CN105002107B - 产香菌gxy35、其培养方法及烟用香料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种产香菌GXY35，保藏编号为CGMCC NO.10261，其培养方法为：将保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35在发酵培养基中进行发酵培养。本发明还提供了一种由所述产香菌GXY35对含有烟末的发酵培养基进行发酵得到的烟用香料。本发明的产香菌GXY35可以发酵含有烟末成分的培养基，并产生对乙烯基愈创木酚作为典型的香味物质，该种香味物质与烟香较好协调，可用于提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味。

Description

产香菌GXY35、其培养方法及烟用香料
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产香菌GXY、其培养方法及烟用香料。
背景技术
烟草薄片是一种将整个卷烟过程中的废弃制品制成形状接近甚至优于天然烟叶的再造烟叶。利用造纸法生产烟草薄片的工艺为：将烟草物料用水浸泡萃取，经压榨将烟草水溶性物与烟草纤维等不溶物进行固液分离，所得固体再经抄纸制成纤维薄片片基，所得液体再经浓缩制成烟草水溶性物浓缩液，在该浓缩液中加入酶制剂或/和微生物制剂进行生物降解反应，然后将经过生物降解反应的烟草水溶性物浓缩液浸涂或喷涂到薄片片基上，最后经干燥、分切制得烟草薄片。
我国的烟草薄片由于原料本身的限制，普遍存在缺乏香气的品质问题。利用产香微生物发酵烟末溶液等烟叶加工产生的废料制备生物香料，对于提高造纸法生产的烟草薄片的吸食品质具有重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种产香菌GXY35，其保藏编号为CGMCCNO.10261，此菌株的培养方法及应用以及用此菌株制备的烟用香料。
本发明公开了一种产香菌GXY35，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.10261。
本发明公开了一种保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35的培养方法，包括以下步骤：
将保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35在发酵培养基中进行发酵培养。
优选的，所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO40.6～1.2g，Na2HPO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl20.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
优选的，所述发酵培养时，活菌接种量为1～12％。
优选的，所述发酵培养的温度为28～43℃，发酵培养的时间为24～100h，起始pH值为5～9，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:8～1:20。
优选的，所述发酵培养的温度为37℃，发酵培养的时间为96h，起始pH值为7，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:20。
本发明公开了一种烟用香料，其特征在于，由上述技术方案所述的保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35对含有烟末的发酵培养基进行发酵得到；
所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO40.6～1.2g，Na2HPO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl20.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
本发明还公开了上述技术方案所述的产香菌GXY35在烟草增香中的应用。
与现有技术相比，本发明提供产香菌GXY35，保藏编号为CGMCCNO.10261，其可以发酵含有烟末成分的培养基，并产生对乙烯基愈创木酚作为典型的香味物质，该种香味物质与烟香较好协调，可用于提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味。
生物保藏说明
产香菌GXY35，分类命名为克雷伯氏菌Klebsiella sp.，于2014年12月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCCNo.10261。
附图说明
图1为实施例3制备的含有烟用香料的发酵液的气相色谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种产香菌GXY35，其保藏编号为CGMCC NO.10261。
具体的，本发明提供了一种产香菌GXY35，其为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC No.10261。
本发明的所述的产香菌GXY35，不能以氮气为氮源，不水解淀粉，对葡萄糖不产酸，甲基红M-R阳性，V-P阴性，吲哚阴性，明胶液化阴性，柠檬酸盐阳性，在脱脂牛奶中于72℃加热15min不再存活。好氧，生长温度37℃。
本发明所述产香菌GXY35的分离筛选方法为：将烟叶用无菌水清洗，得到带有菌种的菌液；
将所述菌液将菌液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个浓度梯度，均匀涂布于基础培养基平板上。放入37℃恒温培养箱中培养；基础培养基的配方：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH值为7.2～7.4，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃下灭菌30min。
24小时后观察平板生长情况，选择菌种数较多、菌株单菌落较多的平板确定为最适浓度梯度。通过测量菌落的大小，观察菌落形状是否规则，边缘是否整齐，表面凸起或平展、有无光泽以及是否光滑，质地粘或脆，颜色透明与否等，挑取出单菌落。采用平板划线法分离纯化菌株，重复多次纯化直至培养皿中菌种形态单一，确定为纯菌株，编号保存。
对上述产香菌GXY35进行16S rRNA检测。根据菌株的基因测序结果与克雷伯氏菌具有高度的同源性，故将本发明得到的产香菌GXY35鉴定为克雷伯氏菌Klebsiella sp.。
本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35的培养方法，包括以下步骤：
将保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35在发酵培养基中进行发酵培养。
所述发酵培养基的组成优选为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO40.6～1.2g，Na2HPO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl20.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
所述发酵培养基更优选为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.75g，KH2PO40.9g，Na2HPO41g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，占培养基固体含量5％的烟末。
所述发酵培养基中，所述烟末包括烟叶、烟梗、烟花等的碎末。
所述发酵培养时，活菌接种量优选为1～12％，更优选为10～12％。
所述发酵培养的温度优选为28～43℃，更优选为35～37℃；所述发酵培养的时间优选为24～100h，更优选为90～100h；起始pH值优选为5～9，更优选为7～8；所述发酵培养基中烟末与水的质量，即料液比，优选为1:8～1:20，更优选为1:15～1:20。
所述发酵培养的最佳条件为：所述发酵培养的温度为37℃，发酵培养的时间为96h，起始pH值为7，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:20。
本发明还公开了一种烟用香料，由上述技术方案所述的保藏编号为CGMCCNO.10261的产香菌GXY35对含有烟末的发酵培养基进行发酵得到；
所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO40.6～1.2g，Na2HPO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl20.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
所述发酵培养基的组成优选为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.75g，KH2PO40.9g，Na2HPO41g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，占培养基固体含量5％的烟末。
本发明对于发酵培养基中所用的烟末没有特殊限制，其可以为烟叶加工中产生的废料烟末。
所述发酵时，活菌接种量优选为1～12％，更优选为10～12％。
所述发酵的温度优选为28～43℃，更优选为35～37℃；所述发酵时间优选为24～100h，更优选为80～100h；起始pH值优选为5～9，更优选为7～8；所述发酵培养基中烟末与水的质量比，即料液比，优选为1:8～1:20，更优选为1:15～1:20。
所述发酵培养的最佳条件为：所述发酵培养的温度为37℃，发酵时间为96h，起始pH值为7，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:20。
所述烟用香料主要成分为对乙烯及愈创木酚，为典型的挥发性香味成分，可以与烟香较好协调，明显提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味。
本发明还公开了一种产香菌GXY35在烟草增香中的应用。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有产香效果的菌株、其培养方法及烟用香料进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1本发明产香菌GXY35的分离
称取烟叶5g于100ml洁净的锥形瓶中，加入100ml无菌水。摇床37℃，200rpm条件下培养15min～30min，使烟叶表面的微生物转移至无菌水中。
将菌液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七个浓度梯度，均匀涂布于基础培养基平板上。基础培养基的配方：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L，pH值为7.2～7.4，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃下灭菌30min。
放入37℃恒温培养箱中培养。24小时后观察平板生长情况，选择菌种数较多、菌株单菌落较多的平板确定为最适浓度梯度。通过测量菌落的大小，观察菌落形状是否规则，边缘是否整齐，表面凸起或平展、有无光泽以及是否光滑，质地粘或脆，颜色透明与否等，挑取单菌落。采用平板划线法分离纯化菌株，重复多次纯化直至培养皿中菌种形态单一，确定为纯菌株，编号保存。
根据菌株的基因测序结果与克雷伯氏菌具有高度的同源性，故将本发明得到的产香菌GXY35鉴定为克雷伯氏菌Klebsiella sp.。
实施例2产香菌GXY35的发酵条件优化
取保藏编号为CGMCC NO.10261的产香菌GXY35按照表1及表2的实验条件设计在发酵培养基中进行发酵培养。所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.75g，KH2PO40.9g，Na2HPO41g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，占培养基固体含量5％的烟末。
培养完毕后，用二氯甲烷萃取发酵液，收集有机相于三角瓶中。由于发酵萃取液中的残余水分可能对气象色谱仪器造成影响，故添加一定量无水硫酸钠4℃静置过夜，去除残余在萃取液中的水分。之后加入1ml乙酸苯乙酯作为定量分析的内标物质，经浓缩处理，得到淡黄色挥发性物质，进行GC/MS定性定量分析。
气相条件：色谱柱：HP-5，进样口：260℃，进样量：1μL，分流比：10:1，延迟5min，升温程序：50℃保持2分钟，然后以6℃/分的速度，升到280℃保持10分钟。
质谱条件：Aux：260℃，四级杆温度：150℃，离子源温度：230℃，质量扫描范围：30～550amu
表1 L16(45)正交实验设计表
表2 发酵条件优化正交实验结果
以未接种产香菌GXY35的发酵液作为空白对照，利用GC/MS对发酵液中特征香味物质的含量进行定量分析可知，特征香味成分产量最多组合为A3B3C4D3E1最佳发酵条件为料液比1:20，接种量12％，发酵温度37℃，发酵时间96h，起始pH值7.0，此时特征香味物质的含量最高，通过内标物质计算其准确含量，可达0.724541mg/mL。
实施例3
取保藏编号为CGMCC NO.10261的具有产香效果的菌株在发酵培养基中进行发酵培养，得到含有烟用香料的发酵液。所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.75g，KH2PO40.9g，Na2HPO41g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，占培养基固体含量5％的烟末。
其料液比1:20，接种量12％，发酵温度37℃，发酵时间96h，起始pH值7.0，转速为150r/min。
图1为实施例3制备的含有烟用香料的发酵液的气相色谱图。
表3为实施例3制备的含有烟用香料的发酵液成分分析结果。
表3 实施例3制备的含有烟用香料的发酵液成分分析结果
由表3可知，本实施例制备的发酵液中含有对乙烯基愈创木酚，对乙烯基愈创木酚具有挥发性香味，其含量较高。该种香味物质与烟香较好协调，可用于提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)GXY35，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.10261。
2.一种保藏编号为CGMCC NO.10261的克雷伯氏菌GXY35的培养方法，包括以下步骤：
将保藏编号为CGMCC NO.10261的克雷伯氏菌GXY35在发酵培养基中进行发酵培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO4 0.6～1.2g，Na2HPO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl2 0.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养时，活菌接种量为1～12％。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～43℃，发酵培养的时间为24～100h，起始pH值为5～9，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:8～1:20。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为37℃，发酵培养的时间为96h，起始pH值为7，所述发酵培养基中烟末与水的质量比为1:20。
7.一种烟用香料，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.10261的克雷伯氏菌GXY35对含有烟末的发酵培养基进行发酵得到；
所述发酵培养基的组成为：
每1000ml发酵培养基中含有阿魏酸0.5～0.9g，KH2PO4 0.6～1.2g，Na2HPO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g，CaCl2 0.05～0.15g，FeSO4·7H2O 0.01～0.03g，占培养基固体含量3～10％的烟末。
8.权利要求1所述的克雷伯氏菌GXY35在烟草增香中的应用。
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