CN104988194A - 一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺 - Google Patents

一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺 Download PDF

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CN104988194A CN201510359457.6A CN201510359457A CN104988194A CN 104988194 A CN104988194 A CN 104988194A CN 201510359457 A CN201510359457 A CN 201510359457A CN 104988194 A CN104988194 A CN 104988194A
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张淑华
刘丽平
及雪敏
王晴
李洋
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Abstract

一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,属于环境微生物领域,其制备工艺是:a、向日葵花盘的预处理,b、果胶的酶法提取及果胶浓度的测定,c、果胶得率分析,d、成品果胶的制备。有益效果是:1、本发明对枝状枝孢霉菌产原果胶酶这一新功能进行了研究,得到原果胶酶的酶活较高,生产的果胶品质较好,降低果胶酶的生产成本,减少果胶的进口量。2、以废弃的向日葵为原料,生产成本低,反应条件易于控制,工艺简单,减少了环境污染,具有生态效应和经济效应。

Description

一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺
技术领域
本发明属于环境微生物领域。
背景技术
枝状枝胞霉菌(Cladosporium cladosporioides)为腐生真菌,广泛存在于自然界的土壤、蔬菜、腐木、腐烂水果中。该菌在适宜的底物培养基中能产生纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶等,目前,我国对该菌的研究大都集中在医疗致病菌方面,2012年张华娇等人对枝状枝孢菌F4-1液体发酵产纤维素酶及酶学性质进行研究,2008年张鹏申请了关于枝状枝孢霉产紫杉醇的专利,2014年中国农业大学申请了关于芽枝状枝孢霉及木质纤维素酶的专利等。但关于该菌在果胶酶方面的研究还尚未见有关报道。
果胶是由α-1,4糖苷键连接的半乳糖醛酸,是植物中存在的天然多糖类高分子聚合物,它以原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛分布于植物的果实、根、茎、叶中,属亲水性植物胶。果胶来源天然无毒、无害、有益于健康,常被作为保健品而被应用于食品,医疗,环境治理等领域。全世界每年果胶的消耗量约为45000吨,而年产量只有20000-25000吨,果胶的生产国大多集中在美国、德国、丹麦,这些国家大都以干柠檬或橘子皮、苹果渣为原料,我国市场虽然对果胶的需求量较大,但80%左右依靠国外进口,大大提高了果胶成本,无法满足人们对果胶的需求,因此,寻找含有果胶的新原料是科学研究和工业生产的一项重要任务。我国北方土地面积大,向日葵资源丰富,但都作为工业废料或生活垃圾而丢弃,污染环境的同时还是资源的浪费。去粒后的向日葵花盘和梗中原果胶的含量丰富,达17%-25%,是很好的天然原果胶的来源。目前,果胶的提取方法主要有传统酸提法,碱提取法,超声波辅助提取法,螯合剂提取法,酶解法和微生物酶解法等。传统酸提法虽然工艺较为成熟,但反应条件复杂,得到的果胶品质较差;碱提法反应温度不易控制,易发生β消除反应;超声波辅助提取法受设备的影响,提高了果胶的生产成本,规模化工业生产受到了限制;螯合剂提取法提取果胶回收利用难,环境影响问题没有得到有效解决;酶解法成本较高,对酶的纯度要求较高。
微生物原果胶酶(protopectinase)是一种可以催化原果胶水解的胞外酶类,主要是将原果胶降解成可溶性果胶。天然的原果胶酶主要来源于动植物与微生物,但动植物对果胶酶的产量低,提取较困难,不适用于大规模制备。而由于微生物具有生长繁殖迅速,生长条件简单,代谢特殊,产酶量高等优点,因此,微生物原果胶酶在工业中的应用具有潜在的价值。因此得到一株果胶酶高产菌株,是许多学者致力于研究的方向。并且,果胶酶的市场售价较高,利用微生物生产果胶酶可以大大降低生产成本,是优良的生产果胶酶的资源。找到果胶酶高产菌株一直以来都是学者们研究的热点。
发明内容
本发明的目的是:提供一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,利用该菌分泌原果胶酶生产具有低消耗、低污染、产品质量稳定的果胶。
微生物原果胶酶(protopectinase)是一种可以催化原果胶水解的胞外酶类,主要是将原果胶降解成可溶性果胶。天然的原果胶酶主要来源于动植物与微生物,但动植物对果胶酶的产量低,提取较困难,不适用于大规模制备。而由于微生物具有生长繁殖迅速,生长条件简单,代谢特殊,产酶量高等优点,因此,微生物原果胶酶在工业中的应用具有潜在的价值。因此得到一株果胶酶高产菌株,是许多学者致力于研究的方向。并且,果胶酶的市场售价较高,利用微生物生产果胶酶可以大大降低生产成本,是优良的生产果胶酶的资源。找到果胶酶高产菌株一直以来都是学者们研究的热点。
本发明的制备工艺是:
1、      果胶酶产生菌的筛选
a、            富集培养:取自然腐烂的向日葵花盘上的菌接种于富集培养基中,27℃培养3d,取0.2ml进行稀释涂平板10个,27℃倒置培养3天后,挑取单菌落进行摇瓶培养进行初筛。
b、           初筛:将富集菌液按1:50接种于选择培养基中,27℃,160r/min进行摇瓶培养,取0.2ml进行稀释涂布,培养3天,产果胶酶的菌落所着生的蓝色(含有溴酚蓝)培养基有黄色水解圈生成,挑取水解圈明显的菌落进行复筛。
c、      复筛:在筛选培养基中挑取水解圈大的单菌落,通过测定和计算其变色圈直径Dp(mm)和菌落生长圈直径Dc(mm)的比值(Dp/Dc)进行复筛。在培养皿的中心分别接入初筛获得的菌种,接种后的培养皿置27℃的恒温培养箱中培养3 d。在培养皿中菌落周围滴加碘液,测量各菌落生长圈的直径Dc(mm)和变色圈的直径Dp(mm),选择Dp/Dc值较大的菌种作备用,最终选取一株果胶酶活力高的菌株进行实验。
2、 果胶酶产生菌的初步鉴定
a、形态学鉴定 培养特征:选择培养基上,27℃,培养3d即形成较典型的菌落,菌落中间呈墨绿色,边缘为白色,轮廓规则,外观呈绒毛状。
形态特征:27℃下选择培养基上培养3d,显微镜下观察菌株的菌丝形态、分生孢子梗的分枝情况、帚状枝及瓶梗的类型等显微形态特征。菌丝细胞丝状交织,具横隔;分生孢子梗直或弯,有隔膜,褐色,分生孢子生在梗顶端,易脱落,多为单胞,卵形或纺锤形,淡褐色。
b、分子生物学鉴定 取新鲜菌丝体50 mg,加液氮研磨成粉末,用试剂盒提取RNA。利用真菌通用引物 ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3; ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3进行rDNA的反转录和ITS序列PCR扩增,获得长度为514 bp的目的片段。将上述序列在NCBI中进行BLAST比对和同源性分析,结果表明,菌株的ITS序列与 Cladosporium cladosporioides同源性最高达96%,基于菌株的ITS序列,利用MECA5.1和Clustalx1.83构建系统发育树,结合形态特征鉴定,将菌株鉴定为芽枝状枝孢霉菌(Cladosporium cladosporioides)。
3、酶活测定
a、粗酶液的提取
发酵液在4°C,10000 r/min离心10 min以上,取上清液作为粗酶液。
b、酶活测定
采用DNS(3,5— 二硝基水杨酸)法,吸取0.2 ml适当稀释的酶液于试管中,加1.8 ml浓度为0.4%的果胶底物溶液(37℃水浴预热),45℃水浴反应30 min后加2 ml的DNS终止反应,沸水浴10 min,冷却后蒸馏水定容到15 ml摇匀。空白:吸取0.2 ml煮沸的稀释酶液于试管中,加2ml的DNS和1.8ml浓度为0.4%果胶底物溶液,45℃水浴反应30min,沸水浴l0min,冷却后蒸馏水定容到15 ml,摇匀。在540 nm下测定其吸光值。在上述反应体系中,每毫升果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1微克还原糖定义为一个酶活单位。绘制葡萄糖标准曲线。
充分混合后于沸水浴10 min,冷却后蒸馏水定容15 ml,以1管对照,540 nm测OD值。
4、遗传稳定性的测定
对复筛获得的枝状枝孢霉菌连续传代5代,利用向日葵培养基进行发酵考察菌株的产酶特性。
5、利用枝状枝孢霉菌分泌原果胶酶提取向日葵花盘果胶
a、向日葵花盘的预处理
将自然干燥的去粒的向日葵花盘粉碎,过60目筛,在沸水中灭酶3min,用8层纱布滤去水和部分杂质,再用NaOH调节pH为7.5的75℃热水浸泡15min,反复漂洗三遍,可以除去原料中大部分的酶、色素、杂质和可溶性糖,备用。
b、果胶的酶法提取及果胶浓度的测定
将优化后的枝状枝孢霉菌接种于向日葵发酵培养基中,27℃,160r/min摇床培养3d,发酵液经灭菌的滤纸过滤,得到原果胶酶粗酶液。然后,按向日葵粉末与粗酶液料液比1:3 -1:5.5范围内装液,以45℃,pH5.0,的条件下振荡(120r/min)反应(同时以灭活的酶液处理作对照) ,使向日葵原果胶在原果胶酶的作用下分离出来。在不同的时间反应下,将反应液过滤,测定滤液中的粘度,确定果胶的提取量。
以乌氏粘度计测定滤液的流出时间(t1),同时对预先灭活的酶液处理的向日葵粉末做同样的处理,作为空白对照,以乌氏粘度计测定空白对照组滤液的流出时间(t2),发酵液中的果胶浓度即可用t1-t2来代表。
c、果胶得率分析
称取一定量的待检验样品,加入果胶体积1.5倍的95%乙醇,在沸水浴上加热30min,除去糖分及其它物质。过滤,将沉淀加水40ml,50℃,30min 以溶解果胶。过滤,用少量水洗涤滤纸及沉淀,滤液移入 50ml 容量瓶中加水至刻度。此为可溶性果胶液。
沉淀物加0.45-0.55mol/L硫酸,在沸水浴上加热1h以上,以水解原果胶,冷却后采用咔唑硫酸比色法测定果胶的含量,并计算果胶得率。
  
C-从标准曲线上查得的半乳糖醛酸的浓度(μg/ml);
V-样品溶液最后定容的体积(ml);
W -样品重量(g)。
d、成品果胶的制备
将酶处理后的反应体系用八层纱布过滤,将滤液调pH至7.0后, 于加热炉上煮沸10min,10000r/min离心10min,取上清液加入果胶体积1.5倍的95%乙醇沉淀2h,5000r/min离心10min后,将沉淀用75% 的乙醇洗涤两次,于鼓风干燥箱50℃烘干至含水量达到行业标准QB2482 - 2000 要求的8 %即得成品果胶。
e、酶与向日葵反应的条件优化
分别对酶提取向日葵花盘果胶的时间、温度、料液比、pH进行优化,最终确定最优条件。再在上述研究的基础上,对原果胶酶酶法生产果胶的得率进行了分析。
本发明初筛得到的果胶酶产生菌枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)初始酶活为8916.442U/ml,用向日葵发酵培养基优化培养,适宜的料液比为1:35-1:45,低于或者高于这个范围枝状枝孢霉菌的生长及产酶能力均会降低,(NH42SO4和蛋白胨均为适宜的氮源,但相比之下(NH42SO4优于蛋白胨,其添加量为1%,酶反应温度为在40-50℃,pH值4.5-5.5,该条件下酶活力变化不大,但在料液比1:40,(NH42SO4添加量1%,酶反应温度45℃,pH值5.0,该条件下最终测得酶活为70482.98U/ml,比初始菌株提高了7.9倍。用该菌分泌的原果胶酶提取向日葵花盘果胶,酶反应温度在40-60℃范围内酶将向日葵粉末降解完全,低于40℃,酶与向日葵反应不完全,高于60℃,酶会失活,同样pH值在4.5-5.5,酶液反应时间5-7h,料液比1:3.5-1:5范围内酶降解向日葵果胶效果最好,其在酶反应温度45℃,pH5.0,酶液反应时间5.5h,料液比1:4的条件下,果胶收率达38.71%。
本发明的有益效果是:
提取果胶采用的是生活废弃物向日葵盘,绿色环保,使用所述枝状枝孢霉菌生产原果胶酶,所得的果胶酶液的酶活为70482.98U/ml。比目前我国学者研究的果胶酶的酶活均要高。2010年王媛等人从腐烂的大枣中筛选得到一株果胶酶产生菌L16(45),在最佳条件下其酶活为10758U/ml。2012年浙江师范大学蓝丽晶从污泥中筛选出一株草酸青霉菌,其最终酶活为54391.7U/ml。2013年徐冲等从腐烂的水果皮中筛选得到2株果胶酶产生菌G16和G25,其酶活分别为6.37万U/ml和6.84万U/ml。2014年陈永强等从腐烂水果中筛选出一株果胶酶产生菌G1,其酶活为4506.7U/ml。另外,利用该菌分泌原果胶酶生产果胶的品质较好,果胶得率较高为38.71%,2014年刘义武等人采用木瓜蛋白酶提取柠檬皮果胶,果胶得率为32.3%,2005年张一青等人用Aspergillus sp XZ-131分泌的原果胶酶提取桔柚皮果胶,果胶得率为35.7%,而且向日葵花盘果胶为低酯果胶,不但可以作为食品添加剂,还可以被糖尿病患者等食用,也可以用在医疗保健品中,深受消费者的青睐。本发明利用的原料为生活废弃物,操作工艺简单,获得的原果胶酶酶活高,果胶品质较好,为低酯果胶,具有一定的研究价值,为工业生产提供参考。
1、本发明对枝状枝孢霉菌产原果胶酶这一新功能进行了研究,得到原果胶酶的酶活较高,生产的果胶品质较好,降低果胶酶的生产成本,减少果胶的进口量,为未来我国果胶酶及果胶产业提供理论参考。
2、 以废弃的向日葵为原料,生产成本低,反应条件易于控制,工艺简单,减少了环境污染,具有生态效应和经济效应。
附图说明
附图1:枝状枝孢霉菌菌落形态图;
附图2:ITS序列RCR电泳图;
附图3:ITS序列测序结果;
附图4:NCBI上Blast比对结果;
附图5:系统发育树;
附图6:葡萄糖标准曲线;
附图7:初始菌株透明圈直径与菌落直径比及酶活(U/ml)。
具体实施方式
实施例1
果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化
1、培养基的配置
(1)富集培养基:NaNO2g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4 0.5g,FeSO0.01g,蔗糖 30g,琼脂 15—20g,水1000ml,pH自然。
(2)选择培养基:果胶1g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4 0.5g,FeSO0.01g,NaNO3 3g,溴酚蓝0.2g,琼脂15—20g,水1000ml。
(3)发酵培养基:液料比(向日葵:水)1:40,(NH4)2SO4 1g,KH2PO4 3.8g,K2HPO4 .3H2O 0.2g,FeSO4 0.001g,KCl 0.05g,水100ml。
2、果胶酶产生菌的筛选
(1)富集培养 取自然腐烂的向日葵花盘上的菌接种于富集培养基中,27℃培养3d,取0.2ml进行稀释涂平板10个,27℃倒置培养3d后,挑取单菌落进行摇瓶培养进行初筛。
(2)初筛 取一定量菌液进行涂布,27℃培养3d,产果胶酶的菌落所着生的溴酚蓝培养基有黄色水解圈生成,挑取水解圈明显的菌落进行复筛。
(3)复筛 挑取初筛透明圈大的菌落通过测定其Dp/Dc值进行复筛,将孢子悬液稀释涂布于只有果胶作为唯一碳源的选择培养基上,27℃培养3d,在平板上滴加灭菌的碘液,静止观察透明圈的大小,测定变色圈的直径Dp(mm)和菌落直径Dc(mm),选择Dp/Dc值较大的菌种作备用,最终选取一株高酶活力的菌株进行实验。
3、果胶酶产生菌的初步鉴定
(1)形态学鉴定 培养特征:选择培养基上,27℃,培养3d即形成较典型的菌落,菌落中间呈墨绿色,边缘为白色,轮廓规则,外观呈绒毛状。
形态特征:27℃下选择培养基上培养3d,显微镜下观察菌株的菌丝形态、分生孢子梗的分枝情况、帚状枝及瓶梗的类型等显微形态特征。菌丝细胞丝状交织,具横隔;分生孢子梗直或弯,有隔膜,褐色,分生孢子生在梗顶端,易脱落,多为单胞,卵形或纺锤形,淡褐色。
(2)分子生物学鉴定 取新鲜菌丝体50 mg,加液氮研磨成粉末,用试剂盒提取RNA(附图3)。利用真菌通用引物 ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3; ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3进行cDNA的反转和ITS序列PCR扩增,获得长度为514 bp的目的片段。测序由上海生物工程有限公司完成。将上述序列在NCBI中进行BLAST比对和同源性分析,结果表明,菌株的ITS序列与 Cladosporium cladosporioides同源性最高达96%,基于菌株的ITS序列,利用MECA5.1和Clustalx1.83构建系统发育树,结合形态特征鉴定,将菌株鉴定为芽枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)。
4、酶活测定方法
4.1粗酶液的提取
发酵液在4°C,10000 r/min离心10 min,取上清液作为粗酶液。
4.2酶活测定方法
采用DNS(3,5— 二硝基水杨酸)法,吸取0.2 ml适当稀释的酶液于试管中,加1.8 ml浓度为0.4%的果胶底物溶液,45℃水浴反应30 min后加2 ml的DNS终止反应,沸水浴10 min,冷却后蒸馏水定容到15 ml摇匀。空白:吸取0.2 ml煮沸的稀释酶液于试管中,加2mL的DNS和1.8mL浓度为0.4%果胶底物溶液,45℃水浴反应30min,沸水浴l0min,冷却后蒸馏水定容到15 ml,摇匀。在540 nm下测定其吸光值。在上述反应体系中,每毫升果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1微克还原糖定义为一个酶活单位。绘制葡萄糖标准曲线。
充分混合后于沸水浴10 min,冷却后蒸馏水定容15 ml,以1管对照,540 nm测OD值。绘制葡萄糖标准曲线。
4.3枝状枝孢霉的酶活测定
将复筛得到的枝状枝孢霉菌接种于分离培养基中27℃,160r/min摇瓶培养3d,取0.1ml菌液涂布分离培养基的平板10个,27℃恒温培养箱静置培养3d,喷洒碘液,静止1min倒掉多余碘液,选取7株透明圈大的菌L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7分别接种于向日葵发酵培养基中摇瓶培养,测定酶活。菌株的酶活力随着Dp/Dc值的增大而增大,L1菌株的Dp/Dc值最高,相应的酶活为8916.442U/ml。该菌株是从吉林省向日葵中筛选得到。
5、遗传稳定性的测定及发酵条件优化
5.1稳定性测定
对复筛获得的枝状枝孢霉菌连续传代5代,利用向日葵培养基进行发酵考察菌株的产酶特性。
5.2发酵条件优化
本研究分别对最适碳源、氮源、料液比、酶反应温度、热稳定性、pH及pH稳定性等条件进行了优化,大大提高了原果胶酶产生菌枝状枝孢霉的产酶能力,为后续试验做准备。
5.3结果分析
本发明初筛得到的果胶酶产生菌枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)初始酶活为8916.442U/ml,用向日葵发酵培养基优化培养,适宜的料液比为1:35-1:45,低于或者高于这个范围枝状枝孢霉菌的生长及产酶能力均会降低,(NH42SO4和蛋白胨均为适宜的氮源,但相比之下(NH42SO4优于蛋白胨,其添加量为1%,酶反应温度为在40-50℃,pH值4.5-5.5,该条件下酶活力变化不大,但在料液比1:40,(NH42SO4添加量1%,酶反应温度45℃,pH值5.0,该条件下最终测得酶活力为70482.98U/ml,比初始菌株提高了7.9倍。
利用枝状枝孢霉菌分泌原果胶酶提取向日葵花盘果胶
1、向日葵花盘的预处理
将自然干燥的去粒的向日葵盘粉碎,过60目筛,在沸水中灭酶3min,用8层纱布滤去水和部分杂质,再用NaOH调节pH为7.5的75℃热水浸泡15min,反复漂洗三遍,可以除去原料中大部分的酶、色素、杂质和可溶性糖,备用。
2、果胶的酶法提取及果胶浓度的测定
将枝状枝孢霉菌接种于向日葵发酵培养基中,27℃,160r/min摇床培养3d,发酵液经灭菌的滤纸过滤,得到原果胶酶粗酶液。然后,在装有40ml粗酶液的三角瓶中放入10g向日葵粉末,以45℃,pH5.0,的条件下振荡(120r/min)反应(同时以灭活的酶液处理作对照) ,使向日葵原果胶在原果胶酶的作用下分离出来。在不同的时间反应下,将反应液过滤,测定滤液中的粘度,确定果胶的提取量。
以乌氏粘度计测定滤液的流出时间(t1),同时对预先灭活的酶处理的向日葵粉末做同样的处理,作为空白对照,以乌氏粘度计测定空白中滤液的流出时间(t2),发酵液中的果胶浓度即可用t1-t2来代表。
3、果胶得率分析
称取5g待检测样品,置于150ml 的烧杯中,加入50ml 95%乙醇,在沸水浴上加热30~40min,除去糖分及其它物质。过滤,将沉淀加水40ml,50℃,30min 以溶解果胶。过滤,用少量水洗涤滤纸及沉淀,滤液移入 50ml 容量瓶中加水至刻度,此为可溶性果胶液。
沉淀物加0.5mol/L硫酸100ml,在沸水浴上加热1h,以水解原果胶,冷却后移入100ml容量瓶中,加水至刻度,此为原果胶测定液。采用咔唑硫酸比色法测定果胶的含量,并计算果胶得率。
C-从标准曲线上查得的半乳糖醛酸的浓度(μg/ml);
V-样品溶液最后定容的体积(ml);
W-样品重量(g)。
4、            成品果胶的制备
将酶处理后的反应体系用八层纱布过滤,将滤液调pH至7.0后, 于电炉上煮沸10min,10000r/min离心10min,取上清液加入果胶体积1.5倍的95%乙醇沉淀2h,5000r/min离心10min后,将沉淀用75% 的乙醇洗涤两次,于鼓风干燥箱50℃烘干至含水量达到行业标准QB2482 - 2000 要求的8 %即得成品果胶。
5、            结果与分析
分别对酶提取向日葵花盘果胶的时间、温度、料液比、pH进行优化,最终确定最优条件。再在上述研究的基础上,对原果胶酶酶法生产果胶的得率进行了分析。
用该菌分泌的原果胶酶提取向日葵花盘果胶,酶反应温度在40-60℃范围内酶将向日葵粉末降解完全,低于40℃,酶与向日葵反应不完全,高于60℃,酶会失活,同样pH值在4.5-5.5,酶液反应时间5-7h,料液比1:3.5-1:5范围内酶降解向日葵果胶效果最好,其在酶反应温度45℃,pH5.0,酶液反应时间5.5h,料液比1:4的条件下,果胶收率达38.71%。
 <110> 长春理工大学
<120> 一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺
<160> 1
<210> 1
<211> 514
<212> DNA
<213> 枝状枝孢霉菌(Cladosporium cladosporioides)
<220>
<221>
<222>(1).....(514)
<223>该DNA序列用ITS序列引物经PCR扩增出来
<400>1
GTATATGTGCGCCAGCATCTACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGT
CCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGG
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Claims (5)

1.一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,其制备工艺是:
a、向日葵花盘的预处理
将自然干燥的去粒的向日葵花盘粉碎,过60目筛,在沸水中灭酶3min,用8层纱布滤去水和部分杂质,再用NaOH调节pH为7.5的75℃热水浸泡15min,反复漂洗三遍,可以除去原料中大部分的酶、色素、杂质和可溶性糖,备用;
b、果胶的酶法提取及果胶浓度的测定
将优化后的枝状枝孢霉菌接种于向日葵发酵培养基中,27℃,160r/min摇床培养3d,发酵液经灭菌的滤纸过滤,得到原果胶酶粗酶液;然后,按向日葵粉末与粗酶液料液比1:3 -1:5.5范围内装液,以45℃,pH5.0,的条件下振荡120r/min反应,使向日葵原果胶在原果胶酶的作用下分离出来;在不同的时间反应下,将反应液过滤,测定滤液中的粘度,确定果胶的提取量;
以乌氏粘度计测定滤液的流出时间t1,同时对预先灭活的酶液处理的向日葵粉末做同样的处理,作为空白对照,以乌氏粘度计测定空白对照组滤液的流出时间t2,发酵液中的果胶浓度即可用t1-t2来代表;
c、果胶得率分析
称取待检验样品,加入果胶体积1.5倍的95%乙醇,在沸水浴上加热30min,除去糖分及其它物质;过滤,将沉淀加水,50℃,30min 以溶解果胶;过滤,用少量水洗涤滤纸及沉淀,此为可溶性果胶液;
沉淀物加0.45-0.55mol/L硫酸,在沸水浴上加热1h以上,以水解原果胶,冷却后采用咔唑硫酸比色法测定果胶的含量,并计算果胶得率;
C-从标准曲线上查得的半乳糖醛酸的浓度(μg/ml);
V-样品溶液最后定容的体积(ml);
W -样品重量(g);
d、成品果胶的制备
将酶处理后的反应体系用八层纱布过滤,将滤液调pH至7.0后, 于加热炉上煮沸10min,10000r/min离心10min,取上清液加入果胶体积1.5倍的95%乙醇沉淀2h,5000r/min离心10min后,将沉淀用75% 的乙醇洗涤两次,于鼓风干燥箱50℃烘干至含水量达到行业标准QB2482 - 2000 要求的8 %即得成品果胶。
2.如权利要求1所述的一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,其制备工艺是:用向日葵发酵培养基优化培养,优选的料液比为1:35-1:45。
3.如权利要求1所述的一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,其制备工艺是:以(NH42SO4和蛋白胨为优选的氮源,其添加量为1%。
4.如权利要求1所述的一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,其制备工艺是:酶反应温度为在40-50℃,pH值4.5-5.5。
5.如权利要求1所述的一种利用枝状枝孢霉菌生产原果胶酶制备向日葵花盘果胶的工艺,其制备工艺是:酶液反应时间5-7h。
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