JP6534933B2 - 培養物中のウイルス収量を増加させるためのｉＮＯＳ阻害剤の使用 - Google Patents

Description

本発明は一般に、培養物中でウイルスおよび組換えビリオンを産生するための方法に関する。特に、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの産生のためのヘルパーとして用いることができる組換えヘルペスウイルスなどの、培養物中の様々なウイルスの収量を増加させるための、アウリントリカルボン酸、デキサメタゾンおよびバルプロ酸のようなｉＮＯＳ阻害剤の使用に関する。

ヘルペスウイルスは自然界に広く普及しており、多くの動物種に見出される。単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）および単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルスのような、ヒトに由来するいくつかを含む、少なくとも１００種のヘルペスウイルスが特性評価されている。これらのウイルスは、皮膚感染、陰部ヘルペス、ウイルス性脳炎などのような様々なヒト疾患の原因となる。

ＨＳＶ−１感染は、サイトカインおよびインターフェロン（ＩＮＦ）などの前炎症活性および殺菌活性を有するタンパク質の発現をもたらす細胞内シグナリング経路を誘導することにより、宿主防御および自然免疫系を活性化する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ＩＮＦシグナリングは、ウイルスクリアランスのための最も重要な細胞防御機構の１つである（非特許文献４、非特許文献５）。

研究者は、特に、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および日本脳炎ウイルスのようないくつかのウイルスに対する一酸化窒素（ＮＯ）の抗ウイルス活性を報告している（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。ＮＯは、フリーラジカル気体分子であり、宿主防御のメディエータである（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。ＨＳＶ−１は、宿主の抗ウイルス応答を誘導するのみならず回避もすることが知られている（非特許文献１５）。ＨＳＶ感染は、大量のＮＯを産生するＮＯＳの誘導性アイソフォームをコードする遺伝子である、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を誘導することができる。

ヘルペスウイルスおよびそれに由来する組換えタンパク質は、いくつかのワクチンの製造において用いられている。アデノウイルスの他に、ヘルペスウイルスは組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの産生のための完全なヘルパーウイルス機能を提供することが示されている（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＡＡＶの複製およびパッケージングにとって必要とされるＨＳＶ−１遺伝子の最小セットは、初期遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９と同定されている（非特許文献１８）。これらの遺伝子は、ＨＳＶ−１コア複製機構の要素−ヘリカーゼ、プライマーゼおよびプライマーゼアクセサリータンパク質（Ｕ_Ｌ５、Ｕ_Ｌ８およびＵ_Ｌ５２）ならびに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｕ_Ｌ２９）をコードする。

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで長期の高レベル形質導入を達成するために上手く用いられてきた。上記進歩にも拘らず、遺伝子療法のための大量の臨床等級高力価ｒＡＡＶビリオンの産生は、同時トランスフェクションプロトコールの拡張性における制限のため、困難であり続けている。このプロセスは、３つの要素の効率的な細胞送達を必要とする：（１）ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）により隣接する対象の遺伝子を含むベクター；（２）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むベクター；ならびに（３）アデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスを用いるか、または無ウイルスヘルパープラスミドを用いて提供される遺伝子（非特許文献１９を参照されたい）。かくして、ｒＨＳＶに基づくｒＡＡＶ製造プロトコールにおいて、ｒＡＡＶの収量は、ヘルパーｒＨＳＶベクターの最大力価により制限される。

ｄ２７．１−ｒｃと呼ばれる、複製欠損ＨＳＶ−１ベクターは、ＡＡＶ−２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現し（非特許文献２０）、それは元のｄ２７−１ウイルスから操作されており（非特許文献２１）、ＨＳＶ−１複製にとって必要とされるタンパク質であるＩＣＰ２７を産生しない。このベクターは複製欠損であるが、ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要とされるＨＳＶ−１初期遺伝子を発現する（非特許文献２０）。

典型的には、ｒＡＡＶ鋳型を担持する一方のベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ領域を発現する他方のベクターとを、ｒＡＡＶビリオンを産生させるため、２９３細胞中に同時感染させる。両方のＨＳＶ−１ベクターは複製欠損であり、したがって、ＩＣＰ２７コンプリメント細胞系であるＶ２７中でのみ増殖することができる（非特許文献２１）。ＨＳＶに基づくＡＡＶ産生プロトコールにおいては、２９３細胞は１２のより高い感染多重度（ＭＯＩ）のＨＳＶ−１に感染させる必要がある。Ｖ２７細胞中のｄ２７−１由来ベクターの収量は、典型的には約１Ｘ１０^７プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌであるため、これは制限である。

ＨＳＶ−１力価をさらに増加させるために、いくつかの方法および試薬が精査されている（例えば、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。デキサメタゾンおよびバルプロ酸は両方とも、いくつかのインターフェロン（ＩＦＮ）応答性抗ウイルス遺伝子により示される宿主防御機構を阻害し、ウイルス遺伝子の転写レベルを増大させ、かくして、ＨＳＶ−１のウイルス増殖および収量を改善した（非特許文献２４、非特許文献２５）。

上記知識にも拘らず、培養物中でのウイルス産生を改善するために宿主防御を阻害するより多くの方法が必要である。上記で説明された通り、研究者は、特に、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および日本脳炎ウイルスのようないくつかのウイルスに対する一酸化窒素（ＮＯ）の抗ウイルス活性を報告している（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。ＮＯは、フリーラジカル気体分子であり、宿主防御のメディエータである（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。上記のように、ＨＳＶ感染は、大量のＮＯを産生するＮＯＳの誘導性アイソフォームをコードする遺伝子である、ｉＮＯＳの発現を誘導することができる。

ｉＮＯＳ阻害剤であるＮ−メチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＡ）の存在は、これらのウイルスの３種全部についてウイルス複製の阻害を逆転させた（非特許文献１１）。ｉＮＯＳ阻害剤の概説については、非特許文献２６を参照されたい。別の化合物、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）は、ｉＮＯＳ発現の下方調節およびかくして、ＮＯ産生の減少による細菌リポ多糖により誘導される細胞死からマクロファージを保護することが示されている（非特許文献２７）。ＡＴＡは、酸化ストレスにより誘導されるオリゴデンドロサイトにおける、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、リボヌクレオチドリダクターゼ、リボヌクレアーゼヌクレアーゼなどのいくつかの酵素との相互作用、タンパク質合成阻害、アポトーシスの防止およびＤＮＡ断片化の遮断のような、多数の生物活性で認められたポリマーの異種混合物である（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０）。

アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）はまた、ＩＦＮ媒介性転写活性化を防止することも報告されている（非特許文献３１、非特許文献３２）。ＡＴＡは、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路、ＩＧＦ−１受容体およびタンパク質キナーゼＣシグナリングのアクチベータとして知られる（非特許文献３３、非特許文献３４）。インターフェロンのようなサイトカインの抗ウイルス性抗微生物作用および抗増殖作用は、Ｌ−アルギニンのグアニジノ窒素から、大量のラジカル気体ＮＯを産生する一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）のアイソフォームをコードする遺伝子であるｉＮＯＳの発現を誘導するその能力に起因し得る（非特許文献３５、非特許文献３６）。ＩＦＮ−γによるマクロファージの処理は、エクトロメリアウイルス（ＥＶ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ）およびＨＳＶ−１の複製を高度に制限することが示されている。

一方で、ＡＴＡは、ＨＩＶ、ヘルペスウイルスＨＨＶ−７、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびその他などのいくつかのウイルスに対する抗ウイルス剤としても知られる（非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０）。しかしながら、ＡＴＡは、ＨＥＫ−２９３細胞中でアデノウイルス５型（Ａｄ５）の複製を遮断しなかった（非特許文献４１）。さらに、ＡＴＡは、２９３細胞中での対照アデノウイルスベクターの力価を予想外に増加させるが、同時に、ワクシニアウイルスに対する抗ウイルス効果を有することが報告されている（非特許文献４２）。

ＳａｉｎｚおよびＨａｌｆｏｒｄ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）７６：１１５４１〜１１５５０頁 Ｈａｌｌｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００６）３４４：１１９〜１３０頁 Ｐａｌｕｄａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１）１１：１４３〜１５４頁 Ｂｒａｎｄｎｅｒ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔｆｕｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ （１９７３）３５４：１１７６頁 Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００８）１５：５４５〜５５２頁 Ｂｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６４６６〜６４７２頁 Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：９１０〜９１５頁 Ｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：５２２７〜５２３５頁 Ｐｅｒｔｉｌｅら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．（１９９６）４０：３４２〜３４８頁 Ｃｒｏｅｎ Ｋ．Ｄ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９３）９１：２４４６〜２４５２頁 Ｋａｒｕｐｉａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４４５〜１４４８頁 Ｒｏｌｐｈら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）２１７：４７０〜４７７頁 Ａｍａｒｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）５１：３２６〜３３１頁 Ｌａｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：２２０２〜２２１０頁 Ｍｏｓｓｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５：７５０〜７５８頁 Ｂｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８１）４０：２４１〜２４７頁 Ｍｉｓｈｒａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：６３２〜６３９頁 Ｗｅｉｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：２４７６〜２４８３頁 Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９頁 Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９８６〜９９３頁 Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９ ｖｏｌ．６３（８）３３９９〜４０７頁 Ｗｅｃｈｕｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）１６：４９３〜４９６頁 Ｏｚｕｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００２）１８：４７６〜４８２頁 Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、（２００２）１７５：１６５〜１７６頁 Ｏｔｓｕｋｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００８）１６：１５４６〜１５５５頁 Ｓｏｕｔｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９６）５１：３８３〜３９４頁 Ｃｈｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００２） ｖｏｌ．１３７（７）１０１１〜２０頁 ＴｓｃｈｅｒｎｅおよびＰｅｓｔｋａ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９７５）８：４７９〜４８７頁 Ｍｉｋｅｌｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９７６）２５：８２１〜８２７頁 Ｖｏｌｌｇｒａｆら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９９）７３：２５０１〜２５０９頁 Ｔｓｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）１０１：９０〜１０１頁 Ｃｈｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）１３７：１０１１〜１０２０頁 Ｂｅｅｒｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００１）１４２：３０９８〜３１０７頁 Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：４６７２２〜４６７２８頁 Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．、ＦＡＳＡＢ Ｊ．（１９９２）６：３０５１頁 Ｗｅｒｎｅｒ−Ｆｅｌｍａｙｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９０）１７２：１５９９頁 Ｃｕｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）３４：３２９〜３３７頁 Ｚｈａｎｇら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．（１９９９）４３：２３〜３５頁 Ｙａｐら、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｃｈｅｍ．（２００５）２９：２１２〜２１９頁 Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ、Ａｄｖｅｎｔｓ， Ａｄｖａｎｃｅｓ， ａｎｄ Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．（２０１１）３１：１１８〜１６０頁 Ｈｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（２００４）３２０：１１９９〜１２０３頁 Ｍｙｓｋｉｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００７）８１：３０２７〜３０３２頁

かくして、本発明は、ワクチン産生のため、ならびに効率的な遺伝子療法手順にとって必要な量でのｒＡＡＶビリオン産生のためなどの様々な目的のために十分な量のｒＨＳＶを産生する努力を妨げる、ｒＨＳＶの低い産生のようなウイルス産生を制限する問題に取り組むことにより、先行技術における欠陥を克服するものである。本明細書に記載の方法を用いて、少なくとも伝統的な方法を超える規模のような、より高力価の様々なウイルスを得ることができる。

特に、本発明者らはここで、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）がｉＮＯＳを阻害し、ＨＳＶ産生を増加させることを発見した。本明細書の実施例に示されるように、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下でのマイクロモル濃度のＡＴＡは、Ｖ２７細胞中でのＨＳＶ−１／ｄ２７−１ベクター収量と、Ｖｅｒｏ、Ｖ２７および２９３細胞中での野生型（ｗｔ）ＨＳＶ−１ウイルス収量との両方を増加させた。デキサメタゾンおよびバルプロ酸などの他のｉＮＯＳ阻害剤も、培養物中でのＨＳＶ−１力価を増加させた。ＨＳＶにより誘導されるｉＮＯＳ発現は、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにより分析された通り、ＨＳＶ＋ＡＴＡ試料中で減少することが示された。同様に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムアレイ分析により、ＨＳＶにより上方調節された３つ全部の一酸化窒素合成酵素遺伝子（ｎＮＯＳ、ｉＮＯＳおよびｅＮＯＳ）の発現が、ＨＳＶ＋ＡＴＡ試料中で下方調節されることが確認された。また、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙにより、炎症性ＩｇＥおよびＩＦＮシグナリング、ならびに一般的な免疫応答に関与する遺伝子がＨＳＶ−１により上方調節され、ＡＴＡの添加後に抑制されることが検出された。他方で、細胞周期Ｇ１／Ｓ、ＷＮＴ発生におけるシグナル伝達に主に関与する遺伝子は、ＨＳＶにより有意に下方調節され、ＡＴＡの添加後に上方調節された。

これらの結果は、ｒＡＡＶビリオン産生のため、ならびに予防、治療および診断目的のためのより高いＨＳＶ−１力価に関する要求のため、有意である。

したがって、一実施形態において、本発明は、アウリントリカルボン酸を含む細胞培養物中でウイルスを培養することを含む、ウイルスを産生するための方法に関する。ある特定の実施形態において、ウイルスは、ＨＳＶ−１のようなヘルペスウイルスである。

さらなる実施形態において、ヘルペスウイルスは、野生型ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターのような組換えＨＳＶ−１ベクターである。

さらなる実施形態において、ウイルスは、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞またはＶ２７細胞のようなＶｅｒｏ細胞中で培養される。

さらなる実施形態において、本発明は、
（ａ）Ｖ２７細胞にＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターを感染させること；および
（ｂ）アウリントリカルボン酸、バルプロ酸またはデキサメタゾンを含む細胞培養物中で感染したＶ２７細胞を培養すること
を含む、ＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターを培養するための方法に関する。

ある特定の実施形態において、細胞培養物は、ウシ胎仔血清のような血清をさらに含む。

さらなる実施形態において、本発明は、アウリントリカルボン酸と、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞またはＶ２７細胞のようなＶｅｒｏ細胞とを含む細胞培養物に関する。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書の開示を考慮すれば当業者には容易に想到するであろう。

アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）がｄ２７−１に感染したＶ２７溶解物中でのｉＮＯＳ発現を阻害することを示すウェスタンブロットの図である。 ＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールの原理（図２Ａ）ならびにＨＳＶ収量に影響するＡＴＡ添加のための濃度および条件を決定するためのＶ２７上清中のｄ２７−１ ＨＳＶ−１力価の最適化を示す図である。 ６ウェルプレート（図２Ｂ）中、様々なＡＴＡ濃度でのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ／ｍｌ）として表されるウイルス力価を示す。 Ｔ１５０フラスコ（図２Ｃ）中、様々なＡＴＡ濃度でのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ／ｍｌ）として表されるウイルス力価を示す。 ＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールにおける血清の存在の重要性を示す図である。さらなる最適化およびＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールにおけるＦＢＳの存在の重要性を、ｄｒｐ／ｍｌおよびｐｆｕ／ｍｌとして表したｄ２７−１ ＨＳＶ−１力価上に示した。 培養物中の野生型ＨＳＶ ＫＯＳおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ株に対するＡＴＡの効果を示す図である。ＡＴＡは、Ｖｅｒｏ細胞中で両方のウイルス型の収量を増加させたが、ＡＴＡは２９３細胞中ではＨＳＶ−１ ＫＯＳの成長を阻害すると考えられた。その他方、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ株は、２９３細胞中でのＡＴＡ誘導後に最も高い力価に達した。さらに、ＡＴＡは、ＨｅＬａ細胞中で両方の型のＨＳＶ−１ウイルスを阻害すると考えられた。 培養物中の野生型ＨＳＶ ＫＯＳおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ株に対するＡＴＡの効果を示す図である。ＡＴＡは、Ｖｅｒｏ細胞中で両方のウイルス型の収量を増加させたが、ＡＴＡは２９３細胞中ではＨＳＶ−１ ＫＯＳの成長を阻害すると考えられた。その他方、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ株は、２９３細胞中でのＡＴＡ誘導後に最も高い力価に達した。さらに、ＡＴＡは、ＨｅＬａ細胞中で両方の型のＨＳＶ−１ウイルスを阻害すると考えられた。 ｒＡＡＶビリオンの産生に対するＨＳＶストック中のＡＴＡの効果を示す図である。ｒＡＡＶ力価は、感染中に添加した２０μＭのＡＴＡを用いて製造されたＨＳＶストックを用いた場合にわずかに増加した。また、ＡＴＡは、１０μＭのＡＴＡを、２ｈのＨＳＶ同時感染工程中に２９３細胞培地に直接加えた場合にｒＡＡＶ力価を増加させることも示された。 ｒＡＡＶビリオンの産生に対するＨＳＶストック中のＡＴＡの効果を示す図である。ｒＡＡＶ力価は、感染中に添加した２０μＭのＡＴＡを用いて製造されたＨＳＶストックを用いた場合にわずかに増加した。また、ＡＴＡは、１０μＭのＡＴＡを、２ｈのＨＳＶ同時感染工程中に２９３細胞培地に直接加えた場合にｒＡＡＶ力価を増加させることも示された。 ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１ウイルス力価に対するデキサメタゾン（Ｄｅｘ）の効果を示す図である。ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１の最終力価は、一般に、未処理対照と比較してＤｅｘで予備処理または処理した後にわずかに上昇した。 ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１ウイルス力価に対するバルプロ酸（ＶＡ）による予備処理の効果を示す。５ｍＭの濃度で、ＶＡはｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１の力価をわずかに上昇させたが、５ｍＭ未満および５ｍＭを超える濃度は、未処理対照と比較して、ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１力価に対する阻害効果を有すると考えられた。

本発明の実施は、別途指摘しない限り、当業界の技術の範囲内にある、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を用いるものとする。そのような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照されたい。

本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、上掲にしても、下掲にしても、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

１．定義
本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、以下に示されるように定義されることが意図される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が明確に別途指摘しない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。かくして、例えば、「ヘルペスウイルス（ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）」に対する参照は、２つまたはそれ以上のそのようなウイルスの混合物などを含む。

用語「組換えＨＳＶ」、「ｒＨＳＶ」および「ｒＨＳＶベクター」とは、ウイルスゲノム中に組み入れられた異種遺伝子を含有する、単離された、遺伝的に改変された形態の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を指す。用語「ｒＨＳＶ／ｒｃ」または「ｒＨＳＶ／ｒｃウイルス」または「ｒＨＳＶヘルパー機能ベクター」とは、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子がｒＨＳＶゲノム中に組み入れられたｒＨＳＶを意味する。用語「ｒＨＳＶ発現ウイルス」および「ｒＨＳＶ／ＡＡＶ」は、ＡＡＶに由来する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列がｒＨＳＶゲノム中に組み入れられたｒＨＳＶを示す。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さの産物に限定されない。かくして、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義内に含まれる。完全長タンパク質とその断片との両方がこの定義により包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加および置換（一般的には、天然で保存的である）のような改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発による意図的なものであってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどにより偶然のものであってもよい。用いられる発現系に応じて、ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含むか、または欠いてもよい。さらに、ポリペプチドは、一方が天然に存在する場合、天然シグナル配列を含むか、または含まなくてもよい。シグナル配列が通常は存在しない場合、タンパク質を異種配列と共に産生させることができる。

「天然」ポリペプチドとは、天然に由来する対応する分子と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。そのような天然配列を天然から単離するか、または組換えもしくは合成手段により産生することができる。用語「天然」配列は、天然に存在するトランケート型または分泌形態の特異的分子（例えば、細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に存在するバリアント形態（例えば、選択的スプライシングされた形態）および天然に存在する対立遺伝子バリアントを特に包含する。

「バリアント」とは、対応する完全長天然配列との少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義される活性ポリペプチド、シグナルペプチドを欠くポリペプチド、シグナルペプチドを含むか、もしくは含まないポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示される完全長ポリペプチド配列の任意のその他の断片を意味する。そのようなポリペプチドバリアントは、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮおよび／またはＣ末端に、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が付加、または欠失されたポリペプチドを含む。通常、バリアントは、対応する完全長天然配列に対する少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、およびあるいは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、バリアントポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、例えば、少なくとも約２０アミノ酸長、例えば、少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは、少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは、少なくとも約３００アミノ酸長、またはそれ以上である。

特に好ましいバリアントは、天然で保存的である置換、すなわち、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換を含む。特に、アミノ酸は一般に、４つのファミリー：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分割される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、トレオニンのセリンによる単離された置き換え、またはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による同様の保存的置き換えは、生物活性に対する大きな効果はないことが合理的に推定できる。例えば、対象のポリペプチドは、分子の所望の機能が無傷のまま保持される限り、約５〜１０までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらには約１５〜２５もしくは５０までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜５０の任意の数を含んでもよい。

「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントを指す。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、その配列が分子の定義された長さにわたって少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で用いられる場合、実質的に相同であるとは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列も指す。

一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド間またはアミノ酸間の一致性を指す。同一性パーセントを、配列を整列させ、２つの整列された配列間の正確な一致数を計数し、短い方の配列の長さで除算し、結果に１００を乗算することによる、２つの分子間の配列情報の直接的比較によって決定することができる。ペプチド合成のためのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁、１９８１の部分的相同性アルゴリズムを適合させる、ＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）、５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣのような、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、分析に役立てることができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムにおいて入手可能であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムにも依拠する。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載のデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントを、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコアリングテーブルおよび６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティと共に用いて決定することができる。

本発明の文脈における同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により配布された、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があるＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを用いることである。このパッケージスイートから、スコアリングテーブルのためのデフォルトパラメータ（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いることができる。生成されたデータから、「一致」の値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出するための他の好適なプログラムは、当業界で一般に公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータと共に用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを、以下のデフォルトパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；選別＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用することができる。これらのプログラムの詳細は当業界で周知である。

あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いる消化、および消化された断片のサイズ決定により、相同性を決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列を、例えば、特定のシステムについて定義されたようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、上掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上掲を参照されたい。

用語「縮重バリアント」とは、縮重バリアントが誘導されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、その核酸配列中に変化を含有するポリヌクレオチドを意図する。

「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置いた場合、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと、３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンとにより決定される。転写終結配列は、コード配列の３’に位置してもよい。

「ベクター」とは、適当な制御エレメントと会合した場合に複製することができる、また遺伝子配列を細胞に導入することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような任意の遺伝子エレメントを意味する。かくして、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。

「組換えベクター」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる異種核酸配列を含むベクターを意味する。

「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物の粒子中への付加または挿入により、遺伝的に変化したウイルスを意味する。

用語「トランスジーン」とは、適切な条件下で細胞中に導入され、ＲＮＡに転写される、場合により、翻訳および／または発現され得るポリヌクレオチドを指す。一態様において、それは、それが導入された細胞に所望の性質を付与するか、またはさもなければ所望の治療もしくは診断結果をもたらす。

ウイルス力価を参照して用いられる場合、用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」および「ゲノム等価物」とは、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター製造物中のゲノム粒子の数を、例えば、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０：１０３１〜１０３９頁；およびＶｅｌｄｗｉｊｋら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００２）６：２７２〜２７８頁に記載のような当業界で公知の手順により測定することができる。

ウイルス力価を参照して用いられる場合、用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」とは、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２：１９６３〜１９７３頁に記載のような、複製中心アッセイとしても知られる、感染中心アッセイにより測定される感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

ウイルス力価を参照して用いられる用語「形質導入単位（ｔｕ）」とは、例えば、Ｘｉａｏら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）１４４：１１３〜１２４頁；またはＦｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５２０〜５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載のような機能的アッセイにおいて測定される機能的トランスジーン産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指すように用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が、当業界で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６頁、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ１３：１９７頁を参照されたい。そのような技術は、適切な宿主細胞に１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入するのに用いることができる。

用語「異種」は、それがコード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常は一緒に連結されない、および／または通常は特定の細胞と関連しない配列を示す。かくして、ある核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然で他の分子との関連が見出されない別の核酸分子の内部またはそれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然でコード配列との関連が見出されない配列に隣接するコード配列を含んでもよい。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然に見出されない構築物（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、通常は細胞中に存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的にとって異種であると考えられる。対立遺伝子変異または天然に存在する突然変異事象は、本明細書で用いられる場合、異種ＤＮＡを生じさせない。

「核酸」配列とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。この用語は、限定されるものではないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンのような、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を捕捉する。

ＤＮＡ「制御配列」の用語は、レシピエント細胞中でのコード配列の複製、転写および翻訳を集合的に提供する、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的に指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞中で複製、転写および翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。

用語「プロモーター」は、本明細書では、調節配列がＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始させることができる遺伝子に由来する、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すように、その通常の意味で用いられる。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、コファクター、調節タンパク質などにより誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、コファクター、調節タンパク質などにより誘導される）、および「構成的プロモーター」を含んでもよい。

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された要素がその通常の機能を行うように配置されるエレメントの配置を指す。かくして、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現を行うことができる。制御配列は、それらがその発現を指令するように機能する限り、コード配列と連続的である必要はない。かくして、例えば、非翻訳であるが転写される配列の介入がプロモーターとコード配列との間に存在してもよく、プロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結」されると依然として考えてもよい。

タンパク質またはヌクレオチド配列に言及する場合、「単離された」とは、示される分子が同じ型の他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。かくして、例えば、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象となるポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、この分子は組成物の基本特性に有害に影響しないいくつかの付加的な塩基または部分を含んでもよい。

特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」、「下流」、「３−プライム（３’）」または「５−プライム（５’）」の状況にあると記載される場合のような、本出願を通して特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対的位置を記載するために、それは当業界で従来通りであると言われるＤＮＡ分子の「センス」または「コード」鎖中での配列の位置であることが理解されるべきである。

特に所与の量を参照する用語「約」は、±５パーセントの偏差を包含することを意味する。

２．本発明を実行する様式
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、そのようなものとして勿論変化してもよい特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定を意図するものではない。

本明細書に記載のものと類似するか、または同等であるいくつかの方法および材料を本発明の実施において用いることができるが、好ましい材料および方法を、本明細書に記載する。

本発明の中心は、マイクロモル濃度のアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）がＨＳＶ−１ベクター収量を増加させるという発見である。この知見は、大規模ＨＳＶ産生、ならびにｒＨＳＶおよびｒＡＡＶベクター産生の両方にとって重要である。さらに、また驚くべきことに、実施例に示される通り、ｒＨＳＶ−１ストック中のＡＴＡの存在は、ｒＡＡＶ収量に負の影響を及ぼさなかった。ミリモル量およびより高い濃度のＡＴＡは抗ウイルス剤であることが知られているため、この結果は驚くべきものである（Ｃｕｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）３４：３２９〜３３７頁；Ｚｈａｎｇら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．（１９９９）４３：２３〜３５頁；Ｙａｐら、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｃｈｅｍ．（２００５）２９：２１２〜２１９頁；Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ、Ａｄｖｅｎｔｓ， Ａｄｖａｎｃｅｓ， ａｎｄ Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．（２０１１）３１：１１８〜１６０頁）。

上記で説明された通り、研究者は、特に、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および日本脳炎ウイルスのようないくつかのウイルスに対する一酸化窒素（ＮＯ）の抗ウイルス活性を報告している（Ｂｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６４６６〜６４７２頁；Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：９１０〜９１５；Ｌｉｎら、１９９７；Ｐｅｒｔｉｌｅら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．（１９９６）４０：３４２〜３４８頁）。ＮＯは、フリーラジカル気体分子であり、宿主防御のメディエータである（Ｃｒｏｅｎ Ｋ．Ｄ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９３）９１：２４４６〜２４５２頁；Ｋａｒｕｐｉａｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４４５〜１４４８頁；Ｒｏｌｐｈら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）２１７：４７０〜４７７頁；Ａｍａｒｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）５１：３２６〜３３１頁；Ｌａｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：２２０２〜２２１０頁）。ＨＳＶ感染は、大量のＮＯを産生するＮＯＳの誘導性アイソフォームをコードする遺伝子である、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を誘導することができる。

本明細書に示されるように、ＡＴＡはＨＳＶにより上方調節されるｉＮＯＳを抑制し、それによって培養物中でのＨＳＶ力価を増加させる。デキサメタゾンおよびバルプロ酸などのさらなるｉＮＯＳ阻害剤も、同じ効果を有する。一実施形態において、次いで、そのようなｉＮＯＳ阻害剤の使用は、培養物中の組換えヘルペスウイルス力価を増加させ、特定の阻害剤の非存在下で産生されるウイルスよりも有意に多くのウイルスの産生を可能にする。前記方法により産生されるウイルスを、予防、治療および診断目的のため、ならびに遺伝子送達および遺伝子療法のための組換えビリオンの製造において使用するのに十分な量の組換え構築物を産生するためなどの様々な文脈で用いることができる。

アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、５−（（３−カルボキシ−４−ヒドロキシフェニル）（３−カルボキシ−４−オキソ−２，５−シクロヘキサンジエン−１−イルイデン）メチル）−２−ヒドロキシ安息香酸は、サリチル酸をホルムアルデヒド、硫酸および硝酸ナトリウムで処理した場合に形成する非硫酸化負荷電芳香族ポリマーの異種混合物である（Ｃｕｓｈｍａｎら、（１９９１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３２９〜３３７頁；Ｃｕｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：３３７〜３４２頁を参照されたい）。アウリントリカルボン酸は、式：

を有する。

ＡＴＡの異種混合物は、タンパク質核酸相互作用を阻害する（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、（１９７９）５６２：５３４〜５４５頁）；核取込みおよび核結合レベルでステロイド受容体と相互作用する（Ｍｅｌｌｏｎ，Ｗ．Ｓ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８４）３３：１０４７〜１０５７頁；Ｍｏｕｄｇｉｌｅｔら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）２３：１２５〜１３２頁）；ＤＮＡポリメラーゼを阻害する（Ｎａｋａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７７：９１〜９６頁）；ＲＮＡａｓｅ阻害剤として作用する（Ｓｋｉｄｍｏｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８９）２６３：７３〜８０頁）と記載された。

培養物中のウイルスへの添加のためのＡＴＡを、酸性形態で用いるか、またはアウリントリカルボン酸三ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩などのような塩として提供することができる。

本発明に関して有用であるさらなる物質としては、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）およびバルプロ酸（ＶＡ）が挙げられる。Ｄｅｘは、転写レベルおよび転写後レベルでラットメサンギウム細胞中のｉＮＯＳ発現を阻害することが示されている（Ｋｕｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９４）３０４：３３７〜３４０頁；Ｋｕｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：２５５〜２５９頁）。Ｄｅｘはまた、ＰＣ１２細胞中でＨＳＶ−１ ｏｒｉＬ ＤＮＡ複製を増強することが示されている。ＶＡのナトリウム塩であるバルプロ酸ナトリウムは、ＨＳＶ−１、ヒトサイトメガロウイルス、ＨＩＦ−１、ヒトヘルペスウイルス−８、麻疹ウイルスおよびポリオウイルス１型の複製を刺激することが示されている（Ｍｏｔａｍｅｄｉｆａｒら、Ｉｒａｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００６）３１：２８〜３２頁；Ｋｕｎｔｚ−Ｓｉｍｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ（１９９５）７６：１４０９〜１４１５頁；Ｍｏｏｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７７：１９９３〜１９９９頁；Ｙｌｉｓａｓｔｉｇｕｉら、ＡＩＤＳ（２００４）１８：１１０１〜１１０８頁；Ｓｈａｗら、ＡＩＤＳ（２０００）１４：８９９〜９０２頁；Ｋａｂｉｒｉら、Ｉｒａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００１）２６：５５〜６１頁）。さらに、バルプロ酸は、ｉＮＯＳを阻害することが示されている（Ｇｕｏら、Ｓｕｒｇｅｒｙ（２００７）１４２：１５６〜１６２頁）。ＡＴＡに関して、ＶＡ、またはナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩のようなその塩などを本発明の方法において用いることができる。

より高い力価でｒＨＳＶ−１ベクターを産生するためのＡＴＡ、ＤｅｘおよびＶＡの使用が本明細書に例示されるが、これらのｉＮＯＳ阻害剤を用いて、限定されるものではないが、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルスなど）；ポックスウイルス科；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶのような様々な肝炎ウイルス；パピローマウイルスおよびロタウイルス；レトロウイルスなどのウイルスのような、培養物中の様々なウイルスの力価を増加させることができる。これらのウイルスおよびその他のウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ（編）、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（編）、１９９１）を参照されたい。これらのウイルス、またはそれから誘導される免疫原を、ワクチンおよび診断剤の産生において用いることができる。さらに、これらのウイルスのいくつか、特に、ヘルペスウイルスを用いて、以下に記載の遺伝子送達技術における使用のための組換えビリオンの産生のための組換えベクターを産生することができる。

かくして、ＡＴＡ、ＤｅｘおよびＶＡを用いて、ヘルペスウイルス科のメンバーである任意のヘルペスウイルスの収量を増加させることができる。これは、特に、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）およびヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、例えば、ＢＨＶ−１、ＢＨＶ−２、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７を含む。ヘルペスウイルスは、多くの株のいずれかに由来するものであってもよい。例えば、本発明を用いて産生されるウイルスがＨＳＶである場合、そのウイルスは、例えば、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に由来するものであってよく、ＨＳＶ−１株ＫＯＳ、ＨＳＶ−１株ＭｃＩｎｔｙｒｅ、ＨＳＶ−１株Ｐａｔｔｏｎ、ＨＳＶ−２株３３３、ＨＳＶ−２株Ｇなどのような様々なＨＳＶ株のいずれかに由来するものであってもよい。さらに、産生されるウイルスは、野生型ウイルス、またはＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に由来するＤＮＡを含有する組換えウイルスおよび型間組換え体を含む、その誘導体であってもよい。誘導体は、好ましくは、ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２ゲノムまたはその一部に対する少なくとも７０％の配列相同性、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列相同性を有する。誘導体は、ヌクレオチド置換、例えば、１、２または３から１０、２５、５０または１００個の置換により改変されたＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ゲノムの配列を有してもよい。ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ゲノムは、あるいは、またはさらに、１つもしくはそれ以上の挿入および／もしくは欠失ならびに／またはいずれかの末端もしくは両方の末端での伸長により改変されていてもよい。

他の誘導体としては、遺伝子中の突然変異、特に、ウイルスの弱毒化をもたらす遺伝子中の突然変異を既に有する株が挙げられる。そのようなウイルスの例としては、１７１６株（ＭａｃＬｅａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）７２：６３２〜６３９頁）、全てＩＣＰ３４．５中に突然変異を有する、Ｒ３６１６およびＲ４００９株（ＣｈｏｕおよびＲｏｉｚｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：３２６６〜３２７０頁）およびＲ９３０株（Ｃｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：８３０４〜８３１１頁）、ＩＣＰ４中に欠失を有するｄ１２０株（ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８５）５６：５５８〜５７０頁）、ＩＣＰ２７中に欠失を有するｄ２７−１株（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：１７０４〜１７１５頁）またはＩＣＰ２７とＩＣＰ４の両方に欠失を有するｄ９２株（Ｓａｍａｎｉｅｇｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：５７０５〜５７１５頁）が挙げられる。様々なＨＳＶ遺伝子を記載するのに用いられる用語は、例えば、ＣｏｆｆｉｎおよびＬａｔｃｈｍａｎ（１９９６）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＳ Ｌａｔｃｈｍａｎ Ｅｄ．）、９９〜１１４頁：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎに見出される通りである。

容易に明らかである通り、意図される目的にとって好適な任意のｒＨＳＶを、本発明において用いることができる。ある特定の実施形態において、本発明において用いられるｒＨＳＶは複製欠損である。アデノウイルスの使用を含む方法とは対照的に、ｒＨＳＶはｒＡＡＶ産物の有意な汚染物質とならないため、ｒＡＡＶビリオンの産生のためには、複製することができないｒＨＳＶによる産生細胞の感染が好ましい。これは、アデノウイルスの除去と関連する精製工程を排除することによりｒＡＡＶビリオンの最終的な収量を増加させるのに役立ち得る。本発明の特定の実施形態において、ｒＨＳＶは、複製不能性がＩＣＰ２７遺伝子中の欠失に起因するＨＳＶ−１の突然変異体から構築される。複製欠損表現型を示すＨＳＶの任意の他の好適な突然変異体を、ｒＨＳＶを構築するために用いることもできる。

対象となる方法を用いるｒＡＡＶ産生のための１つの特に好ましい組換え突然変異体ＨＳＶ−１株は、ＨＳＶ−１株ｄ２７−１である。この株は、例えば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９７３〜９８５頁および米国特許第７，０９１，０２９号に記載のように製造することができる。上記で説明された通り、この突然変異ベクターは、ＩＣＰ２７を産生せず、メッセンジャーＲＮＡの宿主細胞スプライシングはＩＣＰ２７により阻害されることが知られているため、ｒＡＡＶビリオンを産生するために有利に用いられる。ＩＣＰ２７はまた、ＡＡＶ−２のｒｅｐおよびｃａｐメッセージの適切なスプライシングを行うこともできる。このベクターは、複製欠損であり、野生型（ｗｔ）ＨＳＶ−１と比較して低い細胞傷害性を示す。ｄ２７−１ウイルスは、ｒＡＡＶビリオン産生のためのヘルパーウイルスとしての使用にとって有利であるいくつかの他の特徴を示す。第１に、それはｒＡＡＶ産生にとって必要とされることが知られる初期遺伝子を発現する（Ｗｅｉｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：２４７６〜２４８３頁）。さらに、ｄ２７．１は、ＡＡＶの複製およびパッケージングにとって必須であるＨＳＶ−１遺伝子の１つであるＵＬ２９の産物である一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＩＣＰ８を過剰発現する（Ｗｅｉｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：２４７６〜２４８３頁）。

ＡＡＶゲノムは、約４６８１個のヌクレオチドを含有する線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは一般に、それぞれの末端上で逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する内部非反復ゲノムを含む。ＩＴＲはおよそ１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。ＩＴＲは、ＤＮＡ複製起点、およびウイルスゲノムのためのパッケージングシグナルの提供を含む複数の機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）およびキャプシド（ｃａｐ）遺伝子として知られる、２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ウイルスを複製させ、ビリオン中にパッケージングさせるウイルスタンパク質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルスタンパク質のファミリーが、その見かけの分子量に従って命名された、ＡＡＶ ｒｅｐ領域、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０から発現される。ＡＡＶ ｃａｐ領域は、少なくとも３つのタンパク質、ＶＰＩ、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。

「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当業界で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションなどの、多くの機能を有することが示された。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムの複製にとって集合的に必要である。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９頁；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３〜８０１頁を参照されたい。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の好適な相同体は、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することも知られるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０４：３０４〜３１１頁）。

「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするＡＡＶゲノムの当業界で認識された領域、またはその機能的相同体を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。ＡＡＶ ｃａｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（上掲）を参照されたい。

典型的には、２つのｒＨＳＶベクターを用いて、ｒＡＡＶビリオンを産生することができる。一方は、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子がｒＨＳＶゲノム中に組み入れられたｒＨＳＶヘルパー機能ベクターである。他方は、ＡＡＶ由来ＩＴＲ配列がｒＨＳＶ中に組み入れられ、対象の遺伝子に隣接するｒＨＳＶ発現ベクターである。

かくして、一実施形態において、ｉＮＯＳ阻害剤を用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含有する第１のｒＨＳＶベクターの収量を増加させることができる。この方法の第１のｒＨＳＶベクターの実施形態としては、限定されるものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８、ヤギおよびウシＡＡＶ（例えば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８０２９２５９５号を参照されたい）、ならびにそのバリアントなどのＡＡＶの様々な血清型に見出されるｃａｐ遺伝子に基づく遺伝子構築物が挙げられる。また、新規ＡＡＶ血清型に由来するｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに存在する血清型の組換えまたは突然変異により改変されたものも本発明の範囲内にある。上記で説明した通り、ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、公知のＡＡＶ血清型のいずれかから誘導することができる。例えば、ｒＨＳＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２から誘導されるｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−６から誘導されるｃａｐ遺伝子を有してもよい；当業者であれば、他のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の組合せも可能であり、その明確な特徴はｒＡＡＶビリオン産生をサポートする能力であることを認識できる。

ある特定の実施形態において、ｒＨＳＶヘルパー機能ベクター中のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、その天然プロモーターによって誘発されてもよい。ＡＡＶ−２のｐ５およびｐ１９プロモーターは、それぞれ、Ｒｅｐ７８および６８ならびにＲｅｐ５２および４０の発現を制御する。ｐ４０プロモーターは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の発現を制御する。さらに、異種プロモーターを用いて、ＡＡＶ遺伝子の発現を誘発することができる。開示される方法において用いることができる他のプロモーターの例としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１ｔｋ）プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターおよびニワトリβ−アクチンプロモーターが挙げられる。

遺伝子構築物を、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の組込みにとって好適なＨＳＶゲノム中の任意の部位または複数の部位に挿入することができる。ある特定の実施形態において、ベクターは、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９８６〜９９３頁；および米国特許第７，０９１，０２９号に記載のように、ｒＨＳＶ−１ウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座へのＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の相同組換えにより構築される。

本明細書で説明される通り、ｒＨＳＶヘルパー機能ベクターは、産生性ＡＡＶ複製およびカプシド封入のためにｉｎ ｔｒａｎｓで機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ｒＨＳＶヘルパー機能ベクターは、検出可能なｗｔ ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）を生成することなく効率的なｒＡＡＶビリオン産生をサポートする。そのようなベクターの例は、ｒＨＳＶ−１ ｄ２７．１ｒｃである。それを産生するためのベクターおよび方法は、本明細書の実施例、ならびに全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９８６〜９９３頁；および米国特許第７，０９１，０２９号に記載されている。

第２のｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ発現ベクターと呼ばれ、１つまたはそれ以上のプロモーターにより誘発される１つまたはそれ以上の対象の遺伝子と共に、ＡＡＶに由来するＩＴＲを含有する。いくつかの実施形態において、対象の遺伝子は、一対のＩＴＲの間に挿入される。異種遺伝子は、典型的には、適切な条件下で患者の標的細胞中での遺伝子発現を誘発することができる異種プロモーター（構成的、細胞特異的、または誘導性）に機能的に連結される。また、ポリアデニル化部位のような終結シグナルを含んでもよい。

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。ＡＡＶ−２配列については、例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１頁；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（編））を参照されたい。本発明のベクターにおいて用いられるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変化させてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されるものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８、ヤギおよびウシＡＡＶ（例えば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８０２９２５９５号を参照されたい）、ならびにそのバリアントなどのいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかから誘導することができる。さらに、発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図される通りに機能する、すなわち、宿主細胞ゲノムもしくはベクターからの対象の配列の切出しおよびレスキューを可能にする、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合のレシピエント細胞ゲノム中へのＤＮＡ分子の組込みを可能にする限り、同一であるか、または同じＡＡＶ血清型もしくは単離物から誘導する必要はない。

ＡＡＶ ＩＴＲを、ウイルスゲノムから、またはそれを含有するＡＡＶベクターから切り出して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載のもののような、標準的なライゲーション技術を用いて、選択された核酸構築物の５’および３’に融合することができる。例えば、ライゲーションを、２０ｍＭ Ｔｒｉｃ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、および４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ中、０℃で（「付着末端」ライゲーションのため）または１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ中、１４℃で（「平滑末端」ライゲーションのため）成し遂げることができる。分子間「付着末端」ライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭ全最終濃度）で行われる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがその中に記載されており、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。

選択されたポリヌクレオチド配列は、対象の細胞中でのその転写または発現を指令する制御エレメントに作動可能に連結される。そのような制御エレメントは、通常は選択された遺伝子と関連する制御配列を含んでもよい。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列は一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列から誘導されるものを含む。例としては、限定されるものではないが、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ極初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子から誘導される配列も、本明細書では有用である。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などから商業的に入手可能である。

対象の遺伝子は、治療的価値のある可能性がある遺伝子であってもよい。治療的遺伝子の例としては、限定されるものではないが、α−１抗トリプシン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＧＡＡ、エリスロポエチンおよびＰＥＤＦが挙げられる。トランスジーン発現の成功を選択するか、または同定することが望ましい場合、対象の遺伝子はリポーター遺伝子であってもよい。リポーターとして、または選択のために用いられる遺伝子の多くの例が公知であり、本発明において用いることができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、ホスホロ−トランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、アミノグリコシド、ホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢ、キサンチン−グアニンホスホリボシル、ルシフェラーゼ、ＤＨＦＲ／メトトレキサート、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が挙げられる。

ｒＨＳＶ−１発現ウイルスを、上記とほぼ同じ方式で、すなわち、例えば、全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９８６〜９９３頁；および米国特許第７，０９１，０２９号に記載のような、ＨＳＶ−１ ｔｋ遺伝子中での相同組換えにより産生させることができる。

一度産生されたら、ｒＨＳＶベクター、または任意の他の対象のウイルスを、適切な細胞系中、培養物中で増殖させる。ヘルペスウイルスについては、そのような細胞系として、限定されるものではないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能なＶｅｒｏ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。ＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターを用いる場合、このウイルスは典型的には、ＩＣＰ２７コンプリメント細胞系Ｖ２７中で培養される（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：１７０４〜１７１５頁）。限定されるものではないが、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地または後者の混合物（ＤＦ培地）のような、ウシ胎仔血清のような血清を含むか、または含まない、問題のウイルスのための任意の好適な培地を用いることができる。血清が存在する場合、培養物は、例えば、２％〜２０％の血清、より典型的には、５％〜１５％の血清、７％〜１２％の血清、またはこれらの範囲内の任意の数、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％などを含んでもよい。さらに、血清を用いる場合、それは初期培養物中に、および／または培養物に添加されたその後の新鮮な培地中に存在してもよい。

本発明による方法において添加されるｉＮＯＳ阻害剤の量は変化してもよく、用いられる特定の阻害剤、用いられる培地および培養されるウイルスにある程度依存する。例えば、ヘルペスウイルスをＶｅｒｏ細胞中で培養する場合、存在する場合、初期培養物中のＡＴＡの濃度は、典型的には、５μＭ〜５００μＭ、好ましくは、１０μＭ〜２５０μＭ、例えば、２０μＭ〜１００μＭ、すなわち、３０μＭ〜７５μＭ、例えば、３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５など、またはこれらの記述された範囲内の任意の整数である。同様に、存在する場合、初期培養物中のデキサメタゾンの濃度は、典型的には、０．１μＭ〜５００μＭ、好ましくは、０．５μＭ〜２５０μＭ、例えば、１μＭ〜１００μＭ、すなわち、５μＭ〜７５μＭ、例えば、１．．．５．．．１０．．．１５．．．２０．．．２５．．．３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５など、またはこれらの記述された範囲内の任意の整数である。バルプロ酸を用いる場合、初期濃度は、０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ〜２５０ｍＭ、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭ、すなわち、５ｍＭ〜７５ｍＭ、例えば、１．．．５．．．１０．．．１５．．．２０．．．２５．．．３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．５０．．．５５．．．６０．．．６５．．．７０．．．７５など、またはこれらの記述された範囲内の任意の整数である。

ある特定の実施形態において、ウイルスに感染した細胞は、０．５時間〜２４時間、例えば、０．７５時間〜１２時間、１時間〜５時間、１時間〜２時間、またはこれらの範囲内の任意の数の時間もしくはその画分にわたって、上記のように培地中で初期培養する。ｉＮＯＳ阻害剤および／または血清は、初期培養物中に存在しても、またはしなくてもよい。続いて、新鮮な培地を添加し、培養物を２４〜１２０時間、例えば、４８〜９６時間、５０〜８０時間、６０〜７５時間、７０〜７４時間、またはこれらの範囲内の任意の数の時間もしくはその画分にわたってインキュベートする。ｉＮＯＳ阻害剤および／または血清は、その後の培養物中に存在しても、または存在しなくてもよいが、但し、ｉＮＯＳ阻害剤は初期培養物およびその後の培養物の一方または両方に存在する。

いくつかの実施形態において、初期培養物中のｉＮＯＳ阻害剤は、その後の培養物中よりも高濃度で存在する。かくして、例えば、ｉＮＯＳ阻害剤がＡＴＡである場合、それは初期培養物中に３０〜７５μＭの量で、次いで、その後の培養物中に５〜２５μＭの量で存在してもよい。あるいは、阻害剤は、初期培養物またはその後の培養物中にのみ存在してもよい。

以下の実施例に示されるように、ＡＴＡを用いる１つの特に好ましい方法は、初期培養物中に５０μＭのＡＴＡの存在を含み、その後の培養物中、２０μＭまでＡＴＡの量を減少させる。さらに、ＡＴＡの場合、ＡＴＡが存在すると同時に血清を含むことが好ましい。かくして、ＡＴＡを初期培養物に添加する場合、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を培地に添加することが有利である。同様に、ＡＴＡをその後の培養物に添加する場合、より高いウイルス収量を得るためには、ＦＢＳの添加が必要である。

次いで、ウイルスを培養して、望ましいウイルス力価を得る。例えば、本明細書に記載のＨＳＶ−１ ｄ２７−１ベクターの場合、ＡＴＡはＶ２７細胞上清中でｄ２７−１収量を３〜５倍増加させ、その力価は少なくとも１ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌまたは４ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌであってもよい。同様に、ＡＴＡはまた、野生型（ｗｔ）ＨＳＶ−１ウイルス株ＭｃＩｎｔｙｒｅおよびＫＯＳの収量を１ｌｏｇ増加させ、２９３またはＶｅｒｏ力価は最大で１ｘ１０^９ＤＲＰ／ｍｌであってもよい。次いで、ウイルスをさらなる使用のために収穫する。

本発明の目的のために、ｒＡＡＶビリオンを産生するための好適な宿主細胞としては、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして用いることができるか、または用いられた、例えば、懸濁培養物、フラスコ、プレート、バイオリアクタなどの中で成長することができる、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。かくして、本明細書で用いられる「宿主細胞」は一般に、外因性ＤＮＡ配列を形質導入された細胞を指す。ｒＡＡＶビリオンを作製するのに用いるために１つの型の細胞中で組換えヘルペスウイルスを産生させる場合、次いで収穫されるベクターを別の好適な宿主細胞中にトランスフェクトする。安定なヒト細胞系を起源とする２９３細胞（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを介して容易に入手可能）が、ｒＡＡＶビリオンを産生するのに好ましい宿主細胞である。特に、ヒト細胞系２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胚性腎細胞系（Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁）であり、アデノウイルスのＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９４：４６０頁）。２９３細胞系は容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットフォームを提供する。

ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＨＳＶ発現ベクターを用いる前に、またはそれと同時に、ｒＨＳＶヘルパー機能構築物を宿主細胞に形質導入することにより宿主細胞中に導入される。かくして、ｒＨＳＶヘルパー構築物は、産生的ＡＡＶ感染にとって必要であるＡＡＶ機能の喪失を補完するためのＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過的発現を提供するために用いられる。ＡＡＶヘルパー構築物はＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自身では複製もパッケージングも行うことができない。

組換えＡＡＶ複製の後、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配などのような様々な従来の精製方法を用いて宿主細胞からｒＡＡＶビリオンを精製することができる。例えば、陰イオン交換カラム、親和性カラムおよび／または陽イオン交換カラム上での精製のような、複数のカラム精製工程を用いることができる。例えば、国際公開ＷＯ０２／１２４５５を参照されたい。

次いで、対象のヌクレオチド配列を含有する得られるｒＡＡＶビリオンを、当業界で周知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８〜３９９６頁；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３〜５３９頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９頁；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３〜８０１頁；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５〜１６９頁；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７〜１８７５頁に記載の技術を用いる遺伝子送達のために用いることができる。

２．実験
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示目的のみで提供されるものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

用いられる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力が為されたが、いくらかの実験誤差および偏差は勿論許容されるべきである。

材料および方法
細胞
Ｖｅｒｏ由来Ｖ２７細胞（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：３３９９〜３４０７頁）およびヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ）由来２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９７７）３６：５９〜７４頁）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＡＧＴＣ、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）から得て、Ｖｅｒｏ細胞およびＨｅＬａ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）およびＶ２７細胞についてはゲネチシン（５０ｍｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または他の細胞については１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）のいずれかを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）中で維持した。

ＨＳＶ−１産生
ｗｔＨＳＶ−１ ＫＯＳ株およびｗｔＨＳＶ−１ ＫＯＳ株のＩＣＰ２７欠損誘導体：ベクターｄ２７−１（ＲｉｃｅおよびＫｎｉｐｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：１７０４〜１７１５頁）、ｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２およびｒＨＳＶ−ＥＧＦＰ（Ｋａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）１６：２２９〜２３９頁）ならびにその産生株ＩＣＰ２７コンプリメントＶ２７細胞系を、ＡＧＴＣ（Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）から得た。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＡＢＩ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ）から購入したｗｔＨＳＶ−１ ＭａｃＩｎｔｙｒｅ株およびｗｔＨＳＶ−１ ＫＯＳ株を、Ｖｅｒｏ、２９３またはＨｅＬａ細胞系中で増殖させた。感染性ベクター粒子を、培養上清を回収することにより感染の７２ｈ後に収穫した。ＤＮａｓｅ耐性粒子／ｍｌ（ＤＲＰ／ｍｌ）中のＨＳＶ−１ストックの力価を、Ｔａｑｍａｎアッセイにより決定した。粗培養培地内のウイルスゲノムを、３７℃で６０ｍｉｎのＤＮａｓｅＩ（最終５０Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下での処理、次に５０℃で６０ｍｉｎのプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）消化（１Ｕ／ｍｌ）、次いで、９５℃で３０ｍｉｎの変性により定量した。線状化されたプラスミドｐＺｅｒｏ１９５ＵＬ３６（ＡＧＴＣ，Ｉｎｃ．、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬから得た）を用いて、標準曲線を作製した。プライマー−プローブセットは、ベクターゲノムＵＬ３６配列（ＨＳＶ−ＵＬ３６ Ｆ：５’−ＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧ（配列番号１）；ＨＳＶ−ＵＬ３６ Ｒ：５’−ＴＣＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴＣＧ（配列番号２）；ＨＳＶ−ＵＬ３６プローブ：５’−６ＦＡＭ−ＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３））に特異的であった。ＰＣＲ産物の増幅を、以下のサイクリングパラメータ：５０℃で２ｍｉｎの１サイクル、９５℃で１０ｍｉｎの１サイクル；９５℃で１５ｓｅｃ、および６０℃で６０ｓｅｃの４０サイクルを用いて達成した。

ＡＴＡ実験
ＡＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａ１８９５アウリントリカルボン酸実用等級、８５％以上（滴定）、粉末）ストック溶液を、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム水溶液中５００μＭ濃度として作製した。ＡＴＡストック溶液を、ＤＭＥＭ±１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中でさらに希釈し、１２〜６０μＭ ＡＴＡの範囲の濃度（８．５〜２１μｇ ＡＴＡ／ｍｌ）にした。０．１５の感染多重度（ＭＯＩ＝０．１５）でのＨＳＶ−１感染（典型的には、６ウェルプレート中で６ｘ１０^５細胞）を、１〜２ｈ、総最終培地容量の４０％（２／５ｖｏｌ）中で行い、残りの培地（総最終容量の６０％または３／５）を希釈工程中に添加した。次いで、細胞を７２時間インキュベートし、上清を収穫して、１ミリリットルあたりの形成単位（ＰＦＵ／ｍｌ）およびＤＲＰ／ｍｌ力価アッセイを行った。

デキサメタゾン（Ｄｅｘ）実験
デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ｄ４９０２）を、無水アルコール中で２ｍｇ／ｍｌに溶解した。これをＤＭＥＭで希釈して、１Ｍ濃度を達成し、−２０℃で保存した。

６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に、Ｖ２７細胞を６ウェルプレート中に播種した。デキサメタゾンを添加して、播種培地中で１μＭの濃度を達成した。これをよく混合し、ウェルに添加した。

培地を吸引し、感染性ＨＳＶ−１ ｄ２７−１ストックを、ＤＭＥＭ（添加物なし）１ｍｌあたりのＭＯＩ０．１５（＝細胞播種密度ｘ０．１５／ｐｆｕ力価のＨＳＶストック）で添加した。ウェルあたり感染性接種物１ｍｌを添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで１〜２時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ １．５ｍｌを添加した。培養物を７０〜７４時間、インキュベータに戻した。

遊離培地を収穫し、ボルテックスし、１，１００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しい分注チューブに移し、ボルテックスし、アリコートし、ストックを−８０℃で凍結した。

バルプロ酸（ＶＡ）実験
バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ−Ｐ４５４３）を、水中で１Ｍ濃度となるように溶解した。Ｖ２７細胞を、６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に６ウェルプレート中に播種した。１Ｍバルプロ酸をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ １ｍｌに加え、５μＭの濃度を達成した。これをよくボルテックスし、ウェルに添加した。プレートを６時間インキュベートし、吸引し、感染性ＨＳＶ−１ ｄ２７−１ストックを、ＤＭＥＭ（添加物なし）１ｍｌあたりＭＯＩ０．１５（＝細胞播種密度ｘ０．１５／ｐｆｕ力価のＨＳＶストック）で添加した。

ウェルあたり感染性接種物１ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで１〜２時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ １．５ｍｌを添加した。プレートを７０〜７４時間、インキュベータに戻した。遊離培地を収穫し、ボルテックスし、１，１００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しい分注チューブに移し、ボルテックスし、アリコートした。ストックを−８０℃で凍結した。

ｒＡＡＶ産生
２９３細胞（２．５ｘ１０^６個）に、Ｋａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００９）１６：２２９〜２３９頁により記載されたようにｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２とｒＨＳＶ−ＥＧＦＰベクターの両方を同時に感染させた。感染後２〜４ｈで、感染性培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ等価物と交換し、感染前培養容量を倍化した。収穫時に、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。ＤＲＰ力価を、９６ウェルブロックサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）中でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により定量した。粗試料を３サイクルの凍結および解凍にかけた後、ベンゾナーゼ（２５０Ｕ／ｍｌ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％最終濃度タンパク質等級Ｔｗｅｅｎ８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下でインキュベートし、３７℃で６０ｍｉｎインキュベートした後、５０℃で６０ｍｉｎ、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。最後に、３７℃で３０ｍｉｎ、ＤＮａｓｅＩ（５０Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した後、次いで９５℃で２０ｍｉｎ変性させた。線状化されたプラスミドｐＤＣ６７／＋ＳＶ４０を用いて、標準曲線を作製した。プライマー−プローブセットは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）配列：ｒＡＡＶ−Ｆ：５’−ＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号４）；ｒＡＡＶ−Ｒ：５’−ＧＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴ−３’（配列番号５）；ｒＡＡＶ−プローブ：５’６−ＦＡＭ−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号６）に特異的であった。ＰＣＲ産物の増幅を、以下のサイクリングパラメータ：５０℃で２ｍｉｎの１サイクル、９５℃で１０ｍｉｎの１サイクル；９５℃で１５ｓｅｃおよび６０℃で６０ｓｅｃの４０サイクルを用いて達成した。

ヒトゲノムアレイ
集密な２９３細胞（７５ｃｍ^２フラスコ中の２．４ｘ１０^６個の細胞）を、およそ２０ｈにわたってＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養した後、１プラーク形成単位／細胞（ＰＦＵ／細胞）のＨＳＶ−１ ＭａｃＩｎｔｙｒｅ株を９０ｍｉｎ感染させた。２０μＭ（最終）濃度のＡＴＡを感染の９０ｍｉｎ後に添加した。感染細胞を感染の２４ｈ後に収穫した。十分な品質および量の全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて懸濁液から単離した。全ゲノム発現プロファイリングを、Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．によるＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０Ａｒｒａｙ上で行った。３μｇの全ＲＮＡを入力材料として提供した。

全体として、バイオアナライザ上で評価されたＲＮＡの品質は、９を超えるＲＩＮ値を有していた。アレイハイブリダイゼーションおよびスケーリング係数は、通過品質制御範囲内にあった。走査の後、生の発現ＣＥＬファイルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ ｖｓ．１．１．２（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）でプロセッシングした。各ＣＥＬファイルを、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）でプロセッシングし、まとめた表をテキストファイルとしてエクスポートした。下流ゲノミクスおよび統計分析を、ＪＭＰゲノミクス（バージョン５）（ｊｍｐ．ｃｏｍ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて行った。第１に、フィルタリング工程を適用して、低い発現、具体的には、８つの試料のうちの少なくとも２つにおいてｌｏｇ^２モードで６未満の値を濾過除去した。５４，６７５の全Ａｆｆｙ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２プローブのうち、４１，５６９（７６％）のプローブがカットオフの後に残った。２つの陽性対照試料、良好にハイブリダイズした、それぞれ、ヒト脳およびプールされたヒトユニバーサル参照ＲＮＡも見られた。将来の分析のために、これらの２つの試料を除外した。

主成分分析により、ＨＳＶを用いて、および用いずに処理された試料である２つの異なる集団が示された。したがって、第１の主成分分離（９１．７％）は、ＨＳＶとビヒクルの効果によって説明される。データを各プローブにわたって中央正規化して、０の中央シグナルを得た。ＡＮＯＶＡを行い、ＨＳＶとビヒクルの間、ＡＴＡとビヒクルの間、ＨＳＶ＋ＡＶＡとビヒクルの間、およびＨＳＶ＋ＡＴＡとＨＳＶのみの間の有意な転写差を見出した。複数の試験補正を含まず、０．０１未満のｐ値を有するものを有意な遺伝子と考えた。

自立性マップを用いて、ビヒクル、ＨＳＶ１、およびＨＳＶ１＋ＡＴＡの間での発現パターンを検査した。ＡＴＡ処理により上方調節または下方調節される特異的転写物を見出すことが望ましかった。ＨＳＶの存在下でいくらかの刺激を示した異なる遺伝子クラスターが見出され、ＡＴＡ補正はこれらの遺伝子をビヒクルのベースラインまで戻した。同様に、ビヒクルと比較してＨＳＶにより示された遺伝子クラスターも見出され、続いて、ＡＴＡを用いる処理により活性化された。これらのものを、それぞれ、クラスターＡおよびＢと呼んだ（表１および表２を参照されたい）。分析を追跡して、ＧｅｎｅＧｏソフトウェア（ｇｅｎｅｇｏ．ｃｏｍ）を用いてこれらのクラスターの生物学的機能を問い合わせた。

ＲＴ^２Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−ＱＩＡＧＥＮ）
６ｘ１０^５個の２９３細胞（ＡＧＴＣから）を、５０μＭのＡＴＡを含むか、または含まないＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳの存在下で１〜２時間、ＭＯＩ １でｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ株に感染させ、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳで４０％に希釈した（最終ＡＴＡ濃度２０μＭ）。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて２４ｈ後に３回、全ＲＮＡ試料を収穫し、カラム上でＤＮａｓｅ処理し、溶出させた。溶出液ＲＮＡの３回試料を合わせ、分光光度計Ｏ．Ｄ．の読取りを２６０および２８０ｎｍで溶出液に対して行い、濃度を決定した。試料ＲＮＡを、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＲＴ２第一鎖キットを用いて鋳型ｃＤＮＡに変換した。次いで、ｃＤＮＡを、ヒトＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路ＰＣＲアレイ（ＰＡＨＳ−０３９Ａ）中で用いた。

ＡＴＡを用いるＶ２７細胞中でのＨＳＶ誘導ｉＮＯＳレベルの阻害
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中のＶ２７細胞を、１のＭＯＩでＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターに感染させ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を用いて、または用いずに３０μＭのＡＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理した。ＡＴＡを用いない対照実験も行った。Ｖ２７細胞溶解物を感染の２４時間後（ｈ．ｐ．ｉ．）に得て、溶解物に対してウェスタンブロットを実行し、ｉＮＯＳタンパク質を精製ウサギ抗ｉＮＯＳ／ＮＯＳ ＴｙｐｅＩＩｐＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６１０３３２）を用いることにより検出した。結果を図１に示す。

示されるように、ＨＳＶ感染は、ＡＴＡを含まない培養物中でのｉＮＯＳ発現を誘導した（レーン４および５）。ｉＮＯＳ発現は、３０μＭのＡＴＡの存在下で阻害された（レーン２および３）。１０％ＦＢＳの存在または非存在は、ｉＮＯＳ発現に対する効果を有さなかった。

ＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールの最適化
ＡＴＡがＶ２７細胞中でのｒＨＳＶ−１ ｄ２７−１（ｄ２７−１）ベクター収量を増加させることができるかどうかを試験するために、ＡＴＡを感染（工程１）または希釈工程（工程２）の間に培地に印加した（図２Ａ）。ＭＯＩ＝０．１５でのｄ２７−１感染を、最終培地容量の２／５で行い、残りの３／５の培地を希釈工程の間に添加した。

ＡＴＡ処理は、Ｖ２７細胞単層中でのＨＳＶ−１プラーク形成または細胞溶解を遅延させた。収穫時、感染の７２時間後（ｈｐｉ）の細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ＡＴＡの非存在下での１００％ＣＰＥと比較して２０〜６０％であった。ＨＳＶ−１感染工程中のＡＴＡによる処理（工程１でのＡＴＡ）により、７２ｈｐｉで収穫されたＶ２７細胞上清におけるｄ２７−１力価の増加が示された（図４Ｂ）。感染工程（ＡＴＡ Ｉ）中に添加された場合の最適ＡＴＡ濃度は５０μＭであり、残りの３／５ｖｏｌの培地を添加することにより、希釈工程中に２０μＭ ＡＴＡの最終濃度（ｆ．ｃ．）にこれをさらに希釈した。この場合、ＡＴＡは収穫時（７２ｈ．ｐ．ｉ．）の上清中のｄ２７−１力価を約１０倍増加させた：４．０±０．３ｘ１０^７ＤＲＰ／ｍｌまたは１．４±０．２ｘ１０^７ＰＦＵ／ｍｌから３．７±０．２ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌまたは１．２±０．３ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌ（図４Ｂ）。

ＡＴＡ添加のための濃度および条件がＨＳＶ収量に対して影響するかを決定するために、以下の実験を行った。変化する濃度のＡＴＡを、以下のように２工程で６ウェルプレート（図２Ｂ）またはＴ１５０フラスコ（図２Ｃ）中でＨＳＶ−１ ｄ２７−１ベクターに感染させたＶ２７培養物に添加した。プロトコールの工程１において、Ｖ２７細胞を、１０％ＦＢＳおよび０〜６０μＭのＡＴＡ濃度を含むＤＭＥＭの最終容量の２／５中で０．１５ＭＯＩのｒＨＳＶベクターに感染させた。細胞を３７℃で１〜２時間培養し、工程１を完了させた。工程２において、３／５の最終培地容量の添加により、ＡＴＡの濃度を１２〜２４μＭの範囲に低下させた。細胞を３７℃で７０〜７４時間培養し、上清を収穫した。ウイルス力価を、１ｍｌあたりのＤｎａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ／ｍｌ）またはプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）として表し、上記のように決定した。

結果を図２Ｂおよび２Ｃの両方に示し、最適なＡＴＡ濃度を太字で示す。見られるように、６ウェルプレート（図２Ｂ）とＴ１５０フラスコ（図２Ｃ）の両方において、工程１または工程２のいずれかでＡＴＡを添加した培養物は、ＡＴＡを用いないものよりも有意に高いＨＳＶ力価を有していた。さらに、最も高い力価は工程１における５０μＭのＡＴＡ濃度で見られ、工程２で２０μＭまで低下したが（図２Ｂ）、全濃度のＡＴＡはＡＴＡを欠く培養物よりも高いウイルス力価をもたらした。

さらなる実験を行って、最適な条件およびＨＳＶ力価に対するＦＢＳの存在または非存在の効果を決定した。ＡＴＡ含有培地中の血清、特に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在が、ＡＴＡにより誘導されるＨＳＶ−１力価収量のための最も重要なパラメータであった。希釈工程中の無血清培地中へのＡＴＡの追加（工程２でのＡＴＡ）は、ウイルス力価の低下をもたらし、「ＤＲＰ」力価は対照レベルより下まで低下し、ＰＦＵ／ｍｌ力価は検出以下であった（図３）。無血清培地中のさらにより劇的な効果は、３μＭ濃度で出発するＡＴＡを感染工程１の間に追加した場合に認められ、ＤＲＰ／ｍｌおよびＰＦＵ／ｍｌ力価の両方が検出限界以下であった。

この実験において、Ｖ２７細胞を、６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に６ウェルプレート中に播種した。ＨＳＶ２ｘ感染溶液を以下のように製造した：ＨＳＶ−１ ｄ２７．１ストックを２ｘ力価でＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）に添加し、細胞を最終ＭＯＩ０．１５で感染させた。ＤＭＥＭ中の１００μＭまたは４０μＭのＡＴＡを含有し、ＦＢＳを含まないか、または２０％ＦＢＳを含む、いくつかの２ｘＡＴＡ溶液の組合せを製造した。

ＨＳＶ２ｘ感染溶液を、等量のＤＭＥＭ−／＋２０％ＦＢＳまたは所望の２ｘＡＴＡ溶液−／＋２０％ＦＢＳのいずれかと混合し、ボルテックスし、ウェルあたり感染性接種物１ｍｌを工程１において添加した。ウェルが工程１においてＡＴＡを含有していた場合、その濃度は５０μＭであり、全ウェルを１〜２ｈインキュベートした。工程２においては、さらに１．５ｍｌのＤＭＥＭ組合せ−／＋４０μＭ ＡＴＡおよび−／＋２０％ＦＢＳを添加した。ウェルが工程１であっても工程２であってもＡＴＡを含有していた場合、最終ＡＴＡ濃度は２０μＭであった。プレートを７０〜７４時間にわたってインキュベータに戻した後、遊離培地を収穫し、ボルテックスし、１，１００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しい分注チューブに移し、ボルテックスし、アリコートし、ストックを−８０℃で凍結した。

ＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールにおける血清の存在の重要性
さらなる実験を行って、最適な条件およびＨＳＶ力価に対するＦＢＳの存在または非存在の効果を決定した。ＡＴＡ含有培地中の血清、特に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在が、ＡＴＡにより誘導されるＨＳＶ−１力価収量のための最も重要なパラメータであった。希釈工程中の無血清培地中へのＡＴＡの追加（工程２でのＡＴＡ）は、ウイルス力価の低下をもたらし、「ＤＲＰ」力価は対照レベルより下まで低下し、ＰＦＵ／ｍｌ力価は検出以下であった（図３）。無血清培地中のさらにより劇的な効果は、３μＭ濃度で出発するＡＴＡを感染工程１の間に追加した場合に認められ（データは示さない）、ＤＲＰ／ｍｌおよびＰＦＵ／ｍｌ力価の両方が検出限界以下であった。

この実験において、Ｖ２７細胞を、６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に６ウェルプレート中に播種した。ＨＳＶ２ｘ感染溶液を以下のように製造した：ＨＳＶ−１ ｄ２７．１ストックを２ｘ力価でＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）に添加し、細胞を最終ＭＯＩ０．１５で感染させた。ＤＭＥＭ中の１００μＭまたは４０μＭのＡＴＡを含有し、ＦＢＳを含まないか、または２０％ＦＢＳを含む、いくつかの２ｘＡＴＡ溶液の組合せを製造した。ＨＳＶ２ｘ感染溶液を、等量のＤＭＥＭ−／＋２０％ＦＢＳまたは所望の２ｘＡＴＡ溶液−／＋２０％ＦＢＳのいずれかと混合し、ボルテックスし、ウェルあたり感染性接種物１ｍｌを工程１において添加した。ウェルが工程１においてＡＴＡを含有していた場合、その濃度は５０μＭであり、全ウェルを１〜２ｈインキュベートした。工程２においては、さらに１．５ｍｌのＤＭＥＭ組合せ−／＋４０μＭ ＡＴＡおよび−／＋２０％ＦＢＳを添加した。ウェルが工程１であっても工程２であってもＡＴＡを含有していた場合、最終ＡＴＡ濃度は２０μＭであった。プレートを７０〜７４時間にわたってインキュベータに戻した後、遊離培地を収穫し、ボルテックスし、１，１００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を新しい分注チューブに移し、ボルテックスし、アリコートし、ストックを−８０℃で凍結した。

培養物中の野生型ＨＳＶ力価に対するＡＴＡの効果
図４Ａは、ｗｔＨＳＶ−１増殖を許容する細胞系：２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるｗｔＨＳＶ−１株、ＫＯＳおよびＭｃＩｎｔｙｒｅの両方の上清力価を示す。ｗｔＨＳＶ−１株ＫＯＳおよびＭｃＩｎｔｙｒｅを、５０μＭのＡＴＡを工程１で添加し、工程２の後に最終濃度を２０μＭのＡＴＡに希釈するＡＴＡ−ＨＳＶプロトコールを用いて、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞中で増殖させた。ウイルスを含有する上清を、上記のように３日後に収穫した。ＡＴＡは、Ｖｅｒｏ細胞においては両方のウイルス型の収量を増加させた。ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ株は２９３細胞中ではＡＴＡ誘導後に最も高い力価に達したが、ＡＴＡは２９３細胞中ではＨＳＶ−１ ＫＯＳ成長を阻害すると考えられた。最後に、ＡＴＡはまた、ＨｅＬａ細胞中では両方の型のＨＳＶ−１ウイルスを阻害すると考えられた。二元配置ＡＮＯＶＡ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定；−ＡＴＡ対＋ＡＴＡ：^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：ｐ＞０．０５；ｎ＝４独立実験。

統計計算のために、１０回の独立実験のセット（ｎ＝１０）を用いるより大規模な試験を、感染工程（工程１）中にＡＴＡを添加して、または添加せずに６ウェルプレート中で行い、複製欠損ｄ２７−ＧＦＰおよびまた、ＡＴＡが同様にｗｔＨＳＶ−１株中で力価を増加させることができるかどうかを調査するためにｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ株と比較した（図４Ｂ）。感染工程（工程１）中にＡＴＡを５０ｍＭで、ｄ２７−１についてはＶ２７細胞またはｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅについては２９３細胞の集密な細胞単層に添加し、細胞をＭＯＩ＝０．１５のベクターに感染させたが、ＡＴＡを１ｈ後に最終２０ｍＭ濃度に希釈した。二元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定により分析された通り、ＡＴＡ添加後、ｄ２７−１力価は、５．４ｘ１０^７ＤＲＰ／ｍｌまたは１．１ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌ（^＊＊Ｐ＜０．０１）から６．１倍有意に増加し、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅは３．３ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌまたは１．０ｘ１０^９ＤＲＰ／ｍｌ（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）から９．１倍有意に増加した（図４Ｂ）。

ｒＡＡＶビリオンの産生に対するＨＳＶストック中のＡＴＡの効果
ＨＳＶ産生中のＡＴＡの存在がＨＳＶベクターを用いて産生されたｒＡＡＶビリオンの収量に影響したかどうかを決定するために、ｒＡＡＶ力価が、２９３細胞中で産生されたｒＨＳＶ−１ストックから存在するＡＴＡ残留物により影響されたことを示す以下の実験を実施した（図５Ａ）。異なる濃度のＡＴＡ濃度（１２μＭまたは２０μＭ最終濃度）の下で製造されたＡＴＡを含有するｒＨＳＶ−１ストックを用いて６０ｍｍプレート中の２９３細胞中でｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２およびｒＨＳＶ−ＥＧＦＰベクターの同時感染により、ｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターを産生した（材料および方法を参照されたい）。ｒＡＡＶ ＤＲＰ／ｍｌ力価は、感染中に２０μＭ ＡＴＡを添加して製造された（ＡＴＡ工程１）ｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２ストックを用いた場合に、ｒＡＡＶ産生中のＡＴＡ濃度がおよそ３μＭであった「ＡＴＡなし」対照（^＊ｐ＜０．０５）に対してわずかに１．３倍増加した。有意なｒＡＡＶ力価の増加は、１２μＭ ＡＴＡを用いて製造されたｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２ストックを用いた場合に検出された（図５Ａ）。一元配置ＡＮＯＶＡ；Ｔｕｋｅｙ検定：＊ｐ＜０．０５；２０μＭ ＡＴＡ対ＡＴＡなし；ｎ＝４独立実験。

別の実験において、ＡＴＡは、１０μＭのＡＴＡを２ｈのｒＨＳＶ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２およびｒＨＳＶ−ＥＧＦＰ同時感染工程中に２９３細胞培地に直接加えた場合、ｒＡＡＶ力価を増加させることが示された。この効果は、ＡＴＡ濃度が２０μＭよりも高い場合には観察されなかった（図５Ｂ）。

ＡＴＡの作用機序
ヒトゲノムアレイによるＡＴＡの作用機序ならびにＶｅｒｏとＶ２７がサル由来細胞系であるという事実を明らかにするために、ｗｔＨＳＶ−１増殖を、いくつかのヒト細胞系中で試験した（図４Ａ〜４Ｂ）。２つの野生型ＨＳＶ−１（ｗｔＨＳＶ−１）株、ＫＯＳおよびＭｃＩｎｔｙｒｅの増殖を、３つの細胞系：ヒト胚性腎２９３（２９３細胞）、ヒト子宮頸がんＨｅＬａ細胞およびアフリカミドリザル腎上皮Ｖｅｒｏ細胞において比較した。実験を、５０μＭのＡＴＡを感染工程中に追加し、２０μＭ ＡＴＡ濃度にさらに希釈するＡＴＡ Ｉプロトコールスキームに従って１０％ＦＢＳ含有培地中で実行した（材料および方法を参照されたい）。ヒト由来２９３細胞においては、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅウイルス力価のみが、１．４ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌから１．２ｘ１０^９ＤＲＰ／ｍｌまで、ＡＴＡにより有意に増加した（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｖｅｒｏ細胞においては、ＡＴＡはｗｔＨＳＶ−１ ＫＯＳ株においてのみ、１．７ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌから９．１ｘ１０^８ＤＲＰ／ｍｌまで力価を有意に増加させた（^＊＊＊ｐ＜０．００１；両統計値：二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定；ｎ＝４）。驚くべきことに、ＨｅＬａ細胞においては、ＡＴＡはＫＯＳとＭｃＩｎｔｙｒｅ ＨＳＶ−１株の両方の増殖を阻害すると考えられた。

ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ感染に対する細胞応答遺伝子特性を同定するために、２４ｈにわたってモック処理された、ＡＴＡ処理された（ＡＴＡ）、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ感染した（ＨＳＶ）か、またはＡＴＡ処理され、ｗｔＨＳＶ−１ ＭｃＩｎｔｙｒｅ感染した（ＨＳＶ＆ＡＴＡ）２９３細胞と共にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０ Ａｒｒａｙを用いて転写プロファイリングを行った。感染またはＡＴＡ処理により誘導された遺伝子発現の変化を、未感染の細胞試料中で一致するものに対して各プローブの遺伝子発現レベルを参照することにより同定した。ＨＳＶ−１感染のみが、未処理の細胞遺伝子プロファイルと比較した場合、２９３細胞の遺伝子発現プロファイルに対する強い影響を有していた。

第１に、フィルタリング工程を適用して、低い発現を濾過除去したところ、５４，６７５の全Ａｆｆｙ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２プローブのうち、４１，５６９（７６％）のプローブがカットオフ後に残った。主成分分析により、２つの異なる集団、ＨＳＶで処理した試料およびＨＳＶで処理しない試料が示された。ＡＮＯＶＡを行って、ＨＳＶとビヒクルの間、ＡＴＡとビヒクルの間、ＨＳＶ＋ＡＶＡとビヒクルの間、およびＨＳＶ＋ＡＴＡとＨＳＶのみの間の転写の有意差を見出した。０．０１未満のｐ値を有意な遺伝子と考えた。自立性マップを用いて、ビヒクル、ＨＳＶ１、およびＨＳＶ１＋ＡＴＡの間の発現パターンを検査した。異なる遺伝子クラスター、クラスターＡおよびＢ（表１および表２）が見出され、ＨＳＶ−１により引き起こされた転写プロファイルの変化およびＡＴＡによるその補正を示し、これらの遺伝子をビヒクルベースラインまで戻した。

これらのクラスターの生物学的機能を、ＧｅｎｅＧｏにおいて分析した。クラスターＡ（表２）は、５８のプローブであり、ＨＳＶ−１における上方調節およびＡＴＡの添加後の抑制を示した。これらの遺伝子は主に、炎症性ＩｇＥおよびＩＦＮシグナリング、ならびに一般的な免疫応答に関与していた。クラスターＢ（表１）は１５２のプローブであり、ＨＳＶ−１による下方調節およびそれらをビヒクルベースラインまで戻すことによりその後のＡＴＡ上方調節を示した。このクラスター中の遺伝子は、細胞周期Ｇ１／Ｓ、ＰＴＥＮにおけるシグナル伝達、およびＷＮＴ発生に主に関与していた。例えば、ＨＳＶ−１の存在下でのＡＴＡは、細胞周期進行経路に由来するＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＣＮＫ、ＣＮＮＭ２遺伝子およびＦＯＸＣ１、ＦＯＸＤ３、ＦＯＸＯ３のようなＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ経路に由来する遺伝子を上方調節した（表１を参照されたい）。

表３Ａおよび３Ｂは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎ Ａｒｒａｙにより分析された場合、ＨＳＶ ＡＴＡ試料におけるｎＮＯＳ、ｉＮＯＳおよびｅＮＯＳ発現の低下を示し、Ｑｉａｇｅｎｅ ＳＡＢ Ｊａｋ−Ｓｔａｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにより分析された場合、ＨＳＶ＋ＡＴＡ試料におけるｉＮＯＳ発現の低下を示す。

ＨＳＶ収量に対するデキサメタゾンの効果
ｉＮＯＳ阻害剤であるデキサメタゾンもまた培養物中でのｒＨＳＶ収量を増加させたかどうかを決定するために、以下の実験を行った。図６は、ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１ウイルス力価に対するデキサメタゾンの効果を示す。最終的な力価ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１は、一般に、未処理対照と比較してｄｅｘ予備処理または処理の後にわずかに上昇した。

Ｖ２７細胞を、６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に６ウェルプレート中に播種し、次の日、異なる濃度のデキサメタゾン（ｄｅｘ）を、ＨＳＶ−１感染の前（予備処理）または感染中（処理）に、２／５ｖｏｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培地中、ウェルに添加した。３７℃で１〜２時間インキュベートした後、３／５ｖｏｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳを添加した。培養物をインキュベータに戻し、上清を７０〜７４時間後に収穫した。データを、力価の平均値±Ｓ．Ｄ．としてｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝２）で示す。

ＨＳＶ収量に対するバルプロ酸の効果
ｉＮＯＳ阻害剤であるバルプロ酸もまた培養物中でのｒＨＳＶ収量を増加させたかどうかを決定するために、以下の実験を行った。図７は、ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１ウイルス力価に対するバルプロ酸（ＶＡ）による予備処理の効果を示す。５ｍＭ濃度のＶＡは、ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１の力価をわずかに上昇させたが、５ｍＭ未満およびそれを超える濃度は、未処理の対照と比較した場合、ｄ２７−１／ＧＦＰ ＨＳＶ−１力価に対する阻害効果を有すると考えられた。

Ｖ２７細胞を、６ｘ１０^５細胞／ウェルでの感染の前日に６ウェルプレート中に播種し、次の日、異なる濃度のＶＡを、ウェルに添加した。プレートを６ｈインキュベートし、吸引し、感染性ＨＳＶ−１ ｄ２７−１ストックを含有する２／５ｖｏｌの培地を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートした後、３／５ｖｏｌのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ培地を添加した。培養物をインキュベータに戻し、上清を７０〜７４時間後に収穫した。

前記実施例に示された通り、マイクロモル濃度のＡＴＡは、ＨＳＶ−１ベクター収量を増加させる。この知見は、大規模ＨＳＶ産生、ならびにｒＨＳＶおよびｒＡＡＶベクター産生の両方にとって重要である。さらに、および驚くべきことに、ｒＨＳＶ−１ストック中のＡＴＡの存在は、ｒＡＡＶ収量に負の影響を及ぼさなかった。ミリモル量およびそれより高い濃度のＡＴＡは抗ウイルス剤であることが知られているため、この結果は驚くべきものである（Ｃｕｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）３４：３２９〜３３７頁；Ｚｈａｎｇら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．（１９９９）４３：２３〜３５頁；Ｙａｐら、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｃｈｅｍ．（２００５）２９：２１２〜２１９頁；Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ、Ａｄｖｅｎｔｓ， Ａｄｖａｎｃｅｓ， ａｎｄ Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｓ Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．（２０１１）３１：１１８〜１６０頁）。無血清培地中では、本発明者らは、マイクロモル濃度でのＡＴＡの可能性がある抗ウイルス効果も観察したが、血清（１０％ＦＢＳ）の存在下では観察しなかった。

本明細書に示されるように、ＡＴＡ処理は、Ｖ２７細胞単層中でのＨＳＶ−１プラーク形成および細胞溶解ならびに細胞変性効果（ＣＰＥ）を遅延させ、抗アポトーシス性質を示している。ＨＳＶ−１収量の増加におけるＡＴＡの作用機序は、ＨＳＶ−１産生およびウイルスクリアランスを担う細胞自然抗ウイルス免疫応答の低下にとって必要とされる因子の変化を含むと考えられる。上記のヒトゲノムアレイ分析から、ＨＳＶ−１感染単独で２９３細胞の遺伝子発現プロファイルに強く影響し、ＡＴＡの効果はＨＳＶ−１とＡＴＡの両方で処理された細胞において多く観察されることが発見された。細胞周期Ｇ１／Ｓ、ＰＴＥＮにおけるシグナル伝達、およびＷＮＴ発生に関与する遺伝子は、ＨＳＶ−１により有意に下方調節され、ＡＴＡの添加後に上方調節された。

炎症性ＩｇＥおよびＩＦＮシグナリング、ならびに一般的な免疫応答に主に関与する遺伝子は、ＨＳＶ−１によって上方調節され、ＡＴＡの添加後に抑制された。ＨＳＶ−１の存在下では、ＡＴＡは細胞周期進行経路に由来するＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＣＮＫ、ＣＮＮＭ２遺伝子およびＦＯＸＣ１、ＦＯＸＤ３、ＦＯＸＯ３などのＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ経路に由来する遺伝子を上方調節した。

遺伝子療法および他の適用のための大規模生産のためには、より高いＨＳＶ−１ベクター収量が必要であるため、ＡＴＡがＨＳＶ−１収量を増加させることができるという知見は重要である。

かくして、ｉＮＯＳ阻害剤を用いてウイルス収量を増加させるための方法が記載される。対象となる発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されたが、本明細書に定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変更を加えることができることが理解される。

Claims (16)

1. アウリントリカルボン酸と血清とを含む細胞培養物中でヘルペスウイルスに感染した細胞を培養することを含む、ヘルペスウイルスを産生するための方法であって、アウリントリカルボン酸は、５〜７５μＭの濃度で存在し、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である、前記方法。
2. 前記ＨＳＶ−１が野生型ＨＳＶ−１である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＨＳＶ−１が組換えＨＳＶ−１ベクターである、請求項１に記載の方法。
4. 前記組換えＨＳＶ−１ベクターがＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターである、請求項３に記載の方法。
5. 前記ウイルスが２９３またはＶｅｒｏ細胞中で培養される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ウイルスがＶ２７細胞中で培養される、請求項５に記載の方法。
7. 血清がウシ胎仔血清である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
8. （ａ）Ｖ２７細胞をＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターに感染させること；および
   （ｂ）前記感染したＶ２７細胞を、５〜７５μＭの濃度のアウリントリカルボン酸を含み、血清をさらに含む細胞培養物中で培養すること
   を含む、ＨＳＶ−１ ｄ２７．１ベクターに感染した細胞を培養するための方法。
9. 血清がウシ胎仔血清である、請求項８に記載の方法。
10. アウリントリカルボン酸、血清、ヘルペスウイルスおよび２９３またはＶｅｒｏ細胞を含む細胞培養物であって、アウリントリカルボン酸は、５〜７５μＭの濃度で存在し、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である、前記細胞培養物。
11. Ｖ２７細胞を含む、請求項１０に記載の細胞培養物。
12. 前記ヘルペスウイルスが、請求項１〜４のいずれか１項に定義されたものである、請求項１０または１１に記載の細胞培養物。
13. 細胞培養物中で産生されるヘルペスウイルスの収量を増加させるためのアウリントリカルボン酸の使用であって、前記細胞培養物は、血清をさらに含み、前記ヘルペスウイルスは、２９３またはＶｅｒｏ細胞中で培養され、前記ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である、前記使用。
14. 細胞培養物がＶｅｒｏ細胞を含む、請求項１３に記載の使用。
15. 前記Ｖｅｒｏ細胞がＶ２７細胞である、請求項１４に記載の使用。
16. 前記ヘルペスウイルスが、請求項１〜４のいずれか１項に定義されたものである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用。

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