CN108004175A

CN108004175A - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108004175A
Application number: CN201711454636.3A
Authority: CN
Inventors: 夭建华; 米其利; 李晶; 朱昆; 楼牧梦; 张崇阳; 李雪梅; 陈建华; 杨光宇; 莫明和
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108004175B

Abstract

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1及其制备方法和应用，属于微生物应用技术领域。本发明所用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1菌株已于2017年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017705。用YGA1菌株制备的浓缩发酵液在料液中添加0.1‑1.0%时，能够有效稳定料液的感官质量，抑制料液中腐败细菌的增殖，延长料液保质期，卷烟感官评吸结果表明上述添加量对卷烟感官抽吸品质没有影响。本发明方法成本低，操作方法易行，在延长料液保质期、防止料液变质方面具有很大应用潜力。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，特别是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YGA1及其制备方法和在延长料液保质期中的应用。

背景技术

烟用香精香料被广泛用于烟草及烟草制品，能够赋予卷烟产品独特的风格，也是构成卷烟品牌风格的重要因素。料液又称加料香精，在卷烟生产过程中用量较大，一般由蔗糖、蜂蜜和果糖等糖类，水果浓缩物等天然提取物，甘油和柠檬酸等多种添加剂，加入大量水调配而成。料液的复杂成分组成和加工工艺等导致其质量稳定性较差，易发生变质，保质期非常短。卷烟企业实际生产过程中，因生产计划调整等原因不可避免存在料液剩余情况，这些剩余料液在贮存过程中经常出现变质，给企业造成了经济损失。

某些微生物自身或其代谢具有抑菌防腐的功效，被作为一种安全、天然、高效的防腐剂用于延长食品的保质期。例如乳酸链球菌次级代谢产物乳酸链球菌素，能够有效抑制引起食品腐败的各类细菌的生长繁殖，抑菌谱广，被广泛用于肉制品、乳制品和蔬菜加工等领域。贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYGA1采用筛选培养基分离自烟用香精香料，具有较强的纤维素酶活性，对大肠杆菌具有较强的抑制作用，该菌在料液中的应用尚未见公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYGA1及其制备方法和在延长料液保质期中的应用。抑制料液中腐败细菌的增殖，为烟用料液的变质防控提供一种安全、有效和操作易行的技术方法。

本发明从烟用香精香料中筛选到一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYGA1，其浓缩发酵液能够有效稳定料液的感官质量，所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYGA1菌株已于2017年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CCTCC NO.M2017705。

本发明采用纤维素刚果红培养基，从烟用香精香料中分离到的69株细菌进行了筛选，筛选得到15株具有较强纤维素酶活性的菌株，再利用纸片抑菌实验法以大肠杆菌（Escherichia coli）为实验对象，筛选到具有较强的大肠杆菌抑菌活性的YGA1菌株，经形态学、生理生化和16S rRNA序列系统发育分析将YGA1菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。

本发明的技术方案如下：

一、贝莱斯芽孢杆菌YGA1的分离和筛选：

1、培养基配制：胰蛋白大豆琼脂培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；刚果红纤维素培养基：硝酸钠1 g/L、磷酸氢二钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.9 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、酵母浸出粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、刚果红0.2 g/L、纤维素粉5 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15min；

2、菌株的分离和筛选

（1）细菌分离：从若干份香精香料样品中，利用胰蛋白大豆培养基，采用稀释涂布平板法分离细菌，挑取单菌落经多次划线得到纯的菌株，经菌落形态和显微形态判断获得69株纯的细菌；

（2）菌株的纤维素酶活性筛选：将纯的菌株分别接种于刚果红纤维素培养基，30℃培养7-14d后直接观察酶活状况，从69株菌中筛选得到15株具有较强纤维素酶活性的菌株；

（3）菌株的抑菌活性筛选：接种液体培养的菌株，于含有大肠杆菌的胰蛋白大豆肉汤中，采用试管抑菌法筛选菌株的抑菌活性，最终筛选获得具有较强抑菌活性的YGA1菌株。

二、YGA1的浓缩发酵液的制备：

（1）YGA1菌株的复苏和活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于添加胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养18-20h，获得种子培养液；

（2）YGA1菌株的扩大培养：将种子培养液以5%-10%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉1-5 g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养24-32h，获得YGA1菌株的发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：取1L YGA1菌株发酵液，于4℃，12000rpm离心20-30min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至20-50倍，获得浓缩发酵液。

（1）中所述的长期保存菌株和短期保存菌株是：YGA1菌株的长期保存（＞1月）和短期保存（＜7d）：长期保存采用10%（v/v）甘油管于-80℃保存，短期保存采用胰蛋白大豆琼脂斜面培养基（胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨 3.0g，氯化钠 5.0g，磷酸氢二钾 2.5g，葡萄糖2.5g，补水至1000ml，pH 7.2）于4℃保存；

三、所述的YGA1菌株的浓缩发酵液在延长料液保质期中的应用时，将YGA1菌株的浓缩发酵液以0.1%-1.0%（v/v）加入烟用料液中，通过抑制腐败细菌的增殖延长料液保质期。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

（1）本发明提供了一种延长料液保质期的YGA1菌株。

（2）本发明所述YGA1菌株添加应用到料液中，能够有效稳定料液的感官质量，抑制料液中腐败细菌的增殖，延长料液保质期。

（3）本发明方法具有成本低，操作方法易行的优点，在延长料液保质期、防止料液变质方面具有很大应用潜力。

附图说明

图1是YGA1菌株的革兰氏染色的图。

图2 是YGA1菌株的系统发育树的图。

所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2017年11月17日，保藏缟号：CCTCC No.M2017705。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：

贝莱斯芽孢杆菌YGA1的分离和筛选

1、培养基配制：胰蛋白大豆琼脂培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；刚果红纤维素培养基：硝酸钠1 g/L、磷酸氢二钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.9 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、酵母浸出粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、刚果红0.2 g/L、纤维素粉5 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15min。

2、菌株的分离和筛选

（1）细菌分离：从若干份香精香料样品中，利用胰蛋白大豆培养基，采用稀释涂布平板法分离细菌，挑取单菌落经多次划线得到纯的菌株，经菌落形态和显微形态判断获得69株纯的细菌。

（2）菌株的纤维素酶活性筛选：将纯的菌株分别接种于刚果红纤维素培养基，30℃培养7-14d后直接观察酶活状况，从69株菌中筛选得到15株具有较强纤维素酶活性的菌株。

菌株YGA1的鉴定：

1、材料和方法：（1）革兰氏染色采用革兰氏染色试剂盒进行；（2）生理生化鉴定采用梅里埃API 20NE微生物生理生化鉴定条进行；（3）16S rRNA序列系统发育分析：利用细菌基因组提取试剂盒提取YGA1基因组DNA，用16S rRNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增保守序列，并在华大基因有限公司进行测序，序列信息提交至NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行在线比对分析，采用Clustalx进行YGA1序列和近缘种序列的多重比对，再Mega 6进行系统发育树分析。2、结果：如图1所示，菌株YGA1在胰蛋白大豆琼脂培养基平板上的菌落特征：浅黄色色，圆形，透明，光滑，边缘整齐，含水量大。经革兰氏染色显微鉴定，YGA1为革兰氏阳性、细胞杆状，长约2μm，宽约0.3μm。β半乳糖苷酶阳性，精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、色氨酸脱羧酶阴性，柠檬酸和硫化氢阴性，能利用蔗糖、苦杏仁苷和3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇，不能利用葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖和阿拉伯糖，细胞色素氧化酶阴性，吲哚产生阴性，硝酸还原盐阴性，亚硝酸盐还原阳性。

表1 YGA1菌株的生理生化结果

注：“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。

将菌株YGA1的16S rRNA序列进行同源性比对，结合生理生化试验，将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYGA1，YGA1菌株16S rRNA序列见序列表。实施例2：

贝莱斯芽孢杆菌YGA1浓缩发酵液的制备

1、诱导及发酵培养基配制：含纤维素的胰蛋白大豆肉汤诱导培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5 g/L、纤维素粉1-5 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；。

2、浓缩发酵液的获得：

（1）YGA1菌株的复苏和活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于添加胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养20h，获得种子培养液；

（2）YGA1菌株的扩大培养：将种子培养液以5%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉1g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养24h，获得YGA1菌株的发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：取1L YGA1菌株发酵液，于4℃，12000rpm离心20-30min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至20倍，获得浓缩发酵液。

实施例3：

贝莱斯芽孢杆菌YGA1浓缩发酵液的制备

1与实施例2相同。

2、浓缩发酵液的制备：

（1）YGA1菌株的复苏和活化：取甘油管长期保存菌株，于37℃水浴中复苏，或取斜面短期保存菌株，接种于添加胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养18h，获得种子培养液；

（2）YGA1菌株的扩大培养：将种子培养液以10%（v/v）接种量接种于添加纤维素粉5g/L的胰蛋白大豆肉汤培养基中，于30℃，120-140rpm培养32h，获得YGA1菌株的发酵液；

（3）发酵液的收集和浓缩：取1L YGA1菌株发酵液，于4℃，12000rpm离心20-30min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至50倍，获得浓缩发酵液。

实施例4：

贝莱斯芽孢杆菌YGA1的应用

将实施例2或实施例3的贝莱斯芽孢杆菌YGA1浓缩发酵液以0.1%-1.0%（v/v）加入烟用料液中，通过抑制腐败细菌的增殖延长料液保质期。

1、抑菌活性的测定

（1）料液样品及处理：Y1002、Y1015和Y1043烟用料液，由某香精香料企业提供。采用0.22μm的一次性无菌滤膜过滤，备用；（2）浓缩发酵液的添加：以没有添加浓缩发酵液的烟用料液为阴性对照，实验组添加浓缩发酵液，添加量分别为0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1.0%，5.0%（v/v）；（3）腐败细菌的添加：以没有添加浓缩发酵液、添加大肠杆菌菌液的烟用料液为阳性对照，将大肠杆菌采用胰蛋白大豆肉汤活化后，以10⁴CFU/mL接种于料液中；（4）抑菌活性考察：各试管于36℃培养48h，采用试管抑菌法考察抑菌活性；（5）结果显示：与阳性对照和阴性对照相比，在Y1002、Y1015和Y1043三种烟用料液中，添加0.01%和0.05%的浓缩发酵液对大肠杆菌没有抑制作用，添加0.1%，0.5%和1.0%的浓缩发酵液能够有效抑制大肠杆菌的增殖，具有显著的腐败细菌大肠杆菌的抑制活性。

2、感官评吸

将浓缩发酵液分别以0.1%，0.5%，1.0%（v/v）的添加量分别添加至Y1002、Y1015和Y1043料液中，然后将料液均匀喷施于烟丝上，按常规方法制成卷烟，置于温度为（22±1）℃，相对湿度为（60±2）%的恒温恒湿环境内平衡48h平衡后，用于感官评吸。对照样品为添加等量料液的卷烟。

感官评吸结果显示，与对照卷烟相比，添加0.1%，0.5%，1.0%（v/v）浓缩发酵液的卷烟其香气质量、刺激性、余味、杂气量等没有发生明显变化，提示以上添加量的浓缩发酵液在料液中的添加对卷烟感官抽吸品质没有明显影响。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌YGA1(Bacillus velezensis)

<400> 1

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420

ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc tctaggagcc agccgctcga 1420

<210> 2

<211> 3

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 23

<210> 3

<211> 3

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 22

Claims

1.一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1菌株于2017年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2017705。

2.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1的制备方法，其特征在于按以下进行：

1）培养基配制：胰蛋白大豆琼脂培养基：胰蛋白胨15 g/L、大豆胨5 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15 min；刚果红纤维素培养基：硝酸钠1 g/L、磷酸氢二钠1.2 g/L、磷酸二氢钾0.9 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、酵母浸出粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、刚果红0.2 g/L、纤维素粉5 g/L、琼脂15.0 g/L，121℃高压蒸汽灭菌15min；

2）菌株的分离和筛选

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1的应用，其特征在于，按以下进行：

1）菌株发酵液的制备：

（3）发酵液的收集和浓缩：取1L YGA1菌株发酵液，于4℃，12000rpm离心20-30min，收集上清液，将上清液在旋转蒸发仪上浓缩至20-50倍，获得浓缩发酵液；

2）将YGA1菌株的浓缩发酵液以0.1%-1.0%（v/v）加入烟用料液中，通过抑制腐败细菌的增殖延长料液保质期。

4.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YGA1的应用，其特征在于，在菌株发酵液的制备的（1）中所述的长期保存菌株和短期保存菌株是：YGA1菌株的长期保存＞1月和短期保存＜7d：长期保存采用10%v/v甘油管于-80℃保存，短期保存采用胰蛋白大豆琼脂斜面培养基于4℃保存，所述的胰蛋白大豆琼脂斜面培养基为：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨 3.0g，氯化钠 5.0g，磷酸氢二钾 2.5g，葡萄糖 2.5g，补水至1000ml，pH7.2。