CN104974252A - 一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途，本发明提供了一种抗Her2抗体-小分子药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate或ADC），对传统的单克隆抗体进行偶联物修饰，选择较传统化学连接子（Linker）在体循环前更为稳定的不可切除化学连接子（Linker）。该偶联物较传统的化学治疗、放射性治疗具有更强的靶向性。较之传统的抗Her2单克隆抗体，提高了药效治愈窗口。并且在体循环中具有更好的稳定性，降低了药物进入肿瘤细胞前的毒性。本发明提供了该抗体-小分子药物偶联物的制备方法和用途。

Description

一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术与化学技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物。另外，本发明还涉及该抗体-小分子药物偶联物的制备方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据统计，全球每年约有120余万妇女患乳腺癌，50余万妇女死于乳腺癌，北美洲，西欧，北欧等发达国家乳腺癌发病率最高，非洲发病率最低。近年来，乳腺癌的发病在世界范围内呈明显上升趋势。无论在高发区还是低发区，乳腺癌发病率均以5-20%的速度上升。随着亚洲国家生活水平的提高，亚洲乳腺癌发病的增长趋势已明显高于欧美国家，成为上升幅度最大的地区之一。尽管我国与其他国家和地区相比较，尚属于乳腺癌低发地区，但是乳腺癌的发病率也处于上升阶段。在我国，乳腺癌在一些城市已发展为女性恶性肿瘤发病的首位，上海1972-1974年女性乳腺癌的发病率为18.3/10万，1987-1989年为25.1/10万，增长37.6%，年增长2.3%。据专家预测，2000年上海女性乳腺癌发病率将达28.8/10万，占女性恶性肿瘤的首位。

HER2(人表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor2)受体是分子量为185kD,具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，配体与HER2受体结合后，使HER2受体自身磷酸化并激活其酪氨酸激酶活性，从而促进细胞增殖。正常人中有一定的HER2受体自身磷酸化并激活其酪氨酸激酶活性，从而促进细胞增殖。正常人中有一定的HER2基因的表达，但其过度表达就可导致细胞过度增殖和表型恶化转化，也就形成了肿瘤。HER2过度表达的乳腺癌特点表现为病情进展迅速，化疗缓慢短期，对三苯氧胺易产生耐药，无病生存率和总生存率低于HER2阴性的乳腺癌。

随着人源化抗体技术的出现和发展，为这种针对HER2受体的单抗免疫治疗过渡到临床提供了可能。近些年来，已经有了商品化的抗HER2单克隆抗体Herceptin（Genetech公司）。

尽管相比传统的化学药物而言,抗体药物对抗原活性细胞有专属的选择性，能够降低脱靶毒性和较长的药物半衰期。然而，目前只有13种治疗性癌症的抗体推向市场。也表明了对于识别影响肿瘤生长靶点以及找到具有临床效果的抗体非常困难。

抗体-小分子药物偶联物（ADC）是一种新颖的靶向性治疗药物方法，将抗体片段和毒素、毒性药物以及放射性物质偶联被视为一种选择性杀死肿瘤细胞的一个非常重要的途径。这种药物通过抗体与细胞表面的抗原识别，通过内吞作用进入胞质内，一般由于细胞内独特的生理化学环境下，激发抗体释放小分子成分，从而达到靶向治疗的作用。这极大程度上提高了抗癌药物的靶向性，同时又增加了抗体药物的治疗窗口。在2014年基因泰克推出了针对Her2位点的ADC药物Kadcyla。

然而，抗体-小分子药物偶联的理念并不是最近才提出的，早在上世纪70年代，在动物模型中使用ADC药物已经在文献中被描述。在上世纪80年代，使用鼠源抗体药物偶联物被首次进行临床试验。直到2000年第一款ADC药物美罗塔，由抗-CD33的抗体与卡奇霉素（一种对DNA有高度毒性的）化合物进行偶联得到，在美国批准上市用于治疗急性粒细胞血癌。由于担忧药品潜在的安全性以及未能有效的证明治疗作用，辉瑞公司于2010年将该药物召回。

抗体-小分子偶联中，小分子部分主要由化学毒素（Payload）以及化学连接子（Linker）组成。

目前，在ADC治疗中比较常见的化学毒素主要针对细血管长丝，DNA，RNA的结构。然而并不是所有属于这三类的化学毒素能够在ADC药物的应用中取得成功，目前较为常见的此类化学毒素为美登素类（Maytansinoids），奥利斯他汀类（auristatins），紫杉醇类（taxol derivatives），卡奇霉素类（Calicheamicins），CC-1069类似物，多卡米星类（duocarmycins），鹅膏蕈碱类（Amanitins）。其中美登素类化合物首次由S.Morris Kupchan小组在Maytenusserrata的灌木中发现（Journal of the American ChemicalSociety197294(4),1354-1356）。此外，某些微生物同样可以产生包括美登醇在内的美登素类似物（U.S.Pat.No.4,151,042）。具有不同细胞毒性的美登醇的各种类似物可由化学制备（for review seeChem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004)）。美登素类的化合物还包括DM1，DM3，DM4均在ADC的药物中有广泛的应用。目前已报道美登素具有极强的抗癌性和细胞毒性，比传统的化疗药物毒性要强100-1000倍。其结构ADC方面应用的相关专利，最早于ImmunoGen Inc公司获得（U.S.Pat.No.5,208,020）。

化学连接子，对ADC药物的体内代谢的稳定性，药物活性，也起到了非常重要的作用。目前国内外公认的化学连接键使用腙键，二硫键等可切除键以及硫醚键等不可切除化学键。在第一代ADC药物美罗塔中，使用了二硫键以及腙键这两个可切除二硫键连接抗体与卡奇霉素。由于其不稳定的化学键以及有限的治疗效果，已于2010年由辉瑞公司召回。在第二代ADC药物，Kadcyla利用了不可切除的硫醚键，具有良好的活性和较低的生物学毒性。然而，由于硫醚键的体内氧化作用，化学键仍有可能在血液循环中断裂，FDA特别指出了其具有较强的肝毒性。

发明内容

本发明的目的是提供一种新颖的可特异性结合Her2受体的单克隆抗体-小分子药物偶联物及其制备工艺，其中小分子药物与抗体通过酰胺键连接。

本发明公开的抗体-小分子药物偶联物，具有式1-a的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，

R1为-OH或者-SH，

R2为-CH3，-CH2OH或-CH2OC(=O)R9，

R3为H、OH、OC(=O)R9和OR9基团，

R4为氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(=O)R9，

R5为H或C1-C6烷基，

R6为氢或氨基酸侧链，

R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C6环烷基，氨基酸侧链，

R8为氢、氨基酸侧链或者-SO3H，

X1为O，S，亚胺基，

X2为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接，

Ab为抗HER2人源化单克隆抗体，

p为小分子药物与抗体的比例，为1,2,3,4,5,6。

上述抗体-小分子药物偶联物式1-a中包含式1-a-i，为美登素衍生物部分，

其中，

R¹为-OH或者-SH，

R²为-CH₃，-CH₂OH或-CH₂OC(=O)R⁹，

R³为H、OH、OC(=O)R⁹和OR⁹基团，

R⁴为氢、C_1-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和C(=O)R⁹，

R⁵为H或C₁-C₆烷基，

R⁶为氢或氨基酸侧链，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

上述抗体-小分子药物偶联物式1-a中还包含了式1-a-ii，为化学连接子部分，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

本发明还公开了一种具有化学连接子的美登素类衍生物小分子药物的化学前体，其结构为，

其中，

R¹为-OH或者-SH，

R²为-CH₃，-CH₂OH或-CH₂OC(=O)R⁹，

R³为H、OH、OC(=O)R⁹和OR⁹基团，

R⁴为氢、C_1-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和C(=O)R⁹，

R⁵为H或C₁-C₆烷基，

R⁶为氢或氨基酸侧链，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基，

Y¹为符合式1-y-iii或者式1-y-iv的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

R¹¹为卤素，活性酯类化合物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

本发明公开了一种新颖的化学连接子，其结构为式1-a-ii，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

本发明公开的抗体-小分子药物偶联物，抗体与小分子药物是通过酰胺键连接的，与已上市药物Kadcyla利用的硫醚键连接不同。本发明公开的化学连接子改善了以往小分子连接子的疏水性结构，使得抗体在常规的制剂环境下更难以产生聚合作用。并且通过体内抑瘤实验和毒性研究对比实验，本发明的抗体-小分子药物偶联物均具有良好的抑瘤活性和较低的生物学毒性，并且均优于Kadcyla，因此具有良好的医药用途前景。

本发明还公开了一种化学连接子的化学前体药物，其结构为，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

R¹²为卤素，活性酯类化合物，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基，

Y¹为符合式1-y-iii或者式1-y-iv的下列结构，

其中，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

R¹¹为卤素，活性酯类化合物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

进一步的，本发明公开了一些化学连接子的化学前体药物，其结构为，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

R¹⁰为卤素，活性酯衍生物，

R¹¹为卤素，活性酯衍生物。

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8。

进一步的，本发明还公开了具有式1-b的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，p为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，优选平均值为3.5，Ab为抗Her2人源化单克隆抗体。

进一步的，本发明还公开了具有式1-c的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，p为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，优选平均值为3.5，Ab为抗Her2人源化单克隆抗体。

多种抗HER2抗体是现有技术中已知的。优选地，此类抗体是单克隆抗体。它们可以是所谓的嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。它们可以是全长抗HER2抗体；具有相同生物学活性的抗HER2抗体片段；包括此类抗体或片段的氨基酸序列变体和/或糖基化变体。人源化抗HER2抗体的例子以INN名称曲妥珠单抗和帕妥珠单抗已知。具有各种特性的其它HER2抗体已经记载于Tagliabue等，Int.J.Cancer，47：933-937(1991)；McKenzie等，Oncogene，4：543-548(1989)；Cancer Res.，51：5361-5369(1991)；Bacus等，MolecularCarcinogenesis，3：350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)，88：8691-8695(1991)；Bacus等，Cancer Research，52：2580-2589(1992)；Xu等，Int.J.Cancer，53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等，Cancer Research，52：2771-2776(1992)；Hancock等，Cancer Res.，51：4575-4580(1991)；Shawver等，CancerRes.，54：1367-1373(1994)；Arteaga等，Cancer Res.，54：3758-3765(1994)；Harwerth等，J.Biol.Chem.，267：15160-15167(1992)；美国专利No.5,783,186；及Klapper等，Oncogene，14：2099-2109(1997)。最成功的治疗性抗HER2抗体是由Genentech Inc.和F.Hoffmann-La Roche Ltd以商品名HERCEPTIN出售的曲妥珠单抗。关于HER2抗原及针对其的抗体的更多详情记载于许多专利和非专利出版物(关于合适的概述，见美国专利No.5,821,337，No.6,407,213和WO2006/044908)。中国专利01132225.X记载了一种人源化抗HER2单克隆抗体及其制法和药物组合物。

本发明还公开了一种抗体-小分子药物偶联物的制备方法，具体包括如下步骤，

1、制备抗体，

2、将美登素类衍生物化学前体与化学连接子前体进行合成，并修饰成为适合抗体偶联的小分子药物，

3、将步骤1获得的抗体与步骤2获得的小分子药物进行偶联反应，合成抗体-小分子药物偶联物。

进一步的，本发明还公开了一种新颖的抗体-小分子药物偶联工艺，偶联工艺包括如下步骤，

a，抗体置换缓冲溶液

使用的抗Her2抗体原液置换至缓冲溶液中，得置换后的抗体。置换后的抗体浓度为20-30mg/ml。

b，制备美登素-化学连接子小分子药物母液

使用化学合成方法将美登素与化学连接子进行连接，得到小分子药物，使用色谱柱纯化后，将其溶解于有机溶剂，使其浓度为10mg/ml。

c，偶联反应

以小分子药物与抗体为5:1的比例，将置换后的抗体与小分子药物混合，温度为20-30℃。反应时间为1-4小时。最终将反应液在G-25的缓冲液进行过柱。

本发明的a步骤的液体缓冲溶液优选磷酸钾-NaCl，磷酸钠-NaCl缓冲溶液，pH4.0-7.5。

本发明的b步骤的有机溶剂优选二甲基乙酰胺（DMA），二甲基甲酰胺（DMF），乙醇。

本发明还公开了这种抗体-小分子药物偶联物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途，这些肿瘤以过度表达HER2受体为特征，尤其是癌症，所述癌症选自乳腺癌，胃癌，卵巢癌，结直肠癌或者胰腺癌。HER2过表达与一些癌症的发生、发展以及预后等密切相关已被许多研究所证实，如《肿瘤防治研究》2008年3月35卷13期公开了HER2过度表达预后相关因素研究；《中国医药导报》2013年第2期公开了HER2蛋白在卵巢上皮性癌中的表达状态及其临床病理意义；《现代肿瘤医学》2013年第2期公开了肿瘤分子靶向治疗疗效预测因子的研究进展；：《世界华人消化杂志》2013年第36期公开了胃癌HER2检测的进展等等。

本发明公开了一种美登素衍生物及其与抗Her2人源化单克隆抗体偶联生成的抗体-小分子药物偶联物。由于该偶联物使用了不可切除的新颖的化学连接子，使得偶联物的体循环稳定性大大增强。

本文中所用的术语“单克隆抗体（单抗）”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。

本发明中的“化合物”指小分子药物化合物以及其化学偶联物，包括其化学对映异构体与非对映异构体。

本发明使用的“抗体-小分子药物偶联药物（Antibody-Drug Conjugate或ADC）”主要由单克隆抗体，化学毒素，连接子组成。

本发明使用的“化学毒素”（Payload）泛指ADC药物中使用到的药物小分子，特指美登素类（Maytansinoids），奥利斯他汀类（auristatins），紫杉醇类（taxol derivatives），卡奇霉素类（Calicheamicins），CC-1069类似物，多卡米星类（duocarmycins），鹅膏蕈碱类（Amanitins）化合物及其衍生物。

本发明中涉及到的“连接子（Linker）”泛指在ADC药物中通过化学键连接化学毒素与单克隆抗体药物的化合物。

本发明中涉及到的“美登素类衍生物”，或者美登素，指包括具有美登素结构骨架的化合物及其前体，包括其立体异构体。本发明中使用的“小分子药物”指具有化学活性的小分子化合物，本文中特指具有“美登素类衍生物-化学连接子”化合物及其药物前体。

本发明中“化合物前体”及“药物前体”特指能够合成获得该化合物或药物的前体原料。

本发明中使用的“烷基”即饱和烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，同时也是最简单的一种有机化合物。包括甲基（CH₃-），乙基（C₂H₅-）等直链以及支链烷烃化合物。也包括具有3元环，4元环，5元环，6元环等常见的环烷烃类化合物。

本发明中使用的“烯烃”是指含有C=C键（碳-碳双键）（烯键）的碳氢化合物及其化学衍生基团。属于不饱和烃，分为链烯烃与环烯烃。按含双键的多少分别称单烯烃、二烯烃等化合物。

本发明中使用的“炔烃”是一类有机化合物，属于不饱和脂肪烃,其官能团为碳-碳三键（C三键）结构的化合物及其衍生基团。通式C_nH_2n-2(其中n为非1正整数)可代表炔烃。乙炔。简单的炔烃化合物有乙炔(C₂H₂)，丙炔(C₃H₄)等。

本发明中使用的“氨基”或“胺基”其中氨基是有机化学中的基本碱基，所有含有氨基的有机物都有一定碱的特性，由一个氮原子和两个氢原子组成，化学式-NH2。如氨基酸就含有氨基，有一定碱的特性。氨基是一个活性大、易被氧化的基团。胺基是氨的氢原子被烃基代替后的有机化合物。氨分子中的一个、两个或三个氢原子被烷基取代而生成的化合物，分别称为第一胺（伯胺）、第二胺（仲胺）和第三胺（叔胺）。它们的通式为：RNH₂——伯胺、R₂NH、胺仲胺、R₃N胺、叔胺。胺类广泛存在于生物界，具有极重要的生理作用。

本发明中使用的“氨基酸”是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基连在α含碳上的为α上氨基酸。组成蛋白质的氨基酸均为α基氨基酸。

本发明中使用“芳基”是指任何从简单芳香环衍生出的官能团或取代基。虽然更特殊的名称如苯基，被用来描述未被取代的芳基，但出于概括和简练的原因芳基仍然被使用。最简单的芳基是苯基，由苯衍生而来。芳烃分子的芳核碳上去掉一个氢原子后，剩下一价基团的总称，通常用Ar通表示。例如：苯基、邻甲苯基、1-萘基(或αα萘基)、2-萘基等，都属于此类。

本发明中使用的“羰基”是由碳和氧两种原子通过双键连接而成的有机官能团（C=O)。是醛，酮，羧酸，羧酸衍生物等官能团的组成部分。

本发明中使用的“羧基”是指有机化学中的基本酸基，所有的有机酸都可以叫羧酸，由一个碳原子、两个氧原子和一个氢原子组成，化学式-COOH。如醋酸（CH3COOH）、柠檬酸都含有羧基，这些羧基与烃基直接连接的化合物，叫作羧酸。

本发明中使用的“羧酸”是指含有羧基的有机化合物衍生物。

本发明中使用的“氰基”是指-CN基团。

本发明中使用的“卤素”或者“卤原子”是指包括氟（F）、氯（Cl）、溴（Br）、碘（I）、砹（At）的原子。

本发明中使用的“硝基”是指-NO₂。

本发明中使用的“巯基”是指-SH。

本发明使用的“发明使用的指的是（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）。是一种酰胺合成中使用的活化剂。

本发明使用的“发明使用指的是二环己基碳二亚胺，是一个常用的失水剂，在多肽合成中具有广泛的应用。

本发明使用的“发明使用：中文名：4-二甲氨基吡啶，是一种超强亲核的酰化作用催化剂。

本发明中使用的“发明中使指的是二氯甲烷溶剂。

本发明中使用的“HOBT”指的是4-二甲氨基吡啶。

本发明中使用的“发明中使用指的是氢氧化锂。

本发明中使用的“发明中使指的是小分子药物-抗体药物偶联率，指的是一个抗体连接多少个小分子药物。一般DAR值指的是连接药物的平均值。

本发明中使用的“聚体”指的是单克隆抗体由于不稳定产生的二聚以及三聚等等这类现象。

附图说明：

图1，抗体-小分子药物偶联物的SEC-HPLC图谱

图2，抗Her2抗体-小分子药物偶联物对细胞系SK-BR-3增殖的抑制作用

图3，抗Her2抗体-小分子药物偶联物对细胞系A549增殖的作用

图4，抗Her2抗体-小分子药物偶联物对裸鼠肿瘤体积的抑制情况

图5，抗Her2抗体-小分子药物偶联物对大鼠体重的影响

具体实施方式：

本实施例涉及到小分子合成反应均为行业内公认的经典有机合成反应，请参照闻韧编著的《药物合成反应》以及荣国斌编译的《有机人名反应及机理》。其中关于ADC药物的合成主要参考Zhao RY等人发表的Synthesis andevaluation of hydrophilic linkers for antibody maytansinoid conjugates.J Med Chem54:3606–3623。其他相关化合物的合成路线与方法，均与下文中所述的实施例方法基本一致。

实施例1，抗Her2单克隆抗体的制备。

本实施例的抗Her2抗体主要根据美国专利No.5,821,337中所记载的方法和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)的序列进行制备。

实施例2，化合物2-a缩合生成2-b。

分别称取EDCI（360mg，1.88mmol）、HOBT（254.34mg，1.88mmol）溶解于50ml DCM中，冰水浴搅拌。随后加入如上式所述3-a(914mg,2.30mmol)，低温搅拌15分钟，加入溶解于DCM的化合物2-a（976mg，1.53mmol）。反应逐步升至室温，反应两小时后，使用TLC板进行监控,使用甲醇:DCM(1:20)比例色谱柱分离。得到所需要的产品2-b752mg(收率48.2%)。LC-MS（M+Na⁺）计算值1037.41，实测值1037.38。

实施例3，化合物2-b单水解生成2-c。

称取2-b500mg（492umol），溶解于1ml的乙醇溶液中，逐滴加入LiOH水溶液10ml（含有14.15mg的LiOH）。反应持续10分钟。使用乙醚直接萃取1次。取下层水溶液，调节pH至3，使用乙醚萃取水相。合并有机相使用无水硫酸钠干燥后，使用EA:PE(1：4)比例进行色谱柱分离。得到所需产物2-c215mg。直接进行下一步反应。LC-MS(M+Na⁺)。计算值为1009.38，实测值1009.39。

实施例4，化合物2-c与NHS（N-羟基琥珀酸亚胺）酯化反应2-d。

称取200mg2-c（202.53mmol）溶解于10ml的无水甲苯中，氮气保护，加入233mg的NHS（2.03mol）。逐滴加入200ul浓硫酸。加热回流20min。冷却后，水洗3次，并使用饱和碳酸钠洗涤一次，使用甲苯萃取，无水硫酸钠干燥后使用甲醇：DCM(1:20)比例进行色谱柱分离。得到所需产品2-d165mg。LC-MS（M+H⁺）。计算值为1084.42，实测值为1084.41。

实施例5，化合物2-d与抗体药物偶联生成1-c。

使用的抗Her2的抗体换液至溶液A(50mM磷酸钾，50mM NaCl和2mM EDTA，pH为6.5)，稀释至2.5mg/mL。加入化合物2-d，使2-d与抗体的比例为7:1（摩尔当量）。然后，加入DMA至总体积的15%。温室搅拌3小时使反应物混匀。用1/10反应液体积（100ul）的1M乙酸溶液终止反应，pH为4.5。多余的未反应的或水解的试剂和过量的1-c使用事先准备的G-25在pH值7.4的磷酸缓冲液（水溶液）平衡的凝胶柱过滤柱。在280nm紫外检测下用20mM琥珀酸溶液洗脱，并收集第一个被洗脱出来的蛋白质峰，得到产物1-c。

实施例6，抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-c的DAR值计算。

用Nano Drop测定收集到的1-c在280nm和252nm处的OD值，使用如下计算公式计算：

C_DM1(M)=(A₂₈₀*ε³⁰² _252nm-A₂₅₂*ε³⁰² _280nm)/(ε^DM1 _280nm*ε³⁰² _252nm-ε^DM1 _252nm*ε³⁰² _280nm)

C₃₀₂(M)=(A₂₈₀*ε^DM1 _252nm-A₂₅₂*ε^DM1 _280nm)/(ε³⁰² _280nm*ε^DM1 _252nm-ε³⁰² _252nm*ε^DM1 _280nm)

DAR=C_DM1/C₃₀₂=0.06457*（A₂₅₂-0.35*A₂₈₀）/(47*A₂₅₂-A₂₈₀)

C_DM1(mg/ml)=C_DM1(M)*Mw_DM1*稀释倍数

C₃₀₂(mg/ml)=C_Ab(M)*Mw₃₀₂*稀释倍数

其中：ε³⁰² _280nm=215380，ε³⁰² _252nm=79194，ε^DM1 _280nm=5700，ε^DM1 _252nm=26790

Mw_DM1=738，Mw₃₀₂=145163

计算得到抗体药物偶联的浓度和小分子药物与抗体比(DAR)值为3.5。

DAR值3.5为业内认可的较为理想的小分子药物-抗体连接比率，该比率具有良好的药效并且不易改变原抗体的疏水性质。

实施例7，抗体-小分子药物偶联物1-b的制备

原料为实施例2中的2-a与化合物3-b（结构如下），实验条件和制备方法与实施例2-实施例6中相同，最终得到抗体-小分子药物偶联物1-b，DAR值为3.5,。

实施例8，抗体-小分子药物偶联物1-c的聚体量的计算。

使用Agilent1290HPLC对抗体-小分子偶联药物1-c使用TSKgel G3000SWXL7.8×300mm分子排阻色谱柱对聚体量进行检测，流动相为0.2M磷酸钠-氯化钠缓冲溶液，pH6.8。流速为0.5ml/min，柱温为25℃。测得聚体的含量为5.6%。见图1。

实施例9，抗Her2抗体-小分子药物偶联物的体外抗肿瘤特性。

我们采用HER2阳性乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3和HER2阴性细胞系A549（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞中心）评价了抗Her2抗体-小分子药物偶联物对肿瘤细胞的抑制作用，具体研究过程如下：采用胰蛋白酶（0.25%，V/V）消化SK-BR-3和A549，使细胞剥离，之后悬浮于100μL完全培养基中，取10,000个细胞接种于96孔板进行培养，37℃过夜贴壁生长，再加入100μL含有不同浓度的抗Her2抗体和抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-b的培养基。72h后，用PBS（pH7.5）洗板两次，用CCK-8试剂盒（活细胞计数试剂盒，YEASEN）分析相对细胞增殖。

研究结果表明：抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-c相对抗Her2抗体能更有效地抑制Her2阳性细胞系SK-BR-3的增殖（图2）。而无论是裸抗抗Her2抗体，还是抗Her2抗体偶联物1-c对Her2表达阴性的A549细胞没有生长抑制作用（图3）。

实施例10，抗Her2抗体偶联物的体内抗肿瘤特性。

抗Her2抗体偶联物的体内抗乳腺癌特性是通过对Her2表达阳性的人BT474肿瘤细胞在裸鼠体内的生长抑制效果来评价的，具体研究过程如下：BT474细胞（ATCC,HTB-20^TM）生长于含10%的胎牛血清和添加有2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。收集BT474细胞重悬于PBS，使100μL体积含有6×10⁷细胞，取9周龄的雌性裸鼠，在其右腋注射200μL上述细胞悬液。当肿瘤体积达到180～240mm³时开始分组给药，每组10只。抗Her2抗体偶联物1-c和抗Her2抗体分别按每公斤体重5、15mg抗体量的剂量，每三周一次，共给药3次；对照抗体（Kadayla^周一R，LotN0001B11）按每公斤体重15mg抗体量的剂量，每三周一次，共给药3次。给药方式为静脉注射，注射体积为每次100μL。肿瘤体积每周测定两次，最后一次给药继续观察一周并测定肿瘤体积大小后（第一次给药49天后），动物被立即以过量麻醉致死。

研究结果表明：在同等剂量下，抗Her2抗体偶联物1-c比抗Her2抗体更能够抑制肿瘤细胞的生长；与对照抗体相比，抗Her2抗体偶联物1-c抑制肿瘤细胞生长的作用更强，至第7天，抗Her2抗体偶联物1-c15mg/kg剂量下已检测不到肿瘤（图4）。

实施例11，抗Her2抗体-小分子药物偶联物急性毒性研究

抗Her2抗体-小分子药物偶联物的急性毒性的研究主要通过考察大鼠给药后身体状态和生化指标水平的变化评价的，具体研究过程如下：取健康的Wister雌性大鼠40只（购自中国科学院上海实验动物中心），鼠龄为出生后4周，体重180～220g，分为4组，每组10只。按常规饲养一周后，开始实验。两种抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-b，1-c和对照抗体（Kadayla^后，R，LotN0001B11）分别按每公斤体重60mg抗体量的剂量，以给予空白溶剂的大鼠作为正常对照，经尾静脉缓慢注射，单次给药，每天按时记录大鼠的体重，并于第5天取血进行血生化检测，检测项目包括：AST、ALT、TBIL和GGT，实验开展至第10天，动物被以过量麻醉致死，期间观察大鼠是否有死亡的情况。

大鼠急性毒性的结果表明：相比与正常对照组的大鼠，两种抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-b，1-c和对照抗体对大鼠肝功能有不同程度的损伤，表现为：其AST、ALT、TBIL、GGT指标相比正常对照组较高。但相比而言，两种抗Her2抗体偶联物1-b，1-c的AST、ALT、TBIL、GGT指标低于对照抗体，表明1-b，1-c对肝功能的损伤程度低于对照抗体（表1）；此外，对照抗体给药后大鼠的死亡率为20%，而其中一种抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-b给药后大鼠死亡率为10%（图5），1-c给药后大鼠未发生死亡与正常对照组大鼠相当，可见两种抗Her2抗体-小分子药物偶联物相比对照抗体毒性较低。

表1各组大鼠生存情况和肝功能变化比较

Claims (12)

1.一种抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式1-a的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，

R¹为-OH或者-SH，

R²为-CH₃，-CH₂OH或-CH₂OC(=O)R⁹，

R³为H、OH、OC(=O)R⁹和OR⁹基团，

R⁴为氢、C_1-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和C(=O)R⁹，

R⁵为H或C₁-C₆烷基，

R⁶为氢或氨基酸侧链，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接，

Ab为抗HER2人源化单克隆抗体，

p为小分子药物与抗体的比例，为1,2,3,4,5,6。

2.根据权利要求1中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于式1-a中包含式1-a-i为美登素衍生物部分，

其中，

R¹为-OH或者-SH，

R²为-CH₃，-CH₂OH或-CH₂OC(=O)R⁹，

R³为H、OH、OC(=O)R⁹和OR⁹基团，

R⁴为氢、C_1-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和C(=O)R⁹，

R⁵为H或C₁-C₆烷基，

R⁶为氢或氨基酸侧链，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

3.根据权利要求1中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于式1-a中包含式1-a-ii为化学连接子部分，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

4.一种具有化学连接子的美登素类衍生物小分子药物的化学前体，其结构为

其中，

R¹为-OH或者-SH，

R²为-CH₃，-CH₂OH或-CH₂OC(=O)R⁹，

R³为H、OH、OC(=O)R⁹和OR⁹基团，

R⁴为氢、C_1-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和C(=O)R⁹，

R⁵为H或C₁-C₆烷基，

R⁶为氢或氨基酸侧链，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基，

Y¹为符合式1-y-iii或者式1-y-iv的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

R¹¹为卤素，活性酯类化合物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

5.一种化学连接子的化学前体药物，其结构为，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢、氨基酸侧链或者-SO₃H，

R¹²为卤素，活性酯类化合物，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基，

Y¹为符合式1-y-iii或者式1-y-iv的下列结构，

其中，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

R¹¹为卤素，活性酯类化合物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

6.一种化学连接子，其结构为式1-a-ii，

其中，

R⁷为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链，

R⁸为氢，甲基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，氨基酸侧链或者-SO₃H，

X¹为O，S，亚胺基，

X²为O，S，亚胺基，或无取代基团，

Y为符合式1-y-i或者式1-y-ii的下列结构，

R¹⁰为亚甲基，C₃-C₆环烷基，苯基及其衍生物，

n为0,1,2,3,4,5,6,7,8，

其中波浪线表示与相邻结构共价连接。

7.根据权利要求1-3中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式1-b的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，p为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，Ab为抗Her2人源化单克隆抗体。

8.根据权利要求1-3中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式1-c的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，

其中，p为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，Ab为抗Her2人源化单克隆抗体。

9.根据权利要求7-8中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于抗Her2人源化单克隆抗体为曲妥珠单抗。

10.一种抗体-小分子药物偶联物的制备方法，具体包括如下步骤，

a，制备抗体，

b，将美登素衍生物化学前体与权利要求5所述的化学连接子前体进行合成，并修饰成为适合抗体偶联的小分子药物，

c，将步骤a获得的抗体与步骤b获得的小分子药物进行偶联反应，合成抗体-小分子药物偶联物。

11.一种抗体-小分子药物偶联物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途，其特征在于肿瘤过度表达Her2受体。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于肿瘤是癌症，所述癌症选自乳腺癌，胃癌，卵巢癌，结直肠癌或者胰腺癌。