CN105331669B - 利用工业化生产食用菌废弃菌渣发酵提取黄腐酸的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用工业化生产食用菌废弃菌渣发酵提取黄腐酸的新方法，包括如下步骤，(1)一级种子液的制备；(2)二级种子液制备；(3)将二级种子液枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌、分别接种到1000L‑2000L的发酵罐中，发酵10～15天，得发酵种子液；(4)平菇菌渣的处理(5)将发酵种子液接种到待接种平菇菌渣中，于20～40℃下通风发酵4‑5天，得发酵好的菌渣；(6)黄腐酸的提取(7)喷雾干燥，即得淡黄色的黄腐酸粉末。黄腐酸含量发酵后达到35％以上，经过提取可得到黄腐酸粗品30％(占干物质百分比)左右。

Description

利用工业化生产食用菌废弃菌渣发酵提取黄腐酸的新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及利用工业化生产食用菌的废弃菌渣提取黄腐酸的新方法。

背景技术

黄腐酸(Fulvic Acids，代号FA)主要是一类含活性官能团的大分子芳香-脂肪族羟基羧酸的复杂混合物。其具有分子量小、活性基因高、改良土壤、提高地温、促使根系发达，有效地调节土壤酸碱度、解决土壤板结等方面的独特功效。在气候干燥情况下，缩小作物气孔开张度，抗旱保收。其应用主要如下：

黄腐酸与其它无机化肥(如氮、磷、钾等)配合使用，能固氮、解磷、缓释钾，促使有效成份转化，尽快被作物吸收利用，提高各种有效成份利用率在80％以上。

黄腐酸在蔬菜上的应用：主要是防止蔬菜土壤重茬污染，重茬病菌感染；能有效地破坏土壤病菌繁殖；增强土壤团粒结构，促使作物根系发达，多生根，生新根，提高植株抗病能力，刺激蔬菜生长，增强作物光合作用，使蔬菜生长旺盛，提高单位面积产量，增加菜农收入。黄腐酸在果树上的应用：能促使果树根系发达，提高肥料利用率，提高坐果率，增强鲜果色泽，改善果实品质，收获后耐储存，防止根腐病，对果树的病棵、病枝有很好的调理作用。

国内外关于黄腐酸的研究比较多，前期主要侧重于从泥炭、风化煤、褐煤中进行提取。主要的提取方法有化学提取法(针对不同的原料选择相应的化学试剂进行提取)、化学氧化法、高温氧化法等。近些年随着生化黄腐酸的兴起，采用不同微生物对农作物废弃秸秆以及农产品和经济作物加工废料进行发酵和生物转化，使有机废弃物能够转化成黄腐酸以及其它能够被植物利用营养物质。

总的来说国内外对黄腐酸的提取以及黄腐酸对农作物的作用做了大量的工作，但是关于食用菌废弃物黄腐酸的提取，国内外还没出现相应的研究。目前国内工业化生产食用菌产量已经达到每年2000万吨以上，而作为废弃物食用菌菌渣则含有较高的腐殖酸、菌体多糖、氨基酸等活性物质，大部分企业采用直接丢弃或者以低廉的价格卖给发电厂等，没有形成对食用菌废弃物的环保、安全和高效的利用。

目前，我国工业化生产的食用菌菌渣产量巨大，然而如何对菌渣进行环保有效的处理，却一直没有得到很好的解决；每年大量的菌渣和废菌棒或就地堆置，或直接施入田中，不仅造成了农业有机资源的巨大浪费；而且造成杂菌繁殖、蝇虫滋生，破坏了周围生态环境，，，也给附近食用菌产业造成了巨大危胁。

因此，迫切需要提供一种简单、高效、处理时间短、适用范围广的食用菌菌渣回收利用方法。

发明内容：

针对上述问题，本发明利用工业化生产平菇、杏鲍菇、金针菇、白玉菇的废弃物菌渣为主要原料，辅助添加适当的碳源，根据食用菌菌渣分解原理、微生态平衡原理选择性能优良的有益菌种对菌渣进行再发酵，菌种之间互生互利，互不拮抗，发酵周期约1个月，使微生物能够充分分解菌渣里的纤维素等植物难以直接利用的物质，使其转化为植物能利用的营养物质。经测定其发酵后黄腐酸含量达到35％以上，经过提取可得到黄腐酸粗品30％(占干物质百分比)左右，使食用菌菌渣得到充分的利用。因此本发明对于国内食用菌废弃物黄腐酸的提取，具有重要经济和环境意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用工业化生产食用菌废弃菌渣提取黄腐酸的新方法，采用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌、对食用菌废弃菌渣进行混合发酵，从发酵后的菌渣中提取黄腐酸。

优选的是，所述食用菌为平菇、杏鲍菇、金针菇或白玉菇中的一种或多种。

上述方法包括如下步骤，

(1)取枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌、分别进行二级培养，得相应的二级种子液；

(2)将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、拟康氏木霉、的二级种子液分别接种到100L-1000L的发酵罐中，发酵28--48h，得相应的发酵种子液；

(3)菌渣的培养：称取菌渣、水、麸皮、糖，发酵种子液加入菌渣中，充分搅拌置于通风发酵池，于20～40℃下通风发酵4-5天，得菌渣培养物；

(4)黄腐酸的提取：取发酵好的菌渣加入摩尔浓度为0.1mol/L的NaOH溶液，于提取池中60～65℃处理6～7个小时，过滤，将滤液泵入沉淀池，然后用浓硫酸调至pH值为2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液，沉淀为棕黑腐殖酸；

(5)将上清液pH调至中性，喷雾干燥，即得淡黄色的黄腐酸粉末。

优选的是，步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌的接种量之比为5～6：5～6：8～9；

优选的是，步骤(3)中，所述湿菌渣、麸皮和糖的质量比为30-40：1-5：0.5-1；所述枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母菌：拟康氏木霉菌的接种量之比为1～2:1～3:1～2；

优选的是，步骤(6)中，所述发酵好的菌渣和NaOH溶液的质量比为1～5:5～30。

优选的是，步骤(1)中，所述的种子培养基为LB液体培养基或土豆汁液体培养基。

进一步地，所述的LB液体培养基的配制方法为：称取NaCL 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，分别加入1000ml水中，调节pH值为7.0，121～125℃灭菌20～25min；

所述的NaCL、蛋白胨、酵母提取物的质量比为：2～5：2～5：1。

优选的是，步骤(4)中，所述的待接种菌渣的水分含量为50％-70％。

本发明有益的效果是：

1.本发明主要利用微生物对菌渣进行发酵转化生产生化黄腐酸，使食用菌生产中的废料得到了很好的利用，并且进行了工业扩大，创造了相应的经济价值并且使资源得到了循环利用。

2.本发明的黄腐酸产量高达30％以上。最佳发酵时间为4-5天。喷雾干燥后黄腐酸粉经容量滴定法测定其含量达到85％-90％。

附图说明

图1本发明生产黄腐酸红外光谱图

图2市售生化黄腐酸红外光谱扫描图

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行进一步的阐述。应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：

1菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为中国微生物菌种保藏管理中心的编号为CGMCC1.210的菌株；枯草芽孢杆菌CGMCC1.210产α-淀粉酶活力很强。

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)为中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CMCC3.6612的菌株；产纤维素酶活力很高

热带假丝酵母(Candida tropicalis)为中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CMCC2.402的菌株；可同化五碳糖。

2具体方法

(1)培养基：枯草芽孢杆菌种子培养基：LB培养基；热带假丝酵母、拟康氏木霉种子培养基：PDA培养基；

(2)一级种子液的制备：将枯草芽孢杆菌、接种于LB培养基中32℃培养18h，热带假丝酵母和拟康氏木霉菌菌种分别接种于PDA中，30℃分别培养摇瓶培养32—48h作为种子液；

(3)二级种子制备：将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌一级液体菌种分别接种于50L-100L发酵罐中，发酵相应的时间作为二级种子液。

(4)将二级种子液枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌、分别按照5％、5％、8％、的接种量接种到1000L-2000L的发酵罐中，分别发酵相应的时间，后期泵入储罐短时间保存。

(5)菌渣的处理：分别称取湿菌渣40份，加入麸皮4份，糖1份，种子液按接种量为枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母：拟康氏木霉＝1:2:3接入处理好的平菇菌渣中。总接种量为2-3％，充分搅拌置于通风发酵池，32℃通风发酵4-5天，过程中注意保持水分在50％-70％。

(6)黄腐酸含量测定：采用容量滴定法。

(7)黄腐酸的提取方法：取发酵好的菌渣，按照菌渣和NaOH溶液的质量比为1:5～30的比例加入0.1mol/L的NaOH溶液，于提取池中60℃处理6个小时，过程中适当搅拌，板框过滤。将滤液泵入沉淀池，然后用浓硫酸调至PH2左右，静置1-3h，过滤，上清液即为黄腐酸溶液。沉淀为棕黑腐殖酸，可回收利用。将上清液PH调至中性，然后喷雾干燥既得相应的淡黄色的黄腐酸粉末。

(8)测定黄腐酸固体粉末中黄腐酸的百分比。

(9)取适量干燥的黄腐酸粉末进行氨基酸分析

(10)取适量干燥的黄腐酸粉末与市售的生化黄腐酸进行红外图谱对比

3.3经氨基酸分析仪测定其氨基酸含量如下表：

表1发酵前后17种游离氨基酸对比(mg/100g)

RT	氨基酸出峰时间	氨基酸	发酵前氨基酸	发酵后氨基酸
					1	5.047	Asp	15.849	85.339
2	5.807	Thr	32.359	66.152
					3	6.293	Ser	27.274	54.652
4	7.127	Glu	68.384	104.782
					5	9.96	Gly	42.153	98.02
6	10.727	Ala	52.289	60.002
					7		Cys	9.58	9.76
8	13.04	Val	25.329	46.246
					9	14.253	Met	12.328	30.617
10	16.473	Ile	26.317	29.384
					11	17.52	Leu	62.892	75.982
12	18.52	Tyr	22.359	28.736

13	19.633	Phe	25.728	42.277
					14	22.02	Lys	35.237	69.845
15	23.08	NH3	51.844	62.64
					16	24.087	His	18.478	23.056
17		Trp
					18	27.887	Arg	37.943	82.131
1	13.49	pro	44.68	66.378

由上表可见发酵后游离氨基酸含量得到显著提高。

3、结果与讨论

3.1通过实验发现，5中菌的接种比例为枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母：拟康氏木霉＝1-2:1-3:1-2时，黄腐酸产量最高，达到30％以上。最佳发酵时间为4-5天。

3.2喷雾干燥后黄腐酸粉经容量滴定法测定其含量达到85％-90％。

实施例2

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，所述食用菌为平菇。

实施例3

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，所述食用菌为杏鲍菇。

实施例4

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，所述食用菌为金针菇。

实施例5

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，所述食用菌为白玉菇。

实施例6

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，步骤(4)中将二级种子液枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌、拟康氏木霉菌、分别按照6％、6％、9％、的接种量接种到1000L-2000L的发酵罐中，分别发酵相应的时间，后期泵入储罐短时间保存。

实施例7

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，湿菌渣、麸皮和糖的质量比为30：1：0.5。

实施例8

处理步骤与实施例1相同，不同之处在于，湿菌渣、麸皮和糖的质量比为40：5：1。

实施例9

步骤(5)中，所述枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母菌：拟康氏木霉菌的接种量之比为1:1:1。

实施例10

步骤(5)中，所述枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母菌：拟康氏木霉菌的接种量之比为2:3:2。

实施例2-10中黄腐酸产量皆达到30％以上。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种利用工业化生产食用菌废弃菌渣发酵提取黄腐酸的方法，其特征在于，采用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、拟康氏木霉对食用菌废弃菌渣进行混合发酵，从发酵后的菌渣中提取黄腐酸；

具体包括如下步骤，

(1)取枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、拟康氏木霉分别进行二级培养，得相应的二级种子液；

(2)将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、拟康氏木霉的二级种子液分别接种到1000L-2000L的发酵罐中，发酵10～15天，得相应的发酵种子液；

(3)菌渣的处理：称取湿菌渣、麸皮、糖，混合发酵种子液充分搅拌后置于通风发酵池，于20～40℃下通风发酵4-5天，得发酵好的菌渣；

(4)黄腐酸的提取：取步骤(3)发酵好的菌渣加入摩尔浓度为0.1mol/L的NaOH溶液，于提取池中60～65℃处理6～7个小时，过滤，将滤液泵入沉淀池，然后用浓硫酸调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液，沉淀为棕黑腐殖酸；

(5)将上清液pH调至中性，喷雾干燥，即得淡黄色的黄腐酸粉末；

步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、拟康氏木霉的接种量之比为5～6：5～6：8～9；

步骤(3)中，所述湿菌渣、麸皮和糖的质量比为30-40：1-5：0.5-1；

步骤(3)中，所述混合发酵种子液中，枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母：拟康氏木霉的接种量之比为1～2:1～3:1～2；

步骤(3)中，所述湿菌渣接种后的水分含量为50％-70％；

步骤(4)中，所述发酵好的菌渣和NaOH溶液的质量比为1～5:5～30。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食用菌为平菇、杏鲍菇、金针菇或白玉菇中的一种或多种。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述枯草芽孢杆菌的培养基为LB培养基；所述热带假丝酵母和拟康氏木霉的培养基为PDA培养基。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的LB液体培养基的配制方法为：称取NaCL，蛋白胨，酵母提取物，分别加入水中，调节pH值为7.0，121～125℃灭菌20～25min，所述的NaCL、蛋白胨、酵母提取物的质量比为：2～5：2～5：1。