RU2676733C2 - Использование ингибиторов inos для повышения урожая вирусов в культуре - Google Patents
Использование ингибиторов inos для повышения урожая вирусов в культуре Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676733C2 RU2676733C2 RU2015133205A RU2015133205A RU2676733C2 RU 2676733 C2 RU2676733 C2 RU 2676733C2 RU 2015133205 A RU2015133205 A RU 2015133205A RU 2015133205 A RU2015133205 A RU 2015133205A RU 2676733 C2 RU2676733 C2 RU 2676733C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsv
- atk
- cells
- virus
- aav
- Prior art date
Links
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title abstract description 24
- 101100396994 Drosophila melanogaster Inos gene Proteins 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N aurintricarboxylic acid Chemical compound C1=CC(=O)C(C(=O)O)=CC1=C(C=1C=C(C(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 GIXWDMTZECRIJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims abstract description 25
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 131
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 113
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 75
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 64
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 46
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 abstract description 45
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 abstract description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 102100029823 Tyrosine-protein kinase BTK Human genes 0.000 description 168
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 111
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 82
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 76
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 52
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 28
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 22
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 10
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 101710130522 mRNA export factor Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 8
- 102100022397 Nitric oxide synthase, brain Human genes 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 101150014715 CAP2 gene Proteins 0.000 description 6
- 101100326803 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-2 gene Proteins 0.000 description 6
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 description 6
- 102100031227 Protein Dr1 Human genes 0.000 description 6
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 101150056293 AJUBA gene Proteins 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 description 4
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 4
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 description 4
- 108010008858 Nitric Oxide Synthase Type I Proteins 0.000 description 4
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 4
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 4
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 4
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000001805 Bromodomains Human genes 0.000 description 3
- 108050009021 Bromodomains Proteins 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 102100036876 Cyclin-K Human genes 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010009307 Forkhead Box Protein O3 Proteins 0.000 description 3
- 102100035421 Forkhead box protein O3 Human genes 0.000 description 3
- 101000713127 Homo sapiens Cyclin-K Proteins 0.000 description 3
- 101000624625 Homo sapiens M-phase inducer phosphatase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000993455 Homo sapiens Metal transporter CNNM2 Proteins 0.000 description 3
- 241001546602 Horismenus Species 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 101710156592 Putative TATA-binding protein pB263R Proteins 0.000 description 3
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 108010038305 down-regulator of transcription 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 2
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100033641 Bromodomain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010092681 DNA Primase Proteins 0.000 description 2
- 102000016559 DNA Primase Human genes 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102100030012 Deoxyribonuclease-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021084 Forkhead box protein C1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000871850 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000818310 Homo sapiens Forkhead box protein C1 Proteins 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101001128156 Homo sapiens Nanos homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 101001124309 Homo sapiens Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 2
- 101001121610 Homo sapiens Nuclear envelope pore membrane protein POM 121C Proteins 0.000 description 2
- 101000700733 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000701845 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 5-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000596771 Homo sapiens Transcription factor 7-like 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 2
- 101000801209 Homo sapiens Transducin-like enhancer protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150113031 Jag1 gene Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023326 M-phase inducer phosphatase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 2
- 102100025815 Nuclear envelope pore membrane protein POM 121C Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108010084438 Oncogene Protein v-maf Proteins 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 101150071808 PTHLH gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100032543 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN Human genes 0.000 description 2
- 108010066816 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100039685 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 Human genes 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 2
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100030410 Spermatogenesis-associated protein 5-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088184 T Cell Transcription Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102100030627 Transcription factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100035101 Transcription factor 7-like 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 2
- 102100033763 Transducin-like enhancer protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150085237 UL36 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150011902 UL52 gene Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 102000009543 guanyl-nucleotide exchange factor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026210 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 Human genes 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVBOROZXXYRWJL-UHFFFAOYSA-N 2-[(4-oxo-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=S)NC1=O SVBOROZXXYRWJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLWPKTDSDUQBFY-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(aminomethyl)-2,4-dioxo-1H-pyrimidin-5-yl]acetic acid Chemical compound C(=O)(O)CC=1C(NC(NC=1CN)=O)=O LLWPKTDSDUQBFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010543 22q11.2 deletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100036657 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 Human genes 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100020971 39S ribosomal protein L10, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100039776 39S ribosomal protein L4, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100024420 39S ribosomal protein S30, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 5-(methylaminomethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNCC1=CNC(=O)NC1=O MQJSSLBGAQJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 6-(aminomethyl)-5-methoxy-2-sulfanylidene-1H-pyrimidin-4-one Chemical compound COC=1C(NC(NC=1CN)=S)=O UDZRZGNQQSUDNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSPHKCOAUOJLIO-UHFFFAOYSA-N 6-(aziridin-1-ylamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound N1C(=O)N=CC=C1NN1CC1 HSPHKCOAUOJLIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 6-chloropyridine-3,4-diamine Chemical compound NC1=CN=C(Cl)C=C1N OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWJYOKZMYFJUOY-KQYNXXCUSA-N 9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-(methylamino)-7h-purin-8-one Chemical compound OC1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SWJYOKZMYFJUOY-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 102100024768 ATP-dependent RNA helicase DDX50 Human genes 0.000 description 1
- 102100027166 Activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100036438 Amyloid beta precursor protein binding family B member 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 1
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 1
- 102100040359 Angiomotin-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000702760 Arabidopsis thaliana Cytosolic sulfotransferase 12 Proteins 0.000 description 1
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035683 Axin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 1
- 102100027955 BAG family molecular chaperone regulator 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100027360 BAH and coiled-coil domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091005625 BRD4 Proteins 0.000 description 1
- 102100040794 Beta-1 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100032850 Beta-1-syntrophin Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 102100029895 Bromodomain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000014836 CACNA1I Human genes 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038782 Carbohydrate sulfotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026679 Carboxypeptidase Q Human genes 0.000 description 1
- 102100024532 Cardiac-enriched FHL2-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037398 Casein kinase I isoform epsilon Human genes 0.000 description 1
- 102100040751 Casein kinase II subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100028914 Catenin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038737 Centrosomal protein of 131 kDa Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 102100030289 Chronophin Human genes 0.000 description 1
- 102100031552 Coactosin-like protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108010017222 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p57 Proteins 0.000 description 1
- 102000004480 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p57 Human genes 0.000 description 1
- 102100023263 Cyclin-dependent kinase 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100033270 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 101150026402 DBP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 102100024762 DNA-binding death effector domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036945 Dead end protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 102100036411 Dermatopontin Human genes 0.000 description 1
- 101710088341 Dermatopontin Proteins 0.000 description 1
- 208000000398 DiGeorge Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100037794 Diacylglycerol lipase-beta Human genes 0.000 description 1
- 101710114381 Diacylglycerol lipase-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100020751 Dipeptidyl peptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036039 Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032302 Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase NUDT4B Human genes 0.000 description 1
- 102100037573 Dual specificity protein phosphatase 12 Human genes 0.000 description 1
- 102100027088 Dual specificity protein phosphatase 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 102100030370 E3 ubiquitin-protein ligase Hakai Human genes 0.000 description 1
- 102100022199 E3 ubiquitin-protein ligase MIB2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022404 E3 ubiquitin-protein ligase Midline-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035493 E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like Human genes 0.000 description 1
- 102100028152 E3 ubiquitin-protein ligase RNF113A Human genes 0.000 description 1
- 102100027414 E3 ubiquitin-protein ligase RNF19B Human genes 0.000 description 1
- 102100037249 Egl nine homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150030061 Eloc gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010003751 Elongin Proteins 0.000 description 1
- 102000004662 Elongin Human genes 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036313 Forkhead box protein O3B Human genes 0.000 description 1
- 102100039676 Frizzled-7 Human genes 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000887167 Gallus gallus Gallinacin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000887235 Gallus gallus Gallinacin-9 Proteins 0.000 description 1
- 241001556449 Garrha rubella Species 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000015626 Glucagon-Like Peptide-2 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010024044 Glucagon-Like Peptide-2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100033807 Glycoprotein hormone beta-5 Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150035982 Habp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035961 Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Human genes 0.000 description 1
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102100030339 Homeobox protein Hox-A10 Human genes 0.000 description 1
- 102100030308 Homeobox protein Hox-A11 Human genes 0.000 description 1
- 102100028707 Homeobox protein MSX-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040615 Homeobox protein MSX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035081 Homeobox protein TGIF1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000691589 Homo sapiens 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001136696 Homo sapiens 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000854440 Homo sapiens 39S ribosomal protein L10, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000667416 Homo sapiens 39S ribosomal protein L4, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000689854 Homo sapiens 39S ribosomal protein S30, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000830424 Homo sapiens ATP-dependent RNA helicase DDX50 Proteins 0.000 description 1
- 101000836967 Homo sapiens Activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000928680 Homo sapiens Amyloid beta precursor protein binding family B member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000891151 Homo sapiens Angiomotin-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000895049 Homo sapiens Antizyme inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000697866 Homo sapiens BAG family molecular chaperone regulator 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000937836 Homo sapiens BAH and coiled-coil domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000892264 Homo sapiens Beta-1 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000868444 Homo sapiens Beta-1-syntrophin Proteins 0.000 description 1
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000883008 Homo sapiens Carbohydrate sulfotransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910846 Homo sapiens Carboxypeptidase Q Proteins 0.000 description 1
- 101000981085 Homo sapiens Cardiac-enriched FHL2-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101001026376 Homo sapiens Casein kinase I isoform epsilon Proteins 0.000 description 1
- 101000892026 Homo sapiens Casein kinase II subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000946436 Homo sapiens Caseinolytic peptidase B protein homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000916173 Homo sapiens Catenin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000957451 Homo sapiens Centrosomal protein of 131 kDa Proteins 0.000 description 1
- 101000582974 Homo sapiens Chronophin Proteins 0.000 description 1
- 101000940352 Homo sapiens Coactosin-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000908138 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000944380 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000830366 Homo sapiens DNA-binding death effector domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000950194 Homo sapiens Dead end protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000595333 Homo sapiens Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000590225 Homo sapiens Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase NUDT4B Proteins 0.000 description 1
- 101000924017 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000881110 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101001057612 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001083405 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase Hakai Proteins 0.000 description 1
- 101000973495 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase MIB2 Proteins 0.000 description 1
- 101000680670 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase Midline-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001023703 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like Proteins 0.000 description 1
- 101001079154 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF113A Proteins 0.000 description 1
- 101000881648 Homo sapiens Egl nine homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000930963 Homo sapiens Forkhead box protein O3B Proteins 0.000 description 1
- 101000885797 Homo sapiens Frizzled-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001069255 Homo sapiens Glycoprotein hormone beta-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001021503 Homo sapiens Hematopoietically-expressed homeobox protein HHEX Proteins 0.000 description 1
- 101000654725 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Proteins 0.000 description 1
- 101001083164 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A10 Proteins 0.000 description 1
- 101001083158 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A11 Proteins 0.000 description 1
- 101000985653 Homo sapiens Homeobox protein MSX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000967222 Homo sapiens Homeobox protein MSX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000632186 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 1
- 101000596925 Homo sapiens Homeobox protein TGIF1 Proteins 0.000 description 1
- 101001001478 Homo sapiens Importin subunit alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001006895 Homo sapiens Krueppel-like factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001139130 Homo sapiens Krueppel-like factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001039113 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing protein 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000957756 Homo sapiens Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000578877 Homo sapiens Mid1-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000655000 Homo sapiens Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim29 Proteins 0.000 description 1
- 101001052477 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001128132 Homo sapiens NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001128158 Homo sapiens Nanos homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000577163 Homo sapiens Neurogenic locus notch homolog protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001124991 Homo sapiens Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 101001121613 Homo sapiens Nuclear envelope pore membrane protein POM 121 Proteins 0.000 description 1
- 101001121654 Homo sapiens Nuclear pore complex protein Nup50 Proteins 0.000 description 1
- 101000836620 Homo sapiens Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Proteins 0.000 description 1
- 101000585675 Homo sapiens Obscurin Proteins 0.000 description 1
- 101001123300 Homo sapiens PR domain zinc finger protein 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000651908 Homo sapiens Paired amphipathic helix protein Sin3b Proteins 0.000 description 1
- 101000825940 Homo sapiens Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000730493 Homo sapiens Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D Proteins 0.000 description 1
- 101000609264 Homo sapiens Polyadenylate-binding protein-interacting protein 2B Proteins 0.000 description 1
- 101000728236 Homo sapiens Polycomb group protein ASXL1 Proteins 0.000 description 1
- 101001122792 Homo sapiens Pre-mRNA-splicing factor 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000580748 Homo sapiens Pre-mRNA-splicing factor RBM22 Proteins 0.000 description 1
- 101000611614 Homo sapiens Proline-rich protein PRCC Proteins 0.000 description 1
- 101000881943 Homo sapiens Protein EURL homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000944810 Homo sapiens Protein KTI12 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001129345 Homo sapiens Protein O-linked-mannose beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001072191 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase A2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599464 Homo sapiens Protein phosphatase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000835739 Homo sapiens Putative teratocarcinoma-derived growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000959153 Homo sapiens RNA demethylase ALKBH5 Proteins 0.000 description 1
- 101000629826 Homo sapiens RNA-binding E3 ubiquitin-protein ligase MEX3C Proteins 0.000 description 1
- 101001062098 Homo sapiens RNA-binding protein 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000580716 Homo sapiens RNA-binding protein 24 Proteins 0.000 description 1
- 101001110312 Homo sapiens Ras-associating and dilute domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 101000677113 Homo sapiens Ras-like protein family member 10B Proteins 0.000 description 1
- 101000752221 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000637798 Homo sapiens SH3 domain and tetratricopeptide repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101001001645 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase pim-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000813777 Homo sapiens Splicing factor ESS-2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000890836 Homo sapiens TRAF3-interacting JNK-activating modulator Proteins 0.000 description 1
- 101000633627 Homo sapiens Teashirt homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000825086 Homo sapiens Transcription factor SOX-11 Proteins 0.000 description 1
- 101000687911 Homo sapiens Transcription factor SOX-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000595534 Homo sapiens Transforming growth factor beta regulator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000635938 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 proprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000655155 Homo sapiens Transmembrane protein 158 Proteins 0.000 description 1
- 101000766332 Homo sapiens Tribbles homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000788517 Homo sapiens Tubulin beta-2A chain Proteins 0.000 description 1
- 101000835646 Homo sapiens Tubulin beta-2B chain Proteins 0.000 description 1
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000875780 Homo sapiens Ubiquinone biosynthesis protein COQ4 homolog, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000941707 Homo sapiens Uncharacterized protein C15orf39 Proteins 0.000 description 1
- 101000894576 Homo sapiens Uncharacterized protein C20orf96 Proteins 0.000 description 1
- 101000922093 Homo sapiens Uncharacterized protein C21orf58 Proteins 0.000 description 1
- 101000583031 Homo sapiens Unconventional myosin-Va Proteins 0.000 description 1
- 101000644174 Homo sapiens Uridine phosphorylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 101000932785 Homo sapiens Voltage-dependent T-type calcium channel subunit alpha-1I Proteins 0.000 description 1
- 101000868391 Homo sapiens Voltage-dependent calcium channel gamma-6 subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000666519 Homo sapiens Xaa-Pro aminopeptidase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788773 Homo sapiens Zinc finger and BTB domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000744919 Homo sapiens Zinc finger protein 503 Proteins 0.000 description 1
- 101000760268 Homo sapiens Zinc finger protein 581 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701041 Human betaherpesvirus 7 Species 0.000 description 1
- 241000578472 Human endogenous retrovirus H Species 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 101100508081 Human herpesvirus 1 (strain 17) ICP34.5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700326 Human herpesvirus 1 strain KOS Species 0.000 description 1
- 241000701068 Human herpesvirus 2 strain 333 Species 0.000 description 1
- 241000701069 Human herpesvirus 2 strain G Species 0.000 description 1
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100036188 Importin subunit alpha-3 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100039227 Intracellular hyaluronan-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710205872 Intracellular hyaluronan-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101150015758 Jam3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100027797 Krueppel-like factor 11 Human genes 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100020680 Krueppel-like factor 5 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150104000 LASP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035118 LIM and SH3 domain protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040645 Leucine-rich repeat-containing protein 15 Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100034069 MAP kinase-activated protein kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010041955 MAP-kinase-activated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150083929 MIB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100031677 Metal transporter CNNM2 Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100038615 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028338 Mid1-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100032536 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim29 Human genes 0.000 description 1
- 102100024189 Mitogen-activated protein kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100030608 Mothers against decapentaplegic homolog 7 Human genes 0.000 description 1
- 101150118570 Msx2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101000608766 Mus musculus Galectin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101100286114 Mus musculus Hoxa11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100399479 Mus musculus Lmln gene Proteins 0.000 description 1
- 101100264027 Mus musculus Whamm gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038379 Myogenic factor 6 Human genes 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTWVQPHTOUKMDI-YFKPBYRVSA-N N-Methyl-arginine Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NTWVQPHTOUKMDI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100031902 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100025254 Neurogenic locus notch homolog protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000005665 Neurotransmitter Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010084810 Neurotransmitter Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 1
- 101150100944 Nos2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025812 Nuclear envelope pore membrane protein POM 121 Human genes 0.000 description 1
- 102100025447 Nuclear pore complex protein Nup50 Human genes 0.000 description 1
- 102100027051 Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030127 Obscurin Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000016978 Orphan receptors Human genes 0.000 description 1
- 108070000031 Orphan receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000025443 POZ domain binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091014659 POZ domain binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028973 PR domain zinc finger protein 13 Human genes 0.000 description 1
- 108091093018 PVT1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027333 Paired amphipathic helix protein Sin3b Human genes 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 102100022771 Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032538 Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 102100035846 Pigment epithelium-derived factor Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100039438 Polyadenylate-binding protein-interacting protein 2B Human genes 0.000 description 1
- 102100029799 Polycomb group protein ASXL1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 102100027481 Pre-mRNA-splicing factor RBM22 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040829 Proline-rich protein PRCC Human genes 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101800001065 Protein 2B Proteins 0.000 description 1
- 101710132457 Protein A1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037083 Protein EURL homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100033702 Protein KTI12 homolog Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 102100031305 Protein O-linked-mannose beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010059000 Protein Phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005569 Protein Phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100036351 Protein disulfide-isomerase A2 Human genes 0.000 description 1
- 101710092489 Protein kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037976 Protein phosphatase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 102100036286 Purine nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 102100026407 Putative teratocarcinoma-derived growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101150027249 RL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102100039083 RNA demethylase ALKBH5 Human genes 0.000 description 1
- 102100026872 RNA-binding E3 ubiquitin-protein ligase MEX3C Human genes 0.000 description 1
- 102100029250 RNA-binding protein 14 Human genes 0.000 description 1
- 102100027487 RNA-binding protein 24 Human genes 0.000 description 1
- 108091007336 RNF19B Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102100022126 Ras-associating and dilute domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 102100021578 Ras-like protein family member 10B Human genes 0.000 description 1
- 101100030250 Rattus norvegicus Pom121 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 102100023916 Retinol dehydrogenase 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710178628 Retinol dehydrogenase 11 Proteins 0.000 description 1
- 108010053823 Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100021707 Rho guanine nucleotide exchange factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 101150068862 Rnf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 102100032027 SH3 domain and tetratricopeptide repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005041 SLC6A8 Human genes 0.000 description 1
- 101700026522 SMAD7 Proteins 0.000 description 1
- 101000850528 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) V-type proton ATPase subunit c Proteins 0.000 description 1
- 102100029289 Serine/arginine-rich splicing factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036119 Serine/threonine-protein kinase pim-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150004321 Srgap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108090000030 T-Type Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003691 T-Type Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000925 TNF receptor-associated factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004399 TNF receptor-associated factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000922 TNF receptor-associated factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034779 TRAF family member-associated NF-kappa-B activator Human genes 0.000 description 1
- 102100040128 TRAF3-interacting JNK-activating modulator Human genes 0.000 description 1
- 102000003570 TRPV5 Human genes 0.000 description 1
- 102100029218 Teashirt homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000019347 Tob1 Human genes 0.000 description 1
- 108700038377 Tob1 Proteins 0.000 description 1
- 101150041680 Tob1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100022415 Transcription factor SOX-11 Human genes 0.000 description 1
- 102100024276 Transcription factor SOX-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036078 Transforming growth factor beta regulator 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030742 Transforming growth factor beta-1 proprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100033036 Transmembrane protein 158 Human genes 0.000 description 1
- 102100026387 Tribbles homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150034091 Trpv5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025225 Tubulin beta-2A chain Human genes 0.000 description 1
- 102100026248 Tubulin beta-2B chain Human genes 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1O[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035953 Ubiquinone biosynthesis protein COQ4 homolog, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100031458 Uncharacterized protein C15orf39 Human genes 0.000 description 1
- 102100021438 Uncharacterized protein C20orf96 Human genes 0.000 description 1
- 102100031105 Uncharacterized protein C21orf58 Human genes 0.000 description 1
- 102100030409 Unconventional myosin-Va Human genes 0.000 description 1
- 102100020892 Uridine phosphorylase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032335 Voltage-dependent calcium channel gamma-8 subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100036048 WASP homolog-associated protein with actin, membranes and microtubules Human genes 0.000 description 1
- 101710119258 WASP homolog-associated protein with actin, membranes and microtubules Proteins 0.000 description 1
- 101150035359 Wbp11 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 102100037103 Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710201035 Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038359 Xaa-Pro aminopeptidase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101150095329 Zfand5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025350 Zinc finger and BTB domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100039962 Zinc finger protein 503 Human genes 0.000 description 1
- 102100024712 Zinc finger protein 581 Human genes 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- FUASJQSBFUVWJQ-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=N Chemical compound [N].NC(N)=N FUASJQSBFUVWJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M amino sulfate Chemical compound NOS([O-])(=O)=O DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002032 cellular defenses Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 108010007169 creatine transporter Proteins 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150025771 cxxc4 gene Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 101150075618 foxd3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108040001860 guanyl-nucleotide exchange factor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 1
- 208000022013 kidney Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 108010084677 myogenic factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 108010009099 nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010025647 phosphate-binding proteolipid Proteins 0.000 description 1
- UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N phosphorine Chemical compound C1=CC=PC=C1 UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108090000102 pigment epithelium-derived factor Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 102000028499 poly(A) binding Human genes 0.000 description 1
- 108091023021 poly(A) binding Proteins 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102000007268 rho GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940084026 sodium valproate Drugs 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005029 transcription elongation Effects 0.000 description 1
- 238000012085 transcriptional profiling Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Представленное изобретение относится к способу получения вируса герпеса, включающему культивирование клетки, инфицированной указанным вирусом герпеса, в культуре клеток, которая содержит ауринтрикарбоновую кислоту и эмбриональную телячью сыворотку. Изобретения также относятся к способу культивирования клетки и к применению ауринтрикарбоновой кислоты. Изобретения позволяют использовать ингибитор iNOS - ауринтрикарбоновую кислоту для повышения урожая вируса герпеса в культуре клеток и могут быть использованы в медицинской промышленности. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 7 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение, в общем, относится к способам для получения вирусов и рекомбинантных вирионов в культуре. В частности, изобретение относится к использованию ингибиторов iNOS, таких как ауринтрикарбоновая кислота, дексаметазон и вальпроевая кислота для увеличения урожая различных вирусов в культуре, включая рекомбинантные герпесвирусы, которые, в свою очередь, можно использовать в качестве вирусов-помощников для выработки вирионов рекомбинантного аденоассоциированного вируса.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Герпесвирусы широко распространены в природе и встречаются у большинства видов животных. Охарактеризовано, по меньшей мере, сто герпесвирусов, в том числе несколько от людей, такие как вирус простого герпеса-1 (HSV-1) и вирус простого герпеса-2 (HSV-2), вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирус (CMV) и другие герпесвирусы человека, такие как HHV6 и HHV7. Эти вирусы несут ответственность за различные заболевания человека, такие как кожные инфекции, генитальный герпес, вирусный энцефалит и т.п.
Заражение HSV-1 активирует защитные силы организма и врожденный иммунный ответ за счет индуцирования внутриклеточных путей передачи сигнала, которые приводят к экспрессии белков с провоспалительными и противомикробными свойствами, включая цитокины и интерфероны (ИФ) (Sainz and Halford, J. Virol (2002) 76: 11541-11550; Haller et al., Virology (2006) 344: 119-130; Paludan et al., Nat. Rev. Immunol. (2011) 11: 143-154). Сигнальный путь интерферонов представляет собой один из наиболее важных механизмов клеточной защиты для элиминации вирусов (Brandner & Mueller, Hoppe-Seyler's Zeitschriftfur physiologische Chemie (1973) 354: 1176; De Vries et al., Gene Ther. (2008) 15:545-552).
Исследователи сообщают о противовирусной активности оксида азота (NO) против некоторых вирусов, таких как вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита, и вирус японского энцефалита, наряду с другими (Bi et al., J. Virol. (1995) 69:6466-6472; Harris et al., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin et al., Virol. (1997) 71:5227-5235; Pertile et al., Avian Dis. (1996) 40:342-348. NO представляет собой свободно радикальную газообразную молекулу и является медиатором иммунной системы организма (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91:2446-2452; Karupiah et al., Science (1993) 261:1445-1448; Rolph et al., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro et al., J. Med Virol. (1997) 51:326-331; Lane et al., J. Virol. (1997) 71:2202-2210. Известно, что HSV-1 способен, как вызывать противовирусные ответы организма, так и уклоняться от них (Mossman et al., J. Virol. (2001) 75:750-758). Заражение HSV способно вызывать экспрессию индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), гена, кодирующего индуцибельную изоформу NOS, которая производит большие количества NO.
Герпесвирусы и их рекомбинантные белки используют в производстве ряда вакцин. Помимо аденовирусов, было показано, что герпесвирусы полностью обеспечивают функции вируса-помощника для выработки вирионов рекомбинантного аденоассоциированного вируса (Buller, R.M.L., J. Virol. (1981) 40:241 -247; Mishra et al., Virology (1990) 179:632-639). Был установлен минимальный набор генов HSV-1, необходимый для репликации AAV и упаковки, включающий ранние гены UL5, UL8, UL52 и UL29 (Weindler et al., J. Virol. (1991) 65:2476-2483). Эти гены кодируют компоненты корового комплекса репликации HSV-1 - геликазу, праймазу и вспомогательные белки праймазы (UL5, UL8 и UL52) и белок, связывающий одноцепочечную ДНК (UL29).
Векторы на основе рекомбинантных AAV (rAAV) успешно применяют для получения высокого уровня длительной трансдукции in vivo. Несмотря на вышеперечисленные преимущества, производство больших количеств вирионов rAAV с высоким титром для клинического применения в генотерапии продолжает оставаться сложным из-за ограничений в масштабируемости протокола котрансфекции. Процесс требует эффективной клеточной доставки трех компонентов: (1) вектора, содержащего интересующий ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами AAV (ITR); (2) вектора, содержащего гены rep и cap AAV; и (3) генов, обеспечивающих использование вируса-помощника, такого как аденовирус или вирус простого герпеса или использование безвирусных хелперных плазмид (см., Muzyczka, N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1992) 158:97-129). Таким образом, в производственных протоколах rAAV на основе rHSV, урожай rAAV ограничен максимальным титром векторов-помощников rHSV.
Вектор с HSV-1, дефицитный по репликации, который называется d27.1-rc, экспрессирует гены rep и cap AAV (Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:986-993) и сконструирован из исходного вируса d27-1 (Рис at al., J. Virol. 1989 vol. 63 (8) pp. 3399-407), который не вырабатывает ICP27, белок, необходимый для репликации HSV-1.
Хотя этот вектор является дефицитным по репликации, он все же экспрессирует ранние гены HSV-1, необходимые для репликации и упаковки rAAV (Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:986-993).
Как правило, одним вектором, несущим матрицу rAAV и другим вектором, экспрессирующим регионы rep и cap AAV, совместно инфицируют клетки 293 для выработки вирионов rAAV. Оба вектора на основе HSV-1, являются дефицитными по репликации и, таким образом, могут размножаться только в линии клеток, дополненной ICP27, V27 (Рис at al., J. Virol. 1989 vol. 63 (8) pp. 3399-407). По протоколу выработки AAV на основе HSV, клетки 293 необходимо инфицировать HSV-1 с высокой множественностью заражения (MOI), равной 12. Это является ограничением, поскольку урожаи векторов-производных d27-1 в клетках V27 составляют, как правило, приблизительно 1×107 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл.
Были исследованы несколько способов и реагентов для того чтобы дополнительно повысить титры HSV-1 (see, e.g., Wechucket al., Biotechnol. Prog. (2000) 16:493-496; Ozuer et al., Biotechnol. Prog. (2002) 18:476-482; Erlandsson et al., J. Endocrinol, (2002) 175:165-176; Otsuki et al., Mol. Ther. (2008) 16:1546-1555).
Как дексаметазон, так и вальпроевая кислота ингибируют защитные механизмы организма, представленные несколькими интерферон (ИФН)-чувствительными противовирусными генами, повышают уровень транскрипции вирусных генов, и, таким образом, улучшают распространение вируса и урожай HSV-1 (Erlandsson et al., J. Endocrinol. (2002) 175:165-176; Otsuki et al., Mol. Ther. (2008) 16:1546-1555).
Несмотря на вышеизложенные знания, необходимы дополнительные способы для ингибирования иммунной системы с целью улучшения продукции вируса в культуре. Как упоминалось выше, исследователи сообщают о противовирусной активности оксида азота (NO) против некоторых вирусов, таких как вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита и вирус японского энцефалита, наряду с другими (Bi et al, J. Virol. (1995) 69:6466-6472; Harris et al., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin et al, J. Virol. (1997) 71:5227-5235; Pertile et al. Avian Dis. (1996) 40:342-348. NO представляет собой свободнорадикальную газообразную молекулу и является медиатором иммунной системы (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91:2446-2452; Karupiah et al., Science (1993) 261:1445-1448; Rolph et al., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro et al., J. Med. Virol. (1997) 51:326-331; Lane et al., J. Virol. (1997) 71:2202-2210). Как описано выше, инфекция HSV может вызывать экспрессию iNOS, гена, кодирующего индуцибельную изоформу NOS, которая производит большие количества NO.
Присутствие ингибитора iNOS, N-метил-L-аргинина (L-NMA), отменяет ингибирование репликации вирусов для всех этих трех вирусов (Karupiah et al. Science (1993) 261: 1445-1448). Для обзора ингибиторов iNOS, см. Southan et al,Biochem. Pharmacol. (1996) 51:383-394. Было показано, что другое соединение, ауринтрикарбоновая кислота (АТК), защищает макрофаги от гибели клеток, вызванной бактериальным липополисахаридом посредством подавления экспрессии iNOS, и, таким образом, снижения выработки NO (Chen et al., British Journal of Pharmacology (2002) vol. 137 (7) pp. 1011-20). АТК представляет собой гетерогенную смесь полимеров, которым приписывают все большее количество видов биологической активности, таких как взаимодействие с рядом ферментов, включая ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, обратную транскриптазу (РНК-зависимую ДНК-полимеразу), аминоацил-тРНК-синтетазу, рибонуклеотидредуктазу, нуклеазу рибонуклеаз, ингибирование синтеза белка, предотвращение апоптоза и блокирование фрагментации ДНК в олигодендроцитах, вызванное окислительным стрессом (Tscherne and Pestka, Antimicrob. Agents Chemother.(1975) 8:479-487; Mikelens et al., Biochemical Pharmacology (1976) 25:821-827; Vollgraf et al., J. Neurochem.(l999) 73:2501-2509).
Также описано, что ауринтрикарбоновая кислота (АТК) предотвращает активацию транскрипции, опосредованную ИФН (Tsi et al., Mol. Pharmacol. (2002) 101:90-101; Chen et al., British J. Pharmacol. (2002) 137:1011-1020). АТК известна как активатор пути Raf/MEK/MAPK, рецептора IGF-1 и сигнального пути протеинкиназы C (Beery et al., Endocrinology (2001) 142:3098-3107; Chen et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:46722-46728). Противовирусное, противомикробное и антипролиферативное действие цитокинов, таких как интерфероны, может быть связано с их способностью вызывать экспрессию iNOS, гена, кодирующего изоформу синтазы оксида азота (NOS), которая производит большие количества радикального газа, NO, из гуанидинового азота L-аргинина (Nathan, C, FASAB J. (1992) 6:3051; Werner-Felmayer et al., J. Exp. Med. (1990) 172:1599). Показано, что обработка макрофагами с ИФН-γ серьезно ограничивает репликацию вируса оспы мышей (EV), вируса осповакцины (VV) и HSV-1.
С одной стороны, АТК также известна как противовирусное средство против некоторых вирусов, включая ВИЧ, вирус герпеса HHV-7, SARS-CoV и других (Cushman et al., J. Med. Chem. (1991) 34:329-3371991; Zhang et al., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap et al., ComputationalBiol andChem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160). АТК, однако, не блокирует репликацию аденовируса типа 5 (Ad5) в клетках HEK-293 (He, Biochem. Biophys. Res. Comm. (2004) 320:1199-1203). Кроме того, сообщают, что АТК неожиданно повысила титр контрольного аденовирусного вектора в клетках 293, хотя в то же самое время оказала противовирусное воздействие на вирус осповакцины (Myskiw et al., J. Virol. (2007) 81:3027-3032).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, таким образом, преодолевает недостатки известного уровня техники путем решения проблем, которые ограничивают продукцию вируса, таких как низкая продукция rHSV, что затрудняет усилия по производству достаточных количеств rHSV для различных целей, включая производство вакцины, а также для продукции вирионов rAAV в количествах необходимых для эффективных процедур генотерапии. С использованием способов, описываемых в настоящем документе, можно получать более высокие титры вирусов, такие как, по меньшей мере, на порядок больше, чем при традиционных способах.
В частности, авторы изобретения в настоящем документе открыли, что ауринтрикарбоновая кислота (АТК) ингибирует iNOS и повышает продукцию HSV. Как показано в примерах в настоящем документе, микромолярные концентрации АТК в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) повысили как урожай вектора HSV-1/d27-1 в клетках V27, так и вируса дикого типа (wt) HSV-1 в клетках Vero, V27 и 293. Другие ингибиторы iNOS, включая дексаметазон и вальпроевую кислоту, также повысили титры HSV-1 в культуре. Было показано, что экспрессия iNOS, вызванная HSV, снизилась в образцах HSV+АТК при анализе с микропанелью SABiosciences. Аналогично, анализ при помощи панели генома человека Affymetrix подтвердил, что повышенная экспрессия всех трех генов синтазы оксида азота (nNOS, iNOS и eNOS), вызванная HSV, была снижена в образцах HSV+АТК. Affymetrix Gene Array также выявил, что экспрессия генов, которые участвуют в сигнальном пути IgE и ИФН, связанном с воспалением, и в системных иммунных ответах, была снижена за счет HSV-1 и подавлена после добавления АТК. С другой стороны, экспрессия генов, преимущественно вовлеченных в фазу клеточного цикла G1/S и передачу сигнала при развитии, опосредованном WNT, была значительно снижена за счет HSV и повышена после добавления АТК.
Эти результаты являются значимыми из-за спроса на более высокие титры HSV-1 для продукции вирионов rAAV, а также для профилактических, терапевтических и диагностических целей.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения вируса, включающему культивирование вируса в культуре клеток, которая содержит ауринтрикарбоновую кислоту. В определенных вариантах осуществления вирус представляет собой вирус герпеса, такой как HSV-1.
В дополнительных вариантах осуществления вирус герпеса представляет собой HSV-1 дикого типа или рекомбинантный вектор HSV-1, такой как вектор HSV-1 d27.1.
В дополнительных вариантах осуществления вирус культивируют в клетках 293, HeLa или Vero, таких как клетки V27.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к способу культивирования вектора HSV-1 d27.1, включающему:
(a) заражение клеток V27 вектором HSV-1 d27.1; и
(b) культивирование зараженных клеток V27 в культуре клеток, содержащей ауринтрикарбоновую кислоту, вальпроевую кислоту или дексаметазон.
В определенных вариантах осуществления культура клеток дополнительно содержит сыворотку, такую как эмбриональная телячья сыворотка.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к культуре клеток, содержащей ауринтрикарбоновую кислоту и клетки 293, HeLa или Vero, такие как клетки V27.
Эти и другие варианты осуществления рассматриваемого изобретения будут очевидны специалистам в данной области в свете описания в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Фигура 1 представляет собой Вестерн-блоттинг, показывающий, что ауринтрикарбоновая кислота (АТК) ингибирует экспрессию iNOS в лизатах V27, зараженных d27-1.
Фигуры 2A-2C показывают принципы протокола АТК-HSV (фигура 2A) и оптимизацию титров d27-1 HSV-1 в супернатантах V27 для того чтобы определить, какие концентрации и условия добавления АТК оказывают воздействие на урожаи HSV. Фигура 2B показывает вирусные титры, выраженные в виде частиц, устойчивых к ДНКазе (DRP/мл) при различных концентрациях АТК в 6-луночных планшетах (фигура 2B) и колбах T150 (фигура 2C).
На фигуре 3 представлена важность присутствия сыворотки в протоколе АТК-HSV. Дополнительная оптимизация и важность присутствия ЭТС в протоколе АТК-HSV были продемонстрированы на титрах d27-l HSV-1, выраженных в виде drp/мл и БОЕ/мл.
Фигуры 4A-4B демонстрируют влияние АТК на штаммы KOS и McIntyre HSV дикого типа в культуре. АТК повышает урожай обоих типов вируса в клетках Vero, однако АТК, по-видимому, ингибирует рост HSV-1 KOS в клетках 293. С другой стороны, штамм McIntyre wtHSV-1 достигает наибольших титров после индукции АТК в клетках 293. Кроме того, АТК, по-видимому, ингибирует оба типа вирусов HSV-1 в клетках HeLa.
Фигуры 5A-5B демонстрируют влияние АТК в стоках HSV на продукцию вирионов rAAV. Титры rAAV были слегка увеличены, когда добавляли сток HSV, приготовленный с 20 мкМ АТК, добавленной во время заражения. Также было показано, что АТК повышает титр rAAV, когда 10 мкМ АТК вводили непосредственно в среду с клетками 293 в течение 2 часов этапа совместного заражения с HSV.
На фигуре 6 представлено влияние дексаметазона (Dex) на вирусный титр d27-1/GFP HSV-1. Конечные титры d27-1/GFP HSV-1 были, в основном, слегка повышены после предварительных обработок или обработок dex по сравнению с необработанным контролем.
На фигуре 7 представлено влияние предварительной обработки вальпроевой кислотой (ВК) на вирусный титр d27-1/GFP HSV-1. ВК в концентрации 5 мМ слегка повысила титр d27-1/GFP HSV-1, однако концентрации ниже и выше 5 мМ, по-видимому, оказывают ингибирующее действие на титр d27-1/GFP HSV-1 по сравнению с необработанным контролем.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иначе, общепринятые способы химии, биохимии, технологии рекомбинантной ДНК и иммунологии в пределах данной области техники. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); Т.Е. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, выше или ниже, включены, таким образом, в качестве ссылки полностью.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В описании настоящего изобретение будут использованы следующие термины, и они определены, как указано ниже.
Следует отметить, что, при использовании в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают отсылки к формам множественного числа, если текст ясно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на "вирус герпеса" включает смесь из двух или более таких вирусов, и т.п.
Термины "рекомбинантный HSV" "rHSV" и "вектор rHSV" относятся к изолированным, генетически модифицированым формам вируса простого герпеса (HSV), содержащим гетерологичные гены, вставленные в вирусный геном. Под термином "rHSV/rc" или "вирус rHSV/rc" или "вирус rHSV с хелперной функцией" подразумевают rHSV, в котором rep и/или cap гены AAV вставлены в геном rHSV. Термины "экспресссирующий вирус rHSV" и "rHSV/AAV" обозначают rHSV, в котором последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) из AAV вставлены в геном rHSV.
Термины "полипептид" и "белок" относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. включены в определение. Определение включает как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Кроме того, для целей настоящего изобретения, "полипептид" относится к белку, который содержит модификации, такие как делеции, вставки и замены (как правило, консервативные по своей природе), в нативной последовательности, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть намеренными, например, посредством сайт-специфического мутагенеза, или могут быть случайными, такими как мутации организмов, которые вырабатывают белки, или ошибки из-за амплификации посредством ПЦР. В зависимости от используемой экспрессирующей системы, в полипептиде может присутствовать или отсутствовать N-концевой метионин. Кроме того, полипептид может содержать или не содержать нативную сигнальную последовательность, если она присутствует изначально. Если сигнальная последовательность в норме отсутствует, белок можно получать с гетерологичной последовательностью.
"Нативный" полипептид относится к полипептиду с той же самой аминокислотной последовательностью, что и соответствующая молекула, полученная из природного источника. Такие нативные последовательности можно выделять из природных источников или можно получать рекомбинантными или синтетическими способами. Термин "нативная" последовательность конкретно включает природные укороченные или секретируемые формы конкретной молекулы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы с альтернативным сплайсингом) и природные аллельные варианты полипептида.
Под "вариантом" подразумевают активный полипептид, определенный в настоящем документе, имеющий, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичности аминокислотных последовательностей с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью, полипептид без сигнального пептида, внеклеточный домен полипептида, с наличием или отсутствием сигнального пептида, или любой другой фрагмент последовательности полноразмерного полипептида, как описано в настоящем документе. Такие полипептидные варианты включают, например, полипептиды, где один или несколько аминокислотных остатков добавлены или удалены с N- и/или C-конца полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Как правило, такой вариант будет иметь, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 81% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 82% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 83% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 84% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 85% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 86% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 87% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 88% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 89% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 91% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 92% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 93% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 94% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 95% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 96% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 97% идентичности аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 98% идентичности аминокислотных последовательностей и альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичности аминокислотных последовательностей с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью. Как правило, вариантные полипептиды имеют, по меньшей мере, приблизительно 10 аминокислот в длину, такие как, по меньшей мере, приблизительно 20 аминокислот в длину, например, по меньшей мере, приблизительно 30 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 40 аминокислоты в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 50 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 60 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 70 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 80 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 90 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 100 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 150 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 200 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 300 аминокислот в длину или больше.
Особенно предпочтительные варианты содержат замены, которые являются консервативными по своей природе, т.е., те замены, которые происходят внутри семейства аминокислот, являющихся родственными по своим боковым цепям. Конкретно, аминокислоты, как правило, делят на четыре семейства: (1) кислые - аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, вполне предсказуемо, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту, треонина на серин, или аналогичная консервативная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой, не будет иметь важного воздействия на биологическую активность. Например, интересующий полипептид может содержать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или не-консервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или не-консервативных аминокислотных замен, или любое количество в пределах от 5 до 50, при условии, что желаемая функция молекулы остается интактной.
"Гомология" относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидами или двумя полипептидными молекулами. Две ДНК или две полипептидных последовательности являются "по существу гомологичными" друг другу, если последовательности демонстрируют, по меньшей мере, приблизительно 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80%-85%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95%-98% идетнтичности последовательности по всей определенной длине молекул. Применяемый в настоящем документе, термин «по существу гомологичный» также относится к последовательности, демонстрирующей полную идентичность с конкретной последовательностью ДНК или полипептида.
В общем случае, "идентичность" относится к точному нуклеотид-к-нуклеотиду или аминокислота-к-аминокислоте соответствию двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Процент идентичности можно определять путем прямого сравнения информации о последовательностях между двумя молекулами посредством сопоставления последовательностей, подсчета точного числа совпадений между двумя совмещенными последовательностями, деления числа на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Для помощи в анализе можно использовать легкодоступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, которая адаптирует алгоритм локальной гомологии из Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступна у Genetics Computer Group, Madison, WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также опираются на алгоритм Смита и Уотермана. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию, рекомендованными производителем, и описанными в вышеуказанном Wisconsin Sequence Analysis Package. Например, процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности с референсной последовательностью можно определять с использованием алгоритма гомологии Смита и Уотермана с таблицей оценки по умолчанию и штрафом за пропуск шести нуклеотидных положений.
Другим способом оценки процента идентичности в контексте настоящего изобретения является использование пакета программ MPSRCH, с охраняемым авторским правом университета Эдинбурга, разработанных John F. Collins и Shane S. Sturrok, и распространяемых IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из этого набора пакетов можно использовать алгоритм Смита-Уотермана, где параметры по умолчанию используют для таблицы оценки (например, штраф за создание пропуска из 12 нуклеотидов, штраф за продление пропуска из одного, и пропуска из шести). Из сгенерированных данных величина "Match" отражает "идентичность последовательности". Другие подходящие программы для расчета процента идентичности или сходства между последовательностями, как правило, известны в данной области, например, другой программой выравнивания является BLAST, используемый с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: генетический код = стандартный; фильтр = отсутствует; цепь =обе; порог = 60; ожидаемое = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировать по = наивысшей оценке; базы данных = не резервировано, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss белок + Spupdate + PIR. Подробности об этих программах хорошо известны в данной области.
Альтернативно, гомологию можно определять путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых образуются стабильные дуплексы между гомологичными областями, с последующим расщеплением нуклеазой/нуклеазами, специфичными по отношению к одноцепочечной ДНК, и определением размеров расщепленных фрагментов. Последовательности ДНК, которые, по существу, гомологичны можно выявлять в экспериментах с гибридизацией по Саузерну, например, при жестких условиях, установленных для этой конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации известно специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., выше; DNA Cloning, выше; Nucleic Acid Hybridization, выше.
Под термином "вырожденный вариант" понимают полинуклеотид, содержащий замены в последовательности его нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с той же самой аминокислотной последовательностью, что и полипептид, кодирующийся полинуклеотидом, из которого получен вырожденный вариант.
"Кодирующая последовательность" или последовательность, которая "кодирует" выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo, если она помещена под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют по старт-кодону на 5'- (амино) конце и стоп-кодону трансляции на 3'- (карбокси) конце. Последовательность терминации транскрипции может быть расположена в 3'-положении по отношению к кодирующей последовательности.
Под "вектором" подразумевают любой генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т.д., который способен к репликации, когда он связан с надлежащими контрольными элементами и который может переносить последовательности генов в клетки. Таким образом, термин включает носители для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы.
Под "рекомбинантным вектором" подразумевают вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, способной к экспрессии in vivo.
Под "рекомбинантным вирусом" подразумевают вирус, который был генетически изменен, например, путем добавления или вставки конструкции гетерологичной нуклеиновой кислоты в частицу.
Термин "трансген" относится к полинуклеотиду, который вводят в клетку и который способен транскрибироваться в РНК и необязательно, транслироваться и/или экспрессироваться при подходящих условиях. В одном из аспектов, он придает желаемое свойство клетке, в которую он был введен, или в ином случае приводит к желаемому терапевтическому или диагностическому исходу.
Термины "геномные частицы (gp)" и "эквиваленты генома" при использовании по отношению к вирусному титру относятся к числу вирионов, содержащих ДНК генома рекомбинантного AAV, безотносительно к инфекционности или функциональности. Число геномных частиц в конкретном препарате вектора можно измерять известными в данной области способами, такими, как описанные, например, у Clark et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; и Veldwijk et al., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.
Термины "единица инфекции (iu)" "инфекционная частица" или "единица репликации" при использовании по отношению к вирусному титру относятся к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора AAV, измеренному с помощью анализа инфицированных фокусов, также известного анализ фокусов репликации, как описано, например, у McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.
Термин "единица трансдукции (tu)" при использовании по отношению к вирусному титру относится к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора cAAV, которые приводят к выработке функционального продукта трансгена, измеренному с помощью функциональных анализов, таких, как описанные, например, у Xiao et al., Exp. Neurobiol. (1997) 144:1 13-124; или in Fisher et al., J. Virol. (1996) 70:520-532 (анализ LFU).
Термин "трансфекция" используют по отношению к захвату чужеродной ДНК клеткой, и клетка является "трансфецированной", когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Ряд способов трансфекции, как правило, известен в данной области. См., например, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene13:197. Такие способы можно использовать для введения одной или нескольких экзогенных молекул ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин "гетерологичный" по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты, таким как кодирующие последовательности и контрольные последовательности, обозначает последовательности, которые в норме не соединены вместе и/или которые в норме не связаны с конкретной клеткой. Таким образом, "гетерологичная" область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты находящийся в составе или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, для которой не обнаружена ассоциация с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты могла бы содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, которые не находятся в ассоциации с кодирующей последовательностью в природе. Другим примером гетерологичной кодирующей последовательности является конструкция, где кодирующая последовательность сама по себе не обнаруживается в природе (например, синтетические последовательности с кодонами, отличными от нативного гена). Аналогично, клетка, трансформированная конструкцией, которая в норме не присутствует в клетке, могла бы считаться гетерологичной для целей по настоящему изобретению. Аллельная вариация или природные мутационные события не приводят к гетерологичной ДНК, используемой в настоящем документе.
Последовательность "нуклеиновой кислоты" относится к последовательности ДНК или РНК. Термин включает последовательности, которые содержат любые из известных аналогов оснований ДНК и РНК, в качестве неограничивающих примеров, такие как 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксил-метил) урацил, 5-фторурацил, 5-бромоурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметил-аминометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметил-гуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метокси-амино-метил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин.
Термин "контрольные последовательности" ДНК относится в обобщенном смысле к промоторным последовательностям, сигналам полиаденилирования, последовательностям терминации транскрипции, вышележащим регуляторным доменам, участкам начала репликации, внутренним участкам связывания рибосом ("IRES"), энхансерам и т.п., которые в совокупности обеспечивают репликацию, транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности в реципиентной клетке. Не все из этих контрольных последовательностей всегда должны присутствовать, при условии, что выбранная кодирующая последовательность способна реплицироваться, транскрибироваться и транслироваться в подходящей клетке-хозяине.
Термин "промотор" используют в настоящем документе в его обычном значении по отношению к нуклеотидной области, содержащей регуляторную последовательность ДНК, где регуляторная последовательность получена из гена, и способна связываться с РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию нижележащей (3'-направление) кодирующей последовательности. Транскрипционные промоторы могут включать "индуцибельные промоторы" (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанная с промотором, индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.д.), "репрессируемые промоторы" (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанная с промотором, индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.д.) и "конститутивные промоторы".
"Функционально связанный" относится к перестройке элементов, где описанные таким образом компоненты сконфигурированы так, чтобы выполнять свою обычную функцию. Таким образом, контрольные последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью, способны к воздействию на экспрессию кодирующей последовательности. Контрольные последовательности не обязательно должны быть смежными с кодирующей последовательностью, при условии, что они функционируют, чтобы направлять ее экспрессию. Таким образом, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности, и промоторная последовательность все еще будет рассматриваться как "функционально связанная" с кодирующей последовательностью.
Под "изолированным" по отношению к белку или нуклеотидной последовательности подразумевается, что указанная молекула присутствует в условиях отсутствия по существу биологических макромолекул того же типа. Таким образом, например, "изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный полипептид" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая по существу свободна от других молекул нуклеиновой кислоты, которые не кодируют указанный полипептид; однако молекула может содержать некоторые дополнительные основания или группы, которые не оказывают вредного воздействия на основные характеристики композиции.
С целью описания относительных положений нуклеотидных последовательностей в конкретной молекуле нуклеиновой кислоты на всем протяжении настоящей заявки, в случаях, когда конкретная нуклеотидная последовательность описана, как расположенная "выше" или "ниже" "3-штрих (3')" или "5-штрих (5')" относительно другой последовательности, следует понимать, что это положение последовательностей в "смысловой" или "кодирующей" цепи молекулы ДНК, которое обозначено, как общепринято в данной области.
Термин "приблизительно", в частности, по отношению к данному количеству, означает, что количество включает отклонения на плюс или минус пять процентов.
2. СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Перед подробным описанием настоящего изобретения, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными составами или параметрами процессов, поскольку таковые, конечно, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и является неограничивающей.
Хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительными материалами и способами являются описанные в настоящем документе.
Центральным местом в настоящем изобретении является открытие того, что ауринтрикарбоновая кислота (АТК) в микромолярных концентрациях увеличивает урожай вектора HSV-1. Этот факт является важным, как для широкомасштабного производства HSV, так и для выработки векторов rHSV и rAAV. Кроме того, неожиданно, что продемонстрировано в примерах, присутствие АТК в стоках rHSV-1 не оказывает негативного воздействия на урожай rAAV. Этот результат является неожиданным, поскольку известно, что АТК в миллимолярных количествах и в более высоких концентрациях является противовирусным средством (Cushman et al., J. Med. Chem. (1991) 34:329-337; Zhang et al., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap et al., Computational Biol. and Chem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160).
Как упоминалось выше, исследователи сообщают о противовирусной активности оксида азота (NO) против некоторых вирусов, таких как вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита и вирус японского энцефалита, наряду с другими (Bi et al., J. Virol. (1995) 69:6466-6472; Harris et al., J. Virol. (1995) 69:910-915; Lin et al., 1997; Pertile et al., Avian Dis. (1996) 40:342-348). NO представляет собой свободнорадикальную газообразную молекулу и является медиатором иммунной системы (Croen K.D., J. Clin. Invest. (1993) 91:2446-2452; Karupiah et al., Science (1993) 261:145-1448; Rolph et al., Virol. (1996) 217:470-477; Amaro et al., J. Med. Virol. (1997) 51:326-331; Lane et al., J. Virol. (1997) 71:2202-2210). Заражение HSV способно вызывать экспрессию iNOS, гена, кодирующего индуцибельную изоформу NOS, которая производит большие количества NO.
Как показано в настоящем документе, АТК подавляет вызванное HSV увеличение экспрессии iNOS и, таким образом, повышает титры HSV. Дополнительные ингибиторы iNOS, в том числе дексаметазон и вальпроевая кислота, также имеют такой же эффект. В одном из вариантов осуществления, использование таких ингибиторов iNOS повышает титры рекомбинантного вируса герпеса в культуре, позволяя производить значительно больше вируса, чем производится в отсутствие конкретного ингибитора. Вирусы, произведенные по способу, можно использовать для различных целей, в том числе для профилактических, терапевтических и диагностических целей, а также для производства в достаточном количестве рекомбинантных конструкций для применения для получения рекомбинантных вирионов для доставки генов и генотерапии.
Ауринтрикарбоновая кислота (АТК), 5-((3-карбокси-4-гидроксифенил)(3-карбокси-4-оксо-2,5-циклогексадиен-1-илиден)метил)-2-гидроксибензойная кислота, представляет собой гетерогенную смесь несульфатированных отрицательно заряженных ароматических полимеров, которые образуются при обработке салициловой кислоты формальдегидом, серной кислотой и нитритом натрия (см. Cushman, et al., (1991) J. Med. Chem.34:329-337; Cushman, et al., J. Med. Chem. 34:337-342). Ауринтрикарбоновая кислота имеет формулу:
Было описано, что гетерогенная смесь АТК ингибирует взаимодействия белок-нуклеиновая кислота (Gonzalezet al., Biochim. Biophys. Acta, (1979) 562:534-545); взаимодействует со стероидными рецепторами на уровне захвата и связывания с ядром (Mellon, W. S., Biochem. Pharmacol. (1984) 33:1047-1057; Moudgilet al., J. Стероид Biochem. (1985) 23:125-132); нигибирует ДНК-полимеразу (Nakaneet al., Eur. J. Biochem. (1988) 177:91-96); и действует как ингибитор РНК-азы (Skidmoreet al., Biochem. J.(1989) 263:73-80).
Для добавления к вирусу в культуре можно использовать АТК в кислой форме или в виде соли, такой как тринатриевая соль ауринтрикарбоновой кислоты, кальциевая соль, аммонийная соль и т.д.
Дополнительные вещества, которые найдут применение в настоящих способах, включают дексаметазон (Dex) и вальпроевую кислоту (ВК). Было показано, что Dex ингибирует экспрессию iNOS в мезангиальных клетках крысы на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях (Kunz et al., Biochem. J. (1994) 304:337-340; Kunz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:255-259). Также было показано, что Dex способствует oriL репликации ДНК HSV-1 в клетках PC12. Было показано, что вальпроат натрия, натриевая соль ВК, стимулирует репликацию HSV-1, цитомегаловируса человека, HIF-1, вируса герпеса-8 человека, вируса кори и полиовируса типа 1 (Motamedifar et al., Iran. J. Med. Sci. (2006) 31:28-32; Kuntz-Simon et al., J. Gen. Virol (1995) 76:1409-1415; Moog et al., J. Gen. Virol (1996) 77:1993-1999; Ylisastigui et al., AIDS (2004) 18:1101-1108; Shaw et al., AIDS (2000) 14:899-902; Kabiri et al. Iran J. Med. Sci. (2001) 26:55-61). Кроме того, было показано, что вальпроевая кислота ингибирует iNOS (Guo et al. Surgery (2007) 142:156-162). Как и в случае с АТК, в настоящих способах можно использовать ВК, или ее соли, такие как соли натрия, кальция, аммония и т.п.
Хотя в качестве примера в настоящем документе приведено использование АТК, Dex, и ВК для выработки векторов rHSV-1 в более высоких титрах, эти ингибиторы iNOS можно использовать для повышения титра множества вирусов в культуре, таких как, но не ограничиваясь ими, вирусы семейств Adenoviridae, Picornaviridae (например, полиовирусы и т.д.); Caliciviridae; Togaviridae (например, вирус краснухи, вирус лихорадки денге и т.д.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (например, вирус бешенства и т.д.); Poxviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae (например, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус, и т.д.); Orthomyxoviridae (например, вирус гриппа типов A, B и C и т.д.); Bunyaviridae; Arenaviridae; различные вирусы гепатита, такие как HAV, HBV и HCV; вирусы папилломы и ротавирусы; ретровирусы; и т.д. См., например, Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B.N. Fields и D.M. Knipe, eds. 1991), для описания этих и других вирусов. Эти вирусы, или полученные из них иммуногены, можно использовать для производства вакцин и диагностики. Кроме того, некоторые из этих вирусов, и в частности, герпесвирусы, можно использовать для выработки рекомбинантных векторов для производства рекомбинантных вирионов для применения в способах доставки генов, описанных ниже.
Таким образом, АТК, Dex и ВК можно использовать для повышения урожая любого из герпесвирусов, которые являются членами семейства herpesviridae. Наряду с другими, оно включает вирус конского герпеса, вирус бычьего герпеса (BHV) и вирус простого герпеса (HSV) человека типов 1 и 2, такие как BHV-1, BHV-2, HSV-1 и HSV-2, вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирус (CMV), HHV6 и HHV7. Герпесвирусы можно получать из любого из множества штаммов. Например, если при помощи изобретения получают вирус HSV, вирус можно получать, например, из HSV-1 или HSV-2, и можно из любого из различных штаммов HSV, таких как HSV-1 штамм KOS, HSV-1 штамм McIntyre, HSV-1 штамм Patton, HSV-2 штамм 333, HSV-2 штамм G и т.п. Кроме того, получаемые вирусы могут быть вирусами дикого типа или их производными, включая рекомбинантные вирусы, и межтиповыми рекомбинантами, содержащими ДНК из HSV-1 и HSV-2. Производные предпочтительно имеют, по меньшей мере, 70% гомологию последовательности с геномами HSV-1 или HSV-2 или с их частями, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90 или 95%. Производное может иметь последовательность генома HSV-1 или HSV-2, модифицированную нуклеотидными заменами, например, от 1, 2 или 3 до 10, 25, 50 или 100 замен. Геном HSV-1 или HSV-2 может быть модифицирован альтернативно или дополнительно за счет одной или нескольких вставок и/или делеций и/или за счет удлинения с одного или с обоих концов.
Другие производные включают штаммы, которые уже имеют мутации в генах, в частности, мутации в генах, которые приводят к ослаблению вируса. Примеры таких вирусов включают штамм 1716 (MacLean et al., J. Gen. Virol. (1991) 72:632-639), штаммы R3616 и R4009 (Chou и Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992) 89: 3266-3270) и R930 (Chou et al., J. Virol. (1994) 68:8304-8311), которые все имеют мутации в ICP34.5, штамм d120, который имеет делецию в ICP4 (DeLuca et al.,J. Virol. (1985) 56:558-570), штамм d27-1 (Rice and Knipe, J. Virol. (1990) 64: 1704-1715), который имеет делецию в ICP27) или штамм d92, который имеет делецию в ICP27 и ICP4 (Samaniego et al., J. Virol. (1995) 69:5705-5715). Терминологию, которую используют при описании различных генов HSV можно найти, например, у Coffin и Latchman (1996), In: Genetic Manipulation of Nervous System (DS Latchman Ed.) pp 99-114: Academic Press, London.
Очевидно, что в изобретении можно использовать любой rHSV, подходящий по назначению. В определенных вариантах осуществления rHSV, который используют по изобретению, является дефицитным по репликации. Для выработки вирионов rAAV предпочтительна инфекция клеток-продуцентов при помощи rHSV, который неспособен к репликации, поскольку в отличие от способов, включающих использование аденовируса, rHSV не становится значительным загрязнителем продукта rAAV. Это может служить увеличению конечного урожая вирионов rAAV за счет удаления этапов очистки, связанных с удалением аденовируса. В конкретном варианте осуществления изобретения rHSV конструируют из мутанта HSV-1, в котором неспособность к репликации вызвана делецией в гене ICP27. Для конструкции rHSV также можно использовать любых других подходящих мутантов HSV, демонстрирующих фенотип, дефицитный по репликации.
Одним особенно предпочтительным рекомбинантным мутантным штаммом HSV-1 для выработки rAAV с использованием рассматриваемых способов является штамм d27-1 HSV-1. Этот штамм можно получать, как описано, например, у Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:973 985 и в патенте США № 7091029, полностью включенным в настоящий документ в качестве ссылки. Как описано выше, этот мутантный вектор не вырабатывает ICP27 и преимущественно используется для продукции вирионов rAAV, поскольку известно, что сплайсинг мРНК в клетке-хозяине ингибируется ICP27. ICP27 может также воздействовать на соответствующий сплайсинг мРНК rep и cap AAV-2. Этот вектор является дефицитным по репликации и демонстрирует сниженную цитотоксичность по сравнению с HSV-1 дикого типа (wt). Вирус d27-1 демонстрирует несколько других характеристик, которые являются благоприятными для применения в качестве вируса-помощника для продукции вирионов rAAV. Во-первых, он экспрессирует ранние гены, о которых известно, что они необходимы для продукции rAAV (Weindler et al., J. Virol. (1991) 65:2476-2483). Кроме того, d27.1 имеет повышенную экспрессию ICP8, белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, который является продуктом UL29, одного из генов HSV-1, необходимых для репликации и упаковки AAV (Weindler et al., J. Virol. (1991) 65:2476-2483).
Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую приблизительно 4681 нуклеотидов. Геном AAV, как правило, содержит внутренний геном без повторов, фланкированный с каждого конца инвертированными концевыми повторами (ITR). ITR составляет приблизительно 145 пар оснований (п.н.) в длину. ITR имеют множество функций, включая обеспечение точек начала репликации ДНК и сигнала упаковки для вирусного генома. Внутренняя часть генома без повторов содержит две больших открытых рамки считывания, известных как гены репликации (rep) и капсида (cap) AAV. Гены rep и cap кодируют вирусные белки, которые позволяют вирусу реплицироваться и упаковываться в вирион. В частности, с области rep AAV экспрессируется семейство, по меньшей мере, из четырех вирусных белков, Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40, названные соответственно их явной молекулярной массе. Область cap AAV кодирует по меньшей мере три белка, VPI, VP2, и VP3.
Под "кодирующей областью rep AAV" подразумевают принятую в данной области область генома AAV, которая кодирует белки репликации Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40. Показано, что эти продукты экспрессии Rep обладают множеством функций, включая, распознавание, связывание и одноцепочечный разрыв в точке начала репликации ДНК AAV, ДНК-хеликазную активность и модуляцию транскрипции с AAV (или других гетерологичных) промоторов. Продукты экспрессии Rep все вместе необходимы для репликации генома AAV. Для описания кодирующей области rep AAV, см., например, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol.158:97-129: и Kotin, R.M. (1994) Human Genotherapy 5:793-S0. Подходящие гомологи кодирующей области rep AAV включают ген rep вируса герпеса 6 (HHV-6) человека, который также известен тем, что опосредует репликацию ДНК AAV-2 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
Под "кодирующей областью cap AAV" подразумевают принятую в данной области область генома AAV, которая кодирует белки капсида VP1, VP2, и VP3, или их функциональные гомологи. Эти продукты экспрессии Cap обеспечивают функции упаковки, которые совместно необходимы для упаковки вирусного генома. Для описания кодирующей области cap AAV, см., например, Muzyczka, N. и Kotin, R.M. (выше).
Как правило, для получения вирионов rAAV будут использоваться два вектора rHSV. Один представляет собой вектор rHSV с хелперной функцией, в котором гены rep и/или cap AAV введены в геном rHSV. Другой представляет собой экспрессирующий вектор rHSV, в котором последовательности ITR из AAV были введены в геном rHSV и фланкируют интересующий ген.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления можно использовать ингибитор iNOS для повышения урожая первого вектора rHSV, который содержит гены rep и/или cap AAV. Варианты осуществления первого вектора rHSV по способу в качестве неограничивающих примеров включают генетические конструкции на основе гена cap, обнаруженного в различных серотипах AAV, включая AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5 и AAV-6, AAV-7 и AAV-8, козий и бычий AAV (см., например, публикацию США. No. 20080292595, полностью включенную в настоящий документ в качестве ссылки), и их варианты. Также в пределе объема изобретения находятся гены rep и cap из новых серотипов AAV, и гены rep и cap, модифицированные путем рекомбинации или мутации существующих серотипов. Гены rep и cap вектора AAV с хелперной функцией можно получать из любых известных серотипов AAV, как описано выше. Например, вектор rHSV с хелперной функцией может иметь ген rep, полученный из AAV-2 и ген cap, полученный из AAV-6; специалист в данной области будет понимать, что возможны и другие сочетания генов rep и cap, определяющей чертой является способность поддерживать производство вирионов rAAV.
В определенных вариантах осуществления гены rep и cap AAV в векторе rHSV с хелперной функцией могут находиться под управлением их нативных промоторов. Промоторы p5 и p19 AAV-2 контролируют экспрессию Rep 78 и 68 и Rep 52 и 40, соответственно. Промотор p40 контролирует экспрессию VP1, VP2 и VP3. Кроме того, для управления экспрессией генов AAV можно использовать гетерологичные промоторы. Примеры других промоторов, которые можно использовать в описанных способах в качестве неограничивающих примеров включают ранний промотор SV40, промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV-1 (HSV-1 tk), индуцибельный промотор металлотионина, промотор вируса опухоли молочной железы мыши и промотор β-актина курицы.
Генетическая конструкция может быть вставлена в любой сайт или сайты генома HSV, подходящие для интеграции генов rep и cap. В определенных вариантах осуществления вектор конструируют путем гомологичной рекомбинации генов rep и cap AAV в локус тимидинкиназы (tk) вируса rHSV-1, как описано в Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:986-993 и патенте США № 7091029, полностью включенных в настоящий документ в качестве ссылки.
Как описано в настоящем документе, вектор rHSV с хелперной функцией кодирует последовательности "AAV с хелперной функцией" (т.е., rep и cap), которые функционируют в транс-положении для продуктивной репликации AAV и упаковки в капсид. Предпочтительно, вектор rHSV с хелперной функцией поддерживает эффективное производство вирионов rAAV без создания каких-либо выявляемых вирионов AAV дикого типа (т.е., вирионов AAV, содержащих функциональные гены rep и cap). Примером такого вектора является rHSV-1 d27.1rc. Вектор и способы его получения описаны в настоящем документе в примерах, а также в Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:986-993; и патенте США № 7091029, полностью включенных в настоящий документ в качестве ссылки.
Второй вектор rHSV обозначается экспрессирующий вектор rHSV и содержит ITR из AAV с одним или несколькими интересующими генами под управлением одного или нескольких промоторов. В некоторых вариантах осуществления интересующий ген вставлен между парой ITR. Гетерологичный ген, как правило, функционально связан с гетерологичным промотором (конститутивным, клеточно-специфичным, или индуцибельным), способным управлять экспрессией гена в клетках-мишенях пациента при подходящих условиях. Можно также включать сигналы терминации, такие как сайты полиаденилирования.
Нуклеотидные последовательности областей ITR AAV известны. См., например, Kotin, R.M. (1994) Human Genotherapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.) для последовательности AAV-2. ITR AAV, используемые в векторах по изобретению необязательно должны иметь нуклеотидную последовательность дикого типа, и ее можно изменять, например, путем вставки, делеции или замены нуклеотидов. Кроме того, ITR AAV могут быть получены из любого из нескольких серотипов AAV, включая в качестве неограничивающих примеров, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 и AAV-8, козий и бычий AAV (см., например, публикацию США. No. 20080292595, полностью включенную в настоящий документ в качестве ссылки), и их варианты. Кроме того, 5'- и 3'-ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в экспрессирующем векторе необязательно должны быть идентичны или получены из одного серотипа или изолята AAV, при условии, что они функционируют подобающим образом, т.е., позволяют вырезать и извлекать интересующие последовательности из генома клетки-хозяина или вектора, и вводить молекулу ДНК в геном реципиентной клетки, когда продукты генов rep AAV присутствуют в клетке.
ITR AAV можно вырезать из вирусного генома или из вектора AAV, содержащего их, и сливать с 5' и 3' концами выбранной конструкции нуклеиновой кислоты с использованием стандартных способов лигирования, таких как описанные в Sambrook et al., выше. Например, лигирование можно проводить в 20 мМ Tris-Cl с pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 33 мкг/мл БСА, 10 мМ-50 мМ NaCl, и либо с 40 мкМ АТФ, 0,01-0,02 (Weiss) единиц T4 ДНК-лигазы при 0°C (для лигирования с "липкими концами") или с 1 мМ АТФ, 0,3-0,6 (Weiss) единиц T4 ДНК-лигазы при 14°C (для лигирования с "тупыми концами"). Межмолекулярное лигирование с "липкими концами", как правило, проводят при общей концентрации ДНК 30-100 мкг/мл (5-100 нМ общая концентрация концов). Векторы AAV, которые содержат ITR, были описаны, например, в патенте США no. 5139941. В частности, некоторые векторы AAV, описанные в том патенте, доступны в Американской коллекции типовых культур ("ATCC") под номерами доступа 53222, 53223, 53224, 53225 и 53226.
Выбранная полинуклеотидная последовательность функционально связана с контрольными элементами, которые направляют ее транскрипцию или экспрессию у рассматриваемых клеток. Такие контрольные элементы могут включать контрольные последовательности, в норме связанные с выбранным геном. Альтернативно, можно использовать гетерологичные контрольные последовательности. Подходящие гетерологичные контрольные последовательности, как правило, включают те, которые получены из последовательностей, кодирующих гены вирусов или млекопитающих. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают, промотор нейронспецифичной енолазы, промотор GFAP, ранний промотор SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши; основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область предраннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы рауса (RSV), синтетические промоторы, гибридные промоторы и т.п. Кроме того, последовательности, полученные из не вирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также найдут применение в настоящем документе. Такие промоторные последовательности коммерчески доступны, например, у StrATKgene (San Diego, CA), Invivogen (San Diego, CA) и других.
Интересующий ген может быть геном, имеющим, по-видимому, терапевтическую ценность. Примеры терапевтических генов в качестве неограничивающих примеров включают α-1 антитрипсин, Фактор VIII, Фактор IX, GAA, эритропоэтин и PEDF. Если необходимо провести отбор или выявить успешную трансэкспрессию гена, ген, представляющий интерес, может быть репортерным геном. Известно множество примеров генов, которые используются в качестве репортерных или для отбора и которые можно использовать в изобретении. Эти гены в качестве неограничивающих примеров включают гены, кодирующие β-галактозидазу, неомицин, фосфоротрансферазу, хлорамфеникол ацетилтрансферазу, тимидинкиназу, люциферазу, бета-глюкуронидазу, аминогликозид, фосфотрансферазу, гигромицин B, ксантин-гуанин фосфорибозил, люциферазу, DHFR/метотрексат, и зеленый флуоресцентный белок (GFP).
Экспрессионный вирус rHSV-1 можно получать во многом таким же образом, как описано выше, а именно, путем гомологичной рекомбинации в ген tk HSV-1, как описано, например, в Conway et al., Gene Ther. (1999) 6:986-993 и патенте США № 7091029, полностью включенным в настоящий документ в качестве ссылки.
После получения векторы rHSV или любой другой вирус, представляющий интерес, выращивают в культуре в подходящей линии клеток. Для герпесвирусов, такие линии клеток в качестве неограничивающих примеров включают, клетки Vero, клетки 293, клетки HeLa, и т.п., доступные в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Md. Если используют вектор HSV-1 d27.1, то этот вирус, как правило, культивируют в ICP27-дополненной линии клеток V27 (Рис et al., J. Virol. (1990) 64: 1704-1715). Можно использовать любую подходящую среду для вирусов, рассматриваемую в данном документе, с сывороткой или без, такой как эмбриональная телячья сыворотка, такую как, без ограничений, среда RPMI 1640, модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), среда F12 или смесь последних (среда DF). Если присутствует сыворотка, культура может содержать, например, от 2% до 20% сыворотки, больше, как правило, от 5% до 15% сыворотки, от 7% до 12% сыворотки, или любое число в пределах этих диапазонов, такое как 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, и т.п. Кроме того, если используют сыворотку, она может присутствовать в исходной культуре, и/или в последующей свежей среде, которую добавляют к культурам.
Количество ингибитора iNOS, который добавляют в способе по изобретению, может варьировать и представляет собой конкретную величину, зависящую от используемого конкретного ингибитора, используемой среды и культивируемого вируса. Например, если герпесвирусы культивируют в клетках Vero, концентрация АТК в начальной культуре, если АТК присутствует, будет, как правило, составлять от 5 мкМ до 500 мкМ, предпочтительно от 10 мкМ до 250 мкМ, такая как от 20 мкМ до 100 мкМ, т.е., от 30 мкМ до 75 мкМ, такая как 30..35..40..45..50..55..60..65..70..75, и т.д. или любое целое число в пределах этих установленных диапазонов. Аналогично, концентрация дексаметазона, если он присутствует, в начальной культуре будет, как правило, составлять от 1 мкМ до 500 мкМ, предпочтительно от 5 мкМ до 250 мкМ, такая как от 1 мкМ до 100 мкМ, т.е., от 5 мкМ до 75 мкМ, такая как 1..5..15..10.. 20..25..30..35..40..45..50..55..60..65..70..75, и т.д. или любое целое число в пределах этих установленных диапазонов. Если используют вальпроевую кислоту, исходная концентрация будет составлять от 1 мМ до 500 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 250 мМ, такая как от 1 мМ до 100 мМ, т.е., от 5 мМ до 75 мМ, такая как 1..5..15..10..20..25..30..35..40..45..50..55..60..65..70..75, и т.д. или любое целое число в пределах этих установленных диапазонов.
В определенных вариантах осуществления зараженные вирусом клетки исходно культивируют в среде, описанной выше, от 0,5 часов до 24 часов, от 0,75 часов до 12 часов, от 1 часа до 5 часов, от 1 часа до 2 часов, или любое число часов или их долей в пределах этих диапазонов. Ингибитор iNOS и/или сыворотка могут присутствовать или отсутствовать в исходной культуре. Затем добавляют свежую среду и культуры инкубируют от 24 до 120 часов, от 48 до 96 часов, от 50 до 80 часов, от 60 до 75 часов, от 70 до 74 часов, или любое число часов или их долей в пределах этих диапазонов. Ингибитор iNOS и/или сыворотка могут присутствовать или отсутствовать в последующей культуре, при условии, что ингибитор iNOS присутствует или в одной из них или в обеих из исходной культуры и последующей культуры.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор iNOS присутствует в исходной культуре в более высокой концентрации, чем в последующей культуре. Таким образом, например, если ингибитор iNOS представляет собой АТК, он может присутствовать в количестве от 30 до 75 мкМ в исходной культуре, а затем от 5 до 25 мкМ в последующей культуре. Альтернативно, ингибитор может присутствовать только в исходной или последующей культуре.
Как показано в примерах ниже, один особенно предпочтительный способ с использованием АТК включает наличие 50 мкМ АТК в исходной культуре, с уменьшением количества АТК в последующей культуре до 20 мкМ. Кроме того, в случае АТК, предпочтительно включение сыворотки одновременно с наличием АТК. Таким образом, если АТК добавляют к исходной культуре, полезно добавлять эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) в среду. Сходно, если АТК добавляют к последующей культуре, для получения более высоких урожаев вируса необходимо добавление ЭТС.
Вирусы затем культивируют для получения желаемого титра вируса. Например, в случае векторов HSV-1 d27-1, описываемых в настоящем документе, АТК повышает урожаи d27-l в супернатантах клеток V27 в 3-5 раз, и титры могут составлять, по меньшей мере, 1×108 БОЕ/мл или 4×108 DRP/мл. Аналогично, АТК также повышает урожаи вирусов дикого типа (wt) HSV-1 штаммов McIntyre и KOS на 1 лог, и титры 293 или Vero могут вырасти вплоть до 1×109 DRP/мл. Вирусы затем собирают для дальнейшего использования.
Для целей изобретения, подходящие клетки-хозяева для получения вирионов rAAV включают микроорганизмы, дрожжевые клетки, клетки насекомых, и клетки млекопитающих, которые используются или могут быть использованы в качестве реципиентов гетерологичной молекулы ДНК и которые способны к росту, например, в суспензионной культуре, колбах, планшетах, биореакторе или т.п. Термин включает потомство исходной клетки, которая была трансфецирована. Таким образом, "клетка-хозяин", применяемая в настоящем документе, как правило, относится к клетке, которая была трансдуцирована экзогенной последовательностью ДНК. Если рекомбинантные герпесвирусы для применения в производстве вирионов rAAV получают в одном типе клеток, собранные векторы затем трансфецируют в другую подходящую клетку-хозяина. Клетки 293, происходящие из стабильной клеточной линии человека, (легко доступны, например, в Американской коллекции типовых культур под номером доступа ATCC CRL1573) являются предпочтительными клетками-хозяевами для получения вирионов rAAV. В частности, клеточная линия человека 293 представляет собой линию клеток эмбриональной почки человека, которая была трансформирована фрагментами ДНК аденовируса типа 5 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), и экспрессирует аденовирусные гены E1a и E1b (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). Линия клеток 293 легко трансфецируется, и обеспечивает особенно подходящую платформу для получения вирионов rAAV.
Хелперные функции AAV вводят в клетку-хозяина путем трансдукции клетки-хозяина конструкцией rHSV с хелперной функцией или до или одновременно с использованием экспрессирующего вектора rHSV. Таким образом, хелперные конструкции rHSV используют для обеспечения, по меньшей мере, транзиторной экспрессии генов rep и/или cap AAV для восполнения утраченных функций AAV, которые необходимы для продуктивной инфекции AAV. В хелперных конструкциях AAV отсутствуют ITR AAV, и они не могут самостоятельно ни реплицироваться, ни упаковываться.
После репликации рекомбинантного AAV вирионы rAAV можно очищать от клетки-хозяина при помощи множества общепринятых способов очистки, таких как хроматография на колонках, градиенты CsCl и т.п. Например, можно использовать многоэтапную очистку на колонках, такую как очистка на анионообменной колонке, аффинной колонке и/или катионообменной колонке. См., например, Международную Публикацию WO 02/12455.
Полученные вирионы rAAV, которые содержат нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, можно затем использовать для доставки генов при помощи способов, хорошо известных в данной области и описанных, например, в патентах США №№ 5173414 и 5139941; международных публикациях WO 92/01070 (опубликована 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликована 4 марта 1993 года); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; and Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ниже приведены примеры конкретных вариантов осуществления для проведения настоящего изобретения. Примеры предлагаются исключительно с иллюстративными целями, и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количества, температуры, и т.д.), но, конечно, следует сделать поправку на некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.
Материалы и Способы
Клетки
Vero-производные клетки V27 (Рис et al., J. Virol. (1989) 63:3399-3407) и клетки 293, производные клеток эмбриональной почки человека (HEK) (Graham et al., J. Gen. Virol. (1977) 36:59-74) получали от Applied Genetic Technologies Corporation (AGTC, Alachua, FL), Vero и клетки HeLa приобретали в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA). Все клетки поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; HyClone, South Logan, UT), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС; HyClone) и либо генетицин (50 мг/мл; Invitrogen) для клеток V27 или 1% пенициллин/стрептомицин (Cellgro Mediatech, Manassas, VA) для других клеток.
Выработка HSV-1
Штамм KOS HSV-1 дикого типа и ICP27-дефицитные производные штамма KOS HSV-1 дикого типа: векторы d27-1 (Rice and Knipe, J. Virol. (1990) 64: 1 04-1715), rHSV-rep2/cap2 и rHSV-EGFP (Kang et al. Gene Ther. (2009) 16:229-239) и их продуцент ICP27-дополненную линию клеток V27 получали от AGTC (Alachua, FL). Штамм Maclntyre HSV-1 дикого типа, приобретенный у Advanced Biotechnologies Inc. (ABI, Columbia MD) и штамм KOS HSV-1 дикого типа (wtHSV-1 KOS) выращивали в линиях клеток Vero, 293 или HeLa. Собирали инфекционные векторные частицы через 72 часа после заражения путем извлечения супернатанта культуры. Титры стоков HSV-1 в частицах, устойчивых к ДНКазам/мл (DRP/мл) определяли посредством анализа Taqman. Вирусные геномы в неочищенной среде для культивирования количественно определяли путем обработки в присутствии ДНКазы I (50 Ед/мл конечная концентрация; Promega) при 37°C в течение 60 мин, с последующим расщеплением протеиназой K (Invitrogen) (1 Ед/мл) при 50°C в течение 60 мин, а затем денатурации при 95°C в течение 30 мин.
Линеаризованную плазмиду pZero 195 UL36 (полученную от AGTC, Inc., Alachua, FL) использовали для получения стандартных кривых. Следующий набор праймеров-зондов был специфическим для последовательности UL36 векторного генома (HSV-UL36 F: 5'- GTTGGTTATGGGGGAGTGTGG (SEQ ID NO: 1); HSV-UL36 R: 5'-TCCTTGTCTGGGGTGTCTTCG (SEQ ID NO:2); HSV-UL36 Зонд: 5'-6FAM- CGACGAAGACTCCGACGCCACCTC-TAMRA (SEQ ID NO:3). Амплификацию ПЦР-продукта проводили со следующими параметрами цикла: 1 цикл при 50°C в течение 2 мин, 1 цикл при 95°C в течение 10 мин; 40 циклов с 95°C в течение 15 сек, и 60°C в течение 60 сек.
Эксперименты с АТК
Исходный раствор АТК (Sigma-A1895 Ауринтрикарбоновая кислота, практическая чистота >85% (титрация), порошок) получали как концентрацию 500 мкМ в водном растворе 100 мМ бикарбоната натрия. Исходный раствор АТК затем разводили в DMEM+/-10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Hyclone, Waltham, MA) в диапазоне концентраций 12-60 мкМ АТК (8,5-21 мкг АТК /мл). Проводили заражение HSV-1 с множественностью заражения 0,15 (MOI=0,15) (как правило, 6×105 клеток в 6-луночном планшете) в 40% (2/5 объема) от общего конечного объема среды в течение 1-2 часов и добавляли оставшуюся среду (60% или 3/5 от общего конечного объема) во время этапа разведения. Клетки затем инкубировали в течение 72 часов и собирали супернатант для проведения анализа бляшкообразующих единиц на миллилитр (БОЕ/мл) и анализа титра DRP/мл.
Эксперименты с дексаметазоном (Dex)
Дексаметазон (Sigma-D4902) растворяли до 2 мг/мл в абсолютном спирте. Потом разбавляли DMEM для получения концентрации 1M и хранили при 20°C.
Клетки V27 высевали в 6-луночные планщеты за сутки до заражения с концентрацией 6×105 клеток/лунку. Добавляли дексаметазон до получения концентрации 1 мкМ в среду для посева. Хорошо смешивали и добавляли в лунки.
Отбирали среду и добавляли инфекционный сток HSV-1 d27-1 с MOI 0,15 (= плотность посева клеток × 0,15/титр БОЕ стока HSV) на 1 мл DMEM (без добавок). Добавляли 1 мл инфекционного инокулята на лунку. Инкубировали в течение 1-2 часов при 37°C, в инкубаторе 5% CO2, после чего добавляли 1,5 мл DMEM-10% с ЭТС. Культуры возвращали в инкубатор на 70-74 часа.
Свободную среду собирали, вортексировали, центрифугировали при 1,100 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант переносили в новую дозированную пробирку, вортексировали, делали аликвоты и замораживали стоки при -80°C.
Эксперименты с вальпроевой кислотой (ВК)
Вальпроевую кислоту (Sigma-P4543) растворяли до концентрации 1M в воде. Клетки V27 высевали в 6-луночные планщеты за сутки до заражения с концентрацией 6×105 клеток/лунку. 1M вальпроевую кислоту добавляли в 1 мл DMEM-10% с ЭТС для получения концентрации 5 мкМ. Хорошо вортексировали и добавляли в лунки. Планшеты инкубировали в течение шести часов, отбирали среду и добавляли инфекционный сток HSV-1 d27-1 с MOI 0,15 (= плотность посева клеток × 0,15/титр БОЕ стока HSV) на 1 мл DMEM (без добавок).
Добавляли 1 мл инфекционного инокулята на лунку и инкубировали в течение 1-2 часов при 37°C, в инкубаторе 5% CO2, после чего добавляли 1,5 мл DMEM-10% с ЭТС. Культуры возвращали в инкубатор на 70-74 часа. Свободную среду собирали, вортексировали, центрифугировали при 1,100 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант переносили в новую дозированную пробирку, вортексировали, делали аликвоты и замораживали стоки при -80°C.
Производство rAAV
Клетки 293 (2,5×106) одновременно заражали совместно векторами rHSV-rep2/cap2 и rHSV-EGFP, как описано Kang et al., Gene Ther (2009) 16:229-239. Через 2-4 часа после заражения инфицированную среду заменяли DMEM +10% ЭТС, в объеме эквивалентном двойному объему культуры до заражения. В момент сбора клеток клеточный осадок замораживали при -80°C. Титры DRP количественно определяли путем полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR) в термоциклере с 96-луночным блоком (Applied Biosystems; 7500 Real Time PCR system). Неочищенные образцы подвергали трем циклам замораживания-оттаивания, затем инкубировали в присутствии Бензоназы (250U/мл), 2 мМ MgCl2, Tween 80 (Calbiochem) с конечной концентрацией 1% и инкубировали при 37°C в течение 60 мин, с последующим расщеплением 0,25% Трипсином (Gibco) при 50°C в течение 60 мин. Наконец, обрабатывали ДНКазой I (50 Ед/мл; Promega) при 37°C в течение 30 мин, а затем денатурировали при 95°C в течение 20 мин. Линеаризованную плазмиду pDC67/+SV40 использовали для получения стандартных кривых. Следующий набор праймеров-зондов был специфическим для поли(A)-последовательности вируса обезьян 40 (SV40): rAAV-F: 5'-AGCAATKGCATCACAAATTTCACAA-3' (SEQ ID NO:4); rAAV-R: 5'-GCAGACATGATKAGATKCATTGATGAGTT-3' (SEQ ID NO:5); rAAV-зонд: 5'-6-FAM-AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC-TAMRA-3' (SEQ ID NO:6). Амплификацию ПЦР-продукта проводили со следующими параметрами цикла: 1 цикл при 50°C в течение 2 мин, 1 цикл при 95°C в течение 10 мин; 40 циклов с 95°C в течение 15 сек, и 60°C в течение 60 сек.
Анализ генома человека (Human Genome Array)
Конфлюэнтные клетки 293 (2,4×106 клеток в колбе объемом 75 см2) культивировали в DMEM+10% ЭТС в течение приблизительно 20 часов и затем заражали одной бляшкообразующей единицей на клетку (БОЕ/клетку) штамма Maclntyre HSV-1 в течение 90 минут. Через 90 минут после заражения добавляли АТК в концентрации 20 мкМ (конечной). Зараженные клетки собирали через 24 час после заражения. Выделяли из суспензии тотальную РНК в подходящем количестве и качестве с использованием набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) по инструкциям производителя. Полногеномное определение профиля экспрессии проводили на Affymetrix Human U133 Plus 2.0 Array от Asuragen, Inc. В качестве исходного материала использовали 3 мкг тотальной РНК.
В общем, качество РНК, оцененное на биоанализаторе, имело значения RI >9. Гибридизационный анализ и коэффициенты масштабирования находились в диапазоне прохождения контроля качества. После сканирования, необработанные файлы экспрессии CEL обрабатывали при помощи Affymetrix Expression Console vs.1.1.2 (affymetrix.com). Каждый файл CEL был обработан Robust Multichip Analysis (RMA), и обобщенная таблица была экспортирована в виде текстового файла. Все последующие геномные и статистические анализы были сделаны при помощи JMP Genomics (версия 5) (jmp.com/software/genomics). Сначала, использовали этап фильтрации для отсева низкой экспрессии, конкретно, значений ниже 6 в режиме log2, по меньшей мере, в 2 из 8 образцов. Из всех 54,675 зондов Affy U133 Plus2, 41,569 (76%) зондов остались после отсева. Также наблюдали два положительных контроля, головной мозг человека и объединенную универсальную референсную РНК человека, соответственно, которые хорошо гибридизовались. Из дальнейшего анализа эти два образца были исключены.
Метод главных компонент выявил две различных популяции, а именно, образцы, обработанные и необработанные HSV. Выделение первой главной компоненты (91,7%), таким образом, объясняется влиянием HSV по сравнению с контрольным растворителем. Данные были нормализованы по среднему по каждой пробе для получения среднего сигнала, равного 0. Проводили дисперсионный анализ (ANOVA) для выявления значительно отличающихся транскриптов между HSV по сравнению с контрольным растворителем, АТК по сравнению с контрольным растворителем, HSV+AVA по сравнению с контрольным растворителем, и HSV+АТК по сравнению с HSV отдельно. Поправки на множественные сравнения не вводили, и гены считали значимыми при значении p меньше 0,01.
Использовали самоорганизующуюся карту для исследования паттернов экспрессии в контрольным растворителе, HSV1, и HSV1+АТК. Желательно было найти специфические транскрипты, которые или активируются или подавляются при обработке АТК. Был обнаружен отдельный кластер генов, которые продемонстрировали некоторую стимуляцию в присутствии HSV, а коррекция по АТК вернула эти гены обратно на исходный уровень контрольного растворителя. Аналогично, был также обнаружен кластер генов, которые подавлялись HSV по сравнению с контрольным растворителем, а затем активировались при обработке АТК. Эти кластеры были названы Кластеры A и B, соответственно (см., таблицы 1 и 2). Анализ был завершен запросом о биологических функциях этих кластеров с использованием программного обеспечения GeneGO (genego.com).
RT2Profiler™ PCR Array (SABiosciences-QIAGEN)
6×105 клеток 293 (от AGTC) заражали штаммом McIntyre wtHSV-1 с MOI 1 в присутствии DMEM и 10% ЭТС с наличием или отсутствием 50 мкМ АТК в течение 1-2 часов и разводили до 40% при помощи DMEM и 10% ЭТС (конечная концентрация АТК 20 мкм). Собирали по три образца тотальной РНК через 24 часа с использованием набора Qiagen RNeasy mini, обрабатывали ДНКазой на колонке и элюировали. Тройные образцы элюата РНК комбинировали и проводили измерения O.D. элюата на спектрофотометре при 260 и 280 нм для определения концентрации. Образец РНК конвертировали в матричную кДНК с использованием набора для первой цепи SABiosciences RT2. Затем использовали кДНК в ПЦР-анализе пути передачи сигнала JAK/STAT человека (PAHS-039A).
Пример 1
Ингибирование уровней iNOS, индуцированных HSV, на клетках V27 с использованием АТК
Клетки V27 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Hyclone, Waltham, MA) заражали вектором HSV-1 d27.1 при MOI 1 и обрабатывали 30 мкМ АТК (Sigma, St. Louis, MO), с наличием или отсутствием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Также проводили контрольные эксперименты без АТК. Лизаты клеток V27 получали через 24 часа после заражения (h.p.i.), проводили Вестерн-блоттинги лизатов и детектировали белок iNOS с использованием очищенного кроличьего антитела анти-iNOS/NOS тип II ПАТ (BD Biosciences, Кат. № 610332). Результаты показаны на фигуре 1.
Как показано, заражение HSV вызвало экспрессию iNOS в тех культурах, которые не содержали АТК (линии 4 и 5). Экспрессия iNOS была ингибирована в присутствии 30 мкМ АТК (линии 2 и 3). Наличие или отсутствие 10% ЭТС не повлияло на экспрессию iNOS.
Пример 2
Оптимизация протокола АТК-HSV
Для того чтобы проверить, может ли АТК повысить урожай вектора rHSV-1 d27-l (d27-1) в клетках V27, добавляли АТК в среду во время заражения (Этап 1) или этапов разведения (Этап 2) (фигура 2A). Заражение d27-l проводили при MOI=0,15 в 2/5 от конечного объема среды и оставшиеся 3/5 среды добавляли во время этапа разведения.
Обработка АТК замедляла формирование бляшек HSV-1 или клеточный лизис в монослоях клеток V27. Цитопатическое действие (CPE) во время сбора клеток, через 72 часа после заражения (hpi), находилось в пределах 20-60% по сравнению с 100% CPE в отсутствие АТК.
Обработка АТК на этапе заражения HSV-1 (АТК на Этапе 1) показала повышенные титры d27-1 в супернатантах клеток V27, собранных через 72 часа после заражения (фигура 4B). Оптимальная концентрация АТК при добавлении на этапе заражения (АТК I) составила 50 мкМ, и затем была разведена до конечной концентрации 20 мкМ АТК во время этапа разведения при добавлении оставшихся 3/5 объема среды. В этом случае, АТК повышала титры d27-1 в супернатанте во время сбора (72 часа после заражения) приблизительно в 10 раз: от 4,0±0,3×107 DRP/мл или 1,4±0,2×107 PFU/мл до 3,7±0,2×108 DRP/мл или 1,2±0,3×108 БОЕ/мл (фигура 4B).
Для того чтобы определить, какие концентрации и условия для добавления АТК оказывают влияние на урожаи HSV, проводили следующие эксперименты. Добавляли АТК в различных концентрациях к культурам V27, зараженным векторами HSV-1 d27-1, или в шестилуночных планшетах (фигура 2B) или в колбах T150 (фигура 2C) в два этапа, как описано далее. На Этапе 1 протокола, клетки V27 инфицировали вектором rHSV с 0,15 MOI в 2/5 от конечного объема DMEM с 10% ЭТС и концентрациями АТК 0-60 мкМ. Клетки культивировали в течение 1-2 часа при 37°C для завершения Этапа 1. На Этапе 2 уменьшали концентрацию АТК в пределах диапазона 12-24 мкМ путем добавления 3/5 от конечного объема среды. Клетки культивировали в течение 70-74 часов при 37°C и собирали супернатант. Вирусные титры выражали в виде частиц, устойчивых к ДНКазам (DRP/мл) или Бляшкообразующих единиц (БОЕ/мл) на мл и определяли, как описано выше.
Результаты показаны на фигурах 2B и 2C, а оптимальные концентрации АТК выделены жирным. Как можно видеть, и в шестилуночных планшетах (фигура 2B) и в колбах T150 (фигура 2C) культуры с АТК, добавленной или на Этапе 1 или на Этапе 2, имели значительно более высокие титры HSV, чем без АТК. Кроме того, наиболее высокие титры наблюдали при концентрациях АТК 50 мкМ на Этапе 1, сниженных до 20 мкМ на Этапе 2 (фигура 2B), хотя все концентрации АТК производили более высокие вирусные титры, чем культуры, в которых не было АТК.
Проводили дополнительные эксперименты для определения оптимальных условий и влияния присутствия или отсутствия ЭТС на титр HSV. Наличие сыворотки, конкретно, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), в АТК-содержащей среде было наиболее важным параметром для титра урожая HSV-1, индуцированного АТК-. Добавление АТК в бессывороточную среду во время этапа разведения (АТК на Этапе 2) привело к снижению вирусного титра, при этом титр "DRP" стал ниже контрольного уровня и титр БОЕ/мл не детектировался (фигура 3). Еще более значительное влияние в бессывороточной среде наблюдали, когда АТК добавляли во время этапа заражения, начиная с концентрации 3 мкМ, и оба титра, DRP/мл и БОЕ/мл, оказались ниже предела детекции.
В этом эксперименте, клетки V27 высевали в шестилуночные планшеты за сутки до заражения с 6×105 клеток/лунку. Заражающий 2x раствор HSV получали следующим образом: сток HSV-1 d27.1 добавляли к DMEM (без ЭТС) в 2x титре, чтобы клетки V27 были заражены с конечным MOI 0,15. Получали несколько комбинаций 2x раствора АТК, содержащего или 100 мкМ или 40 мкМ АТК в DMEM и без ЭТС или с 20% ЭТС. Заражающий 2x раствор HSV смешивали в равных объемах или с DMEM -/+ 20%ЭТС или с желаемым 2x раствором АТК -/+ 20% ЭТС, вортексировали, и добавляли 1 мл заражающего инокулята на лунку на Этапе 1. Если лунки содержали АТК на Этапе 1, концентрация была 50 мкМ, и все лунки инкубировали в течение 1-2 часов. На Этапе 2 добавляли дополнительные 1,5 мл комбинаций DMEM -/+ 40 мкМ АТК и -/+20% ЭТС. Если лунки содержали АТК или на Этапе 1 или Этапе 2, конечная концентрация АТК была 20 мкМ. Планшеты возвращали в инкубатор на 70-74 часа, после чего собирали свободную среду, вортексировали, и центрифугировали при 1,100 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатанты переносили в новую дозированную пробирку, вортексировали, делали аликвоты и замораживали стоки при -80°C.
Пример 3
Важность присутствия сыворотки в протоколе АТК-HSV
Проводили дополнительные эксперименты для определения оптимальных условий и влияния присутствия или отсутствия ЭТС на титр HSV. Наличие сыворотки, конкретно, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), в АТК-содержащей среде было наиболее важным параметром для титра урожая HSV-1, индуцированного АТК. Добавление АТК в бессывороточную среду во время этапа разведения (АТК на Этапе 2) привело к снижению вирусного титра, при этом титр "DRP" стал ниже контрольного уровня и титр БОЕ/мл не детектировался (фигура 3). Еще более значительное влияние в бессывороточной среде наблюдали, когда АТК добавляли во время этапа заражения, начиная с концентрации 3 мкМ, и оба титра, DRP/мл и БОЕ/мл, оказались ниже предела детекции.
В этом эксперименте, клетки V27 высевали в шестилуночные планшеты за сутки до заражения с 6×105 клеток/лунку. Заражающий 2x раствор HSV получали следующим образом: сток HSV-1 d27.1 добавляли к DMEM (без ЭТС) в 2x титре, чтобы клетки V27 были заражены с конечным MOI 0,15. Получали несколько комбинаций 2x раствора АТК, содержащего или 100 мкМ или 40 мкМ АТК в DMEM и без ЭТС или с 20% ЭТС.
Заражающий 2x раствор HSV смешивали в равных объемах или с DMEM -/+ 20%ЭТС или с желаемым 2x раствором АТК -/+ 20% ЭТС, вортексировали, и добавляли 1 мл заражающего инокулята на лунку на Этапе 1. Если лунки содержали АТК на Этапе 1, концентрация была 50 мкМ, и все лунки инкубировали в течение 1-2 часов. На Этапе 2 добавляли дополнительные 1,5 мл комбинаций DMEM -/+ 40 мкМ АТК и -/+20% ЭТС. Если лунки содержали АТК или на Этапе 1 или Этапе 2, конечная концентрация АТК была 20 мкМ. Планшеты возвращали в инкубатор на 70-74 часа, после чего собирали свободную среду, вортексировали, и центрифугировали при 1,100 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатанты переносили в новую дозированную пробирку, вортексировали, делали аликвоты и замораживали стоки при -80°C.
Пример 4
Влияние АТК на титры HSV дикого типа в культуре
Фигура 4A показывает титры штаммов KOS и McIntyre wtHSV-1 в супернатантах линий клеток, разрешающих размножение wtHSV-1: клетки 293, HeLa и Vero. Штаммы KOS и McIntyre wtHSV-1 выращивали в клетках 293, HeLa и Vero с использованием протокола АТК-HSV, в котором 50 мкМ АТК добавляли на Этапе 1, конечную концентрацию после Этапа 2 разбавляли до 20 мкМ АТК. Супернатанты, содержащие вирус, собирали через три дня, как описано выше. АТК повышала урожай обоих типов вируса в клетках Vero. Штамм McIntyre wtHSV-1 достигал наиболее высоких титров после индукции АТК в клетках 293, однако АТК, по-видимому, ингибировала рост KOS HSV-1 в клетках 293. Наконец, АТК также, по-видимому, ингибировала оба типа вирусов HSV-1 в клетках HeLa. Двухсторонний дисперсионный анализ (ANOVA); тест Бонферрони; - АТК vs. + АТК: ***: p 0,001, ns: p>0,05; n=4 независимых экспериментов.
Для статистических расчетов проводили большое исследование партии из десяти независимых экспериментов (n=10) в 6-луночных планшетах с наличием или отсутствием АТК, добавленной во время этапа заражения (Этап 1) по сравнению с дефицитным по репликации d27-GFP и также штаммом McIntyre wtHSV-1 для того чтобы исследовать может ли АТК также повысить титр штамма wtHSV-1 (фигура 4B). АТК добавляли в концентрации 50 мМ к кофлюэнтным монослоям клеток, V27 для d27-1 или 293 для McIntyre wtHSV-1, во время этапа заражения (Этап 1), и заражали клетки векторами при MOI=0,15, в то время как АТК разбавляли через один час до конечной концентрации 20 мМ. После добавления АТК, титр d27-1 достоверно повысился в 6,1 раз от 5,4×107 DRP/мл или 1,1×108 DRP/мл (**P<0,01) и титр McIntyre wtHSV-1 достоверно повысился в 9,1 раз от 3,3×108 DRP/мл или 1,0×109 DRP/мл (***P<0,001) при анализе 2-сторонней ANOVA и тесте Бонферрони (фигура 4B).
Пример 5
Влияние АТК в стоках HSV на выработку или вирионы rAAV
Для того чтобы определить влияет ли присутствие АТК во время выработки HSV на урожай вирионов rAAV, вырабатываемях при помощи векторов HSV, проводили следующий эксперимент, показывающий, что на титры rAAV воздействует остаток АТК, присутствующий в стоках rHSV-1, полученных в клетках 293 (фигура 5A). Вектор rAAV-GFP производили путем совместного заражения векторами rHSV-rep2/cap2 и rHSV-EGFP клеток 293 в 60 мм планшетах с использованием АТК-содержащих стоков rHSV-1, приготовленных при различных концентрациях АТК (конечные концентрации 12 мкМ или 20 мкМ) (см. Материалы и способы). Титр rAAV в DRP/мл был слегка повышен в 1,3 раза при использовании стока rHSV-rep2/cap2, который получали с 20 мкМ АТК, добавленной во время заражения (АТК на Этапе 1), по сравнению с контролем "Без АТК" (*p<0,05), где концентрация АТК во время выработки rAAV была приблизительно 3 мкМ. Не выявили никакого достоверного повышения титра rAAV при использовании стока rHSV-rep2/cap2, который получали с 12 мкМ АТК (фигура 5A). Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA); тест Тьюки:*p<0,05; 20 мкМ АТК по сравнению с без АТК; n=4 независимых экспериментов.
В другом эксперименте, было показано, что АТК повышает титр rAAV, когда 10 мкМ АТК добавляют непосредственно в среду с клетками 293 в течение 2 часов этапа совместного заражения rHSV-rep2/cap2 и rHSV-EGFP. Этого влияния не наблюдали, когда концентрации АТК были выше 20 мкМ (фигура 5B).
Пример 6
Механизм действия АТК
Для того чтобы прояснить механизм действия АТК путем анализа генома человека, и с учетом факта, что Vero и V27 являются линиями клеток, полученными от обезьяны, размножение wtHSV-1 тестировали в нескольких клеточных линиях человека (фигуры 4A-4B). Размножение двух штаммов дикого типа HSV-1 (wtHSV-1), KOS и McIntyre, сравнивали в трех линиях клеток: эмбриональной почки человека 293 (клетки 293), клетки рака шейки матки человека HeLa и клетки эпителия почки африканской зеленой мартышки Vero. Эксперименты проводили в среде, содержащей 10% ЭТС, с последующей схемой протокола АТК I, где 50 мкМ АТК добавляли во время этапа заражения и далее разводили до конечной концентрации АТК 20 мкМ (см. Материалы и способы). В полученных от человека клетках 293 только титр вируса wtHSV-1 McIntyre значимо повысился из-за АТК, от 1,4×108 DRP/мл до 1,2×109 DRP/мл (***p<0,001). В клетках Vero АТК значимо повысила титры только штамма KOS wtHSV-1 от 1,7×108 DRP/мл до 9,1×108 DRP/мл (***p<0,001; оба статистических теста: двухсторонний ANOVA, тест Бонферрони; n=4). Неожиданно, в клетках HeLa, АТК, кажется, подавляет размножение обоих штаммов KOS и McIntyre HSV-1.
Для выявления генетических профилей клеточного ответа на заражение wtHSV-1 McIntyre, проводили транскрипционное профилирование при помощи Affymetrix Human U133 Plus 2.0 Array на клетках 293, которые были или с имитацией обработки, или обработаны АТК (АТК), заражены wtHSV-1 McIntyre (HSV) или обработаны АТК и заражены wtHSV-1 McIntyre(HSV&АТК) в течение 24 часов. Изменения в экспрессии генов, вызванные заражением или обработкой АТК, выявляли путем сравнения уровня экспрессии гена для каждого зонда с уровнем экспрессии соответствующего образца унинфицированных клеток. Заражение HSV-1 само по себе оказывало серьезное воздействие на профиль экспрессии генов в клетках 293 по сравнению с генетическим профилем необработанных клеток.
Сначала, использовали этап фильтрации для отсева низкой экспрессии, и из всех 54,675 зондов Affy U133 Plus2, 41,569 (76%) зондов остались после отсева.
Метод главных компонент выявил две различных популяции, а именно, образцы, обработанные и необработанные HSV. Проводили дисперсионный анализ (ANOVA) для выявления значительно отличающихся транскриптов между HSV по сравнению с контрольным растворителем, АТК по сравнению с контрольным растворителем, HSV+AVA по сравнению с контрольным растворителем, и HSV+АТК по сравнению с HSV отдельно. Гены считали значимыми при значении p меньше 0,01. Использовали самоорганизующуюся карту для исследования паттернов экспрессии в контрольным растворителе, HSV1, и HSV1+АТК. Был обнаружен отдельный кластер генов, Кластер A и B (Таблицы 1 и 2), который показал изменения в транскрипционных профилях, вызванные HSV-1, и их коррекцию АТК, которая вернула эти гены обратно к исходному уровню контрольного растворителя.
Биологические функции этих кластеров анализировали в GeneGo. Кластер A (таблица 2) представлял собой 58 зондов, которые показали усиление экспрессии в HSV-1 и подавление после добавления АТК. Эти гены были преимущественно вовлечены в передачу воспалительного сигнала IgE и ИФН, и в общий иммунный ответ. Кластер B (таблица 1) представлял собой 152 зонда, которые показали снижение экспрессии из-за HSV-1 и их последующую активацию АТК за счет возвращения их обратно к исходному уровню контрольного растворителя. Гены в этом кластере были преимущественно вовлечены в клеточный цикл G1/S, передачу сигнала в PTEN, и развитие, опосредованное WNT. Например, АТК в присутствии HSV-1 повышает экспрессию генов CDC25A, CDKNIA, CDKNIC, CCNK, CNNM2 из каскада прохождения клеточного цикла и генов из каскада Ras/Raf/MEK, в том числе FOXC1, FOXD3, FOXO3 (См. таблицу 1).
Таблицы 3A и 3B показывают снижение экспрессии nNOS, iNOS и eNOS в образцах HSV-АТК при анализе Affymetrix Gen Array и снижение экспрессии iNOS в образцах HSV+АТК при анализе микропанели Qiagene SAB Jak-Stat RT-PCR.
Пример 7
Влияние дексаметазона на урожаи HSV
Для того чтобы определить, повышает ли также ингибитор iNOS дексаметазон урожаи rHSV в культуре, проводили следующий эксперимент (фигура 6). Он показывает влияние дексаметазона (Dex) на вирусный титр d27-1/GFP HSV-1. Конечные титры d27-1/GFP HSV-1 были, в основном, слегка повышены после предварительной обработки dex или обработки по сравнению с необработанным контролем.
Клетки V27 высевали в шестилуночные планшеты за сутки до заражения при 6×105 клеток/лунку, на следующие сутки добавляли различные концентрации дексаметазона (dex) в лунки или до заражения HSV-1 (предварительная обработка) или во время заражения (обработка) в 2/5 объема среды DMEM-10% ЭТС. Через 1-2 часа инкубации при 37°C, добавляли 3/5 объема DMEM-10% ЭТС. Культуры возвращали в инкубатор, и собирали супернатант через 70-74 часа. Данные показаны в виде среднего значения титров + S.D. в БОЕ/мл (n=2).
Пример 8
Влияние вальпроевой кислоты на урожаи HSV
Для того чтобы определить, повышает ли также ингибитор iNOS вальпроевая кислота урожаи rHSV в культуре, проводили следующий эксперимент. На фигуре 7 представлено влияние предварительной обработки вальпроевой кислотой (ВК) на вирусный титр d27-1/GFP HSV-1. ВК в концентрации 5 мМ слегка повысила титр d27-1/GFP HSV-1, однако концентрации ниже и выше 5 мМ, по-видимому, оказывают ингибирующее действие на титр d27-1/GFP HSV-1 по сравнению с необработанным контролем.
Клетки V27 высевали в шестилуночные планшеты за сутки до заражения при 6×105 клеток/лунку, на следующие сутки добавляли различные концентрации ВК в лунки. Планшеты инкубировали в течение 6 часов, отбирали среду, добавляли 2/5 объема среды, содержащей заражающий сток HSV-1 d27-1, и инкубировали в течение 1-2 часов при 37°C, после чего добавляли 3/5 объема среды DMEM 10% ЭТС. Культуры возвращали в инкубатор, и собирали супернатант через 70-74 часа.
Как показано в вышеуказанных примерах, АТК в микромолярных концентрациях повышает урожай вектора HSV-1. Этот факт важен как для широкомасштабной продукции HSV, так и для выработки векторов rHSV и rAAV. Кроме того, неожиданно, присутствие АТК в стоках rHSV-1 не оказывает негативного влияния на урожай rAAV. Этот результат является неожиданным, поскольку известно, что АТК в миллимолярных количествах и более высоких концентрациях является противовирусным средством (Cushman et al., J. Med. Chem. (1991) 34:329-337; Zhang et al., Antiviral Res. (1999) 43:23-35; Yap et al., Computational ВЫ. and Chem. (2005) 29:212-219; De Clercq, Advents, Advances, and Adventures Med. Res. Rev. (2011) 31:118-160).
В бессывороточной среде, но не в присутствии сыворотки (10% ЭТС), авторы изобретения также наблюдали возможное противовирусное влияние АТК в микромолярных концентрациях.
Также как показано в настоящем документе, обработка АТК замедляет формирование бляшек HSV-1 и лизис клеток в монослоях клеток V27 и цитопатическое действие (CPE), что свидетельствует о противоапоптозных свойствах. Механизм действия АТК, связанный с повышением урожая HSV-1, по-видимому, включает изменение факторов, необходимых для выработки HSV-1 и уменьшения клеточного внутреннего противовирусного иммунного ответа, который отвечает за удаление вируса. Из вышеописанного анализа генома человека, было обнаружено, что заражение HSV-1 само по себе оказывает сильное влияние на профиль экспрессии генов в клетках 293, и что влияние АТК в основном наблюдается в клетках V27, обработанных и HSV-1, и АТК. Гены, участвующие в клеточном цикле G1/S, передаче сигнала через PTEN, и развитии, опосредованном WNT, были значительно подавлены HSV-1 и активированы после добавления АТК.
Гены, преимущественно вовлеченные в передачу воспалительного сигнала IgE и ИФН, и общий иммунный ответ, имели сниженную экспрессию из-за HSV-1 и были супрессированы после добавления АТК. В присутствии HSV-1, АТК повышает экспрессию генов CDC25A, CDKNIA, CDKNIC, CCNK, CNNM2 из каскада прохождения клеточного цикла и генов из каскада Ras/Raf/MEK, в том числе FOXC1, FOXD3, FOXO3.
Тот факт, что АТК может повышать урожай HSV-1 является важным, потому что необходимы более высокие урожаи векторов HSV-1 для широкомасштабного производства для генотерапии и других применений.
Таким образом, описаны способы для увеличения урожая вирусов с использованием ингибиторов iNOS. Хотя предпочтительные варианты осуществления рассматриваемого изобретения были описаны в некоторых деталях, следует понимать, что можно производить очевидные вариации в пределах сущности и объема изобретения, определенных в настоящем документе.
Таблица 1. Список генов кластера B: Гены, супрессированные HSV и регулируемые HSV+АТК |
||||
Набор зондов_ID | Символ гена | Название гена | Оценка HSV+АТК в сравнении с HSV | Значение Р для оценки HSV+АТК в сравнении с HSV |
230304_at | - | - | 2,1691 | 0,0001 |
225806_at | JUB | jub, гомолог ajuba (Xenopus laevis) | 2,126171 | 0,0004 |
202935_s_at | SOX9 | SRY (определяющий пол участок Y-хромосомы)-бокс 9 | 1,855105 | 0,000046 |
204790_at | SMAD7 | член 7 семейства SMAD | 1,797951 | 0,0029 |
214633_at | SOX3 | SRY (определяющий пол участок Y-хромосомы)-бокс 3 | 1,797254 | 0,000007 |
210512_s_at | VEGFA | Сосудистый эндотелиальный фактор роста А | 1,754719 | 0,000021 |
216652_s_at | DR1 | Негативный регулятор транскрипции 1, TBP-связывающий (негативный кофактор 2) | 1,745529 | 0,0036 |
205932_s_at | MSX1 | msh гомеобокс 1 | 1,726634 | 6,90Е-06 |
209348_s_at | MAF | v-maf гомолог онкогена мышечно-апоневротической саркомы (птиц) | 1,685705 | 0,0073 |
217028_at | CXCR4 | Рецептор хемокинов 4 (C-X-C мотив) | 1,652962 | 0,0093 |
218251_at | MID1IP1 | Протеин 1, взаимодействующий с MID1 (гомолог специфического для гаструляции G12 (данио рерио)) | 1,642017 | 0,0064 |
1553764_a_at | JUB | jub, гомолог ajuba(Xenopus laevis) | 1,623019 | 0,0017 |
214446_at | ELL2 | фактор элонгации 2 РНК-полимеразы II | 1,602283 | 0,0001 |
227718_at | PURB | Белок В, связывающий пурин-богатые элементы | 1,59314 | 0,0019 |
219624_at | BAG4 | Атаноген 4, ассоциированный с BCL2 | 1,578527 | 0,0007 |
225642_at | KTI12 | Гомолог KTI12, ассоциированный с хроматином (S. cerevisiae) | 1,566082 | 0,0002 |
203705_s_at | FZD7 | frizzled гомолог 7 (Drosophila) | 1,54382 | 0,0002 |
222696_at | AXIN2 | Аксин 2 | 1,526076 | 0,0066 |
202007_at | NID1 | Нидоген 1 | 1,521713 | 0,0029 |
226858_at | CSNK1E | казеинкиназа 1, эпсилон | 1,51752 | 0,0002 |
57739_at | DND1 | Гомолог 1 терминальной стадии дифференцировки (данио рерио) | 1,515518 | 0,0005 |
1558290_a_at | PVT1 | Pvtl онкоген (не кодирующий белок) | 1,515288 | 0,0016 |
215694_at | SPATA5L1 | Подобный ассоциированному со сперматогенезом-5, 1 |
1,51283 | 0,0012 |
206302_s_at | NUDT4/// NUDT4P1 |
nudix (нуклеозид дифосфат связанная часть Х)-тип, мотив 4/// nudix (нуклеозид дифосфат связанная часть Х)-тип, мотив 4, псевдоген 1 | 1,49443 | 0,0073 |
218486_at | KLF11 | Kruppel-подобный фактор 11 | 1,493386 | 0,0006 |
201695_s_at | NP | Нуклеозидфосфорилаза | 1,492386 | 0,0004 |
203002_at | AMOTL2 | Ангиомотин-подобный 2 | 1,489062 | 0,0093 |
227195_at | ZNF503 | белок с цинковыми пальцами 503 | 1,478008 | 0,0094 |
238012_at | DPP7 | Дипептидилпептидаза 7 | 1,471194 | 0,0003 |
209905_at | HOXA9 | гомеобокс A9 | 1,46661 | 0,0003 |
209188_x_at | DR1 | Негативный регулятор транскрипции 1, TBP-связывающий (негативный кофактор 2) | 1,4541 | 0,0001 |
221168_at | PRDM13 | Содержащий PR-домен, 13 | 1,448075 | 0,0043 |
213338_at | TMEM158 | Трансмембранный белок 158 | 1,436626 | 0,0001 |
209098_s_at | JAG1 | «Зазубренный» белок типа 1 (синдром Алажиля) | 1,433177 | 0,0001 |
206300_s_at | PTHLH | Гормон, подобный паратиреоидному гормону | 1,430301 | 0,0004 |
220018_at | CBLL1 | Подобный-1 экотропной ретровирусной трансформирующей последовательности Cas-Br-M (мышь) | 1,427214 | 0,00003 |
226284_at | ZBTB2 | Белок с цинковыми пальцами и содержащий BTB- домен, 2 | 1,421748 | 6,50Е-06 |
213348_at | CDKN1C | ингибитор 1C циклин-зависимой киназы (p57, Kip2) | 1,413731 | 0,0001 |
209565_at | RNF113A | Белок 113A с цинковым пальцем RING-типа | 1,413412 | 7,80Е-0,6 |
239696_at | - | - | 1,413287 | 0,0006 |
212696_s_at | RNF4 | Белок 4 с цинковым пальцем RING-типа | 1,408882 | 0,0034 |
214651_s_at | HOXA9 | гомеобокс A9 | 1,404355 | 0,000042 |
217741_s_at | ZFAND5 | Белок 5 с цинковым пальцем и доменом AN1-типа | 1,401465 | 0,0003 |
229309_at | ADRB1 | Адренергический рецептор бета-1 | 1,398788 | 0,0008 |
228953_at | WHAMM | Гомолог белка WAS, ассоциированный с актином, мембранами Гольджи и микротрубочками | 1,392654 | 0,0013 |
1554522_at | CNNM2 | Циклин М2 | 1,389108 | 0,0049 |
204913_s_at | SOX11 | SRY (определяющий пол участок Y-хромосомы)-бокс 11 | 1,385923 | 0,0004 |
231901_at | C19orf52 | Открытая рамка считывания 52, хромосома 19 | 1,378798 | 0,0034 |
224314_s_at | EGLN1 | Гомолог 1 egl nine (C. elegans) | 1,375757 | 0,0001 |
209099_x_at | JAG1 | «Зазубренный» белок типа 1 (синдром Алажиля) | 1,374203 | 0,0029 |
205555_s_at | MSX2 | msh гомеобокс 2 | 1,368114 | 0,00003 |
216035_x_at | TCF7L2 | Белок 2, подобный транскрипционному фактору 7 (специфический для Т-клеток, HMG-бокс) | 1,368112 | 0,0003 |
225824_at | CCNK | циклин К | 1,363977 | 0,0076 |
209201_x_at | CXCR4 | Рецептор хемокинов 4 (C-X-C мотив) | 1,360311 | 0,0001 |
235147_at | FU32063 | Гипотетический LOC150538 | 1,357503 | 0,0008 |
204527_at | MYO5A | миозин VA (тяжелая цепь 12, миоксин) | 1,356721 | 0,0017 |
242963_at | SGMS2 | сфингомиелинсинтаза 2 | 1,356199 | 0,0008 |
218247_s_at | MEX3C | Гомолог mex-3С (С. elegans) | 1,3496 | 0,0001 |
207654_x_a t | DR1 | Негативный регулятор транскрипции 1, TBP-связывающий (негативный кофактор 2) | 1,348295 | 9,30E-06 |
209357_at | CITED2 | Трансактиватор, взаимодействующий с Cbp/p300, с Glu/Asp-богатым карбокси-концевым доменом, 2 | 1,347165 | 0,0002 |
202241_at | TRIB1 | tribbles, гомолог 1 (Drosophila) | 1,340674 | 0,0009 |
209372_x_a t | TUBB2A///TUBB2B | тубулин, бета 2A///тубулин, бета 2B | 1,339095 | 0,0001 |
205541_s_a t | GSPT2 | Белок перехода из G1 в S фазу, 2 | 1,33517 | 0,005 |
1568815_a _at | DDX50 | DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) бокс полипептид 50 | 1,329483 | 0,0043 |
204805_s_at | H1FX | Семейство гистонов H1, член X | 1,324347 | 0,0013 |
213152_s_a | SFRS2B | Фактор сплайсинга, аргинин/серин-богатый, 2B | 1,322967 | 6,70E-06 |
225699_at | C7orf40 | Хромосома 7, открытая рамка считывания 40 | 1,321373 | 0,0014 |
218295_s_at | NUP50 | нуклеопорин 50kDa | 1,318229 | 0,0014 |
224739_at | PIM3 | pim-3 онкоген | 1,31654 | 0,0001 |
214911_s_at | BRD2 | Белок 2, содержащий бромодомен | 1,313049 | 0,0015 |
208938_at | PRCC | Сосочковая карцинома клеток почки (ассоциированная с транслокацией) | 1,304724 | 0,000041 |
206907_at | TNFSF9 | Суперсемейство фактора некроза опухоли (лиганд), член 9 | 1,295621 | 0,0032 |
202284_s_a t | CDKN1A | ингибитор 1А циклин-зависимой киназы (p21, Cip1) | 1,28534 | 0,0001 |
206915_at | NKX2-2 | NK2 гомеобокс 2 | 1,280773 | 0,000021 |
215087_at | C15orf39 | хромосома 15, открытая рамка считывания 39 | 1,277596 | 0,0013 |
202219_at | SLC6A8 | Семейство переносчиков растворенных веществ 6 (транспортер нейротрансмиттеров, креатин), член 8 | 1,273131 | 0,0006 |
202704_at | TOB1 | трансдуктор ERBB2,1 | 1,272848 | 0,0016 |
213038_at | RNF19B | Белок с цинковыми пальцами 19B | 1,27284 | 0,0022 |
213150_at | HOXA10 | гомеобокс A10 | 1,272477 | 0,008 |
204383_at | DGCR14 | Ген 14 из критического региона для синдрома ДиДжордже | 1,268562 | 0,000043 |
1553613_s_at | FOXC1 | forkhead бокс C1 | 1,26852 | 0,0003 |
218398_at | MRPS30 | Рибосомальный белок митохондрий S30 | 1,266043 | 0,0057 |
202166_s_at | PPP1R2 | Регуляторная (ингибиторная) субъединица 2 протеинфосфатазы 1 | 1,264115 | 0,00003 |
235004_at | RBM24 | Белок 24 с РНК-связывающим мотивом | 1,260011 | 0,0086 |
223742_at | MRPL4 | Рибосомальный белок митохондрий L4 | 1,251284 | 0,000049 |
211756_at | PTHLH | Гормон, подобный паратиреоидному гормону | 1,24883 | 0,0016 |
209211_at | KLF5 | Kruppel-подобный фактор 5 (кишечный) | 1,241821 | 0,0003 |
225796_at | PXK | Содержащая PX-домен серин-треониновая киназа | 1,239504 | 0,0002 |
225434_at | DEDD2 | Белок 2, содержащий домен смерти | 1,23754 | 0,000044 |
208686_s_at | BRD2 | Белок 2, содержащий бромодомен | 1,229145 | 0,0001 |
217821_s_a t | WBP11 | Белок 11, связывающий WW-домен | 1,218077 | 0,0002 |
244519_at | ASXL1 | Подобный белку дополнительных половых гребней, 1 (Drosophila) | 1,208056 | 0,000044 |
208415_x_at | ING1 | Семейство ингибиторов роста, член 1 | 1,184054 | 0,0017 |
216511_s_a t | TCF7L2 | Белок 2, подобный транскрипционному фактору 7 (специфический для Т-клеток, HMG-бокс) | 1,174677 | 0,0024 |
235959_at | - | - | 1,172362 | 0,0008 |
243707_at | - | - | 1,171741 | 0,0005 |
227852_at | RP9 | Пигментная дистрофия сетчатки 9 (аутосомно-доминантная) | 1,171328 | 0,0002 |
1555772_a_at | CDC25A | Белок клеточного цикла деления 25, гомолог A (S. pombe) | 1,170244 | 0,0051 |
221841_s_at | KLF4 | Kruppel-подобный фактор 4 (кишечник) | 1,16333 | 0,0006 |
214789_x_at | SFRS2B | Фактор сплайсинга, аргинин/серин богатый 2B | 1,162135 | 0,0001 |
216997_x_at | TLE4 | Трансдуцин-подобный энхансер расщепления 4 (E(spl) гомолог, Drosophila) | 1,159916 | 0,0001 |
205780_at | BIK | Киллер, взаимодействующий с BCL2 (индуцирующий апоптоз) | 1,158085 | 0,0001 |
212075_s_at | CSNK2A1 | казеинкиназа 2, альфа 1 полипептид | 1,156022 | 0,0049 |
228820_at | XPNPEP3 | X-пролил аминопептидаза (аминопептидаза P) 3, предполагаемая | 1,152448 | 0,0008 |
209653_at | KPNA4 | Кариоферин альфа 4 (импортин альфа 3) | 1,146903 | 0,0004 |
209457_at | DUSP5 | Фосфатаза 5 с двойной специфичностью | 1,144663 | 0,0016 |
224671_at | MRPL10 | Рибосомальный белок митохондрий L10 | 1,144585 | 0,0061 |
200618_at | LASP1 | UM и SH3 белок 1 | 1,140405 | 0,0097 |
228931_at | COQ4 | коэнзим Q4, гомолог (S. cerevisiae) | 1,136018 | 0,0008 |
224583_at | COTL1 | Коактозин-подобный 1 (Dictyostelium) | 1,128103 | 0,001 |
238738_at | PSMD7 | Субъединица 26S протеасомы (просома, мультикаталитическая), не-АФТазная, 7 | 1,128031 | 0,0062 |
202501_at | MAPRE2 | Белок, ассоциированный с микротрубочками, семейство RP/EB, член 2 | 1,12791 | 0,0046 |
214321_at | NOV | Ген со сверхэкспрессией при нефробластоме | 1,123481 | 0,0004 |
202936_s_a t | SOX9 | SRY (определяющий пол участок Y-хромосомы)-бокс 9 | 1,12181 | 0,0054 |
222163_s_a t | SPATA5L1 | подобный ассоциированному со сперматогенезом 5, 1 | 1,116794 | 0,0013 |
241612_at | FOXD3 | forkhead бокс D3 | 1,11263 | 0,0041 |
20243l_s_at | MYC | v-myc вирусный онкоген миеломатоза, гомолог (птицы) |
1,105333 | 0,0007 |
215933_s_at | HHEX | Гематопоэтически экспрессирующийся гомеобокс | 1,105321 | 0,0002 |
204132_s_at | FOXO3/// FOXO3B |
forkhead бокс 03///forkhead бокс 03, псевдоген | 1,100606 | 0,0007 |
201041_s_at | DUSP1 | Фосфатаза 1 с двойной специфичностью | 1,09043 | 0,0004 |
230233_at | - | - | 1,087609 | 0,0005 |
215223_s_at | SOD2 | Супероксид дисмутаза 2, митохондриальная | 1,087493 | 0,0001 |
225689_at | C3orf39 | хромосома 3, открытая рамка считывания 39 | 1,080337 | 0,003 |
223132_s_at | TPJM8 | Белок 8, содержащий трехкомпонентный мотив | 1,073976 | 0,0065 |
203313_s_at | TGIF1 | гомеобокс 1 фактора, индуцированного TGFB | 1,073363 | 0,0008 |
201461_s_a t | MAPKAPK2 | Протеинкиназа 2, активированная митоген-активированной протеинкиназой | 1,070375 | 0,0088 |
236174_at | - | - | 1,069052 | 0,0013 |
223679_at | CTNNB1 | катенин (белок, ассоциированный с кадгерином), бета 1, 88kDa | 1,060314 | 0,0044 |
204039_at | СЕВРА | CCAAT/энхансер-связывающий белок (C/EBP), альфа | 1,052213 | 0,01 |
234302_s_at | ALKBH5 | alkB, восстановление алкилирования, гомолог 5 (E. coli) | 1,049599 | 0,0043 |
223290_at | PDXP | пиридоксаль (пиридоксин, витамин B6) фосфатаза | 1,048187 | 0,0022 |
226644_at | MIB2 | mindbomb гомолог 2 (Drosophila) | 1,041356 | 0,0011 |
206363_at | MAF | v-maf гомолог онкогена мышечно-апоневротической саркомы (птиц) | 1,037386 | 0,0008 |
1555639_a_at | RBM14 | Белок 14 с РНК-связывающим мотивом | 1,035626 | 0,0003 |
222527_s_a t | RBM22 | Белок 22 с РНК-связывающим мотивом | 1,027056 | 0,0008 |
213419_at | APBB2 | Белок, связывающий белок-предшественник амилоида бета (A4), семейство B, член 2 | 1,025879 | 0,0009 |
213360_s_at | POM 121/// POM121C |
POM121 мембранный гликопротеин (крыса)///POM121 мембранный гликопротеин С | 1,023715 | 0,0013 |
225832_s_at | DAG LB | Диацилглицерол липаза, бета | 1,001586 | 0,0001 |
212445_s_at | NEDD4L | Белок, подобный экспрессирующемуся в предшественниках нервных клеток, подавляемому в процессе развития 4 |
0,997235 | 0,0022 |
224562_at | WASF2 | Семейство белков WAS, член 2 | 0,996687 | 0,0043 |
223389_s_a t | ZNF581 | Белок с цинковыми пальцами 581 | 0,99618 | 0,0004 |
231721_at | JAM3 | Узловая молекула адгезии 3 | 0,989941 | 0,0001 |
203140_at | BCL6 | B-клеточная CLL/лимфома 6 | 0,984695 | 0,0004 |
213823_at | HOXA11 | гомеобокс A11 | 0,974615 | 0,0036 |
1552275_s_at | PXK | Содержащая PX-домен серин/треониновая киназа | 0,973552 | 0,0002 |
52731_at | AMBRA1 | аутофагия/беклин-1 регулятор 1 | 0,970744 | 0,000027 |
238624_at | - | - | 0,970064 | 0,0005 |
210479_s_at | RORA | RAR-связанный рецептор-сирота A | 0,965295 | 0,0006 |
220941_s_at | C21orf91 | открытая рамка считывания 91, хромосома 21 | 0,943651 | 0,0013 |
203234_at | UPP1 | уридинфосфорилаза 1 | 0,932337 | 0,0009 |
202102_s_at | BRD4 | Белок 4, содержащий бромодомен | 0,930432 | 0,0034 |
217775_s_at | BDH11 | ретинолдегидрогеназа 11 (все-транс/9-цис/11-цис) | 0,92863 | 0,0029 |
Таблица 2. Список генов кластера А: Гены, которые были активированы HSV и подавлены HSV+АТК |
||||
Набор зондов_ID | Символ гена | Название гена | Оценка HSV+АТК в сравнении с HSV1 | Значение Р для оценки HSV+АТК в сравнении с HSV1 |
243160_at | - | - | -1,01645 | 0,0022 |
205247_at | NOTCH4 | Notch, гомолог 4 (Drosophila) | -0,93759 | 0,0007 |
219256_s_at | SH3TC1 | Домен SH3 и тетратрикопептидные повторы, 1 | -0,91997 | 0,0021 |
221631_at | CACNA1I | Альфа 1I субъединица потенциалзависимого кальциевого канала T-типа | -0,90394 | 0,0018 |
1569961_at | - | - | -0,89195 | 0,0013 |
220277_at | CXXC4 | CXXC палец 4 | -0,85343 | 0,0054 |
229611_at | LMLN | Лейшманолизин-подобный (семейство металлопептидаз M8) | -0,85329 | 0,0005 |
232341_x_at | HABP4 | Гиалуронан-связывающий белок 4 | -0,84077 | 0,0071 |
242219_at | - | - | -0,83521 | 0,0028 |
233767_at | HHLA1 | Ассоциированный с HERV-H LTR, 1 | -0,8339 | 0,0017 |
236925_at | LOC728288 | гипотетический LOC728288 | -0,81812 | 0,008 |
231905_at | C20orf96 | открытая рамка считывания 96, хромосома 20 | -0,80575 | 0,0041 |
233313_at | - | - | -0,80466 | 0,0011 |
1563507_at | - | - | -0,79441 | 0,0043 |
232456_at | C10orf71 | открытая рамка считывания 71, хромосома 10 | -0,78722 | 0,0067 |
203468_at | CDK10 | Циклин-зависимая киназа 10 | -0,77888 | 0,0035 |
237456_at | - | - | -0,77558 | 0,0085 |
216127_at | PDIA2 | Семейство A протеиндисульфидизомеразы, член 2 | -0,76924 | 0,0049 |
207977_s_a t | DPT | дерматопонтин | -0,76077 | 0,0065 |
224510_s_a t | CLPB | CLPB казеинолитическая пептидаза В, гомолог (E. coli) | -0,75625 | 0,006 |
208267_at | TRPV5 | Временный рецептор потенциального катионного канала, подсемейство V, член 5 | -0,73228 | 0,0091 |
221868_at | PAIP2B | Белок 2В, взаимодействующий с поли(А)-связывающим белком | -0,7284 | 1,10E-06 |
1559439_s_at | C21orf58 | Открытая рамка считывания 58 на хромосоме 21 | -0,7256 | 0,0051 |
1552960_at | LRRC15 | Белок 15, содержащий лейцин-богатые повторы | -0,72214 | 0,0049 |
204413_at | TRAF2 | Фактор 2, ассоцированный с рецептором TNF | -0,69678 | 0,0039 |
213888_s_at | TRAF3IP3 | Протеин 3, взаимодействующий с TRAF3 | -0,69063 | 0,0043 |
1553945_at | GPHB5 | Гликопротеиновый гормон бета 5 | -0,67838 | 0,0003 |
221312_at | GLP2R | Рецептор глюкагоноподобного пептида 2 | -0,67682 | 0,0097 |
1554783_s_at | ARHGEF2 | Фактор 2 Rho/Rac обмена нуклеотида гуанин (GEF) | -0,67352 | 0,0005 |
205567_at | CHST1 | карбогидрат (кератансульфат Gal-6) сульфотрансфераза 1 | -0,67335 | 0,0009 |
232473_at | PRPF18 | PRP18 пре-mRNA процессирующий фактор 18, гомолог (S. cerevisiae) | -0,66869 | 0,0064 |
1565583_at | LOC100291336 | Гипотетический белок LOC100291336 | -0,66137 | 0,0086 |
243638_at | - | - | -0,65654 | 0,0041 |
208608_s_at | SNTB1 | Синтрофин бета 1 (основной компонент 1 белка А1, 59kDa, ассоциированного с дистрофином) | -0,65372 | 0,005 |
1556202_at | SRGAP2 | Белок 2, активирующий SLIT-ROBO Rho ГТФазу | -0,64525 | 0,0034 |
206266_at | GPLD1 | Гликозилфосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза D1 | -0,64321 | 0,0015 |
234659_at | - | - | -0,63414 | 0,007 |
204708_at | MAPK4 | Митоген-активированная протеинкиназа 4 | -0,633 | 0,0045 |
236604_at | BAHCC1 | Содержаший домен BAH и суперспираль, 1 | -0,63262 | 0,0083 |
242129_at | SIN3B | SIN3 гомолог B, регулятор транскрипции (дрожжи) | -0,63025 | 0,0018 |
233029_at | OBSCN | обскурин, цитоскелетный кальмодулин и титин-взаимодействующий RhoGEF | -0,62959 | 0,0049 |
203398_s_at | GALNT3 | UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозаминполипептид N- ацетилгалактозаминилтрансфераза 3 (GalNAc-T3) |
-0,62709 | 0,0016 |
242701_at | TBRG1 | Регулятор 1 трансформирующего фактора роста бета | -0,62074 | 0,0032 |
235083_at | LOC151009 | гипотетический LOC151009 | -0,61926 | 0,004 |
206372_at | MYF6 | Миогенный фактор 6 (геркулин) | -0,6146 | 0,0018 |
1567611_at | - | - | -0,61369 | 0,0061 |
236252_at | - | - | -0,61329 | 0,0041 |
206286_s_at | TDGF1//TDGF3 | Фактор роста 1, полученный из тератокарциномы /// Фактор роста 3, полученный из тератокарциномы, псевдоген | -0,61123 | 0,0012 |
1563263_at | PLCG2 | Фосфолипаза C, гамма 2 (фосфатидилинозитол-специфическая) |
-0,60753 | 0,0003 |
214742_at | AZI1 | Индуцируемый 5-азацитидином, 1 | -0,60464 | 0,0089 |
244656_at | RASL10B | RAS-подобный, семейство 10, член В | -0,6032 | 0,0072 |
1555665_at | - | - | -0,59953 | 0,0088 |
224291_at | CACNG6 | Гамма-субъединица 6 потенциал-зависимого кальциевого канала | -0,59548 | 0,0068 |
235616_at | TSHZ2 | teashirt цинковый палец гомеобокс 2 | -0,59219 | 0,0037 |
237461_at | NLRP7 | Белок 7 семейства NLR, содержащий пириновый домен | -0,58969 | 0,0068 |
223693_s_at | RADIL | Белок с DIL-доменами, ассоциированный с Ras | -0,58969 | 0,0052 |
208454_s_at | PGCP | Плазменная глутаматкарбоксипептидаза | -0,58916 | 0,001 |
216426_at | TCEB1 | Фактор элонгации транскрипции В (SII), полипептид 1 (15kDa, элонгин C) | -0,58852 | 0,002 |
Таблица 3A. Снижение экспрессии nNOS, iNOS и eNOS в образцах HSV+АТК в анализе Affymetrix Gen Array; NOS1=nNOS, NOS2=iNOS, NOS3=eNOS |
||||||||
Набор зондов_ID | Pub ID | Символ | ATA | HSV | HSV+ATA | Значение p ATA | Значение p HSV | Значение p HSV+ATA |
240911_at | AI733341 | NOS1 | 1,02 | 1,71 | 1,5 | 0,872 | 0,009 | 0,024 |
207310_s_at | U31466 | NOS1 | 1 | 2,79 | 1,67 | 0,981 | 0,003 | 0,033 |
AF049656 | - | NOS2 | -1,03 | 2,05 | 1,72 | 0,706 | 0,002 | 0,007 |
205581_s_at | NM_000603 | NOS3 | 1,24 | 2,45 | 1,94 | 0,234 | 0,005 | 0,013 |
Таблица 3B. Снижение экспрессии iNOS в образцах HSV+АТК в анализе Jak-Stat RT-PCR Microarray (SABiosciences (QIAGEN)) |
||||||||
RT2 каталог | Pub ID | Символ | ATA | HSV | HSV+ATA | Значение p ATA | Значение p HSV | Значение p HSV+ATA |
240911_at | AI733341 | NOS1 | 1,02 | 1,71 | 1,5 | 0,872 | 0,009 | 0,024 |
Claims (12)
1. Способ получения вируса герпеса, включающий культивирование клетки, инфицированной указанным вирусом герпеса, в культуре клеток, которая содержит ауринтрикарбоновую кислоту и эмбриональную телячью сыворотку, где ауринтрикарбоновая кислота находится в концентрации от 10 до 60 мкМ и где ауринтрикарбоновая кислота присутствует в количестве, которое повышает урожай вируса герпеса.
2. Способ по п.1, где указанный вирус герпеса представляет собой вирус простого герпеса-1 (HSV-1).
3. Способ по п.2, где указанный HSV-1 представляет собой HSV-1 дикого типа.
4. Способ по п.2, где указанный HSV-1 представляет собой рекомбинантный вектор HSV-1.
5. Способ по п.4, где указанный рекомбинантный вектор HSV-1 представляет собой вектор HSV-1 d27.1.
6. Способ по любому из пп.1-5, где указанный вирус культивируют в клетках 293 или Vero.
7. Способ по п.6, где указанный вирус культивируют в клетках V27.
8. Способ культивирования клетки, инфицированной вектором HSV-1 d27.1, включающий:
(a) заражение клеток V27 вектором HSV-1 d27.1; и
(b) культивирование указанных зараженных клеток V27 в культуре клеток, содержащей ауринтрикарбоновую кислоту в количестве, которое повышает вирусный титр HSV-1 d27.1, и дополнительно содержащей эмбриональную телячью сыворотку, где ауринтрикарбоновая кислота находится в концентрации от 10 до 60 мкМ.
9. Применение ауринтрикарбоновой кислоты для увеличения выхода вируса герпеса, полученного в культуре клеток, где указанная культура клеток дополнительно содержит эмбриональную телячью сыворотку, где указанный вирус герпеса культивируют в клетках 293 или Vero и где ауринтрикарбоновая кислота находится в концентрации от 10 до 60 мкМ.
10. Применение по п.9, где указанные клетки Vero представляют собой клетки V27.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361750175P | 2013-01-08 | 2013-01-08 | |
US61/750,175 | 2013-01-08 | ||
PCT/US2014/010553 WO2014110053A1 (en) | 2013-01-08 | 2014-01-07 | Use of inos inhibitors to increase viral yield in culture |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018144779A Division RU2795456C2 (ru) | 2013-01-08 | 2014-01-07 | ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ iNOS ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЯ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015133205A RU2015133205A (ru) | 2017-02-14 |
RU2676733C2 true RU2676733C2 (ru) | 2019-01-10 |
Family
ID=51167323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015133205A RU2676733C2 (ru) | 2013-01-08 | 2014-01-07 | Использование ингибиторов inos для повышения урожая вирусов в культуре |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11299715B2 (ru) |
EP (3) | EP3266866B1 (ru) |
JP (2) | JP6534933B2 (ru) |
KR (1) | KR102307279B1 (ru) |
CN (1) | CN105008523B (ru) |
AR (1) | AR094389A1 (ru) |
AU (1) | AU2014205604B2 (ru) |
BR (2) | BR122020002822B1 (ru) |
CA (1) | CA2897444A1 (ru) |
DK (1) | DK2943567T3 (ru) |
ES (1) | ES2651763T3 (ru) |
HK (2) | HK1214840A1 (ru) |
HU (1) | HUE037482T2 (ru) |
IL (1) | IL239824B (ru) |
MX (1) | MX360470B (ru) |
NO (1) | NO3050055T3 (ru) |
RU (1) | RU2676733C2 (ru) |
SG (3) | SG10201806715TA (ru) |
TW (1) | TWI608102B (ru) |
WO (1) | WO2014110053A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112553229A (zh) | 2014-11-05 | 2021-03-26 | 沃雅戈治疗公司 | 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸 |
SG11201703281RA (en) | 2014-11-14 | 2017-05-30 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
CN112410339A (zh) | 2014-11-14 | 2021-02-26 | 沃雅戈治疗公司 | 调节性多核苷酸 |
EP3230441A4 (en) | 2014-12-12 | 2018-10-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scaav |
PT3436593T (pt) | 2016-03-28 | 2023-01-31 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc | Métodos de inativação pelo calor de adenovírus |
RU2758488C2 (ru) | 2016-05-18 | 2021-10-28 | Вояджер Терапьютикс, Инк. | Модулирующие полинуклеотиды |
EP3526321A4 (en) | 2016-10-14 | 2020-05-13 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | USE OF TONIFYING AGENTS TO IMPROVE THE YIELD OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS |
EP3601581A4 (en) | 2017-03-22 | 2021-05-19 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | CELL CULTURE METHODS USING HDAC INHIBITORS OR REP PROTEINS |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
CN110835622B (zh) * | 2018-08-16 | 2021-04-27 | 上海药明生物技术有限公司 | 用于调节哺乳动物细胞乳酸代谢的培养基及其应用 |
JP2023520149A (ja) | 2020-03-16 | 2023-05-16 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 組換えアデノ随伴ウイルス収量を増強させるための方法 |
WO2023157976A1 (ja) * | 2022-02-21 | 2023-08-24 | 学校法人日本医科大学 | ウイルスベクター生産性増強剤及びウイルスベクターの製造方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2012335C1 (ru) * | 1991-07-04 | 1994-05-15 | Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней | Ингибитор вируса простого герпеса |
US7262033B1 (en) * | 1998-08-03 | 2007-08-28 | Biovex Limited | Cell lines for the propagation of mutated herpes viruses |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
AU8200191A (en) | 1990-07-09 | 1992-02-04 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
ES2197145T3 (es) | 1991-08-20 | 2004-01-01 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Deptm. Of Health And Human Services | Transferencia de genes mediada por adenovirus al gastrointestinal. |
US7223411B1 (en) | 1992-07-31 | 2007-05-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Herpesvirus replication defective mutants |
ATE228008T1 (de) | 1992-07-31 | 2002-12-15 | Harvard College | Herpesvirus impfstoffe |
US6833271B2 (en) | 1996-12-04 | 2004-12-21 | Medi-Cult A/S | Serum-free cell culture media |
US6783972B1 (en) * | 1998-09-22 | 2004-08-31 | University Of Florida Research Foundation | Methods for large-scale production of recombinant AAV vectors |
US6593123B1 (en) | 2000-08-07 | 2003-07-15 | Avigen, Inc. | Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification |
US7091029B2 (en) | 2002-09-23 | 2006-08-15 | Applied Genetics Technologies Corporation | High titer recombinant AAV production |
US7427396B2 (en) | 2004-06-03 | 2008-09-23 | Genzyme Corporation | AAV vectors for gene delivery to the lung |
CN100348718C (zh) * | 2005-10-18 | 2007-11-14 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种支持hek293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基 |
US8334295B2 (en) * | 2007-06-29 | 2012-12-18 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Pyrimidine derivatives as HIV reverse transcriptase inhibitors |
-
2014
- 2014-01-07 RU RU2015133205A patent/RU2676733C2/ru active
- 2014-01-07 WO PCT/US2014/010553 patent/WO2014110053A1/en active Application Filing
- 2014-01-07 EP EP17184746.0A patent/EP3266866B1/en active Active
- 2014-01-07 AU AU2014205604A patent/AU2014205604B2/en not_active Ceased
- 2014-01-07 CN CN201480012376.2A patent/CN105008523B/zh active Active
- 2014-01-07 SG SG10201806715TA patent/SG10201806715TA/en unknown
- 2014-01-07 DK DK14703459.9T patent/DK2943567T3/en active
- 2014-01-07 KR KR1020157021175A patent/KR102307279B1/ko active IP Right Grant
- 2014-01-07 EP EP19160865.2A patent/EP3521420A1/en not_active Withdrawn
- 2014-01-07 ES ES14703459.9T patent/ES2651763T3/es active Active
- 2014-01-07 CA CA2897444A patent/CA2897444A1/en not_active Abandoned
- 2014-01-07 EP EP14703459.9A patent/EP2943567B1/en active Active
- 2014-01-07 JP JP2015551846A patent/JP6534933B2/ja active Active
- 2014-01-07 US US14/758,785 patent/US11299715B2/en active Active
- 2014-01-07 MX MX2015008861A patent/MX360470B/es active IP Right Grant
- 2014-01-07 SG SG10201913130PA patent/SG10201913130PA/en unknown
- 2014-01-07 HU HUE14703459A patent/HUE037482T2/hu unknown
- 2014-01-07 SG SG11201505333PA patent/SG11201505333PA/en unknown
- 2014-01-07 BR BR122020002822-0A patent/BR122020002822B1/pt active IP Right Grant
- 2014-01-07 TW TW103100466A patent/TWI608102B/zh active
- 2014-01-07 BR BR112015016328-9A patent/BR112015016328B1/pt active IP Right Grant
- 2014-01-08 AR ARP140100065A patent/AR094389A1/es unknown
- 2014-09-26 NO NO14781027A patent/NO3050055T3/no unknown
-
2015
- 2015-07-07 IL IL239824A patent/IL239824B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-03-10 HK HK16102764.2A patent/HK1214840A1/zh unknown
-
2018
- 2018-07-10 HK HK18108963.6A patent/HK1249544A1/zh unknown
-
2019
- 2019-05-28 JP JP2019098958A patent/JP6837094B2/ja active Active
-
2022
- 2022-03-03 US US17/686,245 patent/US20220340883A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2012335C1 (ru) * | 1991-07-04 | 1994-05-15 | Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней | Ингибитор вируса простого герпеса |
US7262033B1 (en) * | 1998-08-03 | 2007-08-28 | Biovex Limited | Cell lines for the propagation of mutated herpes viruses |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
ERLANDSSON A.C. et al., Herpes simplex virus type 1 infection and glicocorticoid treatment regulate veral yield, glucocorticoid receptor and NF-kB levels, Journal of Endocrinology, vol. 175, 2002, pp. 165-176. * |
ERLANDSSON A.C. et al., Herpes simplex virus type 1 infection and glicocorticoid treatment regulate veral yield, glucocorticoid receptor and NF-kB levels, Journal of Endocrinology, vol. 175, 2002, pp. 165-176. OTSUKI A., Histone deacetylase inhibitors augment antitumor efficacy of herpes-based oncolytic viruses, Journal of Molecular Therapy, vol. 16 no. 9, 2008, pp. 1546-1555. MYSKIW C.et al.,"Aurintricarboxylic acid inhibits the early stage of vaccinia virus replication by targeting both cellular and viral factors, Journal of Virology, March 2007, Vol. 81, no. 6, pp. 3027-3032. * |
HE R., et al., "Potent and selective inhibition of SARS coronavirus replication by aurintricarboxylic acid"., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 320, 2004, pp. 1199-1203. * |
KUNZ D., et al., "Dexamethasone differentially affects interleukin 1b- and cyclic AMP-induced nitric oxide synthase mRNA expression in renal mesangial cells", Journal of Biochem, Vol. 304, 1994, pp. 337-340. * |
KUNZ D., et al., "Dexamethasone differentially affects interleukin 1b- and cyclic AMP-induced nitric oxide synthase mRNA expression in renal mesangial cells", Journal of Biochem, Vol. 304, 1994, pp. 337-340. HE R., et al., "Potent and selective inhibition of SARS coronavirus replication by aurintricarboxylic acid"., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 320, 2004, pp. 1199-1203. * |
MYSKIW C.et al.,"Aurintricarboxylic acid inhibits the early stage of vaccinia virus replication by targeting both cellular and viral factors, Journal of Virology, March 2007, Vol. 81, no. 6, pp. 3027-3032. * |
OTSUKI A., Histone deacetylase inhibitors augment antitumor efficacy of herpes-based oncolytic viruses, Journal of Molecular Therapy, vol. 16 no. 9, 2008, pp. 1546-1555. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2676733C2 (ru) | Использование ингибиторов inos для повышения урожая вирусов в культуре | |
US20240158809A1 (en) | High-transducing hsv vectors | |
US20220307052A1 (en) | Recombinant herpesvirales vector | |
US20230293730A1 (en) | Nucleic acid constructs and uses thereof for treating spinal muscular atrophy | |
RU2795456C2 (ru) | ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ iNOS ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЯ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ | |
Baez et al. | Using Herpes Simplex Virus Type 1-Based Amplicon Vectors for Neuroscience Research and Gene Therapy of Neurologic Diseases |