CN111718878A - 一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

发明公开了一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备方法。一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B‑3，于2019年10月14日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019820。通过基因工程的手段将菌株Bacillus sp.J3中高酶活性的α–淀粉酶AmyE1和纤维素酶CelE1的基因克隆到载体pMK3上，并在受试菌株Bacillus velezensis B‑3中表达，使该菌株的纤维素酶和淀粉酶活性分别提高了2.8倍和4.93倍。本发明的芽孢杆菌及基因工程菌株可用于缩短烟草陈化时间，提升烟叶吸食品质。

Description

一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备 方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是，本发明涉及一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备方法。

背景技术

目前我国已成为全球最大的烟草生产国和消费国，烟草业已逐渐成为我国的支柱产业和纳税大户。目前世界范围内约有12亿烟民，其中我国约占有3亿多烟民，因此不管从烟草效应还是从烟民需求来看，烟草都起着非常重要的作用。

众所周知，烟叶的陈化是烟草加工过程的一项重要工艺。未经陈化的烟叶中含有大量的有害前体物，如纤维素、木质素、果胶、淀粉等大分子物质，如果烟叶中这些物质含量过高，会导致烟叶品质低劣，使卷烟杂气重，刺激性强，木质气强，还会有焦糊味的产生，从而大大降低了卷烟的吸食口感。而且纤维素和果胶交联，在燃烧的过程中会发生热解反应，会产生有刺激性气味的甲醛和甲醇等致癌物质；而木质素的存在不但影响了烟叶的色泽，而且在燃烧的过程中会产生酚类化合物，会让人产生一种辛辣感和灼热感，降低口感质量，对身体也有害。淀粉含量过高，也会对卷烟的品质产生一定影响，不仅影响卷烟的燃烧速度和燃吸安全性，而且在燃烧时会产生焦糊味，严重影响卷烟香气质和吸食口感。因此，我们通过微生物发酵的方法对烟叶进行陈化，加速降解卷烟中的淀粉、纤维素、木质素和果胶，从而改善烟叶的香吃味和吸食品质。目前，很多学者从自然界中分离到多种微生物用于烟叶的陈化和香气的提升，大部分都是野生的真菌和细菌，很少有对环境中的功能微生物进行基因工程的改造，进一步提高其陈化性能。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌，通过分离和筛选得到一株可产纤维素酶、淀粉酶、漆酶和果胶酶的菌株Bacillus velezensis B-3，保藏号：CCTCC M 2019820 ，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的在于提供一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备方法，通过将菌株Bacillus sp. J3中的α–淀粉酶AmyE1的基因和纤维素酶CelE1的基因克隆到载体pMK3上，并转入野生菌株Bacillus velezensis B-3中过量表达，并将该工程菌株应用到烟叶的陈化工艺上，最终改善烟叶的吸食品质。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，于2019年10月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2019820。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3分离于烤烟烟叶表面。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有纤维素酶活性，其纤维素酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有淀粉酶活性，其淀粉酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有漆酶活性，其漆酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

进一步的，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有果胶酶活性，其果胶酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌，其是按以下过程制备：

（1）分别将菌株Bacillus sp. J3中的α–淀粉酶AmyE1的基因和纤维素酶CelE1的基因克隆到载体pMK3上；

（2）待得到阳性克隆后，提取质粒并通过电转的方式转入芽孢杆菌Bacillusvelezensis B-3中；

（3）测定电转化成功的芽孢杆菌基因工程菌株的α–淀粉酶和纤维素酶的活性。

其中AmyE1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示， CelE1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示。

本发明还提供一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌在烟叶陈化中的应用，可缩短烟叶陈化时间、提升烤烟吸食品质。

上述高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌的出发菌株的分离筛选方法，初筛方法为：先称取1-2g左右的烟叶，并用灭过菌的剪刀剪碎后，置于10ml灭菌的磷酸盐缓冲液中，并充分震荡混匀，进行梯度稀释后，取10-2、10-3、10-4、10-5四个浓度的菌悬液进行涂板，每个梯度3个平板，每平板加液0.1mL，并放置于28℃温箱培养2-3天，挑选单一克隆，并重新划线分离纯化。

纤维素酶鉴定培养基复筛：将上述分离的菌株重新点到该培养基上，放入28-30℃培养箱培养24小时后，观察透明圈大小，初步判断纤维素酶活性大小。

淀粉酶鉴定培养基复筛：将上述分离的菌株重新点到该培养基上，放入28-30℃培养箱培养24小时后，观察细菌生长情况，并打开平板盖子，滴入少量碘液于平皿中，轻轻旋转平皿，使碘液铺满平板，根据形成的透明圈大小判断淀粉酶活性大小。

漆酶鉴定培养基复筛：将上述分离的菌株重新点到该培养基上，放入28-30℃培养箱培养24小时后，观察透明圈大小，初步判断漆酶活性大小。

果胶酶鉴定培养基复筛：将上述分离的菌株重新点到该培养基上，放入28-30℃培养箱培养24小时后，观察透明圈大小，初步判断果胶酶活性大小。

Luria-Bertani (LB)培养基成分(g/L)： 10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，5克氯化钠，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

R2A培养基成分(g/L)：0.5克酵母提取物，0.5克胰蛋白酶，0.5克酶水解酪蛋白，0.5克淀粉，0.5克葡萄糖，0.3克丙酮酸钠，0.3克磷酸氢二钾，0.024克硫酸镁，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

纤维素酶活性鉴定培养基成分(g/L)：0.2g刚果红，0.5g氯化钾，3g硝酸钠，1g磷酸二氢钾，15g羟甲基纤维素钠，0.5g 硫酸镁，0.01g硫酸亚铁，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

淀粉酶活性鉴定培养基成分(g/L)：10g蛋白胨，5g氯化钠，5g牛肉膏，2g可溶性淀粉，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

漆酶活性鉴定培养基成分(g/L)：2.5g愈创木酚，10g酵母膏，20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

果胶酶活性鉴定培养基成分(g/L)：10g果胶，0.2g溴酚蓝，10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1g磷酸二氢钾，0.3g磷酸氢二钾，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

淀粉酶活性鉴定培养基成分(g/L)：10g蛋白胨，5g氯化钠，5g牛肉膏，2g可溶性淀粉，15g琼脂，121℃高温高压灭菌20分钟。

α–淀粉酶和纤维素酶活性的测定方法：

收集100ml菌体，并将收集的菌液4℃低温离心后，用PBS清洗一次，再将菌液悬起后，用超声破碎仪（SCIENTZ-IID, Ningbo xingzhi biotechnology co., China）破解细胞，然后4℃离心，收集上清蛋白。然后常温放置15min后即为粗酶液。然后用Solarbio的α–淀粉酶活性检测试剂盒测定α–淀粉酶活性。同样使用Solarbio的纤维素酶活性检测试剂盒测定纤维素酶活性。

与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：

本发明的菌株是从烤烟的烟叶上分离的野生型菌株，该菌株无致病性，生物安全性高；该菌株同时具有纤维素酶活性、淀粉酶活性、漆酶活性和果胶酶活性；通过转基因手段，将菌株Bacillus sp. J3中高酶活的α–淀粉酶AmyE1和纤维素酶CelE1克隆到载体pMK3上，并转入Bacillus velezensis B-3菌株高表达，可以使该菌株的纤维素酶和淀粉酶活性分别提高了2.8倍和4.93倍。本发明的芽孢杆菌及基因工程菌具有缩短烟叶的陈化时间、提升烤烟的吸食品质的潜能。

附图说明

图1 为Bacillus velezensis B-3菌株的显微镜照片（放大倍数1000倍）；

图2 为提取的Bacillus velezensis B-3菌株全基因组DNA胶图；

图3 为Bacillus velezensis B-3菌株全基因组的注释结果中不同种类功能基因的分布；

图4 为一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌纤维素酶酶活性的测定；

图5 为一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌α-淀粉酶酶活性的测定。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实验指南》（New York: Cold Spring Harbor）。

实施例1：烤烟烟叶上微生物的分离与培养

将不同产地（云南、四川、津巴布韦、美国、巴西等地）自然存放的烤烟烟叶用无菌的剪刀剪碎，称取1-2g左右，并置于5ml灭菌的磷酸盐缓冲液中，在振荡器中充分混匀后，按十倍系列逐渐稀释至适宜浓度，并取10-2、10-3、10-4、10-5四个浓度的菌悬液各0.1mL，将其涂布在各个平板培养基上，每个梯度3个平板，刮刀涂布，28-30℃温箱培养1-2天，挑长势好，菌落饱满的单一克隆，并重新划线分离纯化。

经过初筛分别从云南烤烟、四川烤烟、津巴布韦烤烟、美国烤烟、巴西烤烟的烟叶上得到60株长势良好菌株，其中云南烤烟烟叶上分得9株，四川烤烟烟叶上分得12株，津巴布韦烤烟烟叶上分得18株，美国烤烟烟叶上分得10株，巴西烤烟烟叶上分得11株。

实施例2：微生物的纤维素酶、淀粉酶、漆酶和果胶酶活性的鉴定

将上述分到的60个菌株进行编号，分别接种于LB培养基中进行复苏，一方面将菌液点到纤维素酶鉴定平板、漆酶鉴定平板和果胶酶鉴定平板上，培养约1-3天左右，会观察到菌体周围有透明圈产生，对所选菌株的纤维素酶、漆酶和果胶酶进行定性测定，并记录培养平板上的透明圈情况（V=透明圈直径/菌落的直径），单位mm（见表1）。

另外一方面，用接种环分别点到淀粉酶鉴定培养基，培养16-24h后，在淀粉酶鉴定培养基平板上滴入少量碘液于平皿中，轻轻旋转平皿，使碘液铺满平板，发现有透明圈形成，计算透明圈和菌落直径比值（见表1）。最终只获得1株同时具有纤维素酶、淀粉酶、漆酶和果胶酶活性的菌株B-3（分离于四川烤烟烟叶），为了进一步验证α-淀粉酶和纤维素酶的酶活，通过α-淀粉酶活性测定试剂盒和纤维素酶活性测定试剂盒分别测定这株菌的酶活，发现B-3菌株的α-淀粉酶活性和纤维素酶活性很低，然而J3的α-淀粉酶活性和纤维素酶活性却很高。因此，下一步将J3中的α–淀粉酶AmyE1和纤维素酶CelE1基因转入菌株Bacillusvelezensis B-3中过量表达，增强其纤维素酶和淀粉酶的活性。

实施例3：Bacillus velezensis B-3的细胞形态特征和生理生化特性分析

通过使用显微镜、biolog分析和生化试验对Bacillus velezensis B-3菌株的细胞形态特征和生理生化特性进行分析：

发现Bacillus velezensis B-3为革兰氏阳性，杆状，大小为0.6~0.9um*5um~8um，周生鞭毛，能运动，无荚膜，其在1000倍的油镜下观察结果如图1。最适生长温度25-45摄氏度，pH6.0-9.2，氯化钠耐受度1%-3%。

同时biolog检测结果显示：该菌株可以利用各种糖类物质，如D-果糖、乳酸钠、D-丝氨酸、D-果糖-6磷酸、还可以利用各种氨基酸如L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸等，还可以利用十四烷基硫酸钠、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、萘啶酸、氯化锂、亚碲酸钾、丁酸、丁酮酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、丁酸钠等。

实施例4：Bacillus velezensis B-3的16S rDNA核苷酸序列的扩增和测定

具体操作如下：

取1ml菌液于1.5ml的离心管中，1200rpm离心1min，收集菌体；加500µL的裂解缓冲液并不停地吹打或震荡混匀，并加入溶菌酶；加入300µL的3mol/L的NaCl混匀后，1200rpm离心10min；将上清液移至另外一个离心管中，加入5µl RNase（1mg/ml），放入37℃的温箱30min；加入等体积的苯酚/氯仿（1:1 v/v）抽提一次；在4℃的离心机中离心10min后收集上清液，再用等体积的氯仿抽提一次至无中间层；在4℃的离心机中，12000rpm离心10min后，吸取上层至新的EP离心管中；加1/10的NaAC（PH 5.2）和两倍体积无水乙醇沉淀DNA后，再用冰冷的70%的乙醇冲洗沉淀1次，干燥后，溶于50 µL TE缓冲液或ddH2O中。取2 µL在0.8%的琼脂糖凝胶上跑电泳，检测其纯度和浓度，如图2所示，并将余下的DNA保存于-20℃冰箱。

以提取的全基因组DNA为模板，用16S rRNA通用引物（正向27F引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和反向1492R引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），进行PCR扩增，PCR体系为：2*MIX：10ul、去离子水：7ul、F引物：1ul 、R引物：1ul 、DNA模板：1ul。PCR扩增条件为：95℃ 5分钟，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，循环数 32个，72℃ 10分钟。PCR长度1550bp左右，将PCR产物切胶回收并送到测序公司进行测序，比对结果显示：与NCBI数据库中的Bacillus velezensis strain FZB42相似性为99%，其核苷酸序列见序列表SEQID NO：1。

实施例5：Bacillus velezensis B-3的全基因组测序及分析

将提取的基因组DNA用NanoDrop™ 8000分光光度计测定样品纯度，结果显示OD260/280=1.97，DNA 条带单一，无杂带，无RNA、蛋白质等杂质污染；浓度为154.4ng/ul，总量为12.66ug，完全达到细菌基因组测序的要求。将样品送到北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行建库测序，测序结果在Linux系统上用SPAdes Genome Assembler工具进行拼接和组装，将组装好的结果用RAST Annotation Server进行全基因组注释，再通过NCBI（NationalCenter for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.kegg.jp/）对注释结果中的部分基因进行再确定。如图3所示为Bacillus velezensis B-3的基因组中功能基因注释结果。注释结果中一共包含3883个编码蛋白序列，其编码的蛋白按照功能可分为以下几类：辅因子、维生素、辅基和色素相关（148，3.81%），细胞壁和荚膜形成相关 (78，2.0%)，毒素、感染和防护相关(39，1.0%)，钾离子代谢相关（3，0.08%)，多种功能相关（25，6.44%)，噬菌体、前噬菌体、转座因子和质粒相关 (3，0.08%)，膜转运相关(42，1.08%)，铁离子摄取与代谢类相关(22，0.57%)，RNA代谢相关(67，0.95%)，核苷与核苷酸相关(95，2.45%)，蛋白质代谢相关(203，5.23%)，细胞分裂周期相关(6，0.08%)，运动性和趋化性相关(52，1.34%)，细胞调控和信号转导相关(28，0.72%)，次级代谢相关(7，0.18%)，DNA代谢相关(66，1.70%)，脂肪酸、脂肪和类异戊二烯相关(55，1.42%)，氮代谢相关(21，0.54%)，休眠和孢子形成相关(98，2.52%)，呼吸作用相关(41，1.56%)，应激反应相关(45，1.16%)，芳香化合物代谢相关(12，0.31%)，氨基酸及其衍生物相关(300，7.73%)，硫代谢相关(6，0.15%)，磷代谢相关(16，0.41%)，碳水化合物相关(218，5.61%)，功能未知（2190，56.3%）。

注释结果显示出了纤维素酶的氨基酸序列，见序列表SEQ ID NO：2所示；α-淀粉酶的氨基酸序列，见序列表SEQ ID NO：3所示；漆酶的氨基酸序列，见序列表SEQ ID NO：4；果胶酶的氨基酸序列，见序列表SEQ ID NO：5。结合上述四种酶的酶活性鉴定试验结果共同印证了证明了该菌株同时具有纤维素酶、α-淀粉酶、漆酶和果胶酶的活性。但是，纤维素酶和α-淀粉酶的活性很低，形成的透明圈很小。因此，下一步通过转基因的手段，提高该菌株的纤维素酶和α-淀粉酶的活性。

实施例6：高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌的构建

Bacillus sp.J3菌株的α–淀粉酶AmyE1和纤维素酶CelE1具有很高的酶活，异源表达后同样具有很高的活性，而且可以分泌到胞外行使功能。为了优化Bacillus velezensis B-3菌株的产香性能，必须提高菌株降解淀粉和纤维素的能力。只有最大化地降解烟草中的淀粉、纤维素和蛋白质的量，才能够使烟草在燃烧时，不至于产生刺鼻的气味，增加卷烟的吸食品质。

首先根据已测序的Bacillus sp.J3全基因组序列，分别设计扩增Bacillus sp.J3菌株的α–淀粉酶AmyE1和纤维素酶CelE1基因的引物，引物序列如下：

pMK3-celE1-F：5’- CAAAGCTTagtgaagagccaaaatgatg-3'（Hind III）

pMK3-celE1-R：5’- CGGATCC GTTTTATTTCAGCCCCAGAG-3'（BamH I）

pMK3-amyE1-F：5’- CAAAGCTTGCGGAAGAATGAAGTAAGAG-3’（Hind III）

pMK3-amyE1-R：5’- CGGATCCtcaataaggaagagaaccgc-3'（BamH I）

通过PCR扩增分别获得了含有Hind III和BamH I两个酶切位点的celE1基因片段和amyE1基因片段，其中celE1基因的序列见序列表SEQ ID NO：6，amyE1基因的序列见序列表SEQ ID NO：7。将获得了celE1基因和amyE1基因片段进行过夜酶切（Hind III和BamH I），酶切后的产物进行纯化回收。

然后将回收后的酶切片段分别连入已经被Hind III和BamH I酶切好的pMK3质粒，并通过热激的方法转入DH5α感受态中。随后，提取质粒并送测序公司检测验证。待序列正确后，利用电转的方式将质粒转入Bacillus velezensis B-3菌株中，利用卡那霉素抗性的平板初筛，并利用PCR的方法进行扩增验证。阳性克隆即是构建成功的基因工程菌株。

实施例7：高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌酶活的测定

为了验证获得的基因工程菌株纤维素酶和α–淀粉酶的酶活性是否得到了提高，同样将空载体pMK3转入了Bacillus velezensis B-3菌株中。结果显示，转入空质粒的ZIM3菌株的α–淀粉酶和纤维素酶活性很低，而转入celE1基因和amyE1基因的菌株，其α–淀粉酶和纤维素酶的活性却很高，与对照相比，其纤维素酶和α–淀粉酶活性分别提高了2.8倍和4.93倍。如图4和图5所示。与此同时，通过测定上清液和菌体内的α–淀粉酶和纤维素酶活性时，发现只有培养液上清中具有α–淀粉酶和纤维素酶活性，细胞内却没有酶活，再一次证明α–淀粉酶和纤维素酶是被分泌到胞外行使功能的。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌及其制备方法

<140> 202010661393.6

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1550

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis B-3

<400> 1

ttatcggaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60

gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 120

tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 180

tgtctggacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 240

cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 300

ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 360

cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 420

aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 480

gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540

tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 600

taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 660

gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 720

gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 780

gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 840

tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900

cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 960

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 1020

gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1140

attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1200

tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1260

ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1320

ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1380

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1440

agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga 1500

agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat cacctccttt 1550

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 纤维素酶(2)

<400> 2

Met Lys Arg Ser Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Ala Val

1 5 10 15

Leu Thr Met Gly Gly Leu Leu Pro Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Lys Thr Pro Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln

35 40 45

Leu Val Asn Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser

50 55 60

His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Asp Phe Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys

65 70 75 80

Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr

85 90 95

Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Val

100 105 110

Lys Glu Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile

115 120 125

Asp Trp His Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys

130 135 140

Ala Lys Glu Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro

145 150 155 160

Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp

165 170 175

Lys Arg Asp Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg

180 185 190

Lys Asn Asp Pro Asp Asn Pro Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser

195 200 205

Gln Asp Val Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val

210 215 220

Met Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Ser Leu Arg

225 230 235 240

Asp Lys Ala Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr

245 250 255

Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp

260 265 270

Gln Ser Arg Glu Trp Leu Asn Tyr Leu Asp Ser Lys Lys Ile Ser Trp

275 280 285

Val Asn Trp Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys

290 295 300

Pro Gly Ala Ser Lys Thr Gly Gly Trp Pro Leu Ser Asp Leu Thr Ala

305 310 315 320

Ser Gly Thr Phe Val Arg Glu Asn Ile Arg Gly Asn Lys Asp Ser Thr

325 330 335

Lys Asp Gly Pro Glu Thr Pro Ala Gln Asp Asn Pro Thr Gln Glu Lys

340 345 350

Gly Val Ser Val Gln Tyr Lys Ala Gly Asp Gly Ser Val Asn Ser Asn

355 360 365

Gln Ile Arg Pro Gln Leu His Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Lys Val

370 375 380

Asp Leu Lys Gly Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys

385 390 395 400

Gly Gln Asn Phe Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Ile Gly Cys Gly Asn Leu

405 410 415

Thr His Lys Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Thr Asp Thr

420 425 430

Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Lys Lys Gly Thr Leu Ser Pro Gly Ala Ser

435 440 445

Thr Gly Asn Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser His Tyr

450 455 460

Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Gln Ser Asn Thr Phe Lys Thr

465 470 475 480

Thr Lys Lys Ile Thr Leu Tyr His Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Ala

485 490 495

Glu Pro Asn

<210> 3

<211> 659

<212> PRT

<213> 淀粉酶(3)

<400> 3

Met Phe Glu Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ser Gly Pro Ala Ala Ala Asn

20 25 30

Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu Val Ala Ala Ser Ser Val Lys

35 40 45

Asn Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn Trp Ser Phe Asn Thr Leu Thr

50 55 60

Gln Asn Met Lys Glu Ile Arg Asp Ala Gly Tyr Ala Ala Ile Gln Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met

85 90 95

Arg Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn

100 105 110

Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Asp Met Cys Ala Ala Ala

115 120 125

Glu Lys Tyr Gly Val Lys Val Ile Val Asp Ala Val Ile Asn His Thr

130 135 140

Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asp Glu Ile Lys Arg Ile Pro Asn

145 150 155 160

Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp

165 170 175

Val Thr Gln Asn Ser Leu Leu Gly Leu Tyr Asp Trp Asn Thr Gln Asn

180 185 190

Thr Glu Val Gln Ala Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ala Leu Asn

195 200 205

Asp Gly Ala Asp Gly Phe Arg Tyr Asp Ala Ala Lys His Ile Glu Leu

210 215 220

Pro Asp Asp Gly Asn Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ala Glu Phe Gln Tyr Gly Glu Ile Leu Gln Asp Ser Ala Ser

245 250 255

Arg Asp Thr Ala Tyr Ala Asn Tyr Met Asn Val Thr Ala Ser Asn Tyr

260 265 270

Gly His Ser Ile Arg Ser Ala Leu Lys Asn Arg Asn Leu Ser Val Ser

275 280 285

Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr

290 295 300

Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr

305 310 315 320

Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Gly Ser

325 330 335

Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly

340 345 350

Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser

355 360 365

Ala Leu Phe Lys Asp Gln Ala Ile Thr Ala Val Asn Gln Phe His Asn

370 375 380

Glu Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn

385 390 395 400

Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser Lys Gly Val Val Leu Ala Asn

405 410 415

Ala Gly Ser Ser Ser Val Thr Ile Asn Thr Ser Thr Lys Leu Pro Asp

420 425 430

Gly Arg Tyr Asp Asn Arg Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Ala Asn

435 440 445

Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala Arg Ser Ala Ala Val Leu Tyr

450 455 460

Pro Asp Asp Ile Gly Asn Ala Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Gln

465 470 475 480

Thr Gly Ala Val His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Val Thr Leu Arg

485 490 495

Ala Asn Ala Lys Thr Ile Lys Ala Val Tyr Gln Ile Asn Asn Gly Gln

500 505 510

Gln Thr Ala Phe Lys Asp Gly Asp Arg Leu Thr Ile Gly Lys Glu Asp

515 520 525

Pro Ile Gly Thr Thr Tyr Asn Ile Lys Leu Thr Gly Thr Asn Gly Glu

530 535 540

Gly Ala Ala Arg Thr Gln Glu Tyr Thr Phe Val Lys Lys Asp Pro Ser

545 550 555 560

Gln Thr Asn Ile Ile Gly Tyr Gln Asn Pro Asp His Trp Gly Gln Val

565 570 575

Asn Ala Tyr Ile Tyr Lys His Asp Gly Gly Arg Ala Ile Glu Leu Thr

580 585 590

Gly Ser Trp Pro Gly Lys Ala Met Thr Lys Asn Ala Asp Gly Met Tyr

595 600 605

Thr Leu Arg Leu Pro Glu Asn Ala Asp Thr Ala Asp Ala Lys Val Ile

610 615 620

Phe Asn Asn Gly Ser Ala Gln Val Pro Gly Gln Asn Gln Pro Gly Phe

625 630 635 640

Asp Tyr Val Gln Asn Gly Leu Tyr Asn Asn Ser Gly Leu Asn Gly Tyr

645 650 655

Leu Pro His

<210> 4

<211> 512

<212> PRT

<213> 漆酶(4)

<400> 4

Met Ala Leu Glu Lys Phe Ala Asp Glu Leu Pro Ile Ile Glu Thr Leu

1 5 10 15

Gln Pro Gln Lys Lys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Cys Phe His Lys Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Asp Val Asn Gln

50 55 60

Asp Glu Asn Val Tyr Ile Lys Trp Met Asn Asp Leu Pro Asp Lys His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Glu Ser Gly His Gln

85 90 95

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100 105 110

Pro Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Thr Lys Asp Phe Lys

115 120 125

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130 135 140

Gln Arg Gly Ala Leu Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ile Ile Arg Glu

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Gln Leu Lys Leu Pro Ser Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Met Ile Leu Asp Arg Thr Leu Asn Asp Asp Gly Ser Leu Ser Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Leu Pro Asp Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Phe Phe Cys Gly Asn Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Ala Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Met Glu Val Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Phe Ser Leu Ser Leu Asn Asn Gly Gly Lys

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Val Leu Ile

290 295 300

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Gly Glu His Ile Ile Leu Thr Asn Gly Thr

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Asp Thr Asp Ala Asn Val Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ser Thr Met Pro Asn Val Thr Ser Lys Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Thr Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Lys Leu Gly Thr Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Met Gly

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Gln Ile Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Phe Gly Asp Ile Val

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Val Gln Ala His Ser Gly Glu Val Ile Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Val Thr Asp Lys Gln

500 505 510

<210> 5

<211> 354

<212> PRT

<213> 果胶酶(5)

<400> 5

Met Ile Lys Lys Thr Arg His Leu Ala Phe Leu Ala Ala Leu Gly Phe

1 5 10 15

Ala Leu Cys Leu Ala Ile Val Cys Ser Ala Ser Lys Gln Ala Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Tyr Pro Asp Val Met Gln Gly Leu Thr Gly Phe Ala Gly

35 40 45

Asn Ala Lys Asp His Asn Gly Lys Ala Lys Ser Ala Val Ser Gly Gly

50 55 60

Gln Gly Gly Pro Val Val Tyr Val Ser Asn Leu Asn Asp Leu Lys Asn

65 70 75 80

Asn Ala Gly Gly Thr Asp Arg Lys Thr Ile Val Ile Thr Ser Asp Ile

85 90 95

Ser Ser Pro Gly Lys Ala Val Val Thr Val Gly Ala Asn Lys Thr Ile

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Thr Ser His Arg Leu Thr Asn Ile Tyr Leu Thr Thr

115 120 125

Gly Ser Gly Ser Asn Asn Val Ile Phe Lys Asn Leu Ile Ile Ser His

130 135 140

Ser Ala Ala Ile Thr Gly Asn Asn Asp Ile Pro Met Tyr Ile Ala Asn

145 150 155 160

Gly Gln Asn Tyr Trp Ile Asp His Val Trp Phe Glu Gly His Ser Tyr

165 170 175

Asn Pro Asn Ser His Ser Asp Leu Gly Lys Leu Leu Tyr Val Gly Ala

180 185 190

Lys Ala Asp Phe Val Thr Leu Ser Asn Ser Lys Phe Thr Asp His Leu

195 200 205

Tyr Gly Leu Ile Leu Gly Tyr Pro Asn Asp Asp Asn Glu Gly Arg Asn

210 215 220

Tyr Ile Gly Tyr Pro His Met Thr Ile Thr Asn Asn Tyr Phe Asn Asn

225 230 235 240

Val Tyr Val Arg Ser Pro Gly Leu Met Arg Tyr Gly Tyr Phe His Ala

245 250 255

Lys Asn Asn Tyr Val Thr Asn Phe Asn Leu Gly Phe Thr Ile His Thr

260 265 270

Asn Ala Thr Val Phe Ser Glu Ala Asn Tyr Phe Gly Asn Gly Asn Glu

275 280 285

Lys Gly Gly Met Ile Asp Asp Tyr Gly Thr Ala Gln Phe Thr Asp Ile

290 295 300

Gly Ser Phe Pro Ser Leu Lys Ala Pro Lys Ser Pro Arg Thr Gly Trp

305 310 315 320

Asn Pro Arg Ser Asn Tyr Ser Tyr Gly Thr Leu Ser Ala Gln Asp Ala

325 330 335

Lys Asn Phe Ala Gln Ser Tyr Ala Gly Ala Gln Asn Thr Asn Leu Arg

340 345 350

Tyr Pro

<210> 6

<211> 1500

<212> DNA

<213> celE1

<400> 6

atgaaacggt caatctctat ttttattacg tgtttattga ctacgttatt gacaatgggc 60

ggcatgatgg cttcgccggc atcagcaaca gggacaaaaa cgccagtagc caagaatggc 120

cagcttagca taaaaggtac acagctcgtt aaccgagacg gtaaagcggt acagctgaag 180

gggatcagtt cacacggatt gcaatggtat ggagaatatg tcaataaaga cagcttaaaa 240

tggctgaggg acgattgggg tatcaccgtt ttccgtgcag cgatgtatac ggcagaaggc 300

ggttatattg acaacccgtc cgtgaaaaat aaagtaaaag aagcggttga agcggcaaaa 360

gagcttggga tatatgtcat cattgactgg catatcttaa atgacggtaa tccaaaccaa 420

aataaagaga aggcaaaaga attcttcaag gaaatgtcaa gtctttacgg taacacgcca 480

aacgtcattt atgaaattgc aaacgaacca aacggtgatg tgaactggaa gcgtgatatt 540

aaaccatatg cggaagaagt gatttccgtt atccgcaaaa atgatccaga caacatcatc 600

attgtcggaa ccggtacatg gagccaggat gtaaatgatg ctgccgatga ccagctaaaa 660

gatgcaaacg ttatgtacgc acttcatttt tatgccggca cacacggcca atttttacgg 720

gataaagcaa actatgcact cagcaaagga gcacctattt ttgtgacaga atggggaaca 780

agcgacgcgt ctggaaatgg cggtgtattc cttgatcaat cgagggaatg gctgaaatat 840

ctcgacagca agaccatcag ctgggtgaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 900

tcagctttaa agccgggggc atctaaaaca ggcggctggc ggttgtcaga tttatctgct 960

tcaggaacat tcgttagaga aaacattctc ggcaccaaag attcgacgag ggatattcct 1020

gaaacgccag caaaagataa acccacacag gaaaacggta tttctgtaca atacagagca 1080

ggggatggga gtatgaacag caaccaaatc cgtccgcagc ttcaaataaa aaataacggc 1140

aataccacgg ttgatttaaa agatgtcact gcccgttact ggtataaagc gaaaaacaaa 1200

ggccaaaacg ttgactgtga ctacgcgcag attggatgcg gcaatgtgac acacaagttt 1260

gtgacgttgc ataaaccaaa gcaaggtgca gatacctatc tggaacttgg atttaaaaac 1320

ggaacgctgg caccgggagc aagcacaggg aatattcagc ttcgtcttca caatgatgac 1380

tggagcaatt atgcacaaag cggcgattat tcctttttca aatcaaatac gtttaaaaca 1440

acgaaaaaaa tcacattata tgatcaagga aaactgattt ggggaacaga accaaattag 1500

<210> 7

<211> 1980

<212> DNA

<213> amyE1

<400> 7

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgctg aaacggcgaa caaatcgaat 120

gagcttacag caccgtcgat caaaagcgga accattcttc atgcatggaa ttggtcgttc 180

aatacgttaa aacacaatat gaaggatatt catgatgcag gatatacagc cattcagaca 240

tctccgatta accaagtaaa ggaagggaat caaggagata aaagcatgtc gaactggtac 300

tggctgtatc agccgacatc gtatcaaatt ggcaaccgtt acttaggtac tgaacaagaa 360

tttaaagaaa tgtgtgcagc cgctgaagaa tatggcataa aggtcattgt tgacgcggtc 420

atcaatcata ccaccagtga ttatgccgcg atttccaatg aggttaagag tattccaaac 480

tggacacatg gaaacacaca aattaaaaac tggtctgatc gatgggatgt cacgcagaat 540

tcattgctcg ggctgtatga ctggaataca caaaatacac aagtacagtc ctatctgaaa 600

cggttcttag aaagggcatt gaatgacggg gcagacggtt ttcgatttga tgccgccaaa 660

catatagagc ttccggatga tgggagttac ggcagtcaat tttggccgaa tatcacaaat 720

acatctgcag agttccaata cggagaaatc ctgcaggata gtgcctccag agatgctgca 780

tatgcgaatt atatggatgt gacagcgtct aactatgggc attccataag gtccgcttta 840

aagaatcgta atctgggcgt gtcgaatatc tcccactatg catctgatgt gtctgcggac 900

aagctagtga catgggtaga gtcgcatgat acgtatgcca atgatgatga agagtcgaca 960

tggatgagcg atgatgatat ccgtttaggc tgggcggtga tagcttctcg ttcaggcagt 1020

acgcctcttt tcttttccag acctgaggga ggcggaaatg gtgtgagatt cccggggaaa 1080

agccaaatag gcgatcgcgg gagtgcttta tttgaagatc aggctatcac tgcggtcaat 1140

agatttcaca atgtgatggc tggacagcct gaggaactct cgaacccgaa tggaaacaac 1200

cagatattta tgaatcagcg cggctcacat ggcgttgtgc tggcaaatgc aggttcatcc 1260

tctgtctcta tcaatacggc aacaaaattg cctgatggca ggtatgacaa taaagctgga 1320

gcgggttcat ttcaagtgaa cgatggtaaa ctgacaggca cgatcaatgc caggtctgta 1380

gctgtgcttt atcctgatga tattgcaaaa gcgcctcatg ttttccttga gaattacaaa 1440

acaggtgtaa cacattcttt caatgatcaa ctgacgatta ccttgcgtgc agatgcgaat 1500

acaacaaaag ccgtttatca aatcaataat ggaccagaga cagcgtttaa ggatggagat 1560

caattcacaa tcggaaaagg agatccattt ggcaaaacat acaccatcat gttaaaagga 1620

acgaacagtg atggtgtaac gaggaccgag gaatacagct ttgttaaaag agatccagct 1680

tcggccaaaa ccatcggcta tcaaaatccg aatcattgga gccaggtaaa tgcttatatc 1740

tataaacatg atgggggcca ggcaattgaa ttgaccggat cttggcctgg aaaaccaatg 1800

actaaaaatg cagacggaat ttacacgctg acgctgcctg cggacacgga tacaaccaac 1860

gccaaagtga tttttaataa tggcagcgcc caagtgcctg gccagaatca gcctggcttt 1920

gattacgtgc aaaatggttt atataatgac tcgggcttaa gcggttctct tccttattga 1980

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，于2019年10月14日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019820。

2.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，其特征在于，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3分离于烤烟烟叶表面。

3.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，其特征在于，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有纤维素酶活性，其纤维素酶氨基酸序列如序列表SEQID NO：2所示。

4.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，其特征在于，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有淀粉酶活性，其淀粉酶氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。

5.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，其特征在于，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有漆酶活性，其漆酶氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

6.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3，其特征在于，所述芽孢杆菌Bacillus velezensis B-3具有果胶酶活性，其果胶酶氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：5所示。

7.一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，其是按以下过程制备：

（1）分别将菌株Bacillus sp. J3中的α–淀粉酶AmyE1的基因和纤维素酶CelE1的基因克隆到载体pMK3上；

（2）待得到阳性克隆后，提取质粒并通过电转的方式转入芽孢杆菌Bacillusvelezensis B-3中；

（3）测定电转化成功的芽孢杆菌基因工程菌株的α–淀粉酶和纤维素酶的活性。

8.一种高产纤维素酶和淀粉酶的芽孢杆菌基因工程菌在烟叶陈化中的应用，可缩短烟叶陈化时间、提升烤烟吸食品质。

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