CN104997953B - 一种中药组合物的两种成分的含量测定方法以及多种成分的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物的两种成分的含量测定方法以及多种成分的鉴别方法,属于中药领域,该中药组合物由赤芍、黄芪、生地黄、蒲黄、女贞子、墨旱莲、银杏叶、大黄等原料药组成。本发明的鉴别方法能准确的鉴别出该中药组合物中的成分,专属性强,含量测定方法有助于药物的质量控制,提高药物的安全性和可靠性。
Description
技术领域
本发明属于中药领域,具体涉及中药组合物成分的含量测定以及成分的鉴别方法。
背景技术
中药治疗疾病已经有几千年的历史了,随着科学技术的发展,中药也面临着现代化,要走上世界市场,这就要求必须做好中药质量的控制,中药的成分质量控制则是最关键的,尤其是对于复方的中药制剂,要想全面的控制中药的质量,必须做好各成分的鉴别。
该中药组合物由赤芍、黄芪、生地黄、蒲黄、女贞子、墨旱莲、银杏叶、大黄、三七、地龙、决明子、葛根组成。对于该中药组合物,目前只公开了药物成分和制备方法,并没有给出相应的药物成分的鉴别方法以及成分的含量测定方法。
发明内容
本发明目的是提供一种中药组合物的两种成分的含量测定方法以及多种成分的鉴别方法。
本发明所采用的技术方案是:
一种中药组合物,该中药组合物由下列重量份数的原料药组成:赤芍160-200份黄芪270-300份 生地黄160-200份 蒲黄120-180份 女贞子160-200份 墨旱莲160-200份银杏叶270-300份 大黄60-120份 三七60-120份 地龙60-120份 决明子270-300份 葛根160-200份。
该中药组合物的活性成分制备由以下步骤构成:
(1)、称取蒲黄,以4-8倍量60-80%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭10-30分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡20-36小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、称取生地黄、地龙,第一次加8-10倍量水,浸泡10-30分钟,加热煎煮1-2小时,过滤;第二次加6-9倍量的水,煎煮1-2小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15—1.20,放冷,加适量乙醇使含醇量达50-70%,充分搅拌,冷藏20-36小时,过滤,滤液备用;
(3)、称取黄芪、赤芍,加6-10倍量40-60%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取2-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加6-9倍量70-90%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏;
(6)、称取三七,粉碎成100-120目细粉,备用;
步骤(5)所得清膏和步骤(6)所得细粉共同构成本发明中药组合物的活性成分。
该中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂。
该中药组合物胶囊剂的制备由以下步骤构成:
(1)、称取蒲黄,以4-8倍量60-80%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭10-30分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡20-36小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、称取生地黄、地龙,第一次加8-10倍量水,浸泡10-30分钟,加热煎煮1-2小时,过滤;第二次加6-9倍量的水,煎煮1-2小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20,放冷,加适量乙醇使含醇量达50-70%,充分搅拌,冷藏20-36小时,过滤,滤液备用;
(3)、称取黄芪、赤芍,加6-10倍量40-60%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取2-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加6-9倍量70-90%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏;
(6)、称取三七,粉碎成100-120目粉,加入上述清膏中,搅拌均匀,真空干燥,干浸膏粉碎成80-120目粉,备用;
(7)、取干膏粉和淀粉,混和均匀,用70-90%乙醇为粘合剂制软材,筛网制粒,整粒,装胶囊,即得。
所述的中药组合物制剂中女贞子的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液5~10μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点。
所述的中药组合物制剂中墨旱莲的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液5~10μl,对照药材溶液1~3μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
所述的中药组合物制剂中三七和黄芪的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R10.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液15~25μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。
所述的中药组合物制剂中芍药苷的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取相当于该中药组合物生药量0.5-1.5 g的制剂,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
C、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
D、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量。
所述的中药组合物制剂中葛根素的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取相当于该中药组合物生药量10-18 g的制剂,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
C、、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
D、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量。
本发明的葛根包括葛根和粉葛,2005年的药典没有区分这两种中药,2010年的药典进行了区分,葛根来源于豆科植物野葛,粉葛来源于豆科植物甘葛藤,本发明优选为粉葛。
实验例
采用HPLC色谱法分别对方中赤芍、葛根的有效成分芍药苷、葛根素进行了含量测定,为了选择合适的参数条件进行了以下的优选。
(1)芍药苷
材料、仪器与试药:
芍药苷对照品:购于中国药品生物制品检定所,批号:0736-200219
本发明药物组合物:石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号:20011102、20020102、20020103、20020104,120901
硅胶G(青岛海洋化工厂)
定量毛细管(美国)
高效液相色谱仪:(Waters 1525 Pump HPLC);紫外检测器(Waters 2487 Dual λAbsorbemce Derector);
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
紫外分析仪:(岛津UV—2550);
流动相及样品所用的甲醇为色谱纯; 其它试剂均为分析纯,水为双重蒸馏水。
2、检测波长的选择:对芍药苷对照品进行光谱扫描,光谱图上可见,见图1在230nm处有最大吸收,因此检测波长优选为230nm。
3、流动相的选择:曾采用甲醇-水(30:70)做为流动相,芍药苷在6分钟左右出峰,在样品的色谱图中芍药苷有拖尾现象;调整后,优选为甲醇-水(25:75)后,芍药苷在10分左右出峰,对照品及样品中芍药苷均达到很好的分离,并且峰的对称性很好。
4、色谱条件:
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流动相:甲醇-水(25:75);
流速:1ml/min;
检测波长为230nm;
柱温:室温;
理论板数:按芍药苷峰计算不得低于4000。
5、供试品溶液的制备:
5.1提取溶剂的选择:
取实施例1的胶囊内容物,研细,取适量,精密称定,加等量不同的提取溶剂,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣用流动相定容到50ml的量瓶中,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,做为供试品溶液,进行检测,结果见表1:
由表1可见,无水乙醇提取的芍药苷含量很低,60%乙醇提取的最高,从经济及环保两方面考虑,优选60%乙醇作为提取溶剂。
5.2 超声时间的考察:
取胶囊内容物,研细,取适量,精密称定,加等量的60%乙醇,分别超声处理不同时间,滤过,滤液水浴蒸干,残渣加流动相溶解并稀释至25ml量瓶中,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,滤液作为供试品溶液,进行测定,结果见表2:
由表2可见,超声处理30分钟,芍药苷基本上提取完全,因此提取时间优选为超声30分钟。
5.3中性氧化铝用量的考察:
在考察提取溶剂、提取时间过程中,在对照品及供试品的色谱图中芍药苷均达到很好的分离,但是样品溶液的颜色很深,不澄清,所含的杂质仍较多,因此考虑用中性氧化铝来除去部分杂质。
取胶囊内容物,研细,称取适量,精密加60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10ml,上中性氧化铝柱(内径1.5cm,100-200目),用30ml60%乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加流动相溶解并稀释至25ml量瓶中,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,作为供试品溶液,结果见表3:
由表3可见,中性氧化铝的用量对芍药苷的影响不明显,色谱图中也没有明显的差别,但是对供试品溶液的颜色影响很大,当中性氧化铝的用量为8g时,供试品颜色呈淡黄色,且澄清。因此优选8g中性氧化铝进行除杂。
5.4洗脱剂用量的考察:
将样品上中性氧化铝时,先收集30ml 60%乙醇的洗脱液,再收集20ml 60%乙醇洗脱液,分别将洗脱液水浴蒸干,残渣加流动相溶解并稀释至25ml、10ml量瓶中。注入高效液相色谱仪进行检测,结果后20ml 洗脱液中无芍药苷相对应的峰,说明30ml 60%乙醇可以洗脱完全。因此洗脱剂的用量优选为30ml。
6、对照品溶液的配制:精密称取芍药苷对照品适量,加25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得。
7、阴性试验:称取1/9处方量除赤芍外的方中药材,按制备工艺制得阴性样品,按供试品溶液的处理方法进行处理,得阴性样品溶液。吸取阴性样品溶液、对照品溶液及样品溶液,按选定色谱条件进行检测,结果阴性无干扰。(阴性样品、对照品、样品色谱图见图2,从上到下依次为阴性样品、对照品、样品色谱图)
8、线性关系的考察:取芍药苷对照品适量,精密称定,加25%的甲醇制成19.15mg/50ml的溶液。并按一定比例稀释成一定浓度的对照品溶液,分别吸取该对照品溶液,按选定色谱条件进行检测,测定峰面积,以峰面积的积分值为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。结果表明:芍药苷进样量在0.046— 0.077μg 范围内呈良好的线性关系,回归方程为:Y=5.36e+005X-1.55e+004 r=0.99979测定结果见表4,图3:
9、精密度试验:吸取对照品溶液及相应的供试品溶液,各进样5次,测定峰面积,检测结果见表5:
以上试验结果表明,仪器精密度良好。
10、稳定性试验:吸取对照品溶液及相应的供试品溶液,每隔一定时间进样,测定峰面积,检测结果见表6:
以上试验结果表明,芍药苷在24小时内稳定。
11、重复性试验:取同一批样品9份,取样量分为高、中、低三种剂量, 每个剂量平行三份,按供试品溶液的制备方法分别进行制备,测定。九次测定结果见表7:
12、回收率试验:采用加样回收实验,取同一批样品9份,分为三组,分别加入高、中、低三个浓度的芍药苷对照品溶液,另外称取一份,作为随行样品。按照供试品溶液的制备方法分别进行制备及测定,计算回收率。其测定结果见表8:
13、耐用性试验:
(1)检测波长对含量的影响:
在225nm、230nm、235nm波长下检测120901批样品中芍药苷的含量。试验结果见表9:
从试验结果可见:上述不同检测波长下芍药苷的含量测定结果相差不大。表明检测波长的轻微变动不影响芍药苷的含量测定结果。
(2)不同色谱柱对含量的影响:取同一份120901批供试品,选用不同厂家的色谱柱进行测定,试验结果见表10:
由以上结果可见,更换不同的色谱柱测定同一份样品,芍药苷含量的RSD%为2.63%。表明不同品牌的色谱柱不影响芍药苷含量测定。
(3)中性氧化铝厂家对含量的影响:
采用不同厂家、批号的中性氧化铝,照供试品制备方法制备供试品溶液,测定120901批样品中芍药苷的含量。试验结果见表11:
从试验结果可见:四个不同厂家、批号的中性氧化铝的含量测定结果相差不大。表明中性氧化铝厂家不影响芍药苷的含量测定。
14、含量限度:
芍药苷的含量测定:取三批本发明药物组合物,按照所制定的含量测定方法,分别进行含量测定,其测定结果见表12:
注:按每粒0.4g计。
14、芍药苷转移率的计算:
通过比较三批成品及其相应药材中芍药苷的含量,初步确定本工艺路线赤芍中芍药苷的转移率,结果见表13:
15、样品含量限度制定:
本品为胶囊剂,装量为每粒0.4g,每粒中含赤芍药材0.188g。根据含量测定过程中赤芍药材中芍药苷的平均转移率为55.66%,按照中国药典2010年版一部赤芍含量测定项下规定赤芍药材中芍药苷不得低于1.8%计算,本品含量限度为1000mg×0.188×1.8%×55.66%=1.88mg。因此规定本品每粒含赤芍以芍药苷计,不得低于1.88mg。
(2)葛根素
1、材料、仪器与试药:
葛根素对照品:购于中国药品生物制品鉴定所,批号:110752-200511
本发明药物组合物:石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号:091201、091202、091203
Waters高效液相色谱仪:(Waters 2695 Separations Modμle,Waters 2998Photodiode Array Derector)
工作站:Waters Empower 2 Software Build 2154
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
乙腈:Fisher、色谱纯
水:Milli-Q制备的超纯水
2、检测波长的选择:对葛根素对照品、葛根素含量测定供试品及粉葛阴性样品进行光谱扫描,由光谱图上可见(图4),葛根素对照品、本发明药物组合物葛根素含量测定样品在248.7nm处有最大吸收,而粉葛阴性样品在248.7nm处没有吸收,参照药典葛根素的检测波长,因此检测波长优选为250nm。
3、流动相的选择:采用乙腈-水(12:88)做为流动相,样品中葛根素达到很好的分离,并且对照品及供试品中葛根素色谱峰的对称性很好。
4、色谱条件:
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流动相:乙腈-水(12:88);
流速:1ml/min;
检测波长:250nm;
理论板数:按葛根素峰计算不得低于4000。
5、供试品溶液的制备:
由于本品为复方制剂,样品中成分较多,为减少其他成分对葛根素含量测定的干扰,降低供试品对色谱柱的污染,采用聚酰胺柱层析法对供试品的制备方法进行了考察。
5.1洗脱溶剂用量的选择:
取本品内容物,研细,精密加甲醇25ml,超声处理30分钟,滤过,精密量取续滤液2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱(80-100目,2g,内径1.0cm),收集洗脱液至10ml量瓶中,再分别用10ml水、10ml甲醇、10ml甲醇、5ml甲醇、5ml甲醇洗脱,洗脱液依次收集,测定,试验结果见表14:
由试验结果可知:10ml水溶解、10ml水冲洗,不仅可以冲洗下很多杂质,而且对葛根素含量没有影响,因此供试品蒸干后采用10ml水溶解、10ml水冲洗;再加20ml甲醇即可将葛根素洗脱完全,因此优选20ml甲醇洗脱。
5.2聚酰胺用量考察:
取本品内容物,研细,取约2.5g,精密称定,精密加甲醇25ml,超声处理20分钟,滤过,精密量取续滤液5份,每份2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,分别上聚酰胺柱(80-100目,内径1.0cm),聚酰胺用量分别为0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g,先用水10ml洗脱,再加20ml甲醇洗脱,收集聚酰胺用量为0.5g、1g、1.5g的水洗脱液及上述5份甲醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇-0.5%磷酸水(80:20)溶解,转移至10ml量瓶中,并稀释至刻度,作为供试品溶液,测定,试验结果见表15:
注:单位为mg/g
由试验结果可见:聚酰胺用量在1g到2.5g之间时对葛根素含量测定没有影响,但是聚酰胺用量为0.5g时,水洗脱部分检测到了葛根素,考虑到产品批次的差异,为保证方法的重现性,故此将聚酰胺用量定为1.5g。
5.3提取时间考察:
葛根素的溶出需要一定的时间,故对提取时间进行考察,方法为:取样品研细,加甲醇分别超声处理不同的时间,结果见表16:
由试验结果可见:超声处理30分钟即可将葛根素充分提取,故此超声提取时间优选为30分钟。
5.4溶剂用量考察结果
取本品内容物,研细,取2份,每份约2.5g,精密称定,分别精密加甲醇25ml、50ml,超声处理30分钟,采用聚酰胺柱层析的方法制备供试品溶液,测定含量,试验结果见表17:
由试验结果可见:溶剂用量对葛根素的含量测定没有差异,因此优选25ml甲醇提取。
5.5供试品制备方法总结:
取内容物适量,研细,取约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,密塞,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2 ml,蒸干,残渣加10ml水使溶解,上聚酰胺柱(80-100目,1.5g,内径1.0cm),10ml水洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇-0.5%磷酸水(80:20)溶解并转移至10ml的量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
6、对照品纯度检测:经对葛根素对照品进行面积归一化法测定,结果葛根素对照品的平均纯度为99.86%。
7、阴性试验:
按处方比例称取除粉葛外的其它方中药材,按制备工艺制得阴性样品,按供试品溶液的处理方法进行处理,得阴性样品溶液。分别吸取阴性样品溶液、对照品溶液及供试品溶液,按照选定测定条件进行检测,结果表明:在葛根素相应的保留时间,阴性样品无相应吸收峰出现。表明葛根素含量测定方法专属,见图5。
8、线性关系考察
精密吸取浓度为27.456μg/ml的葛根素对照品溶液2μl、3μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl,注入液相色谱仪,测定峰面积(见表18)。以峰面积积分值为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线,见图6。结果表明:葛根素进样量在54.912~1098.24ng范围内呈良好线性关系,回归方程为:y=4.28e+003x-2.92e+004,r=0.999998。
9、精密度试验
吸取对照品溶液及供试品溶液,各进样5次,测定峰面积,检测结果见表19:
从试验结果可见,葛根素对照品5次测定的峰面积平均值为589589,RSD为0.46%;供试品葛根素的平均值为588909,RSD为0.72%。说明仪器性能良好。
10、稳定性试验
取对照品溶液与供试品溶液,每隔一定时间进样,考察了葛根素溶液的稳定性,结果见表20:
试验结果表明:葛根素含量测定供试品溶液在24h内稳定。
11、重复性试验
取同一批样品(批号091201),按高、中、低剂量取样,每个剂量取3份,按供试品含量测定项下方法,进行提取,制备,测定,结果见表21:
由以上结果可见,同一批样品按高、中、低剂量取样,9次测定的结果,葛根素的平均含量为 0.6786mg/g,RSD为2.19%。表明方法重复性良好。
12、回收率试验
采用加样回收试验。取同一批本发明药物组合物(批号:091201)9份,分别加入含有葛根素对照品的低、中、高三个浓度甲醇溶液25ml,按供试品含量测定项下方法,进行提取,制备,测定,计算回收率。结果见表22:
由试验结果可见:葛根素的平均回收率为99.78%(n=9), RSD为2.34%。表明方法准确度良好。
13、耐用性试验:
(1)检测波长对含量的影响:
在245nm、250nm、255nm波长下检测样品中葛根素的含量。试验结果见表23:
从试验结果可见:不同检测波长下葛根素的含量测定结果相差不大。表明检测波长的轻微变动不影响葛根素的含量测定结果。
(2)柱温变化对含量的影响:取同一份供试品,改变柱温进行测定,试验结果见表24:
由以上结果可见,柱温变化,测定的同一份样品葛根素含量的RSD为0.64%。表明柱温不影响葛根素含量测定结果。
(3)不同色谱柱对含量的影响:取同一份供试品,选用不同厂家的色谱进行测定,试验结果见表25:
由以上结果可见,更换不同的色谱柱测定同一份样品,葛根素含量的RSD%为1.39%。表明不同品牌的色谱柱不影响葛根素含量测定。
(4)聚酰胺厂家对含量的影响:
采用三个不同厂家的聚酰胺,照供试品制备方法制备供试品溶液,测定样品中葛根素的含量。试验结果见表26:
从试验结果可见:三个厂家的聚酰胺的含量测定结果相差不大。表明聚酰胺厂家不影响葛根素的含量测定。
14、含量限度
用正文含量测定项下方法,对三批本发明药物组合物中试样品和相应的粉葛药材进行了葛根素含量测定,并计算葛根素转移率,测定结果见表27:
从以上三批中试样品的含量测定结果看:本发明药物组合物中的葛根素平均转移率为47%。本品每粒含粉葛药材0.188g,根据中国药典2010年版一部粉葛药材项下规定:粉葛含葛根素不得少于0.30%,计算本品每粒中葛根素含量限度应为:0.188×0.30%×47%×1000=0.26mg,即本品每粒含粉葛药材以葛根素(C21H20O9)计不得少于0.26mg。
由于采用了上述技术方案,本发明取得的技术进步是:
本发明的鉴别方法能准确的鉴别出该中药组合物中的成分,专属性强,含量测定方法有助于药物的质量控制,提高药物的安全性和可靠性。
实验例2
本发明的组合物各味药的范围是经过大量实验才得出的最佳范围,不在该范围内的各味药组成的组合物(如:赤芍150份、黄芪350份、生地黄150份、蒲黄200份、女贞子150份、墨旱莲150份、银杏叶350份、大黄50份、三七150份、地龙50份、决明子350份、葛根150份)的效果不佳。
1临床资料
1.1病例:患者均为河北医科大学附属以岭医院就诊患者,选择2006年9月至2007年4月结膜炎患者150例,随机分为对照组、对比组和治疗组,其中对照组50例:男26例,女24例,年龄19-68岁,平均年龄43.2岁;治疗组共50例:男25例,女25例,年龄18-66岁,平均年龄41.2岁;对比组50例:男24例,女26例,年龄18-68岁,平均年龄42.2岁。其中细菌性结膜炎患者45例;病毒性结膜炎患者50例;过敏性结膜炎患者55例;
1.2 临床标准:
(1)细菌性结膜炎:发病急剧,双眼常同时发病(或间隔1日-2日),并伴有大量的粘液性分泌物,夜间分泌较多,常在晨起时双眼会被分泌物糊住。轻症患者有眼部瘙痒和异物感;重症患者眼睑坠重、灼热、畏光、流泪、结膜下充血、水肿、出现小出血点,眼睑亦常红肿、角膜受累、疼痛及视物模糊。
(2)病毒性结膜炎:一般一眼先起,自觉有异物感、刺痒,但分泌物少,且为水样。1/3的病人结膜上可见伪膜,结膜高度充血、水肿,在下睑结膜及穹窿部有多个圆形滤泡,有时结膜下可出现点状出血,耳前淋巴结肿大。
(3)过敏性结膜炎:症状一般较轻,结膜可充血和水肿,感觉瘙痒并伴有流泪,一般无分泌物或粘液性分泌物较少。
1.4 排除标准:
1.5 剔除标准:①不符合纳入标准;②未按规定用药者;③试验期间自行使用其他抗病毒药物可能影响本试验药物疗效者。
2、方法
2.1 治疗方法:
对照组:细菌性结膜炎:氧氟沙星滴眼液,滴入眼睑内,每次2滴,
3-5次/日。
病毒性结膜炎:阿昔洛韦滴眼液,每次1-2滴,每两小时一次。
过敏性结膜炎:醋酸可的松滴眼液,每次1-2滴,3-4次/日。
治疗组:在对照组基础上加服本发明药物,每次3-4粒,3次/日。
对比组:在对照组基础上加服组合物(赤芍150份、黄芪350份、生地黄150份、蒲黄200份、女贞子150份、墨旱莲150份、银杏叶350份、大黄50份、三七150份、地龙50份、决明子350份、葛根150份),每次3-4粒,3次/日。
2.2 疗效评定标准
治愈:结膜充血、弯窿部网状充血及小点状结膜出血吸收,症状消失,分泌物及肿物消失,可正常睡眠;
显效:异物感消失,疼痛减轻,球结膜水肿减轻,症状缓解;
好转:结膜及眼睑水肿消失,一般不发生并发症;
无效:诸症无明显改善。
3、结果
组别 | 例数 | 治愈 | 显效 | 好转 | 无效 | 总有效率 |
对照组 | 50 | 14 | 16 | 16 | 4 | 60% |
对比组 | 50 | 22 | 16 | 8 | 4 | 76% |
治疗组 | 50 | 28 | 17 | 3 | 2 | 90% |
由上表组间疗效结果比较可以得出,在总有效率方面,治疗组与对比组比较,效果显著优于对比组。表明在本发明药物的范围之内的效果比较佳。
附图说明
图1是芍药苷的光谱图;
图2是芍药苷的专属性图;
图3是芍药苷的标准曲线图;
图4是葛根素的光谱图;
图5是葛根素的专属性图;
图6是葛根素的标准曲线图;
图7是实施例2女贞子的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是齐墩果酸对照品,3-5分别是样品;
图8是实施例3墨旱莲的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是墨旱莲对照药材,3-5是样品;
图9是实施例4三七和黄芪的鉴别图;
图10是实施例8女贞子的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是齐墩果酸对照品,3-5分别是样品;
图11是实施例9墨旱莲的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是墨旱莲对照药材,3-5是样品;
图12是实施例10三七和黄芪的鉴别图;
图13是实施例14女贞子的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是齐墩果酸对照品,3-5分别是样品;
图14是实施例15墨旱莲的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是墨旱莲对照药材,3-5是样品;
图15是实施例16三七和黄芪的鉴别图;
图16是实施例20女贞子的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是齐墩果酸对照品,3-5分别是样品;
图17是实施例21墨旱莲的薄层色谱图,自左向右,1是阴性对照,2是墨旱莲对照药材,3-5是样品;
图18是实施例22三七和黄芪的鉴别图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明:
实施例1:本发明药物胶囊剂的制备
处方:
赤芍188克 黄芪282克 生地黄188克 蒲黄141克 女贞子188克
墨旱莲188克 银杏叶282克 大黄94克 三七94克 地龙94克
决明子282克 葛根188克
制备方法:
(1)、按处方量称取蒲黄,以6倍量70%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭15分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡24小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、按处方量称取生地黄、地龙,第一次加9倍量水,浸泡20分钟,加热煎煮1.5小时,过滤;第二次加7倍量的水,煎煮1.5小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15,放冷,加适量乙醇使含醇量达60%,充分搅拌,冷藏24小时,过滤,滤液备用;
(3)、按处方量称取黄芪、赤芍,加8倍量50%乙醇,浸泡20分钟,回流提取2次,每次2小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、按处方量称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加8倍量80%乙醇,浸泡20分钟,回流提取2次,每次2小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25的清膏;
(6)、按处方量称取三七,粉碎成100目粉,加入上述清膏中,搅拌均匀,真空干燥,干浸膏粉碎成100目粉,备用;
(7)、取干膏粉和淀粉,混和均匀,用85%乙醇为粘合剂制软材,筛网制粒,整粒,装胶囊,即得。
实施例2胶囊剂中女贞子的鉴别方法
处方、制备方法同实施例1。
女贞子的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取胶囊内容物2g,相当于该中药组合物生药量11g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液5μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点,见图7,见4个明显斑点。
实施例3胶囊剂中墨旱莲的鉴别方法
处方、制备方法同实施例1。
墨旱莲的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取胶囊内容物2g,相当于该中药组合物生药量11g,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液5μl,对照药材溶液1μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图8,见3个明显斑点。
实施例4胶囊剂中三七和黄芪额鉴别方法
处方、制备方法同实施例1
三七和黄芪的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取胶囊内容物2g,相当于该中药组合物生药量11g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R10.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液15μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰,见图9。
实施例5胶囊剂中芍药苷的含量测定方法
处方和制备方法同实施例1。
芍药苷的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取胶囊内容物0.2g,相当于该中药组合物生药量1g,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
C、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
D、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量,该组合物的芍药苷含量总共为1.88g。
实施例6胶囊剂中葛根素的含量测定方法
处方和制备方法同实施例1。
葛根素的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取胶囊2.5g,相当于该中药组合物生药量14 g,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
C、、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
D、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量,总共为1.88g。
实施例7:本发明药物片剂的制备
处方:
赤芍160克 黄芪300克 生地黄160克 蒲黄180克 女贞子200克
墨旱莲200克 银杏叶270克 大黄60克 三七60克 地龙120克
决明子270克 葛根200克
制备方法:
(1)、按比例称取蒲黄,以5倍量75%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭20分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡27小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、按比例称取生地黄、地龙,第一次加9倍量水,浸泡15分钟,加热煎煮1.5小时,过滤;第二次加7倍量的水,煎煮2小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20,放冷,加适量乙醇使含醇量达60%,充分搅拌,冷藏28小时,过滤,滤液备用;
(3)、按比例称取黄芪、赤芍,加9倍量45%乙醇,浸泡20分钟,回流提取2次,每次2小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、按比例称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加8倍量80%乙醇,浸泡25分钟,回流提取2次,每次2小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏;
(6)、按比例称取三七,粉碎成110目细粉,备用;
(7)、按常规制剂方法制成片剂。
实施例8片剂中女贞子的鉴别方法
处方和制备方法同实施例7。
女贞子的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取片剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液10μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点,见图10,见4个明显斑点。
实施例9片剂中墨旱莲的鉴别方法
处方和制备方法同实施例7。
墨旱莲的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取片剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液10μl,对照药材溶液3μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图11,见3个明显斑点。
实施例10 片剂中三七和黄芪的鉴别方法
处方和制备方法同实施例7。
三七和黄芪的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取片剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R10.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液25μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰,见图12。
实施例11 片剂中芍药苷的含量测定方法
处方和制备方法同实施例7。
芍药苷的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取片剂0.1g,相当于该中药组合物生药量0.5g,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
C、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
D、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量,总共为1.5g。
实施例12片剂黄总葛根素的含量测定方法
处方和制备方法同实施例7。
葛根素的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取片剂1.8g,相当于该中药组合物生药量10 g,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
C、、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
D、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量为2g。
实施例13:本发明药物颗粒剂的制备
处方:
赤芍200克 黄芪270克 生地黄200克 蒲黄120克 女贞子160克
墨旱莲160克 银杏叶300克 大黄120克 三七120克 地龙60克
决明子300克 葛根160克
制备方法:按常规制剂方法制成颗粒剂。
实施例14颗粒剂中女贞子的鉴别方法
处方和制备方法同实施例13。
女贞子的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取颗粒剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液5μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点,见图13,见4个明显斑点。
实施例15颗粒剂中墨旱莲的鉴别方法
处方和制备方法同实施例13。
墨旱莲的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取颗粒剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液5μl,对照药材溶液1μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图14,见3个明显斑点。
实施例16颗粒剂中三七和黄芪的鉴别方法
处方和制备同实施例13。
三七和黄芪的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取颗粒剂1.4g,相当于该中药组合物生药量8g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R10.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液15μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰,见图15。
实施例17颗粒剂中芍药苷的含量测定方法
处方和制备方法同实施例13。
芍药苷的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取颗粒剂0.1g,相当于该中药组合物生药量0.5g,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
C、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
D、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量总共为2g。
实施例18颗粒剂中葛根素的含量测定方法
处方和制备方法同实施例13。
葛根素的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取颗粒剂1.8g,相当于该中药组合物生药量10 g,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2 ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
C、、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
D、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量为1.6g。
实施例19:本发明药物丸剂的制备
处方:
赤芍175克 黄芪280克 生地黄180克 蒲黄150克 女贞子175克
墨旱莲175克 银杏叶270克 大黄100克 三七100克 地龙100克
决明子280克 葛根175克
制备方法:按常规制剂方法制成丸剂。
实施例20 丸剂中女贞子的鉴别方法
处方和制备方法同实施例19。
女贞子的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取丸剂2.7g,相当于该中药组合物生药量15g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液8μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点,见图16,见4个明显斑点。
实施例21丸剂中墨旱莲的鉴别方法
处方和制备方法同实施例19。
墨旱莲的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取丸剂2.7g,相当于该中药组合物生药量15g,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液8μl,对照药材溶液2μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图17,见3个明显斑点。
实施例22丸剂中三七和黄芪的鉴别方法
处方和制备方法同实施例19。
三七和黄芪的鉴别方法由以下步骤构成:
a、取丸剂2.7g,相当于该中药组合物生药量15g,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R10.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液20μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰,见图18。
实施例23 丸剂中芍药苷的含量测定方法
处方和制备方法同实施例19。
芍药苷的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取丸剂0.8g,相当于该中药组合物生药量1.5g,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
C、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
D、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量为1.75g。
实施例24丸剂中葛根素的含量测定方法
处方和制备方法同实施例19。
葛根素的含量测定方法由以下步骤组成:
A、取丸剂3.3g,相当于该中药组合物生药量18g,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
B、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
C、、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
D、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量为1.75g。
Claims (3)
1.一种中药组合物的鉴别方法,该中药组合物由下列重量份数的原料药组成:赤芍160-200份 黄芪270-300份 生地黄160-200份 蒲黄120-180份
女贞子160-200份 墨旱莲160-200份 银杏叶270-300份 大黄60-120份
三七60-120份 地龙60-120份 决明子270-300份 葛根160-200份,该中药组合物的活性成分制备由以下步骤构成:
(1)、称取蒲黄,以4-8倍量60-80%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭10-30分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡20-36小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、称取生地黄、地龙,第一次加8-10倍量水,浸泡10-30分钟,加热煎煮1-2小时,过滤;第二次加6-9倍量的水,煎煮1-2小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15—1.20,放冷,加适量乙醇使含醇量达50-70%,充分搅拌,冷藏20-36小时,过滤,滤液备用;
(3)、称取黄芪、赤芍,加6-10倍量40-60%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取2-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加6-9倍量70-90%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏;
(6)、称取三七,粉碎成100-120目细粉,备用;
步骤(5)所得清膏和步骤(6)所得细粉共同构成本发明中药组合物的活性成分,
其特征在于,所述鉴别方法包括以下步骤:
(1)、女贞子的鉴别方法:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取齐墩果酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液;
c、照薄层色谱法试验,分别吸取供试品溶液5~10μl,对照品溶液5μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以5:2:1的正己烷-丙酮-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在100℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品和对照品色谱相应位置上,分别显相同颜色的主斑点;
(2)、墨旱莲的鉴别方法:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加乙醇30ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
b、另取墨旱莲对照药材,同法制成对照药材溶液;
c、照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液5~10μl,对照药材溶液1~3μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂制备的硅胶G薄层板上,以9:1的正己烷-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,置365nm紫外光灯下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
(3)、三七和黄芪的鉴别方法:
a、取相当于该中药组合物生药量8-15g的制剂,加甲醇30ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加3%氢氧化钠溶液20ml使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20ml,合并正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗涤2次,每次25ml,正丁醇液蒸干,残渣用70%甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
b、另人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 0.4mg、人参皂苷Rb1 0.4mg、三七皂苷R1 0.1mg、黄芪甲苷0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
c、照高效液相色谱法,分别吸取供试品溶液15~25μl,对照品溶液15μl,注入液相色谱仪,以乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱:0-12分钟,19%的乙腈,81%水,12-60分钟,19-36%乙腈,81-64%水;流速1.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,记录色谱图,供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰;
(4)、芍药苷的含量测定方法:
a、取相当于该中药组合物生药量0.5-1.5 g的制剂,研细,加入60%乙醇20ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液10 ml,上中性氧化铝柱,用60%乙醇30ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加25%甲醇溶解至25ml量瓶中,加25%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
b、称取芍药苷对照品适量,用25%甲醇制成每1ml含23μg的溶液,摇匀,即得;
c、高效液相色谱条件:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,25:75的甲醇-水为流动相;检测波长为230nm;
d、测定:分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得芍药苷含量;
(5)、葛根素的含量测定方法:
a、取相当于该中药组合物生药量10-18 g的制剂,研细,加入甲醇25ml,称定重量,超声处理30分钟,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液2 ml,蒸干,残渣加水10ml使溶解,上聚酰胺柱,用水10ml洗脱,弃去水液,再用20ml甲醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液溶解至10ml量瓶中,加80:20的甲醇-0.5%磷酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,即得;
b、精密称取葛根素对照品适量,加80:20的甲醇-0.5%磷酸的溶液制成每1ml含13μg的溶液,摇匀,即得;
c、高效液相色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;12:88的乙腈—水为流动相;检测波长为250nm;
d、分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,测得葛根素含量。
2.根据权利要求1所述的中药组合物的鉴别方法,其特征在于该中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂。
3.根据权利要求1所述的中药组合物的鉴别方法,其特征在于该中药组合物胶囊剂的制备由以下步骤构成:
(1)、称取蒲黄,以4-8倍量60-80%乙醇为溶剂,先用适量溶剂浸润药材,密闭10-30分钟后装渗漉柱,加剩余溶剂浸泡20-36小时,渗漉,收集渗漉液,备用;
(2)、称取生地黄、地龙,第一次加8-10倍量水,浸泡10-30分钟,加热煎煮1-2小时,过滤;第二次加6-9倍量的水,煎煮1-2小时,过滤,滤液合并,浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20,放冷,加适量乙醇使含醇量达50-70%,充分搅拌,冷藏20-36小时,过滤,滤液备用;
(3)、称取黄芪、赤芍,加6-10倍量40-60%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取2-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(4)、称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子,加6-9倍量70-90%乙醇,浸泡10-30分钟,回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,滤液合并,备用;
(5)、将步骤(1)、(2)、(3)和(4)所得提取液合并,减压回收乙醇,继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏;
(6)、称取三七,粉碎成100-120目粉,加入上述清膏中,搅拌均匀,真空干燥,干浸膏粉碎成80-120目粉,备用;
(7)、取干膏粉和淀粉,混和均匀,用70-90%乙醇为粘合剂制软材,筛网制粒,整粒,装胶囊,即得。
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