucleotídeo, ou aminoácido com aminoácido, de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeos, respectivamente. A porcentagem de identidade pode ser determinada por uma comparação direta da informação sobre a sequência entre duas moléculas por alinhamento das sequências, contagem do número exato de correspondências entre as duas sequências alinhadas, divisão pelo comprimento da sequência mais curta, e multiplicação do resultado por 100. Os programas de computador prontamente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, tais como o ALIGN, Dayhoff, M.O. em Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Appl. Math.2:482-489, 1981, para a análise do peptídeo. Os programas para determinar a identidade das sequências de nucleotí- deos estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package ("Pacote de Análise da Sequência Wisconsin"), Versão 8 (disponível da Genetics Computer Group, Madison, WI), por exemplo, os programas BES- TFIT, FASTA e GAP, os quais também baseiam-se no algoritmo de Smith e Waterman. Estes programas são prontamente utilizados com os parâmetros predeterminados, recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package referido acima. Por exemplo, a porcentagem de identidade de uma sequência de nucleotí- deos particular com uma sequência de referência pode ser determinada usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de pontuação predeterminada e uma penalidade de espaço de seis po-sições de nucleotídeos.

[00042] Outro método de estabelecer a porcentagem de identidade no contexto da presente invenção é usar o pacote de programas MPS- RCH, protegido por leis de direito autoral pela Universidade de Edinburgh, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído pela IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir deste conjunto de pacotes, o algoritmo de Smith-Waterman pode ser empregado, onde os parâmetros predeterminados são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, penalidade de abertura de espaço de 12, penalidade de extensão de espaço de um, e um espaço de seis). A partir dos dados gerados, o valor de "Correspondência" reflete a "identidade da sequên-cia". Outros programas adequados para calcular a porcentagem de identidade ou a similaridade entre as sequências são, em geral, conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, usado com parâmetros predeterminados. Por exemplo, o BLASTN e o BLASTP podem ser usados usando os seguintes parâmetros predeterminados: código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; corte = 60; supor = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = ALTA PONTUAÇÃO; Banco de Dados = não desnecessário, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Os detalhes destes programas são bastante conhecidos na técnica.

[00043] Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hi- bridização de polinucleotídeos, sob condições que formem duplexes estáveis entre as regiões homólogas, seguida por digestão com nu- clease(s) específica(s) para fitas simples, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. As sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibri- dização Southern, sob, por exemplo, condições severas, como definidas para aquele sistema particular. A definição das condições apropriadas de hibridização está dentro da habilidade da técnica. Ver, p.ex., Sam- brook e col., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

[00044] Pelo termo "variante degenerada" pretende-se um polinucle- otídeo contendo alterações na sua sequência de ácidos nucleicos, que codifica um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo a partir do qual a variante degenerada é derivada.

[00045] Uma "sequência codificadora" ou uma sequência que "codifica" um polipeptídeo selecionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vivo, quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificadora são determinados por um códon de iniciação na extremidade de 5' (amino) e um códon de interrupção da tradução na extremidade de 3' (carbóxi). Uma sequência de terminação da transcrição pode estar localizada 3' à sequência codificadora.

[00046] Por "vetor" pretende-se qualquer elemento genético, tal como um plasmídio, fago, trasposon, cosmídio, cromossomo, vírus, virion, etc., que seja capaz de replicação quando associado com os elementos de controle apropriados e que pode transferir as sequências dos genes para as células. Desse modo, o termo inclui os veículos de clonagem e expressão, bem como os vetores virais.

[00047] Por "vetor recombinante" pretende-se um vetor que inclui uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga, que é capaz de expressão in vivo.

[00048] Por "vírus recombinante" pretende-se um vírus que tenha sido geneticamente alterado, p.ex., pela adição ou inserção de uma construto de ácido nucleico heteróloga na partícula.

[00049] O termo "transgene" refere-se a um polinucleotídeo que é introduzido em uma célula e é capaz de ser transcrito no RNA e, opcionalmente, traduzido e/ou expresso sob condições apropriadas. Em um aspecto, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual ele foi introduzido ou, em outros contextos, leva a um efeito terapêutico ou diagnóstico desejado.

[00050] Os termos "partículas de genoma (gp)" e "equivalentes de genoma", como usados em referência a um título viral, referem-se ao número de vírions contendo o genoma de DNA de AAV recombinante, independente da capacidade de causar infecção ou da funcionalidade. O número de partículas de genoma em uma preparação particular de vetor pode ser medido por procedimentos conhecidos na técnica, tais como descritos, por exemplo, em Clark e col., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; e Veldwijk e col., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.

[00051] Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou "unidade de replicação", como usados em referência a um título viral, referem-se ao número de partículas de vetores de AAV recombinantes in-fecciosas, como medido pelo ensaio de centro infecioso, também conhecido como ensaio de centro de replicação, conforme descrito, por exemplo, em McLaughlin e col., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.

[00052] O termo "unidade de transdução (tu)", como usado em referência a um título viral, refere-se ao número de partículas de vetores de AAV recombinantes infecciosas que resultam na produção de um produto de transgene funcional, como medido nos ensaios funcionais, tais como descritos, por exemplo, em Xiao e col., Exp. Neurobiol. (1997) 144:1 13-124; ou em Fisher e col., J. Virol. (1996) 70:520-532 (ensaio de LFU).

[00053] O termo "transfecção" é usado para referir-se à absorção de DNA exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno tiver sido introduzido dentro da membrana celular. Diversas práticas de transfecção são, em geral, conhecidas na técnica. Ver, p.ex., Graham e col. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook e col. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nova York, Davis e col. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, e Chu e col. (1981) Gene 13:197. Tais práticas podem ser usadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.

[00054] O termo "heterólogo(a)(s)", conforme refere-se às sequências de ácidos nucleicos, tais como as sequências codificadoras e as sequências de controle, significa sequências que não estão normalmente unidas, e/ou não estão normalmente associadas com uma célula particular. Desse modo, uma região "heteróloga" de um construto de ácido nucleico ou um vetor é um segmento de ácido nucleico dentro da, ou unido a, outra molécula de ácido nucleico que não é encontrada em associação com a outra molécula na natureza. Por exemplo, uma região heteróloga de um construto de ácido nucleico poderia incluir uma sequência codificadora flanqueada por sequências não encontradas em associação com a sequência codificadora na natureza. Outro exemplo de uma sequência codificadora heteróloga é uma construção onde a sequência codificadora propriamente dita não é encontrada na natureza (p.ex., sequências sintéticas tendo códons diferentes do gene nativo). Similarmente, uma célula transformada com uma construção que não está normalmente presente na célula seria considerada heteróloga para os propósitos desta invenção. A variação alélica ou os eventos mutaci- onais que ocorrem naturalmente não dão origem ao DNA heterólogo, conforme usado neste documento.

[00055] Uma sequência de "ácidos nucleicos" refere-se a uma sequência de DNA ou RNA. O termo representa as sequências que incluem quaisquer dos análogos das bases de DNA e RNA, tais como, porém não limitados à 4-acetilcitosina, 8-hidróxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carbóxi-hidroxil-metil) uracil, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracil, 5- carboximetil-aminometiluracil, di-hidrouracila, inosina, N6-isopentenila- denina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracila, 1-metilguanina, 1-metili- nosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil- cito- sina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminome- tiluracil, 5-metóxi-amino-metil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopentenila- denina, éster metílico do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacé- tico, oxibutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiou- racila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, éster metílico do ácido - uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6-diaminopurina.

[00056] O termo "sequências de controle" de DNA refere-se coletivamente às sequências promotoras, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores à montante, origens de replicação, sítios de entrada de ribossomo internos ("IRES"), intensifica- dores, e similares, que coletivamente proporcionam a replicação, a transcrição e a tradução de uma sequência codificadora em uma célula receptora. Nem todas estas sequências de controle necessitam sempre estar presentes, desde que a sequência codificadora selecionada seja capaz de ser replicada, transcrita e traduzida em uma célula hospedeira apropriada.

[00057] O termo "promotor" é usado neste documento em seu sentido comum para referir-se a uma região de nucleotídeo compreendendo uma sequência reguladora de DNA, onde a sequência reguladora é derivada de um gene que é capaz de ligar a RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência codificadora a jusante (direção de 3'). Os promotores de transcrição podem incluir os "promotores induzíveis" (onde a expressão de uma sequência de polinucleotídeos operavel- mente ligada ao promotor é induzida por um analito, cofator, proteína reguladora, etc.), os "promotores reprimíveis" (onde a expressão de uma sequência de polinucleotídeos operavelmente ligada ao promotor é induzida por um analito, cofator, proteína reguladora, etc.) e os "promotores constitutivos".

[00058] "Operavelmente ligada(s)" refere-se a um arranjo de elementos onde os componentes assim descritos são configurados de modo a exercer a sua função usual. Desse modo, as sequências de controle operavelmente ligadas às sequências codificadoras são capazes de efetuar a expressão da sequência codificadora. As sequências de controle não necessitam ser contíguas com a sequência codificadora, desde que elas funcionem para orientar a sua expressão. Desse modo, por exemplo, as sequências transcritas, mesmo não traduzidas, intervenientes podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência codificadora e a sequência promotora pode ainda ser considerada "operavelmente ligada" à sequência codificadora.

[00059] Por "isolada", quando se referir a uma sequência de proteína ou de nucleotídeo, pretende-se que a molécula indicada esteja presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. Desse modo, por exemplo, uma "molécula de ácido nu- cleico isolado que codifica um polipeptídeo particular" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que está substancialmente livre de outras moléculas de ácidos nucleicos que não codificam o polipeptídeo exposto; entretanto, a molécula pode incluir algumas bases ou porções adicionais que não afetem de modo deletério as características básicas da composição.

[00060] Para o propósito de descrever a posição relativa das sequências de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico particular por todo o presente pedido, tal como quando uma sequência de nucleotí- deos particular for descrita como estando situada "à montante", "a jusante", "3 linha (3')" ou "5 linha (5')" em relação à outra sequência, é para ser entendido que ela é a posição das sequências na fita "com sentido" ou "codificadora" de uma molécula de DNA que está sendo referida, conforme é convencional na técnica.

[00061] O termo "cerca de", particularmente em referência a uma dada quantidade, é pretendido incluir os desvios de mais ou menos cinco por cento.

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO

[00062] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a formulações ou parâmetros de processos particulares, visto que tais podem, obviamente, variar. Também é para ser entendido que a terminologia usada neste documento é para o propósito de descrever as modalidades particulares da invenção somente, e não se pretende que seja limitativa.

[00063] Embora diversos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e os métodos preferidos são descritos neste documento.

[00064] É fundamental para a presente invenção a descoberta que o ácido aurintricarboxílico (ATA) em concentrações micromolares aumenta a produção do vetor de HSV-1. Esta descoberta é importante tanto para a produção de HSV em grande escala, quanto para a produção de vetor de rHSV e rAAV. Além disso, e surpreendentemente, conforme mostrado nos exemplos, a presença de ATA nos estoques de rHSV-1 não influenciou negativamente a produção de rAAV. Este resultado é surpreendente, visto que se sabe que o ATA em quantidades milimolares e em concentrações maiores é um agente antiviral (Cushman e col., J. Med. Chem. (1991) 34:329-337; Zhang e col., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap e col., Computational Biol. and Chem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160).

[00065] Conforme explicado acima, os investigadores descreveram a atividade antiviral do óxido nítrico (NO) contra diversos vírus, tais como o vírus da vacínia, o vírus da estomatite vesicular, e o vírus da encefalite japonesa, entre outros (Bi e col., J. Virol. (1995) 69:64666472; Harris e col., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin e col., 1997; Pertile e col., Avian Dis. (1996) 40:342-348). O NO é uma molécula gasosa de radical livre e é um mediador da defesa do hospedeiro (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91 :2446-2452; Karupiah e col., Science (1993) 261:1445-1448; Rolph e col., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro e col., J. Med. Virol. (1997) 51:326-331; Lane e col., J. Virol. (1997) 71:22022210). A infecção por HSV é capaz de induzir a expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS), um gene que codifica uma isoforma in- duzível da NOS que produz grandes quantidades de NO.

[00066] Conforme mostrado neste documento, o ATA suprime a iNOS suprarregulada pelo HSV e, com isso, aumenta os títulos de HSV na cultura. Os inibidores adicionais da iNOS, incluindo a dexametasona e o ácido valproico, também têm o mesmo efeito. Em uma modalidade, então, o uso de tais inibidores da iNOS aumenta os títulos do vírus do herpes recombinante na cultura, permitindo a produção de significativamente mais vírus do que produzido na ausência do inibidor particular. Os vírus produzidos pelo método podem ser usados em uma variedade de contextos, incluindo para propósitos profiláticos, terapêuticos e diagnósticos, bem como para a produção de construções recombinantes em quantidade suficiente para usar na preparação de vírions recombinantes para a distribuição de gene e a terapia gênica.

[00067] O ácido aurintricarboxílico (ATA), ácido 5-((3-carbóxi-4-hi- droxifenil)(3-carbóxi-4-oxo-2,5-ciclo-hexadien-1-ilideno)metil)-2-hidroxi- benzóico, é uma mistura heterogênea de polímeros aromáticos negativamente carregados, não sulfatados, que se forma quando o ácido sa- licílico for tratado com o formaldeído, o ácido sulfúrico e o nitrito de sódio (ver Cushman, e col., (1991) J. Med. Chem.34:329-337; Cushman, e col., J. Med. Chem. 34:337-342). O ácido aurintricarboxílico tem a fórmula:

[00068] A mistura heterogênea de ATA foi descrita inibir as interações entre proteína ácido nucleico (Gonzaleze col., Biochim. Biophys. Acta, (1979) 562:534-545); interagir com receptores esteróides na absorção nuclear e nos níveis de ligação nuclear (Mellon, W. S., Biochem. Pharmacol. (1984) 33:1047-1057; Moudgile col., J. Steroid Biochem. (1985) 23:125-132); inibir a DNA polimerase (Nakanee col.,Eur. J.Biochem. (1988) 177:91-96); e atuar como um inibidor da RNAase (Skid- moree col., Biochem. J.(1989) 263:73-80).

[00069] O ATA para a adição ao vírus na cultura pode ser usado na forma ácida ou pode ser proporcionado como um sal, tal como o sal trissódico de ácido aurintricarboxílico; o sal de cálcio; o sal de amônio, etc.

[00070] As substâncias adicionais que encontrarão uso com os presentes métodos incluem a dexametasona (Dex) e o ácido valproico (VA). A Dex mostrou inibir a expressão de iNOS nas células mesangiais de ratos nos níveis transcricionais e pós-transcricionais (Kunz e col., Bi- ochem. J. (1994) 304:337-340; Kunz e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:255-259). A Dex também mostrou aumentar a replicação de DNA de oriL de HSV-1 nas células PC12. O valproato de sódio, o sal sódico de VA, mostrou estimular a replicação de HSV-1, citomegaloví- rus humano, HIF-1, vírus do herpes humano 8, vírus do sarampo e po- livírus tipo 1 (Motamedifar e col., Iran. J. Med. Sci. (2006) 31:28-32; Kuntz-Simon e col., J. Gen. Virol(1995) 76:1409-1415; Moog e col., J. Gen. Virol (1996) 77:1993-1999; Ilisastigui e col., AIDS (2004) 18:1101-1108; Shaw e col., AIDS (2000) 14:899-902; Kabiri e col. Iran J. Med. Sci. (2001) 26:55-61). Adicionalmente, o ácido valproico mostrou inibir a iNOS (Guo e col., Surgery (2007) 142:156-162). Como com o ATA, o VA, ou os seus sais, tais como os sais de sódio, cálcio, amônio, etc., pode ser usado nos presentes métodos.

[00071] Embora o uso de ATA, Dex, e VA para produzir os vetores de rHSV-1 em títulos maiores seja exemplificado neste documento, estes inibidores da iNOS podem ser usados para aumentar o título de uma variedade de vírus na cultura, tais como, porém não limitados aos vírus das famílias Adenoviridae, Picornaviridae (p.ex., poliovírus, etc.); Calici- viridae; Togaviridae (p.ex., vírus da rubéola, vírus da dengue, etc.); Fla- viviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (p.ex., vírus da raiva, etc.); Poxviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae (p.ex., vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, etc.); Orthomyxoviridae (p.ex., vírus influenza tipos A, B e C, etc.); Bun- yaviridae; Arenaviridae; aos diversos vírus da hepatite, tais como HAV, HBV e HCV; papilomavírus e rotavírus; retrovírus; etc. Ver, p.ex. Virology, 3a Edição (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2a Edição (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds. 1991), quanto a uma descrição deste e de outros vírus. Estes vírus, ou os imunógenos derivados deles, podem ser usados na produção de vacinas e em diagnósticos. Além disso, alguns desses vírus e, em particular, o vírus do herpes, podem ser usados para produzir vetores recombinantes para a produção de vírions recom- binantes para uso nas técnicas de distribuição do gene descritas abaixo.

[00072] Desse modo, o ATA, a Dex e o VA podem ser usados para aumentar a produção de quaisquer dos vírus do herpes que sejam membros da família herpesviridae. Isto inclui o vírus do herpes equino, o vírus do herpes bovino (BHV) e o vírus do herpes simples humano (HSV) ti-pos 1 e 2, tal como BHV-1, BHV-2, HSV-1 e HSV-2, o vírus varicela zoster (VZV), o vírus Epstein-Barr (EBV), o citomegalovírus (CMV), o HHV6 e o HHV7, entre outros. O vírus do herpes pode ser derivado de quaisquer das muitas cepas. Por exemplo, quando o vírus produzido usando a invenção for o HSV, o vírus pode ser derivado de, por exemplo, HSV-1 ou HSV-2, e pode ser de quaisquer das diversas cepas de HSV, tais como a cepa de HSV-1 KOS, a cepa de HSV-1 McIntyre, a cepa de HSV-1 Patton, a cepa de HSV-2 333, a cepa de HSV-2 G, e similar. Além disso, os vírus produzidos podem ser vírus do tipo selvagem, ou seus derivados, incluindo os vírus recombinantes e os recom- binantes entre tipos contendo DNA a partir de HSV-1 e HSV-2. Os deri-vados preferivelmente têm pelo menos 70% de homologia da sequência com quaisquer dos genomas de HSV-1 ou HSV-2 ou suas partes, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 ou 95%. Um derivado pode ter a sequência de um genoma de HSV-1 ou HSV-2 modificada por substituições de nucleotídeos, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a 10, 25, 50 ou 100 substituições. O genoma de HSV-1 ou HSV-2 pode alternativa ou adicionalmente ser modificado por uma ou mais inserções e/ou remoções e/ou por uma extensão em quaisquer ou em ambas as extremidades.

[00073] Os outros derivados incluem as cepas que já tenham mutações nos genes, particularmente mutações nos genes que resultem na atenuação do vírus. Os exemplos de tais vírus incluem a cepa 1716 (MacLean e col., J. Gen. Virol. (1991) 72:632-639), as cepas R3616 e R4009 (Chou e Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89: 32663270) e R930 (Chou e col., J. Virol. (1994) 68:8304-8311), todas as quais têm mutações em ICP34.5, a cepa d120, que tem uma remoção em ICP4 (DeLuca e col.,J. Virol. (1985) 56:558-570), a cepa d27-1 (Rice e Knipe, J. Virol. (1990) 64:1704-1715), que tem uma remoção em ICP27), ou a cepa d92, que tem remoções tanto em ICP27 quanto em ICP4 (Samaniego e col., J. Virol. (1995) 69:5705-5715). A terminologia usada na descrição dos diversos genes de HSV é como encontrada, p.ex., em Coffin e Latchman (1996), Em: Genetic Manipulation of the Nervous System (DS Latchman Ed.) pp. 99-114: Academic Press, Londres.

[00074] Conforme é prontamente aparente, qualquer rHSV adequado para o propósito pretendido pode ser usado na invenção. Em certas modalidades, o rHSV usado na invenção é defeituoso de replicação. Para a produção de vírions de rAAV, prefere-se a infecção das células produtoras com o rHSV que é incapaz de replicação porque, em contraste com os métodos que envolvem o uso de adenovírus, o rHSV não se torna um contaminante significativo do produto de rAAV. Isto pode servir para aumentar a produção final de vírions de rAAV por eliminação das etapas de purificação associadas com a remoção do adenovírus.Em uma modalidade particular da invenção, o rHSV é construído a partir de um mutante de HSV-1 em que a incapacidade de replicar é devida a uma remoção no gene de ICP27. Quaisquer outros mutantes adequados de HSV, exibindo um fenótipo defeituoso de replicação, podem também ser usados para construir o rHSV.

[00075] Uma cepa de HSV-1 mutante recombinante particularmente preferida, para a produção de rAAV usando os presentes métodos, é a cepa de HSV-1 d27-1. Esta cepa pode ser preparada conforme descrito, p.ex., em Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:973 985, e na Patente U.S. No. 7.091.029, incorporados neste documento por referência em sua totalidade. Conforme explicado acima, este vetor mutante não produz a ICP27 e é vantajosamente usado para produzir vírions de rAAV, uma vez que se sabe que a emenda na célula hospedeira do RNA mensageiro é inibida pela ICP27. A ICP27 pode também efetuar a emenda apropriada das mensagens de rep e cap de AAV-2. Este vetor é defeituoso de replicação e mostra citotoxicidade reduzida em comparação com o HSV-1 do tipo selvagem (wt). O vírus d27-1 mostra diversas outras características que são vantajosas para uso como um vírus auxiliador para a produção do virion de rAAV. Primeiro, ele expressa os genes iniciais que se sabe são requeridos para a produção de rAAV (Weindler e col., J. Virol. (1991) 65:2476-2483). Além disso, o d27.1 superex- pressa a ICP8, a proteína de ligação ao DNA de fita simples que é o produto de UL29, um dos genes de HSV-1 essenciais para a replicação e o acondicionamento de AAV (Weindler e col., J. Virol. (1991) 65:24762483).

[00076] O genoma de AAV é uma molécula de DNA de fita simples, linear, contendo cerca de 4681 nucleotídeos. O genoma de AAV em geral compreende um genoma que não se repete, interno, flanqueado sobre cada extremidade por repetições terminais invertidas (ITRs). As ITRs são aproximadamente 145 pares de bases (bp) de comprimento.As ITRs têm múltiplas funções, incluindo proporcionar origens de repli- cação de DNA, e sinais de acondicionamento para o genoma viral. A parte não repetida interna do genoma inclui dois grandes quadros de leitura abertos, conhecidos como os genes de replicação (rep) e de cap- sídio (cap) de AAV. Os genes rep e cap codificam as proteínas virais que permitem que o vírus replique e se acondicione em um virion. Em particular, uma família de pelo menos quatro proteínas virais é expressa a partir da região de rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52, e Rep 40, denominadas de acordo com o seu peso molecular aparente. A região de cap de AAV codifica pelo menos três proteínas, VPI, VP2, e VP3.

[00077] Por "região codificadora de rep de AAV" pretende-se a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de replicação Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40. Estes produtos de expressão de Rep foram mostrados possuir muitas funções, incluindo o reconhecimento, a ligação e o corte da origem de replicação de DNA de AAV, a atividade de DNA helicase e a modulação da transcrição de promotores de AAV (ou outros heterólogos). Os produtos de expressão de Rep são coletivamente requeridos para replicar o genoma de AAV. Quanto a uma descrição da região codificadora de rep de AAV, ver, p.ex., Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immu- nol.158:97-129; e Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy5: 793-801. Os homólogos adequados da região codificadora de rep de AAV incluem o gene rep do vírus do herpes humano 6 (HHV-6), que se sabe também mediar a replicação do DNA de AAV-2 (Thomson e col. (1994) Virology 204:304-311).

[00078] Por "região codificadora de cap de AAV" pretende-se a região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de capsídios VP1, VP2, e VP3, ou os seus homólogos funcionais. Estes produtos de expressão de Cap fornecem as funções de acondicionamento que são coletivamente requeridas para o acondicionamento do genoma viral. Quanto a uma descrição da região codificadora de cap de AAV, ver, p.ex., Muzyczka, N. e Kotin, R.M. (supra).

[00079] Tipicamente, dois vetores de rHSV serão usados para produzir os vírions de rAAV. Um é um vetor de função auxiliadora de rHSV, no qual os genes rep e/ou cap de AAV tenham sido incorporados no genoma de rHSV. O outro é um vetor de expressão de rHSV, no qual as sequências de ITR de AAV tenham sido incorporadas no genoma de rHSV e flanqueiam um gene de interesse.

[00080] Desse modo, em uma modalidade, o inibidor da iNOS pode ser usado para aumentar a produção de um primeiro vetor de rHSV que contém os genes de rep e/ou cap de AAV. As modalidades do primeiro vetor de rHSV do método incluem, porém não estão limitadas às cons- trutos de genes baseadas no gene cap encontrado em diversos seróti- pos de AAV, incluindo AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5 e AAV-6, AAV-7 e AAV-8, AAV caprino e bovino (ver, p.ex., a Publ. U.S. No. 20080292595, incorporada neste documento por referência em sua totalidade), e suas variantes. Também dentro do escopo da invenção estão os genes rep e cap a partir de novos serótipos de AAV, e aqueles modificados por recombinação ou mutação de serótipos existentes. Os genes rep e cap do vetor de função auxiliadora de AAV podem ser derivados de quaisquer dos serótipos de AAV conhecidos, conforme explicado acima. Por exemplo, o vetor de função auxiliadora de rHSV pode ter um gene rep derivado de AAV-2 e um gene cap derivado de AAV-6; alguém de habilidade na técnica reconhecerá que outras combinações de genes rep e cap são possíveis, a característica definidora sendo a capacidade de suportar a produção de vírions de rAAV.

[00081] Em certas modalidades, os genes rep e cap de AAV no vetor de função auxiliadora de rHSV podem ser orientados por seus promotores nativos. Os promotores p5 e p19 de AAV-2 controlam a expressão de Rep 78 e 68 e Rep 52 e 40, respectivamente. O promotor p40 controla a expressão de VP1, VP2 e VP3. Adicionalmente, os promotores heterólogos podem ser usados para orientar a expressão dos genes de AAV. Os exemplos de outros promotores que podem ser usados nos métodos divulgados incluem, porém não estão limitados ao promotor inicial de SV40, o promotor de CMV, o promotor de timidina cinase de HSV-1 (tk de HSV-1), o promotor induzível de metalotionina, o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo e o promotor de β-actina de galinha.

[00082] O construto de gene pode ser inserida em qualquer sítio, ou sítios, no genoma de HSV, adequado para a integração dos genes rep e cap. Em certas modalidades, o vetor é construído por recombinação homóloga dos genes rep e cap de AAV no lócus de timidina cinase (tk) do vírus rHSV-1, conforme descrito em Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:986-993 e na Patente U.S. No. 7.091.029, incorporados neste documento em sua totalidade.

[00083] Conforme explicado neste documento, o vetor de função auxiliadora de rHSV codifica as sequências "de função auxiliadora de AAV" (i.e., rep e cap), que funcionam in trans para a replicação de AAV produtiva e a encapsidação. De preferência, o vetor de função auxiliadora de rHSV suporta a produção eficiente de vírions de rAAV, sem gerar quaisquer vírions de AAV wt detectáveis (i.e., vírions de AAV contendo genes rep e cap funcionais). Um exemplo de tal vetor é o rHSV-1 d27.1rc. O vetor e os métodos de produzir o mesmo são descritos aqui nos exemplos, bem como em Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:986993; e na Patente U.S. No. 7.091.029, incorporados por referência em sua totalidade.

[00084] O segundo vetor de rHSV é chamado um vetor de expressão de rHSV e contém ITRs a partir de AAV, com um ou mais genes de interesse orientados por um ou mais promotores. Em algumas modalidades, o gene de interesse é inserido entre um par de ITRs. O gene heterólogo é típica e funcionalmente ligado a um promotor heterólogo (constitutivo, específico para a célula, ou induzível), capaz de orientar a expressão do gene nas células-alvo do paciente, sob condições apropriadas. Os sinais de terminação, tais como os sítios de poliadenilação, podem também ser incluídos.

[00085] As sequências de nucleotídeos das regiões de ITR do AAV são conhecidas. Ver, p.ex., Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" em Fundamental Virology, 2a Edição, (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds.), quanto à sequência de AAV-2. As ITRs de AAV usadas nos vetores da invenção não necessitam ter uma sequência de nucleotídeos do tipo selvagem, e podem ser alteradas, p.ex., pela inserção, remoção ou substituição dos nucleotídeos. Adicionalmente, as ITRs de AAV podem ser derivadas de quaisquer de diversos serótipos de AAV, incluindo, sem limitação, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 e AAV-8, AAV caprino e bovino (ver, p.ex., a Publ. U.S. No. 20080292595, incorporada neste documento por referência em sua totalidade), e suas variantes. Ademais, as ITRS em 5' e 3', que flanqueiam uma sequência de nucle- otídeos selecionada em um vetor de expressão, não necessitam necessariamente ser idênticas ou derivadas do mesmo serótipo ou isolado de AAV, desde que elas funcionem conforme pretendido, i.e., permitir a ex- cisão e o resgate da sequência de interesse de um genoma ou vetor de célula hospedeiro, e permitir a integração da molécula de DNA no ge- noma da célula receptora, quando os produtos de gene rep de AAV estiverem presentes na células.

[00086] As ITRs de AAV podem ser excisadas do genoma viral ou de um vetor de AAV contendo a mesma e fundidas 5' e 3' de uma construto de ácido nucleico selecionada usando técnicas-padrão de ligação, tais como aquelas descritas em Sambrook e col., supra. Por exemplo, a ligação pode ser efetuada em 20 mM de Tris-Cl pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 33 μg/ml de BSA, 10 mM-50 mM de NaCl, e 40 μM de ATP, 0,01-0,02 unidade (Weiss) de T4 DNA ligase, a 0°C (para a ligação da "extremidade grudenta"), ou 1 mM de ATP, 0,3-0,6 unidade (Weiss) de T4 DNA ligase, a 14°C (para a ligação da "extremidade grossa"). As ligações da "extremidade grudenta" intermoleculares são normalmente efetuadas a 30-100 μg/ml de concentração de DNA total (5-100 nM de concentração final total). Os vetores de AAV que contêm as ITRs foram descritos, p.ex., na Patente U.S. no. 5.139.941. Em particular, diversos vetores de AAV são descritos a este respeito, que estão disponíveis da American Type Culture Collection ("ATCC") sob os Números de Acesso 53222, 53223, 53224, 53225 e 53226.

[00087] A sequência de polinucleotídeos selecionada é operavel- mente ligada aos elementos de controle que orientam a sua transcrição ou expressão nas células de um paciente. Tais elementos de controle podem compreender as sequências de controle normalmente associadas com o gene selecionado. Alternativamente, podem ser empregadas sequências de controle heterólogas. As sequências de controle heterólogas úteis em geral incluem aquelas derivadas de sequências que codificam genes mamíferos ou virais. Os exemplos incluem, porém não estão limitados ao promotor de enolase específico para neurônio, um promotor de GFAP, promotor inicial de SV40, promotor de LTR do vírus do tumor mamário de camundongo; promotor tardio principal de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus do herpes simples (hSV), um promotor de citome- galovírus (CMV), tal como a região promotora inicial imediata de CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma de rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos, e similares. Além disso, as sequências derivadas de genes não virais, tais como o gene de metalotioneína de camundongo, também encontrarão uso neste documento. Tais sequências promotoras estão comercialmente disponíveis, p.ex., da Stratagene (San Diego, CA), Invivogen (San Diego, CA) e outras.

[00088] O gene de interesse pode ser um gene provável de ser de valor terapêutico. Os exemplos de genes terapêuticos incluem, porém não estão limitados à α-1 antitripsina, Fator VIII, Fator IX, GAA, eritro- poietina e PEDF. Quando for desejável selecionar ou identificar a expressão de transgene bem sucedida, o gene de interesse pode ser um gene relator. Muitos exemplos de genes usados como relatores ou para a seleção são conhecidos, e podem ser usados na invenção. Estes incluem, porém não estão limitados aos genes codificando a β-galactosi- dase, a neomicina, a fosforo-transferase, a cloranfenicol acetil transferase, a timidina cinase, a luciferase, a beta-glucuronidase, o aminogli- cosídeo, a fosfotransferase, a higromicina B, a xantina-guanina fosfori- bosila, a luciferase, o DHFR/metotrexato, e a proteína fluorescente verde (GFP).

[00089] O vírus de expressão de rHSV-1 pode ser produzido em grande parte do mesmo modo como descrito acima, a saber, por recom- binação homóloga no gene de tk de HSV-1, conforme descrito, p.ex., em Conway e col., Gene Ther. (1999) 6:986-993 e na Patente U.S. No. 7,091,029, incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

[00090] Assim que produzidos, os vetores de rHSV, ou qualquer outro vírus de interesse, é propagado na cultura, em uma linhagem celular apropriada. Para o vírus do herpes, tais linhagens celulares incluem, porém não estão limitadas às células Vero, células 293, células HeLa, e similares, disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Md. Se o vetor de HSV-1 d27.1 for usado, este vírus tipicamente será cultivado na linhagem celular de complementação de ICP27 V27 (Rice e col., J. Virol. (1990) 64:1704-1715). Qualquer meio adequado para o vírus em questão, com ou sem soro, tal como o soro bovino fetal, pode ser usado, tal como, porém não limitado ao meio RPMI 1640, Meio Eagles Modificado da Dulbecco (DMEM), meio F12 ou uma mistura do último (meio DF). Se o soro estiver presente, a cultura pode incluir, por exemplo, 2% a 20% de soro, mais tipicamente 5% a 15% de soro, 7% a 12% de soro, ou qualquer número dentro destas faixas, tal como 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, e similar. Além disso, se o soro for usado, ele pode estar presente na cultura inicial, e/ou no meio novo subsequente, adicionado às culturas.

[00091] A quantidade do inibidor da iNOS a ser adicionado no método de acordo com a invenção pode ser variada e é, até um certo grau, dependente do inibidor particular usado, do meio usado e do vírus a ser cultivado. Por exemplo, quando os vírus do herpes forem cultivados nas células Vero, a concentração do ATA na cultura inicial, se presente, tipicamente será 5 μM a 500 μM, preferivelmente 10 μM a 250 μM, tal como 20 μM a 100 μM, i.e., 30 μM a 75 μM, tal como 30...35...40...45...50...55...60...65...70...75, etc. ou qualquer número inteiro dentro destas faixas apresentadas. Similarmente, a concentração da dexametasona, se presente na cultura inicial, tipicamente será 0,1 μM a 500 μM, preferivelmente 0,5 μM a 250 μM, tal como 1 μM a 100 μM, i.e., 5 μM a 75 μM, tal como 1... 5... 15... 10... 20... 25... 30...35...40...45...50...55...60...65...70...75, etc. ou qualquer número inteiro dentro destas faixas apresentadas. Se o ácido valproico for usado, a concentração inicial será 0,1 mM a 500 mM, preferivelmente 0,5 mM a 250 mM, tal como 1 mM a 100 mM, i.e., 5 mM a 75 mM, tal como 1... 5... 15... 10... 20... 25... 30... 35... 40... 45... 50... 55... 60... 65... 70... 75, etc. ou qualquer número inteiro dentro destas faixas apresentadas.

[00092] Em certas modalidades, as células infectadas com os vírus são inicialmente cultivadas em meios como descritos acima, por 0,5 hora a 24 horas, tal como 0,75 hora a 12 horas, 1 hora a 5 horas, 1 hora a 2 horas, ou qualquer número de horas ou suas frações dentro destas faixas. O inibidor da iNOS e/ou o soro podem ou não estar presentes na cultura inicial. O meio novo é subsequentemente adicionado e as culturas incubadas por 24 a 120 horas, tal como 48 a 96 horas, 50 a 80 horas, 60 a 75 horas, 70 a 74 horas, ou qualquer número de horas ou suas frações dentro destas faixas. O inibidor da iNOS e/ou o soro podem ou não estar presentes na cultura subsequente, com a condição que o inibidor da iNOS esteja presente em qualquer uma, ou tanto na cultura inicial quanto na cultura subsequente.

[00093] Em algumas modalidades, o inibidor da iNOS na cultura inicial está presente em uma concentração maior do que na cultura subsequente. Desse modo, por exemplo, se o inibidor da iNOS for o ATA, ele pode estar presente em uma quantidade de 30 a 75 μM na cultura inicial e então 5 a 25 μM na cultura subsequente. Alternativamente, o inibidor pode estar presente somente na cultura inicial ou na subsequente.

[00094] Conforme mostrado nos exemplos abaixo, um método particularmente preferido utilizando o ATA inclui a presença de 50 μM de ATA na cultura inicial, com uma redução na quantidade de ATA na cultura subsequente para 20 μM. Adicionalmente, no caso do ATA, é preferível incluir o soro ao mesmo tempo em que o ATA estiver presente. Desse modo, se o ATA for adicionado à cultura inicial, é vantajoso adicionar o soro bovino fetal (FBS) ao meio. Também, se o ATA for adicionado à cultura subsequente, a adição de FBS é necessária para obter maiores rendimentos virais.

[00095] Os vírus são então cultivados para obter um título desejável de vírus. Por exemplo, no caso dos vetores de HSV-1 d27-1 descritos neste documento, o ATA aumenta as produções de d27-1 nos sobrena- dantes das células V27 3 - 5 vezes e os títulos podem ser pelo menos 1 x 108 PFU/ml ou 4 x 108 DRP/ml. Similarmente, o ATA também aumenta os rendimentos das cepas de vírus HSV-1 do tipo selvagem (wt) McIntyre e KOS por 1 log, e os títulos de 293 ou Vero podem ser até 1 x 109 DRP/ml. Os vírus são então coletados para uso adicional.

[00096] Para os propósitos da invenção, as células hospedeiras adequada para produzir vírions de rAAV incluem os micro-organismos, as células de leveduras, as células de insetos, e as células mamíferas, que podem ser, ou foram, usadas como receptoras de uma molécula de DNA heteróloga e que são capazes de desenvolvimento, por exemplo, em cultura de suspensão, frascos, placas, um biorreator, ou similar. O termo inclui a progênie da célula original que tenha sido transfectada. Desse modo, uma "célula hospedeira", como usada neste documento, em geral refere-se a uma célula que tenha sido transduzida com uma sequência de DNA exógena. Se os vírus do herpes recombinantes forem produzidos em um tipo de células para uso na preparação de vírions de rAAV, os vetores coletados são então transfectados em outra célula hospedeira adequada. As células 293, originadas de uma linhagem celular humana estável (prontamente disponível através, p.ex., da American Type Culture Collection sob o Número de Acesso ATCC CRL1573), são células hospedeiras preferidas para produzir os vírions de rAAV. Particularmente, a linhagem celular humana 293 é uma linhagem de células dos rins embriônicas humanas que foi transformada com os fragmentos de DNA do adenovírus tipo 5 (Graham e col. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), e expressa os genes E1a e E1b adenovirais (Aiello e col. (1979) Virology 94:460). A linhagem celular 293 é prontamente trans- fectada, e proporciona uma plataforma particularmente conveniente na qual se produz os vírions de rAAV.

[00097] As funções auxiliadoras de AAV são introduzidas na célula hospedeira por transdução da célula hospedeira com uma construção de função auxiliadora de rHSV antes, ou simultaneamente com, usando o vetor de expressão de rHSV. As construções auxiliadoras de rHSV são, desse modo, usadas para proporcionar pelo menos a expressão transiente dos genes rep e/ou cap de AAV para complementar as funções de AAV que estão faltando, que são necessárias para a infecção pelo AAV produtiva. As construções auxiliadoras de AAV não têm as ITRs de AAV e não podem se replicar nem se acondicionar.

[00098] Após a replicação do AAV recombinante, os vírions de rAAV podem ser purificados da célula hospedeira usando uma variedade de métodos convencionais de purificação, tais como a cromatografia em coluna, os gradientes de CsCl, e similares. Por exemplo, pode ser usada uma pluralidade de etapas de purificação em coluna, tal como a purificação sobre uma coluna de troca aniônica, uma coluna de afinidade e/ou uma coluna de troca catiônica. Ver, por exemplo, o Pedido Internacional No. WO 02/12455.

[00099] Os vírions de rAAV resultantes, contendo a sequência de nu- cleotídeos de interesse, podem então ser usados para a distribuição do gene usando práticas bastante conhecidas na técnica e descritas, p.ex., nas Patentes U.S. Nos. 5.173.414 e 5.139.941; nas Publicações Internacionais Nos. WO 92/01070 (publicada em 23 de janeiro de 1992) e WO 93/03769 (publicada em 4 de março de 1993); em Lebkowski e col., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent e col., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Ther-apy (1994) 5:793-801; Shelling e Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; e Zhou e col., J. Exp. Med. (1994) 179: 1867-1875.

2. EXPERIMENTAL

[000100] Abaixo são exemplos de modalidades específicas para realizar a presente invenção. Os exemplos são proporcionados para propósitos ilustrativos somente, e não são pretendidos para limitar o escopo da presente invenção de modo algum.

[000101] Têm sido feitos esforços para garantir a acurácia em relação aos números usados (p.ex., quantidades, temperaturas, etc.), porém algum erro e desvio experimental obviamente serão permitidos.

Materiais e Métodos Células

[000102] As células V27 derivadas das Vero (Rice e col., J. Virol. (1989) 63:3399-3407) e as células 293 derivadas das células dos rins embriônicos humanos (HEK) (Graham e col., J. Gen. Virol. (1977) 36:5974) foram obtidas da Applied Genetic Technologies Corporation (AGTC, Alachua, FL), as células Vero e HeLa foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Todas as células foram mantidas em meio da Eagle modificado da Dulbecco (DMEM; HyClone, South Logan, UT) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS; HyClone) e Geneticina (50 mg/ml; Invitrogen) para as células V27 ou 1% de penici- lina/estreptomicina (Cellgro Mediatech, Manassas, VA) para as outras células.

Produção de HSV-1

[000103] A cepa de wtHSV-1 KOS e os derivados deficientes de ICP27 da cepa de wtHSV-1 KOS: vetores d27-1 (Rice e Knipe, J. Virol. (1990) 64:1704-1715), rHSV-rep2/cap2 e rHSV-EGFP (Kang e col., Gene Ther. (2009) 16:229-239) e a sua linhagem de células V27 de complementação de ICP27 produtora, foram obtidos da AGTC (Alachua, FL). A cepa de wtHSV-1 MacIntyre, adquirida da Advanced Biotechnologies Inc. (ABI, Columbia MD), e a cepa de wtHSV-1 KOS foram propagadas nas linhagens de células Vero, 293 ou HeLa. As partículas de vetores infecciosas foram coletadas 72 após a infecção por recuperação do sobrenadante da cultura. Os títulos dos estoques de HSV-1 nas partículas resistentes à DNase/ml (DRP/ml) foram determinados por ensaio de Taqman. Os genomas virais dentro do meio de cultura bruto foram quantificados por meio de tratamento na presença de DNase 1 (50 U/ml final; Promega) a 37°C por 60 min, seguido por digestão com proteinase K (Invitrogen) (1 U/ml) a 50°C por 60 min, e então desnaturados a 95°C por 30 min. O plasmídio linearizado pZero 195 UL36 (obtido da AGTC, Inc., Alachua, FL) foi usado para gerar curvas padrões. O conjunto de primer- sonda era específico para a sequência do genoma do vetor UL36 (HSV- UL36 F: 5’- GTTGGTTATGGGGGAGTGTGG (SEQ ID NO:1); HSV- UL36 R: 5’-TCCTTGTCTGGGGTGTCTTCG (SEQ ID NO:2); HSV-UL36 Sonda: 5’- 6FAM - CGACGAAGACTCCGACGCCACCTC-TAMRA (SEQ ID NO:3). A amplificação do produto da PCR foi obtida com os seguintes parâmetros de ciclização: 1 ciclo a 50°C por 2 min, 1 ciclo a 95°C por 10 min; 40 ciclos de 95°C por 15 s, e 60°C por 60 s.

Experimentos do ATA

[000104] A solução de estoque de ATA (Sigma - A1895 Ácido aurintri- carboxílico grau prático >85% (titulação), pó) foi gerada como concentração de 500 μM em 100 mM de solução de bicarbonato de sódio em água. A solução de estoque de ATA foi adicionalmente diluída em DMEM+/-10% de soro bovino fetal (FBS, Hyclone, Waltham, MA) nas faixas de concentrações de 12-60 μM de ATA (8,5-21 μg de ATA /ml). A infecção por HSV-1 na multiplicidade de infecção de 0,15 (MOI= 0,15) (tipicamente 6x105 células em uma placa de 6 poços) foi efetuada em 40% (2/5 vol) do volume de meio final total, por 1-2 h, e o meio restante (60% ou 3/5 do volume final total) foi adicionado durante a etapa de diluição. As células foram então incubadas 72 horas e o sobrenadante coletado para efetuar os ensaios de título em unidades formadoras por mililitro (PFU/ml) e DRP/ml.

Experimentos da Dexametasona (Dex)

[000105] A Dexametasona (Sigma - D4902) foi dissolvida até 2 mg/ml em álcool absoluto. Esta foi diluída com DMEM para obter uma concentração de 1M e armazenada a -20°C.

[000106] As células V27 foram semeadas em placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço. A Dexametasona foi adicionada para obter uma concentração de 1 μM no meio de semeadura. Este foi misturado bem e adicionado aos poços.

[000107] O meio foi aspirado e o estoque de HSV-1 d27-1 infeccioso foi adicionado em MOI 0,15 (= densidade de semeadura de célula x 0,15/ pfu de título de estoque de HSV) por 1 ml de DMEM (sem aditivos). 1 ml de inóculo infeccioso foi adicionado por poço. Isto foi incubado por 1-2 horas, a 37°C, incubadora de 5% de CO2, após cujo tempo 1,5 ml de DMEM-10% de FBS foi adicionado. As culturas foram retornadas para a incubadora por 70-74 horas.

[000108] O meio livre foi coletado, redemoinhado, centrifugado a 1.100 x g por 10 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de distribuição, redemoinhado, dividido em alíquotas e os estoques foram congelados a -80°C.

Experimentos do Ácido Valproico (VA)

[000109] O ácido valproico (Sigma - P4543) foi dissolvido até uma concentração de 1 M em água. As células V27 foram semeadas nas placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço. O ácido valproico a 1 M foi introduzido em 1 ml de DMEM-10% de FBS para obter uma concentração de 5 μM . Isto foi redemoinhado bem e adicionado aos poços. As placas foram incubadas por seis horas, aspiradas e o estoque de HSV-1 d27-1 infeccioso adicionado em MOI 0,15 (= densidade de semeadura de célula x 0,15/ pfu de título do estoque de HSV) por 1 ml de DMEM (sem aditivos).

[000110] 1 ml de inóculo infeccioso foi adicionado por poço e incubado por 1-2 horas a 37oC, incubadora de 5% de CO2, após cujo tempo 1,5 ml de DMEM-10% de FBS foi adicionado. As placas foram retornadas para a incubadora por 70-74 horas. O meio livre foi coletado, redemoinhado, e centrifugado a 1.100 x g por 10 minutos, a 4°C. O sobrena- dante foi transferido para um novo tubo distribuidor, redemoinhado, e dividido em alíquotas. Os estoques foram congelados a -80oC.

Produção de rAAV

[000111] As células 293 (2,5 x106) foram simultaneamente coinfectadas com ambos os vetores rHSV-rep2/cap2 e rHSV-EGFP, conforme descrito por Kang e col., Gene Ther(2009) 16:229-239. Em 24 h após a infecção, o meio infeccioso foi trocado por DMEM +10% de FBS, equivalente a dobrar o volume de cultura de pré-infecção. No momento da coleta, a pelota de células foi congelada a -80°C. Os títulos de DRP foram quantificados por reação em cadeia por polimerase em tempo real (qPCR) em um termociclizador de blocos de 96 poços (Applied Biosystems; Sistema 7500 Real Time PCR). As amostras brutas foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento, então incubadas na presença de Benzonase (250 U/ml), 2 mM de MgCl2, Tween 80 grau proteico, 1% de concentração final (Calbiochem), e incubadas a 37°C por 60 min, seguido por digestão com 0,25% de Tripsina (Gibco) a 50°C por 60 min. Finalmente, o tratamento com DNase I (50 U/ml; Pro- mega) a 37°C por 30 min, e então desnaturou-se a 95°C por 20 min. O plasmídio linearizado pDC67/+SV40 foi usado para gerar curvas padrões. O conjunto de primer-sonda era específico para a sequência de poli(A) do vírus símio 40 (SV40): rAAV-F: 5’- AGCAATAGCATCACAAATTTCA- CAA-3’ (SEQ ID NO:4);rAAV-R: 5’-GCAGACATGATAAG ATACA- TTGATGAGTT-3’ (SEQ ID NO:5) ;rAAV-Sonda: 5’ 6-FAM-AG- CATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:6). A amplificação do produto da PCR foi obtida com os seguintes parâmetros de ciclização: 1 ciclo a 50°C por 2 min, 1 ciclo a 95°C por 10 min; 40 ciclos de 95°C por 15 s, e 60°C por 60 s.

Arranjo do Genoma Humano

[000112] As células 293 confluentes (2,4x106 células em um frasco de 75 cm2) foram cultivadas em DMEM + 10% de FCS por aproximadamente 20 h e foram então infectadas com uma unidade formadora de placa por célula (PFU/cell) da Cepa de HSV-1 MacIntyre por 90 min. O ATA em uma concentração 20 μM (final) foi adicionado 90 min após a infecção. As células infectadas foram coletadas em 24 h após a infecção. O RNA total de qualidade e quantidade suficientes foi isolado da suspensão usando o Mini Kit RNeasy Plus (QIAGEN, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O perfil de expressão do genoma total foi efetuado sobre o Arranjo Affymetrix Human U133 Plus 2.0 pela Asuragen, Inc. 3 μg de RNA total foram proporcionados como material de entrada.

[000113] No todo, a qualidade do RNA avaliada no bioanalisador tinha valores de RIN de > 9. A hibridização do arranjo e os fatores de escala estavam dentro da faixa de controle de qualidade de aprovação. Após varredura, os arquivos CEL de expressão brutos foram processados com o Console de Expressão Affymetrix vs. 1.1.2 (affymetrix.com). Cada arquivo CEL foi processado com Robust Multichip Analysis (RMA) e uma tabela resumida foi exportada como um arquivo de texto. Toda a genômica à jusante e as análises estatísticas foram feitas com JMP Genomics (versão 5) (jmp.com/software/genomics). Primeiramente, uma etapa de filtragem foi aplicada para remover a expressão baixa, especificamente os valores abaixo de 6 no modo log2 em pelo menos 2 das 8 amostras. Das 54.675 sondas totais Affy U133 Plus2, 41.569 (76%) son-das permaneceram após o corte. Duas amostras de controle positivas foram também vistas, RNA do cérebro humano e de referência universal humano reunido, respectivamente, que hibridizaram bem. Para análise futura, estas duas amostras foram excluídas.

[000114] A Análise do Componente Determinante revelou duas populações distintas, amostras tratadas com e sem HSV. A primeira separação do componente determinante (91,7%) é, portanto, explicada pelo efeito do HSV versus Veículo. O dado foi normalizado na média através de cada sonda para ter um sinal mediano de 0. A ANOVA foi efetuada para encontrar transcritos diferenciais significativos entre HSV versus Veículo, ATA versus Veículo, HSV+AVA versus Veículo, e HSV+ATA versus HSV sozinho. As correções múltiplas de teste não foram incluídas, e os genes significativos foram considerados menos que o valor p de 0,01.

[000115] Um mapa auto-organizado foi usado para examinar os padrões de expressão entre Veículo, HSV1, e HSV1+ATA. Era desejado encontrar transcritos específicos que fossem suprarregulados ou infrar- regulados pelo tratamento com ATA. Foi encontrado um aglomerado distinto de genes que mostrou algum estímulo na presença de HSV, e a correção de ATA trouxe estes genes de volta para a linha de base de veículo. Similarmente, um aglomerado de genes que foi reprimido pelo HSV em comparação com o veículo foi também encontrado, e subsequentemente ativado por tratamento com ATA. Estes foram chamados Aglomerados A e B, respectivamente (ver as Tabelas 1 e 2). A análise foi acompanhada para interrogar as funções biológicas destes aglomerados usando o software GeneGO (genego.com).

Arranjo de PCR RT2 Profiler® (SABiosciences - QIAGEN)

[000116] 6x10e5 células 293 (da AGTC) foram infectadas com a cepa wtHSV-1 McIntyre em MOI 1, na presença de DMEM e 10% de FBS, com ou sem 50 uM de ATA, e 1-2 horas, e diluídas para 40% com DMEM e 10% de FBS (concentração final de ATA de 20 uM). As amostras de RNA total em triplicata foram coletadas 24 h posteriormente, usando o mini kit RNeasy Qiagen e tratadas com DNase sobre a coluna e eluídas. As amostras em triplicata de RNA de eluato foram combinadas e as leituras de D.O do fotoespectrômetro foram efetuadas sobre o eluato a 260 e 280 nm, para determinar a concentração. O RNA de amostra foi convertido em cDNA de molde usando o kit de primeira fita RT2 da SABios- ciences. O cDNA foi então usado no Arranjo de PCR da Via de Sinalização de JAK / STAT Humano (PAHS-039A).

Exemplo 1 Inibição dos Níveis de iNOS Induzidos por HSV nas Células V27 usando ATA

[000117] As células V27 em Meio de Eagles Modificado da Dulbecco (DMEM) (Hyclone, Waltham, MA) foram infectadas com o vetor de HSV- 1 d27.1 em uma MOI de 1 e tratadas com 30 μM de ATA (Sigma, St. Louis, MO), com ou sem 10% de soro bovino fetal (FBS). Os experimentos de controle sem ATA foram também efetuados. Os lisados de células V27 foram obtidos 24 horas após a infecção (h.p.i.) e os Western blots foram corridos sobre os lisados e a proteína de iNOS foi detectada usando o pAb do anti-iNOS/NOS Tipo II de coelho purificado (BD Biosciences, Cat no. 610332). Os resultados são mostrados na Figura 1.

[000118] Conforme mostrado, a infecção por HSV induziu a expressão de iNOS naquelas culturas que não incluíram o ATA (caminhos 4 e 5). A expressão de iNOS foi inibida na presença de 30 μm de ATA (caminhos 2 e 3). A presença ou a ausência de 10% de FBS não teve um efeito sobre a expressão de iNOS.

Exemplo 2 Otimização do Protocolo de ATA-HSV

[000119] Para testar se o ATA poderia aumentar a produção do vetor de rHSV-1 d27-1 (d27-1) nas células V27, o ATA foi aplicado ao meio durante as etapas de infecção (Etapa 1) ou diluição (Etapa 2) (Figura 2A). A infecção por d27-1 em MOI = 0,15 foi efetuada em 2/5 do volume de meio final e o 3/5 restante do meio foi adicionado durante a etapa de diluição.

[000120] O tratamento com ATA retardou a formação de placas de HSV-1 ou a lise celular nas monocamadas de células V27. O efeito ci- topático (CPE) na hora da coleta, 72 horas após a infecção (hpi), era entre 20-60% em comparação com 100% de CPE na ausência de ATA. O tratamento com ATA durante a etapa de infecção por HSV-1 (ATA na Etapa 1) mostrou títulos aumentados de d27-1 nos sobrenadantes das células V27 coletados em 72 hpi (Figura 4B). A concentração ótima de ATA, quando adicionado durante a etapa de infecção (ATA I), era 50 μM e este foi adicionalmente diluído até uma concentração final (f.c.) de 20 μM de ATA, durante a etapa de diluição, por adição do 3/5 de volume restante do meio. Neste caso, o ATA aumentou os títulos de d27-1 no sobrenadante no momento da coleta (72 h.p.i.) aproximadamente 10 vezes: de 4,0 ±0,3 x107 DRP/ml ou 1,4 ±0,2x107 PFU/ml para 3,7±0,2 x108 DRP/ml ou 1,2±0,3 x108 PFU/ml (Figura 4B).

[000121] Para determinar quais concentrações e condições para a adição de ATA têm impacto sobre as produções de HSV, os experimentos a seguir foram conduzidos. O ATA em concentrações variadas foi adicionado às culturas de V27 infectadas com os vetores de HSV-1 d27- 1 em placas de seis poços (Figura 2B) ou frascos T150 (Figura 2C), em duas etapas, como se segue. Na Etapa 1 do protocolo, as células V27 foram infectadas com MOI 0,15 do vetor de rHSV em 2/5 do volume final de DMEM com 10% de FBS e 0-60 μM de concentrações de ATA. As células foram cultivas por 1-2 horas, a 37°C, para completar a Etapa 1. Na Etapa 2, a concentração de ATA foi reduzida até uma faixa entre 1224 μM pela adição de 3/5 do volume final de meio. As células foram cultivadas por 70-74 horas, a 37°C, e o sobrenadante coletado. Os títu-los virais foram expressos como Partículas Resistentes de Dnase (DRP/ml) ou Unidades Formadoras de Placas (pfu/ml) por ml e foram determinados conforme descrito acima.

[000122] Os resultados são mostrados em ambas as Figuras 2B e 2C e as concentrações ótimas de ATA estão em negrito. Conforme pode ser visto, tanto nas placas de seis poços (Figura 2B) quanto nos frascos T150 (Figura 2C), as culturas com ATA adicionado em quaisquer da Etapa 1 ou Etapa 2 tiveram títulos de HSV significativamente maiores do que aquelas sem o ATA. Além disso, os maiores títulos foram vistos em concentrações de ATA de 50 μM na Etapa 1, reduzidos para 20 μM na Etapa 2 (Figura 2B), embora todas as concentrações de ATA produzissem maiores títulos virais do que aquelas culturas que não tinham o ATA.

[000123] Foram conduzidos experimentos adicionais para determinar as condições ótimas e o efeito da presença ou da ausência de FBS sobre o título de HSV. A presença de soro, especificamente, 10% de soro bovino fetal (FBS), no meio contendo o ATA foi o parâmetro mais importante para a produção de título de HSV-1 induzido pelo ATA. Uma suple- mentação de ATA no meio sem soro, durante a etapa de diluição (ATA na Etapa 2), causou a redução do título de vírus, onde o título de "DRP" foi reduzido abaixo do nível de controle e o título como PFU/ml estava abaixo da detecção (Figura 3). Um efeito ainda mais dramático no meio sem soro foi visto quando o ATA, começando em concentração de 3 μM, foi suplementado durante a Etapa 1 de infecção e ambos os títulos em DRP/ml e PFU/ml estavam abaixo do limite de detecção.

[000124] Neste experimento, as células V27 foram semeadas em placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço. A solução de infecção de HSV 2x foi preparada como se segue: o estoque de HSV-1 d27.1 foi adicionado ao DMEM (sem FBS) em 2x o título que as células seriam infectadas em MOI final 0,15. Diversas combinações de solução de 2xATA foram preparadas contendo 100 μM ou 40 μM de ATA em DMEM e sem FBS ou com 20% de FBS.

[000125] A solução de infecção de HSV 2x foi misturada volumes iguais de DMEM -/+ 20% de FBS ou solução desejada de 2xATA -/+ 20% de FBS, redemoinhada, e 1 ml de inóculo infeccioso por poço foi adicionado na Etapa 1. Se os poços contivessem ATA na Etapa 1, a concentração seria 50 μM e todos os poços seriam incubados por 1-2 h. Na Etapa 2, 1,5 ml adicional das combinações de DMEM -/+ 40 μM de ATA e -/+ 20% de FBS foram adicionados. Se os poços contivessem o ATA na Etapa 1 ou na Etapa 2, a concentração final de ATA seria 20 μM. As placas foram retornadas para a incubadora por 70-74 horas, após cujo tempo o meio livre foi coletado, redemoinhado, e centrifugado a 1.100 x g por 10 minutos, a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo distribuidor, redemoinhados, divididos em alíquotas e os estoques foram congelados a -80°C.

Exemplo 3 Importância da Presença de Soro no Protocolo de ATA-HSV

[000126] Foram conduzidos experimentos adicionais para determinar as condições ótimas e o efeito da presença ou da ausência do FBS sobre o título de HSV. A presença de soro, especificamente, 10% de soro bovino fetal (FBS), no meio contendo o ATA foi o parâmetro mais importante para a produção de título de HSV-1 induzido pelo ATA. Uma su- plementação de ATA no meio sem soro, durante a etapa de diluição (ATA na Etapa 2), causou a redução do título de vírus, onde o título de "DRP" foi reduzido abaixo do nível de controle e o título como PFU/ml estava abaixo da detecção (Figura 3). Um efeito ainda mais dramático no meio sem soro foi visto quando o ATA, começando em concentração de 3 μM, foi suplementado durante a Etapa 1 de infecção (dados não mostrados) e ambos os títulos em DRP/ml e PFU/ml estavam abaixo do limite de detecção.

[000127] Neste experimento, as células V27 foram semeadas em placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço. A solução de infecção de HSV 2x foi preparada como se segue: o estoque de HSV-1 d27.1 foi adicionado ao DMEM (sem FBS) em 2x o título que as células seriam infectadas em MOI final 0,15. Diversas combinações de solução de 2x ATA foram preparadas contendo 100 μM ou 40 μM de ATA em DMEM e sem FBS ou com 20% de FBS. A solução de infecção de HSV 2x foi misturada volumes iguais de DMEM -/+ 20% de FBS ou solução desejada de 2xATA -/+ 20% de FBS, redemoinhada, e 1 ml de inóculo infeccioso por poço foi adicionado na Etapa 1. Se os poços contivessem ATA na Etapa 1, a concentração seria 50 μM e todos os poços seriam incubados por 1-2 h. Na Etapa 2, 1,5 ml adicional das combinações de DMEM -/+ 40 uM de ATA e -/+ 20% de FBS foram adicionados. Se os poços contivessem o ATA na Etapa 1 ou na Etapa 2, a concentração final de ATA seria 20 μM. As placas foram retornadas para a incubadora por 70-74 horas, após cujo tempo o meio livre foi coletado, redemoinhado, e centrifugado a 1.100 x g por 10 minutos, a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos para um novo tubo distribuidor, redemoinhados, divididos em alíquotas e os estoques foram congelados a - 80°C.

Exemplo 4 Efeito do ATA sobre os Títulos de HSV do Tipo Selvagem na Cultura

[000128] A Figura 4A mostra os títulos de sobrenadante de ambas as cepas de wtHSV-1, KOS e McIntyre, nas linhagens celulares tolerantes à propagação de wtHSV-1: células 293, células HeLa e Vero, as cepas de wtHSV-1 KOS e McIntyre foram propagadas nas células 293, HeLa e Vero usando o Protocolo de ATA-HSV, onde 50 μM de ATA foram adicionados na Etapa 1 e a concentração final após a Etapa 2 foi diluída para 20 μM de ATA. Os sobrenadantes contendo o vírus foram coletados após três dias, conforme descrito acima. O ATA aumentou a produção de ambos os tipos de vírus nas células Vero. A cepa de wtHSV-1 McIntyre atingiu os maiores títulos após a indução pelo ATA nas células 293, entretanto, o ATA pareceu inibir o crescimento do HSV-1 KOS nas células 293. Finalmente, o ATA também pareceu inibir ambos os tipos dos vírus HSV-1 nas células HeLa. ANOVA bidirecional; teste de Bon- ferroni; - ATA vs. + ATA; ***: p<0,01, ns: p>0,05; n = 4 experimentos independentes.

[000129] Para os cálculos estatísticos, foi conduzido um estudo maior com um grupo de dez experimentos independentes (n = 10) em placas de 6 poços, com ou sem o ATA adicionado, durante a etapa de infecção (Etapa 1), comparando d27-GFP deficiente na replicação e também a cepa de wtHSV-1 McIntyre para investigar se o ATA poderia aumentar o título na cepa de wtHSV-1 também (Figura 4B). O ATA foi adicionado a 50 mM às monocamadas de células confluentes, células V27 para d27-1 ou células 293 para wtHSV-1 McIntyre, durante a etapa de infecção (Etapa 1), e as células foram infectadas com os vetores em MOI = 0,15, ao mesmo tempo que o ATA foi diluído 1 h posteriormente até uma concentração final de 20 mM. Após a adição do ATA, o título de d27-1 significativamente aumentou 6,1 vezes de 5,4 x 107 DRP/ml ou 1,1 x 108 DRP/ml (**P<0.01) e o wtHSV-1 McIntyre significativamente aumentou 9,1 vezes de 3,3 x108 DRP/ml ou 1,0 x109 DRP/ml (***P<0.001), como analisado por ANOVA bidirecional e teste de Bonferroni (Figura 4B).

Exemplo 5 Efeito do ATA nos Estoques de HSV sobre a Produção dos Vírions de rAAV

[000130] Para determinar se a presença de ATA durante a produção de HSV impactaria a produção de vírions de rAAV produzidos usando os vetores de HSV, o experimento a seguir foi efetuado mostrando os títulos de rAAV afetados pelo resíduo de ATA presente dos estoques de rHSV-1 produzidos em células 293 (Figura 5A). O vetor de rAAV-GFP foi produzido por coinfecção dos vetores de rHSV-rep2/cap2 e rHSV- EGFP nas células 293, placas de 60 mm, usando estoques de rHSV-1 contendo ATA preparados sob diferentes concentrações de ATA (12 μM ou 20 μM de f.c.) (ver Material e Métodos). O título de rAAV em DRP/ml foi ligeiramente aumentado em 1,3 vez quando se utilizou o estoque de rHSV-rep2/cap2, que foi preparado com 20 μM de ATA adicionados durante a infecção (ATA Etapa 1) versus o Controle "Sem ATA" (*p<0,05), onde a concentração de ATA durante a produção de rAAV era aproximadamente 3 μM. Nenhum aumento de título de rAAV significativo foi detectado quando se utilizou o estoque de rHSV-rep2/cap2 que foi preparado com 12 μM de ATA (Figura 5A). ANOVA unidirecional; teste de Tukey:*p<0,05; 20 μM de ATA vs. Sem ATA; n=4 experimentos independentes.

[000131] Em outro experimento, o ATA foi mostrado aumentar o título de rAAV quando 10 μM de ATA foram introduzidos no meio de células 293, durante 2 h da etapa de coinfecção com rHSV-rep2/cap2 e rHSV- EGFP. Este efeito não foi observado quando as concentrações de ATA eram maiores do que 20 μM (Figura 5B).

Exemplo 6 Mecanismo de Ação do ATA

[000132] Para esclarecer o mecanismo de ação do ATA por arranjo de genoma humano e o fato que Vero e V27 são linhagens celulares derivadas do macaco, a propagação de wtHSV- foi testada em diversas linhagens celulares humanas (Figuras 4A-4B). Uma propagação de duas cepas de HSV-1 do tipo selvagem (wtHSV-1), KOS e McIntyre, foi comparada em três linhagens celulares: 293 do rim embriônico humano (células 293), células do câncer cervical humano HeLa e células Vero epi- teliais do rim de macacos verdes africanos. Os experimentos foram realizados em meio contendo 10% de FBS seguindo o esquema de protocolo de ATA I, onde 50 μM de ATA foram suplementados durante a etapa de infecção e adicionalmente diluídos para concentração de 20 μM de ATA (ver Material e Métodos). Nas células 293 derivadas de seres humanos, somente o título do vírus wtHSV-1 McIntyre aumentou significativamente pelo ATA, de 1,4x108 DRP/ml para 1,2 x109 DRP/ml (***p<0.001). Nas células Vero, o ATA significativamente aumentou os títulos somente na cepa de wtHSV-1 KOS de 1,7x108 DRP/ml até 9,1x108 DRP/ml (***p<0,001; ambas as estatísticas: ANOVA bidirecional, teste de Bonferroni; n=4). Surpreendentemente, nas células HeLa, o ATA semeado inibiu a propagação de ambas as cepas de HSV-1 KOS e McIntyre.

[000133] Para identificar as assinaturas genéticas de resposta das células à infecção por wtHSV-1 McIntyre, o perfil transcricional foi feito usando o Arranjo U133 Plus 2.0 Humano Affymetrix com as células 293, que foram falso tratadas, tratadas com ATA (ATA), infectadas com wtHSV-1 McIntyre (HSV) ou tratadas com ATA e infectadas com wtHSV- 1 McIntyre (HSV&ATA), por 24 h. As alterações da expressão do gene induzidas por infecção ou tratamento com ATA foram identificadas referindo o nível de expressão do gene para cada sonda àquele correspondendo na amostra de células não infectadas. A infecção por HSV-1 sozinha teve forte impacto sobre o perfil de expressão do gene das células 293, quando comparado com o perfil de gene das células não tratadas.

[000134] Primeiro, uma etapa de filtração foi aplicada para remover a expressão baixa e, das 54.675 sondas totais Affy U133 Plus 2, 41.569 (76%) sondas permaneceram após o corte. A Análise do Componente Determinante revelou duas populações distintas, amostras tratadas com e sem HSV. A ANOVA foi efetuada para encontrar transcritos diferenciais significativos entre HSV versus Veículo, ATA versus Veículo, HSV+AVA versus Veículo, e HSV+ATA versus HSV sozinho. Os genes significativos foram considerados menos do que um valor de p de 0,01. Um mapa auto-organizado foi usado para examinar os padrões de expressão entre Veículo, HSV1, e HSV1+ATA. Um aglomerado distinto de genes foi encontrado, Aglomerado A e B (Tabelas 1 e 2), que mostrou alterações nos perfis transcricionais causadas por HSV-1 e a sua correção por ATA que levou estes genes de volta para a linha de base de veículo.

[000135] As funções biológicas destes aglomerados foram analisadas no GeneCo. O Aglomerado A (Tabela 2) representou 58 sondas que mostraram suprarregulação em HSV-1 e supressão após a adição de ATA. Estes genes estavam principalmente envolvidos na sinalização inflamatória de IgE e IFN, e na resposta imune geral. O Aglomerado B (Tabela 1) representou 152 sondas que mostraram infrarregulação por HSV-1 e suprarregulação por ATA subsequente, levando-os de volta para a linha de base de veículo. Os genes neste aglomerado estavam principalmente envolvidos no ciclo celular G1/S, transdução de sinal em PTEN, e desen-volvimento de WNT. Por exemplo, o ATA na presença de HSV-1 suprar- regulou os genes CDC25A, CDKN1A, CDKN1C, CCNK, CNNM2 das vias de progressão do ciclo celular e os genes da via de Ras/Raf/MEK, tais como FOXC1, FOXD3, FOXO3 (ver, a Tabela 1).

[000136] As Tabelas 3A e 3B mostram a redução da expressão de nNOS, iNOS e eNOS nas amostras de HSV com ATA, como analisada pelo Arranjo Affymetrix Gen e redução da expressão de iNOS nas amostras de HSV + ATA, como analisadas pelo Microarranjo de SAB Jak-Stat RT-PCR da Qiagene.

Exemplo 7 Efeito da Dexametasona sobre as Produções de HSV

[000137] Para determinar se o inibidor de iNOS dexametasona também aumentaria as produções de rHSV na cultura, o experimento a seguir foi conduzido (Figura 6). Mostra o efeito da dexametasona (Dex) sobre o título viral de d27-1/GFP HSV-1. Os títulos finais de d27-1/GFP HSV-1 foram, em geral, ligeiramente elevados após os pré-tratamentos ou os tratamentos com dex, em comparação com o controle não tratado.

[000138] As células V27 foram semeadas em placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço, e no dia seguinte, concentrações diferentes de dexametasona (dex) foram adicionadas aos poços antes da infecção com HSV-1 (pré-tratar) ou durante a infecção (tratar) em 2/5 do vol de meio de DMEM-10% de FBS. Após 1-2 horas de incubação a 37oC, 3/5 do vol. de DMEM-10% de FBS foi adicionado. As culturas foram retornadas para a incubadora e o sobrenadante foi coletado após 70-74 horas. Os dados são mostrados como Valor médio dos títulos ± D.P. em pfu/ml (n=2).

Exemplo 8 Efeito do Ácido Valproico sobre as Produções de HSV

[000139] Para determinar se o inibidor da iNOS ácido valproico também aumentaria as produções de rHSV na cultura, foi conduzido o seguinte experimento. A Figura 7 mostra o efeito do pré-tratamento pelo ácido valproico (VA) sobre o título viral de d27-1/GFP HSV-1. O VA em concentração de 5 mM elevou ligeiramente o título de d27-1/GFP HSV- 1, entretanto, as concentrações abaixo e acima de 5 mM pareceram ter um efeito inibidor sobre o título de d27-1/GFP HSV-1, em comparação com o controle não tratado.

[000140] As células V27 foram semeadas em placas de seis poços no dia antes da infecção, a 6x105 células/poço, e no dia seguinte, concentrações diferentes de VA foram adicionadas aos poços. As placas foram incubadas por 6 h, aspiradas e 2/5 do volume de meio contendo estoque de HSV-1 d27-1 infeccioso foi adicionado e incubado por 1-2 horas, a 37°C, após cujo tempo 3/5 do volume de meio DMEM 10% de FBS foi adicionado. As culturas foram retornadas para a incubadora e o sobre- nadante foi coletado após 70-74 horas.

[000141] Conforme mostrado nos exemplos precedentes, o ATA em concentrações micromolares aumenta a produção do vetor de HSV-1. Esta descoberta é importante tanto para a produção de HSV em grande escala, quanto para a produção de vetor de rHSV e rAAV. Além disso, e surpreendentemente, a presença de ATA nos estoques de rHSV-1 não influenciou negativamente a produção de rAAV. Este resultado é surpreendente visto que se sabe que o ATA, em quantidades milimolares e em concentrações mais elevadas, é um agente antiviral (Cushman e col., J. Med. Chem. (1991) 34:329-337; Zhang e col., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap e col., Computational Biol. and Chem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160). No meio sem soro, os inventores também observaram um efeito antiviral possível do ATA em concentrações micro- molares, porém não na presença de soro (10% de FBS).

[000142] Conforme mostrado neste documento, o tratamento com o ATA retardou a formação de placas de HSV-1 e a lise celular nas mo- nocamadas de células V27 e o efeito citopático (CPE), o que evidencia as propriedades antiapoptóticas. O mecanismo de ação do ATA no aumento da produção de HSV-1 parece envolver alterações nos fatores requeridos para a produção de HSV-1 e redução da resposta imune antiviral natural celular, responsável por uma depuração viral. A partir da análise do Arranjo de Genoma Humano acima mencionado, foi desco-berto que a infecção por HSV-1 sozinha tem forte impacto sobre o perfil de expressão do gene das células 293 e o efeito do ATA foi predominantemente observado nas células tratadas tanto com HSV-1 quanto com ATA. Os genes envolvidos no ciclo celular G1/S, na transdução de sinal em PTEN, e no desenvolvimento de WNT foram significativamente infrarregulados pelo HSV-1 e suprarregulados após a adição do ATA.

[000143] Os genes principalmente envolvidos na sinalização inflamatória de IgE e IFN, e na resposta imune geral foram suprarregulados pelo HSV-1 e suprimidos após a adição do ATA. Na presença de HSV- 1, o ATA suprarregulou os genes CDC25A, CDKN1A, CDKN1C, CCNK, CNNM2 das vias de progressão do ciclo celular e os genes da via de Ras/Raf/MEK, incluindo FOXC1, FOXD3, FOXO3.

[000144] A descoberta que o ATA pode aumentar a produção de HSV- 1 é importante por causa da necessidade de maiores produções de vetores de HSV-1 para a produção em grande escala para a terapia do gene e outras aplicações.

[000145] Desse modo, são descritos métodos para aumentar as produções virais usando inibidores da iNOS. Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido descritas em algum detalhe, entende-se que variações óbvias podem ser feitas, sem sair do espírito e do escopo da invenção, como definida neste documento.

Claims (4)

1. Método para cultivar um vetor de HSV-1 d27.1, caracteri-zado pelo fato de que compreende: (a) infectar as células V27 com um vetor de HSV-1 d27.1; e (b) cultivar as ditas células V27 infectadas em uma cultura de células compreendendo o ácido aurintricarboxílico a uma concentra-ção de 10 μM a 60 μM, o ácido valproico a uma concentração de cerca de 5 mM, ou a dexametasona a uma concentração de 0,1 μM a 100 μM.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura de células compreende o ácido aurintricarbo- xílico.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que a dita cultura de células adicionalmente compre-ende o soro.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o soro é o soro bovino fetal.

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