CN105007718B - 生物合成白藜芦醇的未去壳稻谷及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白藜芦醇强化转基因水稻，用于高浓度下生物合成白藜芦醇,其中白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻、以及从该水稻生产的水稻种子的第12号染色体中。进一步的，本发明涉及一种保健功能性食物组成，一种动物饲料组成和一种药物组成，用于预防和改善代谢性疾病，包括从用于生物合成白藜芦醇的所述白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，所述白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻的第12号染色体中。本发明的被插入白藜芦醇合酶基因的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子包含一个高浓度的白藜芦醇，与简单的摄入等量的白藜芦醇相比，其表现出非常优异的作用。进一步的，因为水稻作为食物是以直接使用的形式生产的，没有附加的分离或提取白藜芦醇的过程，因此，可以被广泛地应用于食品，饲料和医药品，用于预防和改善代谢性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种在高浓度下生物合成白藜芦醇的转基因水稻，其中，多种白藜芦醇合酶基因可表达地插入至天然水稻的第十二号染色体中，以及从该水稻生产的水稻种子。进一步的，本发明涉及一种保健功能性食物组成、一种动物饲料组成和一种药物组成，用于预防和改善代谢性疾病，并包括所述白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，多种白藜芦醇合酶基因可表达地插入至天然水稻的第十二号染色体中。
背景技术
近来在韩国，由于经济增长和西化的饮食，人们已增加了对食物中脂肪物质的摄入，且由于缺乏锻炼等原因，一些代谢性疾病如肥胖症、糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症和动脉硬化正趋于增长。
肥胖症通常是指一种身体脂肪过高的情况。对于男性来说，当身体脂肪占总重的比例大于或等于25％的时候视为肥胖症，对于女性来说，当身体脂肪占总重的比例大于或等于30％的时候视为肥胖症。肥胖症已被认为是导致许多与生活方式相关的疾病如糖尿病、高血压、高脂血症等的一个直接或间接的原因。
糖尿病是代谢性疾病的一种，病患的胰岛素分泌物是不足的、功能失调的等(DeFronzo，1988)。糖尿病的特征是高血糖，其涉及到一个高的血糖水平，且由于尿液中高血糖和葡萄糖的排泄，是一种引起各种症状和体征的失调。近来，由于肥胖症尤其是腹部肥胖症患率的增长，糖尿病的发生率一直在成倍地增加。
如果这样的代谢性疾病没有得到正确治疗，伴随着的是各种异常症状。典型的，肾脏病变、神经病变、血管失调所致的中风、肾脏或心脏疾病、糖尿病足溃疡和心血管疾病的风险更高。这些并发症降低了生活质量，最终使患者的寿命变短。治疗这种代谢性疾病的现有方法包括，改善生活方式(饮食疗法和运动疗法)和药物疗法等。然而，严格控制或执行饮食疗法或运动疗法是困难的，且有治疗效果的局限性。因此，可以容易地应用于实际生活中的用于治疗代谢性疾病等的食物的开发是非常必要的。
与此同时，白藜芦醇，白藜芦醇合酶(RS)基因的一种产品，是植保素产品，是在应对外部刺激如紫外线、致病细菌、创伤等造成的环境压力下产生的一种防御物质(Dercks和Creasy,1989)，且是通过白藜芦醇合酶的催化活性，用一分子的香豆酰辅酶A和三分子的丙二酸单酰辅酶A生物合成的(Rolfs和Kindl,1984；Halton和Cornish,1995)。
尽管在多于约72种的植物如葡萄、桑树、花生和百合等中发现了白藜芦醇，但在大多数的谷类作物如水稻、玉米、小麦等，水果和蔬菜中，它并非是生物合成的(Aggarwal等,2004)。
进一步的，除了以上所述的药理作用影响之外，白藜芦醇也被认为是一种激活Sirt-1，一种与延长寿命有关的蛋白质，的物质。Sirt-1蛋白是通过其在低热量条件下被NAD+激活后延长细胞的寿命而与延长寿命有关的蛋白质的一种。根据Konrad等人(2003)，尽管Sirt-1蛋白仅在有限热量时被NAD+激活，但当向一个包括酵母菌的实验中添加白藜芦醇时，Sirt-1蛋白，就像在低的热量条件下一样，被激活并使酵母菌的寿命平均增加70％。
具有这样的生理学活性的白藜芦醇在超过72中植物中被合成，且总是在木本植物如松树等中被合成。但是，在草本植物中，其作为一种应对外部压力如植保素活性伤口、臭氧破坏、紫外线、病虫害感染等的自我防御物质而被生物合成。具有最高的白藜芦醇生物合成的植物是葡萄和花生(Schroder等,1990)。
红葡萄酒含有白藜芦醇，且对它的消耗与心血管疾病发病率呈负相关。这就是所谓的法国悖论(Wu等,2001)并导致全球对红葡萄酒的关注。
相应的，为了人为增加白藜芦醇的含量，已经进行了在收割期间对葡萄进行菌株接种，或用超声波清洗或紫外线辐照对收获之后的葡萄和花生进行处理的研究。
进一步的，研究已经进行了通过引入白藜芦醇合酶基因来开发用于生物合成白藜芦醇的作物，该白藜芦醇合酶基因是通过生物工程学方法从葡萄和花生分离的。据报道，使用葡萄的白藜芦醇合酶基因在转基因猕猴桃植物的叶子中生产出182μg/g的白藜芦醇苷(白藜芦醇糖苷)(Kobayashi等,2000)，且在使用花生的白藜芦醇合酶基因的转基因烟草悬浮培养细胞中生产出50ng/g的白藜芦醇(Hain等,1990)。
P.Stark-Lorenzen等人已报道了一种转基因水稻，其通过向水稻中引入源自葡萄的芪(白藜芦醇)合酶基因而抵抗稻瘟病(Plant Cell Reports(1997)16；668-673)。
更进一步的，本发明人已经公开了一种通过引入花生的常规白藜芦醇合酶基因至水稻中而生产的水稻(韩国专利申请公开号10-2008-0012483)。然而，该研究仅仅证实了白藜芦醇存在其中而未能提供任何改善代谢性疾病的证明性效果。
发明内容
技术问题
本发明人开发了一种转基因水稻，其通过将花生的白藜芦醇合酶基因插入天然水稻的第十二号染色体中，用来高浓度地生物合成白藜芦醇，并且证实了与摄取同样量的白藜芦醇相比，当从对应的水稻生产的白藜芦醇强化水稻被摄取时，其改善代谢性疾病的效果更优，从而完成了本发明。
技术手段
本发明的一个目的是提供一种用于白藜芦醇生物合成的白藜芦醇强化水稻，其中，白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻的第12号染色体中。
本发明的另一个目的是提供本发明的水稻生产的水稻种子。
本发明还有一个目的是提供一种预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成，其包括本发明所述的水稻种子。
本发明还有一个目的是提供一种用于预防和改善代谢性疾病的动物饲料组成，其包括本发明所述的水稻种子。
本发明还有一个目的是提供一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成，其包括本发明所述的水稻种子。
技术效果
本发明所述的转基因水稻，生产于插入白藜芦醇合酶基因的水稻，含有高浓度的白藜芦醇，与简单的摄入相同量的白藜芦醇相比明显表现出更优的效果。此外，由于水稻的生产形式是如食物一样直接被使用而无分离或提取白藜芦醇的附加工艺，它可以广泛用于食物，饲料，和医疗用品，用于功能改善和预防代谢性疾病.
附图说明
图1a示出了一种水稻遗传转化载体pSB2220载体，其能够用白藜芦醇合酶基因遗传转化未去壳稻谷(unhulled rice)。
图1b示出将与本发明所述的用于生物合成白藜芦醇的转化(transformed)水稻中引入的T-DNA插入区域相邻的区域与在NCBI上公开的日本晴(Nipponbare)的序列数据进行比较的分析结果，该日本晴是在序列上与本发明使用的东津稻(Dongjin rice)具有相似性且具有完整的序列分析的粳稻。特别的，绿色表示的核苷酸序列是与水稻的插入区域相邻的基因组序列，关于NCBI中公开的日本晴的序列，第一个T-DNA插入始于水稻(亚洲型栽培稻(Oryza sativa))的第十二号染色体的第330872个碱基位，接着，第二个T-DNA在相反的方向插入且插入终端始于第330907个碱基位。
图2示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻生产的水稻在引入代谢性疾病的动物模型中对血糖方面的作用。在该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，和GMO是指本发明的转化水稻。
图3示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻生产的水稻在引入代谢性疾病的动物模型中对血脂代谢的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，和GMO是指本发明的转化水稻。
图4示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻生产的水稻在引入代谢性疾病的动物模型中对体重变化和总脂肪量的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，和GMO是指本发明的转化水稻。进一步的，该图中，CT是指计算机断层扫描，TF是指总脂肪，SF是指皮下脂肪，和VF是指内脏脂肪。
图5示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型中血糖水平的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图6示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型中血脂代谢特别是血液中的总胆固醇的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图7示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型中血脂代谢特别是血液中的天然脂肪含量的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图8示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型中血脂代谢特别是血液中的高密度脂蛋白含量的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图9示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型中血脂代谢特别是血液中的低密度脂蛋白含量的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图10示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻和对照转化水稻对引入代谢性疾病的动物模型体重变化的作用。该图中，CTL是指对照组，DJ是指东津稻，res是指白藜芦醇，GMO是指对照转化水稻，和HFD是指高脂肪饲料。
图11示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻根据水稻的移植日期的抽穗期(图11a)和积温(图11b)
图12示出本发明的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻根据水稻的移植日期的水稻产量和白藜芦醇含量。
图13示出本发明白藜芦醇合成水稻根据生长环境特别是温度的增加(图13a)和水稻的移植日期(图13b)的种子中白藜芦醇的含量。
具体实施方式
实现本发明目的的一个方面，本发明提供了一种用于生物合成白藜芦醇的水稻，其中，多个白藜芦醇合酶基因被可表达地插入天然水稻的第12号染色体中。
本文所用的术语“水稻”指的是超过一半的世界人口的一个重要的食物资源，是指尤其是在亚洲作为食用作物收获的农作物。它是指那些在稻属植物中作为农作物收获的植物，且据了解，稻属包括20至30个野生种，这其中，亚洲型栽培稻(Oryza sativa)和非洲型稻(Oryza glabemima)只不过是两个栽培品种。本发明中，水稻可以是天然水稻或转基因水稻，优选东津稻，一个在韩国发育与分布的认证种子，或其转基因水稻。
本文所用的术语“转基因”或“转化”是指通过突变如插入，删除，或替换的任一种在DNA核苷酸序列中建立或去除某个特征，特别的，本发明中它是指通过外源DNA导致的遗传性质的变化。这里所用的转化水稻或转基因水稻是指相比于通过转化生产的天然水稻，在DNA核苷酸序列中发生突变的水稻，且包含由某个基因的插入或修饰的引入而产生的基因重组，或通过基因重组技术的活性突变。
本文所用的术语“白藜芦醇”是指具有强抗氧化性的多酚基物质，是当植物面临不利条件如真菌或寄生虫时产生的，并且已知大量存在于在葡萄皮、葡萄籽、花生等之中。已进行了许多关于白藜芦醇对人类的影响的研究，且已知的为对抗癌，抗病毒，神经保护作用，抗衰老，抗炎，延长生命等等的作用。白藜芦醇存在顺式和反式的形式，预期只有反式白藜芦醇有药用功效。
本文所用的术语“白藜芦醇合酶基因”是指一个基因(核苷酸序列)编码一种对合成白藜芦醇有作用的酶，且其可能包括所有无论基质最终对合成白藜芦醇有作用的酶。本发明中，白藜芦醇合酶基因可以源自花生且由SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列组成。
本发明所述的用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化的转基因水稻可以是将白藜芦醇合酶基因插入天然水稻的第12号染色体上的水稻。例如，可以连续的将两拷贝数的白藜芦醇合酶基因可表达地插入第12号染色体上。特别的，所述两拷贝数的白藜芦醇合酶基因可在彼此相反的方向上被插入。
进一步的，本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻可以被插入至天然水稻第12号染色体的以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的区域，尤其是被插入至以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的第572号碱基之后。
进一步的，本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻可以是天然东津稻，其中，白藜芦醇合酶基因被插入至以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列中，尤其是插入至以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的第572号碱基之后，所述以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列存在于第12号染色体中。本发明中白藜芦醇合酶基因被插入的SEQ ID NO:7序列对应的区域在水稻染色体中可被多种天然的或人工的突变改变。因此，本发明所述的白藜芦醇合酶基因被插入的区域可与以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列有80％或以上的同源性，优选的90％或以上，最优选的95％或以上，只要有利于白藜芦醇合酶基因的表达。
本发明的用于生物合成白藜芦醇的水稻不仅可以包括多个变种，杂种等，用来使用本发明的水稻针对特定繁殖条件和特定表型加入或去除一种特征，而且还可以包括随机突变体，是被繁殖研究领域惯用的诱导突变的多种方法而改变的，只要其保持本发明的生物合成白藜芦醇的作用。
本发明所述的诱导突变的方法可以包括辐照如电磁波辐照、粒子辐照、X-射线辐照、γ-射线辐照、α射线辐照、β射线或紫外射线辐照等；化学突变诱导如插层剂(吖啶橙，原黄素，吖啶黄等)，碱基类似物(5’-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤等)，DNA修饰剂(亚硝酸，羟胺(NH2OH)，烷化剂(MMS，EMS，叠氮化钠)等)；等等，但不限于此。
本发明所述的水稻可以是存在登录号KCTC12529BP下的水稻。
本发明的水稻成熟时，在糙米(brown rice)的情况下可以含有约2μg/g至5.3μg/g的白藜芦醇，在精米(milled rice)的情况下可以含有约1.8μg/g至4.1μg/g的白藜芦醇。
本文所用的术语“白藜芦醇苷”是指白藜芦醇的糖苷，且已知的，是虎杖(Polygonum cuspidatum)根的一种主要成分，用于中药治疗。
优选的，本发明的水稻成熟时，其精米可包括约1.0μg/g到6.5μg/g的白藜芦醇苷。
在一个实施例中，本发明证实了，当源自落花生(Arachis hypogaea)的白藜芦醇合酶基因被分离并插入至水稻中时，其对应的基因序列与SEQ ID NO:1相同。证实了，对于转化水稻种子，本发明已确认其在高浓度下生物合成白藜芦醇，对应的白藜芦醇合酶基因被插入至水稻的第12号染色体中。特别的，证实了，两个T-DNAs是在彼此相反的方向上被插入至水稻(亚洲型栽培稻)的第12号染色体中相同的位置。尤其的，与T-DNAs被插入的区域相邻的序列与在NCBI上公开的日本晴相比，其为具有完整的序列分析的亚洲型栽培稻粳稻(Oryza sativa japonica)水稻，且被证实，第一T-DNA插入开始于第330872号碱基位，接着第二T-DNA在相反的方向插入。本发明的具有这样插入结构的转化水稻，与常规的转化水稻相比，能够具有相当优越的白藜芦醇合成能力。所述的转化水稻种子命名为白藜芦醇强化水稻或白藜芦醇强化转基因水稻，且于2013年12月5日存放在韩国生物科学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下。
然而，本发明中分析的碱基位置可能由于各种错误而在一定程度上被改变，通常发生在对几十万到几百万的碱基染色体分析的过程中，且可能依据分析方法，进行不同的分析。但是，这仅仅是分析方法中的一个错误，不是突变位置的实际变化，因此不影响本发明的实质内容。尽管本发明中的所述白藜芦醇合酶基因的碱基位置可能依据未来分析方法的改进或在核苷酸序列分析水平的改变等而受到不同的分析，但是可以重新分析，或基于存放在韩国生物科学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下的本发明的种子，进行解释。
进一步的，本发明生产的用于生物合成白藜芦醇的转基因水稻，其被证实包括，插入至东津稻的第12号染色体的以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的一个区域，尤其是在以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的第572号碱基之后的白藜芦醇合酶基因。当通过NCBIblast程序对所述基因插入的位置进行分析时，证实是在NCBI登录号NC_008405的第12号染色体中，其正是在本发明的东津稻分类中的亚洲型栽培稻粳稻水稻的核苷酸序列分析。
特别的，证实了尤其是在插入NC_008405的第330872号碱基位。然而，因为该碱基位可以根据发生在生长、交配等过程中的突变而改变，如果该插入位置是本质上可能等同的，我们认为没有超出本发明的范围。
在一个实施例中，本发明证实了，当在本发明的转基因水稻的糙米种子中含有白藜芦醇和白藜芦醇苷时，所含有的白藜芦醇和白藜芦醇苷是高浓度的。特别是，在精米中包含约1.8μg/g至4.1μg/g的白藜芦醇，和约1.0μg/g至6.5μg/g的白藜芦醇苷(表3)，且在糙米中包含约2μg/g至5.3μg/g的白藜芦醇(图13)。同时，考虑到白藜芦醇苷主要集中在水稻种子的外壳，白藜芦醇苷在糙米中的浓度预期明显更高。
在另一个实施例中，本发明提供了所述用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化的转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻的第12号染色体中。特别的，本发明提供了从本发明的水稻生产的水稻种子。
本文所用的术语“东津稻”是指于1975年开发的金南风(Geumnampung)和洛东稻(Nakdong rice)以及Satominori三元杂交育种产生的种子，目的是为了开发一种抗病，质量好，产量高的新品种，其中，洛东稻是疾病高抗水稻。在1981年，在韩国其被选为推荐种子并分布开来，命名为东津稻。
本文所用的术语“水稻种子”是指水稻的种子，包含所有的只要是种子情况，无论是无磨的、半磨的(糙米)、或全磨的(精米)。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成，包括从用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被可表达地插入至天然水稻的第12号染色体中。特别的，本发明提供了一种保健功能性食物组成，用于预防和改善代谢性疾病，其包括本发明的白藜芦醇强化转基因水稻产生的水稻种子。本发明的食物组成可作用的代谢性疾病可以包括肥胖症、糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、其他心血管疾病等。优选地，本发明的代谢性疾病可以为糖尿病或肥胖症。
本文所用的术语“保健功能性食物”是指根据保健功能性食物法律6727号，使用对人体有益的原材料或成分生产或加工的食物。所述术语“功能性”是指，用于对人体的结构和功能营养调节获得有益效果或对健康如生理应用获得有益效果的食物摄入。
本发明所述的用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成可以是丸状、粉末、颗粒、浸剂、片剂、胶囊、或液体形式。本发明的组合物可被添加至例如各种食品中，如饮料、口香糖、茶、维生素复合物、保健食品等食物中。
作为可以包含在所述的用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成中的必要成分，可以包括一种用于预防和改善代谢性疾病的组分，其含有用于生物合成白藜芦醇的水稻产生的水稻，或该组分的一种活性物质、或该组分的一种药学上可接受的盐，但不限于此。像传统的食品，可能包含，各种中草药提取物，食品补充添加剂，或天然的碳水化合物作为附加成分。
进一步的，如所述的，食品补充添加剂可额外添加，食品补充添加剂可以包括本领域中的常规食品补充添加剂如调味剂、香料、色素、填料、稳定剂等。
天然碳水化合物的实例是单糖如葡萄糖、果糖等，二糖如麦芽糖、蔗糖等，和多糖例如常规糖如糊精、环糊精等以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇。除了上述的那些，天然调味剂如索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)，和人工调味剂如糖精、阿斯巴甜等，可以有利地使用。
对上述进一步的，本发明的一种用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成可以包括各种营养素，维生素，矿物质(电解质)，调味剂如合成调味剂和天然调味剂，着色剂，填料(奶酪，巧克力等)，果胶酸及其盐类，褐藻酸及其盐类，有机酸，保护胶体增稠剂，pH调整剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇类，用于碳酸饮料的炭化剂等等。此外，所述保健功能性食品组成可以包括用于生产天然果汁、果汁饮料和植物饮料的果肉。这些组分可以单独使用或组合使用。
在本发明的一个实施例中，本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻产生的水稻种子含有高浓度白藜芦醇，以该种子或东津稻种子生产的饲料给患有诱导代谢性疾病的动物模型(小鼠)通过长期高脂饮食喂食12周。
首先，在向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后，其中，用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分，测血糖。消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的小鼠从第八周开始显示血糖降低，且血糖水平在第十二周下降达22％。另一方面，对照组显示血糖升高或不变。进一步的，当给小鼠喂以含有白藜芦醇(Resv)的常规饲料，其中的白藜芦醇(Resv)含量等同于由白藜芦醇强化转基因水稻所产的饲料中所含的白藜芦醇，小鼠没有表现出任何明显的差异，从而证实了白藜芦醇强化转基因水稻对降低血糖的作用优于简单的含有白藜芦醇(图2)。
其次，在向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后，其中，用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分，测定血液中的总胆固醇，血液中的总天然脂肪，和血液中的LDL和HDL胆固醇。消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的小鼠显示血液中的总胆固醇降低27.0％，血液中的总天然脂肪降低37.4％,且血液中的LDL胆固醇降低59.6％,而血液中HDL胆固醇显示升高14.8％，起到预防代谢性疾病的作用。另一方面，与消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的组相比其他对照组显示无作用或作用较低。此外，即使与喂食含有白藜芦醇(Resv)的常规饲料的组相比，其中的白藜芦醇(Resv)含量等同于由白藜芦醇强化转基因水稻所产的饲料中所含的白藜芦醇，消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的组表现出改善血脂的作用。这证实了白藜芦醇强化转基因水稻对改善血脂的作用优于简单的含有白藜芦醇(图3)
进一步的，向患诱导代谢性疾病的小鼠投喂饲料之后，其中，用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻代替该饲料中的碳水化合物组分，测量体重变化和总脂肪。消耗白藜芦醇强化转基因水稻生产的饲料的小鼠显示体重下降24.7％。同时，当使用活体微计算机断层扫描测量总脂肪量时，总脂肪量减少了21.55％(对照组减少了25.43％组)，内脏脂肪量减少了16.33％(对照组减少了20.02％)，皮下脂肪量减少了3.1％(对照组减少了3.83％组)。因此，证实了总脂肪含量与对照组相比显著降低。这证实了白藜芦醇强化转基因水稻对降低血糖的作用优于简单的含有白藜芦醇。
同时，为了比较白藜芦醇强化转基因水稻，本发明人生产了对照转基因水稻，其中的白藜芦醇合酶基因插入至天然水稻的第4号染色体，从而旨在证实本发明的白藜芦醇强化转基因水稻的良好效果。因此，通过证实所述对照转基因水稻，虽然插入了白藜芦醇合酶基因，与具有相同白藜芦醇添加量的天然水稻相比没有表现出显著的差异，间接证实了本发明的白藜芦醇强化转基因水稻在降低血糖水平，改善血脂，降低体重和身体脂肪等等上表现出优异的效果。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预防和改善代谢性疾病的动物饲料组成，包括由用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因可表达的插入至天然水稻的第12号染色体中。
本文所用的术语“动物”指的是一种根据畜牧法第2(2)(i)条和该法实施条例的第二条中每一款所定义的，野生的由于驯服行为而适合饲养的动物。所述动物可以是牛，马，骡，驴，山羊，斑羚，绵羊，鹿，猪，兔子，狗，猫，家禽等。
本文所用的术语“饲料”指的是任何天然的或人工的日粮，餐粮，或其供动物食用、摄取、消化等的组分。在一个实施例中，一种包括本发明的高白藜芦醇含量水稻的动物饲料组成，其可以包括浓缩饲料，粗饲料，和/或特种饲料。
浓缩饲料可以包括：仁果，包括谷类如小麦，燕麦，玉米等；麸皮如米糠，小麦麸，大麦麸等，是来自精制谷粒的副产品；芝麻粕，是从大豆，油菜籽，芝麻，椰子等中提取油的副产品；残留物如剩余淀粉物质，是红薯，土豆等去除淀粉后留下的淀粉残留的主要组成部分；鱼浆，一种从鱼粉，鱼废物和鱼肉得到的液体生物浓缩物；动物基饲料如肉粉，血粉，羽毛粉，脱脂奶粉，干燥从牛奶制得的奶酪或从脱脂牛奶制得的酪蛋白生产的残余物乳清制得的乳清粉；酵母菌，小球藻，海藻等。
粗饲料可以包括新鲜草饲料如野草，牧草，喂青饲料等；块根类蔬菜如饲料用萝卜，饲料用甜菜，作为一种萝卜的芜菁甘蓝等；青贮饲料，一种储藏饲料，通过向筒仓中填充新鲜青草，喂青饲料作物，构树等，并乳酸发酵制得；嫩干草，通过切削和干燥野草、牧草，和畜牧用农作物秸秆制得；以及豆类和植物的叶子。特种饲料可以包括矿物质饲料如牡蛎壳，岩盐等；尿素饲料如尿素及其衍生物，二酰脲异丁烯等；和饲料添加剂，当只混合了天然饲料原料或为了增加饲料的保质期时，其被少量加入混合饲料中以补充可能缺乏的成分。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成，其包括由用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因可表达的插入至天然水稻的第12号染色体中。特别的，本发明提供了一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成，其包括由本发明的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子。
白藜芦醇强化水稻的种子，其包含在本发明的药物组成中，可以不仅包括未加工的水稻生产的水稻种子，还包括从水稻种子产生的所有形式，比如那些加工后激活水稻种子活性物质的产品，水稻提取物，水稻组分等。
此外，本发明的药物组成可以包括药学上可接受的载体。
本发明的药物组成可以通过本领域众所周知的方法以药物制剂的形式生产，以在施用给哺乳动物之后，提供快速的，持续的或延迟的释放活性物质。对于制剂的生产，首选的是将活性物质与载体混合或稀释，或者把它装入容器形式的载体之中。
因此，本发明的药物组成可以按常规方法制成制剂，其形式为粉末，颗粒，片剂，胶囊剂，悬浮剂，乳液，糖浆，口服剂型如气雾剂，外用制剂，栓剂和无菌注射，其可以进一步包括通常用于制备组合物的载体，辅料，和稀释剂。
例如，可以包括在本发明的组成中的载体，可以是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，海藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，滑石粉，硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。当配制该制剂时，可以使用常用的填充剂，扩链剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，稀释剂如表面活性剂等或辅料。
口服固体制剂包括片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊等，并可以通过混合至少一种辅料如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等至复合物而生产。此外，除了简单的辅料，润滑剂如硬脂酸镁、滑石粉，也可以使用。
口服液体制剂可以是悬浮液，溶液，乳液，糖浆等，且可以不仅包括一般用的简单的稀释剂，如水和液体石蜡，还可以包括其他各种辅料如润湿剂，甜味剂，调味剂，防腐剂等。
胃肠外给药制剂可以包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，乳液，冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂或悬浮剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射型酯类如油酸乙酯。作为栓剂基质，可使用半合成椰油酯/棕榈油酯，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂酸甘油酯，甘油明胶等。
实施例
以下，将更详细的描述本发明参考的实施例，但实施例仅作说明用途，因此本发明的范围不限于此。
实施例1，分离白藜芦醇合酶基因并测序
为了使用所述的白藜芦醇合酶基因来研发本发明的用于高浓度生物合成白藜芦醇的水稻，分离出落花生的白藜芦醇合酶基因，其在高浓度下生物合成白藜芦醇。
首先，收获由韩国农村发展局种植培育的落花生的荚，使用液态氮细磨，采用TRI试剂(MRC公司，美国)分离总RNA。使用NucleoTrap mRNA Midi纯化试剂盒(Clontech公司，美国)获得总RNA。
其次，使用一步法RNA PCR试剂盒(Takara公司，日本)，以正向/反向引物进行逆转录-聚合酶链反应。所述逆转录-聚合酶链反应进行如下：50℃下30分钟的1次逆转录；94℃下2分钟的1次变性；和94℃下30秒的35次变性，在57℃下退火一分钟，并在68℃下扩增1分钟。此处使用的正向/反向引物如下：
正向引物
5'-ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC-3'(SEQ ID NO:2)
反向引物
5'-CGTTATATGGCCACACTGC-3'(SEQ ID NO:3)
所述白藜芦醇合成酶cDNA，是从落花生的mRNA的扩增而得，其被克隆至基因载体，即pGEM-T Easy载体(Promega,美国)，转移至大肠杆菌JM109而用于序列分析。序列分析的进行使用了LI-COR公司(美国)的DNA测序仪4200，以及存在于载体中的T7和SP6引物(SEQID NO:1)。
实施例2.一种转化载体的建立
为了诱导从实施例1中得到的所述白藜芦醇合酶基因至水稻中，建立了一种转化载体。
特别的，为了建立水稻的一种转化载体，引入了泛素启动子用于诱导植物体的组成型表达，且引入一种抗除草剂基因，Bar，作为选择标记，同时利用pCAMBIA 3300载体作为骨架。得到的载体被命名为pSB22载体。
通过PCR反应使用正向引物和反向引物使实施例1中所述的白藜芦醇合酶基因扩增，所述正向引物具有被BamH1限制性酶靶向的序列(5'-CGGATCCATGGTGTCTGTGAGTG-3'，SEQ ID NO:4)，且所述反向引物具有被Sac1限制性酶靶向的序列(5'-CGAGCTCCGTTATATGGCCACA-3',SEQ ID NO:5)
PCR反应进行如下：在94℃下2分钟的初始变性；然后，在94℃下20秒变性，64℃下20秒的退火，72℃下50分钟的扩增，如此，循环35次；最后，在72℃下50秒的终极扩增。
PCR反应得到的PCR产品以限制酶BamH1和Sac1进行处理，其被引入至pSB22水稻转化载体中。从引入产生的载体命名为pSB2220，其结构如图1所示。
实施例3.生产白藜芦醇合酶基因转化水稻
为了向水稻中导入实施例2中生产的用于水稻转化的所述pSB2220载体，采用冻融法将所述载体导入根癌农杆菌(LBA 4404)中(An，1987；An等人，1988)。
导入pSB2220的农杆菌在AB液体培养基(K2HPO46g，NaH2PO42g，NH4Cl 2g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.6g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeSO4·7H2O0.05g，葡萄糖10g，去离子水10mL)之中于28℃培养3天，增殖，浓缩10倍后用于愈伤组织的感染。
成熟水稻种子的糙米用70％乙醇消毒一分钟，用2％的次氯酸钠消毒一小时。灭菌后，用消毒水冲洗种子至少5次，并在2N6培养基(N6盐3.95g/L，蔗糖30g/L，酪蛋白水解物1g/L，2,4-D 2mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5.6-5.7)中，于25℃黑暗条件下培养约3周，从而诱导愈伤组织。
在诱导的水稻愈伤组织中，将其直径约3至4毫米的所述愈伤组织再次投入2N6培养基中并在25℃黑暗条件下培养4天。在培养的愈伤组织与培养有农杆菌的培养基混合并感染20分钟之后，将其放入2N6AS100培养基(2N6，100μM乙酰丁香酮)并在20℃黑暗条件下培养3天。混合培养后用消毒水，其中加入了250mg/L头孢噻肟，冲洗愈伤组织至少5次，以去除其中没被诱导的残留的农杆菌。
将农杆菌感染的愈伤组织放入2N6-PT5培养基(N6盐3.95g/L，蔗糖30g/L，酪蛋白氨基酸1g/L，2,4-D 2mg/L，草丁膦5mg/L，头孢噻肟250mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5.6-5.7)中，并在25℃黑暗条件下培养4周，之后挑选具有草丁膦(PPT)选择标记抵抗性的愈伤组织，这样积极生长。
将从2N6-PT5培养基挑选的愈伤组织放入N6-BA培养基(N6盐3.95g/L，蔗糖20g/L，山梨醇30g/L，酪蛋白氨基酸2g/L，2,4-D 1mg/L，BAP 0.5mg/L，PPT 6mg/L，头孢噻肟250mg/L，植物凝胶2g/L，pH 5.6-5.7)中并在25℃黑暗条件下培养2周，之后挑选生长旺盛的愈伤组织
将从N6-BA培养基选取的愈伤组织放入MSR培养基(MS盐3.95g/L，蔗糖40g/L，山梨醇20g/L，肌醇100mg/L，NAA 0.1mg/L，激动素2mg/L，PPT 6mg/L，头孢噻肟250mg/L，植物凝胶5g/L，pH 5.6-5.7)中，并在25℃和16小时的光照条件下培养至少一个月，随后分化成植物体。
当再分化水稻在皮氏培养皿中尺寸达约4至5cm时，将其移到瓶子培养基中，在约20000lux的照明，温度25°和16小时的光照条件下生长到2至3叶期。然后，将幼苗移栽至转基因温室的土壤中，并收获种子。假定目前的再分化植物体是T0代，且从该植物体收获的种子是T1代，连续进展直到T5代。
实施例4.证明白藜芦醇合酶基因是否被诱导至转化水稻中
4-1.诱导的简单证明
通过聚合酶链反应来证明白藜芦醇合酶基因是否被诱导至实施例3生产的转化水稻中
详细的，基因组的DNA从所述实施例3生产的转化水稻中分离，其后进行聚合酶链反应。在聚合酶链反应中使用了所述用于生产pSB2220载体的正向和反向引物(正向；5'-CGGATCCATGGTGTCTGTGAGTG)-3',SEQ ID NO:4,反向；5'-CGAGCTCCGTTATATGGCCACA-3',SEQID NO:5)。
聚合酶链反应进行如下：94℃下初始变性2分钟；然后，94℃下变性20秒，64℃下退火20秒，72℃下扩增50秒，如此循环35次；最后，72℃下终极扩增7分钟。
所述聚合酶链反应显示一个1.1kb的带，其对应于白藜芦醇合酶基因，从而证实了白藜芦醇合酶基因被稳定的插入至所述转化水稻的基因组中。
4-2.所述被插入基因的插入区域分析
为验证所述白藜芦醇合酶基因在本发明实施例3中制得的用于生物合成白藜芦的转化水稻的基因组中的位置，在用限制酶处理后连接一转接子，此后进行PCR。通过测序对PCR产物进行分析和证实。
详细的，从实施例3生产的转化水稻分离基因组DNA并用限制酶进行处理。在37℃下与HaeIII限制酶反应4小时之后，连接一转接子(tccctttagtgagggtaaattg)，然后进行PCR反应。
PCR反应如下进行，94℃下初始变性2分钟；然后，94℃下变性20秒，64℃下退火20秒，72℃下扩增50秒，如此循环35次；最后，72℃下终极扩增7分钟。测序采用LI-COR公司(美国)的DNA测序仪4200进行，并使用水稻中存在的T7和SP6引物。
因此，所述水稻的带线，已证实有白藜芦醇合酶基因插入至水稻的第12号染色体中，被选为本发明的所述的转化(白藜芦醇强化转基因)水稻。
4-3.被插入基因的结构分析和相邻核苷酸序列测定
为证实所述被插入基因在所述基因组DNA中的插入区域和关于本发明实施例3制得的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻的所述插入区域相邻的核苷酸序列，对一侧翼DNA序列进行分析。对两个T-DNA插入至本发明所述的转化水稻这一事实进行了分析。同时，对相邻的核苷酸序列和被插入的T-DNA的结构进行了分析。总之，证实了，两个T-DNA是以彼此相反的方向插入至水稻第12号染色体的同一位置。
将本发明所述的用于生物合成白藜芦醇的转化水稻中引入的T-DNA插入区域相邻的区域与NCBI所公开的日本晴的序列数据相比，其中日本晴是与本发明使用的东津稻在序列上具有相似性且具有完整的序列分析的粳稻，比较显示第一个T-DNA插入至NCBI披露的日本晴序列(NCBI登录号No.NC_008405)的第12号染色体的第330872个碱基位，随后是第二个T-DNA在相反方向的插入。详细的，证实了，第12号染色体的第330871个碱基和所述第一个T-DNA的插入起始区(左边缘)是相连接的，所述第二个T-DNA的插入起始区(左边缘)是与同一条染色体的第330908个碱基相连。总之，证实了所述两个T-DNAs是以反向相连的单个结构被插入至本发明所述的转化水稻的第12号染色体中(图1b)。
发现所分析的相邻核苷酸序列是一个由SEQ ID NO:7表示的核酸序列。特别是，本发明的所述白藜芦醇合酶基因已证实是被插入至SEQ ID NO:7的第572个碱基之后。因此，分析了两个T-DNA是被连续的插入和连接至SEQ ID NO:7的第572个碱基和第609个碱基。
这样，所述的转化水稻种子被命名为白藜芦醇强化水稻且于2013年12月5日被存至韩国生物科学与生物技术研究所生物资源中心的登录号KCTC12529BP之下。
实施例5.转化水稻的白藜芦醇生物合成分析
通过HPLC分析证实了实施例3所生产的转化水稻中是否确实合成了白藜芦醇。
详细的，对T5代转化水稻的糙米种子进行磨碎，将600毫克的粉末放入一2毫升管，随后加入30％甲醇600μL。将混合物在45℃下以150RPM的速度搅拌50分钟，从而提取白藜芦醇。在4℃，10000g转速的条件下离心5分钟，上清液通过0.2μm膜滤器过滤，并用高效液相色谱(HPLC)分析。将(Waters2695，爱尔兰)Waters和Xterra RP18联用，采用5μM 4.6mm x250mm柱(Waters，爱尔兰)进行HPLC分析，并采用水和乙腈作为溶剂用于梯度条件。
建立和分析的梯度条件为0至5分钟时水和乙腈的比率为90:10(v/v)，5至65分钟时水和乙腈的比率为70:30(v/v)。分析进行通过注入10μL的提取物并以1mL/min的流量和UV308nm的波长进行测量。结合紫外光谱和标准物质的保留时间来估计白藜芦醇以及白藜芦醇与糖苷，白藜芦醇苷(白藜芦醇-3-O-葡萄糖苷)的复合物的峰。
分析结果证实，本发明实施例3生产的所述转化水稻包含高浓度的白藜芦醇和白藜芦醇苷。
实施例6.白藜芦醇合成水稻的生长和取决于收获的条件的白藜芦醇浓度的差异
实施例6-1.田间栽培条件下依据水稻移栽时间的水稻生长特性
所述本发明的白藜芦醇合成水稻在田间栽培条件下分别移栽于6月1日，15日，和30日，结果表明，6月1日，15日，和30日的水稻移植后，其主茎叶片的生长终止分别发生在每一次移植后的75.1天，65.1天，55.1天，此时的积温分别是1886℃，1688℃和1474℃。这里，成熟叶子数量分别为13.0，11.6，和11.2，且与典型的中晚熟品种相比，在6月1日移植的水稻抽穗期表现了推迟4天到5天的趋势(图11)。
因此，在6月1日，15日，和30日移栽的水稻抽穗期开始于8月22日，8月27日，和8月31日。因此，看出延迟插秧情况下的抽穗特征是很大可能不完全成熟。
实施例6-2.高温培育条件(温室)下依据水稻移栽日期的水稻生长特征
在高温条件下，相比于田间培养条件下于6月1日移植的水稻(于8月22日抽穗)，本发明所述的白藜芦醇合成水稻随温度的升高，其抽穗期越早。因此，在温度升高3.5℃的条件下，抽穗期提前了5天。
表1
在高温培养条件下抽穗期的变化
如表1中所示，于6月15日移栽的水稻抽穗期比田间栽培条件下提前2天，即是8月27日，于6月30日移栽的水稻抽穗期比田间栽培条件下提前1天，即8月31日。因此，相比于6月1日的水稻移植，温度升高对于缩短水稻生长的作用随水稻移栽日期的推迟而下降。
实施例6-3.水稻产量依据水稻移植日期和高温条件的变化
测量了依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期和高温条件下水稻产量的变化。
表2
水稻产量依据水稻移植日期和高温条件的变化
如表2所示，在2010年，与平均年相比，由于在成熟期中日照时间不足，且在成熟期后期急剧降温，在6月1日移植的水稻产量最高，为520kg/10a。然而，随水稻移植日期的推迟，水稻产量降低。
对于6月1日水稻移植来说，其表现了较为提前的抽穗期，随着温度的升高，水稻产量急剧下降，且在温升为3.5℃的条件下，水稻产量是很低的，为217kg/10a。
水稻移植日期的推迟，由于温度增加导致水稻产量的减少是比较小的，且水稻产量在温升为1.4℃的条件下是最高的。对于6月1日的水稻移植来说，产量构成因素中对在升温条件下产量减少具有最大的影响的是成熟期，且当温度升高，成熟率明显降低。
实施例6-4.依据水稻移植日期的水稻产量和白藜芦醇含量的变化
依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期，测量了白藜芦醇含量的变化。
随着水稻移植日期的推迟，白藜芦醇含量升高，6月15日移植的水稻表现了最高的水稻产量和最高的白藜芦醇含量(图12)。
实施例.6-5依据水稻移植日期、栽培温度和收获日期的白藜芦醇和白藜芦醇苷含
量的变化
依据本发明的白藜芦醇合成水稻的水稻移植日期、栽培温度和收获日期，测量了白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的变化。
表3
依据水稻移植日期、栽培温度和收获日期的种子(精米)中白藜芦醇含量的变化
表4
依据水稻移植日期、栽培温度和收获日期的植物体中白藜芦醇苷含量的变化
如表3所示，随着水稻移植日期的推迟，白藜芦醇含量增加，且在相同的水稻移植条件下，当高温应力处理时白藜芦醇含量增加。抽穗40天后收获的这一组，具有整体较高的白藜芦醇含量。
此外，如表4所示，白藜芦醇苷是白藜芦醇苷水稻的糖苷形式，且随成熟的进程，叶片中的白藜芦醇苷的含量逐渐降低。然而，当水稻移植日期被推迟从而导致延迟成熟或在高温条件下发生成熟，叶片中白藜芦醇苷含量趋于变高。这被确定为是由于高热应激下植保素的影响。
实施例6-6.种子中白藜芦醇含量依据收获时间的变化
测量了本发明所述白藜芦醇合成水稻种子(糙米)中白藜芦醇含量依据收获时间的变化。
如图13所示，在成熟期高温条件下种子中白藜芦醇含量增加，并在温升大于等于2℃的条件，白藜芦醇含量相比于田间栽培条件增加20％。
对于6月1日和6月15日的水稻移植，高温条件下白藜芦醇的增加表现出相似的趋势，但是6月30日的水稻移植随温度的升高，白藜芦醇急剧增加。
实施例6-7.依据实际区域间的差异的生长特征
为了研究本发明的白藜芦醇合成水稻的农业特点，对本发明的白藜芦醇合成水稻和作为母种和比较品种的转化东津稻的农业的特点进行测验。
详细的，东津稻，常规转化水稻(转化水稻中两拷贝数白藜芦醇合酶基因被反向插入至天然水稻的第4号染色体)，和本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻被栽培在隔离的田中，种植间隔为30cm×15cm，每块培土3株苗，通过3个周期的随机分组设计，在3个不同的区域益山、水原和密阳中种植。测量了生长特征和数量。
表5
区域主要生长特征和水稻的产量构成
如表5所示，虽然益山和密阳区域在生长特性和数量上显示出类似的结果，但与益山区的实验组相比，在水原种植的所有的实验组显示出延迟抽穗和高度降低12厘米或更多。由于减少了穗，每穗粒数，和成熟率，水稻产量与益山相比减少约12％。相比于对照组，东津稻、益山、水原和密阳全部显示出相同趋势的产量指数。
此外，通过上述方法收获和捣碎在隔离田中栽培的种子，并分析了精米中的白藜芦醇含量。
表6
白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量分析
| 学名 | 白藜芦醇(μg/g) | 白藜芦醇苷(μg/g) |
| 常规转化水稻 | 1.400.01 | 0.290.00 |
| 本发明的转化水稻 | 2.010.06 | 0.420.03 |
如表6所示，证实了1.40μg/g和2.01μg/g的白藜芦醇分别在常规转化水稻和本发明的白藜芦醇强化转基因水稻中被合成。
将东津稻，常规转化水稻(转化水稻中两拷贝数的白藜芦醇合酶基因被反向插入至天然水稻的第4号染色体)，和本发明所述的白藜芦醇强化转基因水稻的3个周期的样品种植于3个不同的区域，益山、水原和密阳，并被捣碎和生产为精米，随后通过高效液相色谱分析分析白藜芦醇的含量。
表7
在三个区域中种植的种子(精米)中白藜芦醇含量的分析
如表7所示，与益山相比，在水原和密阳的常规转化水稻和本发明的白藜芦醇合酶水稻分别显示出白藜芦醇含量增加了约30％以上和25％以上。这是由于白藜芦醇合成是依据种植区域的温度差异通过白藜芦醇合酶基因植保素效应而增加的。
实施例7.测量白藜芦醇强化水稻在代谢性疾病诱导的动物模型中的作用
本发明的含有高浓度白藜芦醇的水稻对代谢性疾病的作用研究，利用了通过长期高脂饮食而诱导了代谢性疾病的动物模型(小鼠)。具体的，每15个C57BL/6近交系小鼠饲以高脂饮食被饲喂12周，从而建立代谢性疾病如糖尿病，肥胖症，高脂血症，高胆固醇血症等诱导的模型。其次，转化水稻或东津稻种子生产的饲料分施于动物12周。12周之后，通过每3周从尾静脉采血一次，对血糖和胆固醇等进行了分析，从而检验诱导了代谢性疾病的动物模型中的白藜芦醇强化转基因水稻和转化水稻的作用。
实施例7-1.血糖的比较测量
如上所述，对实验动物喂以饲料之后，其中用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测定血糖水平(图2)。
如图2所示，消耗了所述转化水稻生产的饲料的小鼠，从第八周显示出血糖降低，且在第十二周血糖下降22％。另一方面，对照组表现出不变或升高的血糖水平。进一步的，当喂以普通饲料，其中包含的白藜芦醇(Resv)的量与转化水稻生产的饲料中的相当，小鼠没有显示出明显的不同，从而证实了所述转化水稻对降低血糖的作用优于简单的包含白藜芦醇。
实施例7-2.血脂代谢的比较测量
如上所述，喂以饲料之后，其中用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测定了血液中的总胆固醇，血液中的总天然脂肪，和血液中的LDL和HDL胆固醇(图3)。
如图3所示，小鼠消耗了所述转化水稻生产的饲料后显示出，血液中的总胆固醇降低27.0％，血液中的总天然脂肪降低37.4％，和血液中的LDL胆固醇降低59.6％，而血液中的HDL胆固醇增加14.8％，起到预防代谢性疾病的作用。
其他对照组无作用或作用低于消耗了所述转化水稻生产的饲料的组。此外，即使与喂普通饲料的组相比，所述普通饲料包含白藜芦醇(Resv)的量与转化的未去壳稻谷(unhulled rice)生产的饲料中的相当，消耗转化水稻生产的饲料的组表现出改善血脂的作用。这表明，转化水稻对改善血脂的效果优于简单的含有白藜芦醇。
实施例7-3.体重和身体脂肪的比较测量
如上所述，喂以饲料之后，其中用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测量了体重变化和总脂肪量(图4)。
如图4所示，消耗所述转化水稻生产的饲料的小鼠表现出体重降低24.7％。同时，当使用活体断层微计算机扫描测量总脂肪量时，总脂肪量减少了21.55％(对照组减少了25.43％组)，内脏脂肪量减少了16.33％(对照组减少了20.02％)，皮下脂肪量减少了3.1％(对照组减少了3.83％组)。因此，证实了总脂肪含量与对照组相比显著降低。
比较例1.白藜芦醇合成水稻的作用
为了比较同样的白藜芦醇合酶基因被插入至不同的染色体中的转化水稻的作用，对其中同样的白藜芦醇合酶基因插入至天然水稻的第4号染色体中的转化水稻的作用进行了测验。
首先，通过实施例1至3中所述的方法生产转化水稻，其中同样的白藜芦醇合酶基因插入至天然水稻的第4号染色体中。进一步的，通过实施例4中所述的方法证实了，白藜芦醇合酶基因是插在第4号染色体的第29,358,342个碱基上，且被命名为对照转化水稻。
已证实所述对照转化水稻包含白藜芦醇1.60±0.05μg/g(糙米)或1.41±0.014μg/g(精米)，以及白藜芦醇苷3.21±0.06μg/g(糙米)或0.48±0.03μg/g(精米)，从而证实了白藜芦醇合成水稻中白藜芦醇合酶基因是正常起作用的。
参照实施例7，通过同样的方法证实了另一个也像这样生产的白藜芦醇合成水稻在诱导了代谢性疾病的动物模型中的作用。
比较例1-1.血糖的比较测量
如上所述，喂以饲料之后，其中用东津稻和白藜芦醇强化转基因水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测定血糖水平(图5)。
如图5所示，相比于消耗所述含等量白藜芦醇的东津稻的组，消耗所述对照转化水稻的小鼠在整个实验期间表现出较高的血糖水平。
因此，如图2，说明了关于转化水稻的试验，表明与消耗了含等量的白藜芦醇的饲料相比，消耗了所述转化水稻时降低血糖水平的作用明显优越。然而，图5说明了关于对照转化水稻的试验，表明所述对照转化水稻与含等量的白藜芦醇的饲料相比，表现出同等或更差的效果。
比较例1-2.血脂代谢的比较测量
如上所述，喂以饲料之后，其中用东津稻和含白藜芦醇的转化水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测量了血液中的总胆固醇，血液中的总天然脂肪量，和血液中的LDL和HDL胆固醇(图6至9)。
如图6至9所示，与消耗东津稻的组相比，消耗所述对照转化水稻的小鼠对血液中的总胆固醇、血液中的总天然脂肪、和血液中的LDL胆固醇表现出不变的或更差的作用。但是,尽管血液中的HDL胆固醇稍微有增加，这种差异并不显著。
因而，图3所示为关于转化水稻的试验，其表明与消耗含有等量白藜芦醇的饲料相比，当消耗所述转化水稻时，观察到使血液中的总胆固醇，血液中的总天然脂肪和血液中的LDL胆固醇降低并使血液中的HDL胆固醇升高的作用。然而，图6至9所示为关于所述对照转化水稻的试验，其表明对于那些含有等量白藜芦醇的饲料的组来说，所述对照转化水稻表现出了更差的作用。
比较例1-3.体重的比较测量
如上所述，喂以饲料之后，其中用东津稻和含白藜芦醇的转化水稻取代碳水化合物成分而进入被代谢性疾病诱导的小鼠中，测量体重变化(图10)。
如图10所示,与消耗含有等量白藜芦醇的东津稻的组相比，消耗所述对照转化水稻的小鼠显示无变化达到9周，从12周开始体重降低。
但是，相比之下，图4a所显示的关于所述转化水稻的试验中的差异为24.7％，而所述对照转化水稻的体重降低的作用是弱如6％.
对上述结果的总结为，本发明中白藜芦醇合酶基因被插入至天然水稻的第12号染色体中，与其中同样的基因被插入至不同的染色体的转化水稻相比，本发明表现出优异的预防和治疗代谢性疾病的作用。
基于以上的描述，本领域普通技术人员应该了解，其他具体实施例可用于实施本发明，但不脱离本发明的技术理念或本质特征。对此，上述例子仅作说明用途，本发明的目的不限于这些例子。本发明的范围应理解为包括所有的来自如下权利要求或其等效概念的含义和范围的修改或修正的形式，而不是上述的详细描述。
保藏证明
致:白苏铉
农村振兴厅长国立作物科学研究所
457pyeongdong-ro,iksan-si,jeollabuk-do 570-080
韩国
Claims (14)
1.一种生产用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻的方法，包括将两拷贝数的白藜芦醇合酶基因以彼此相反的方向连续地和可表达地插入以连接至在天然未去壳稻谷的第12号染色体中以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的区域中的第572个碱基和第609个碱基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述白藜芦醇合酶基因源自落花生。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述白藜芦醇合酶基因由SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述水稻是保藏在登记号KCTC12529BP之下的水稻。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述水稻成熟时，在糙米中包括白藜芦醇2μg/g至5.3μg/g，并且，在精米中包括白藜芦醇1.8μg/g至4.1μg/g。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步生物合成白藜芦醇苷。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述水稻成熟时在精米中包括1.0μg/g至6.5μg/g的白藜芦醇苷。
8.一种由根据权利要求1-7中任一项所述的方法生产的水稻生产水稻种子的方法。
9.一种用于预防和改善代谢性疾病的保健功能性食物组成，包括用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因以彼此相反的方向被连续地和可表达地插入以连接至在天然水稻的第12号染色体中以SEQ IDNO:7表示的核苷酸序列的区域中的第572个碱基和第609个碱基。
10.根据权利要求9中所述的保健功能性食物组成，其中所述天然水稻是天然东津稻。
11.根据权利要求9中所述的保健功能性食物组成，其中所述用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻进一步生物合成白藜芦醇苷。
12.根据权利要求9中所述的保健功能性食物组成，其中所述代谢性疾病选自肥胖症，糖尿病，高脂血症和高胆固醇血症的组。
13.一种用于预防和改善代谢性疾病的动物饲料组成，其包括用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因以彼此相反的方向被连续地和可表达地插入以连接至在天然水稻的第12号染色体中以SEQ IDNO:7表示的核苷酸序列的区域中的第572个碱基和第609个碱基。
14.一种用于预防和改善代谢性疾病的药物组成，其包括用于生物合成白藜芦醇的白藜芦醇强化转基因水稻生产的水稻种子，其中，两拷贝数的白藜芦醇合酶基因以彼此相反的方向被连续地和可表达地插入以连接至在天然水稻的第12号染色体中以SEQ ID NO:7表示的核苷酸序列的区域中的第572个碱基和第609个碱基。
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