CN104971081A - 一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，首先取干燥的大青叶粉末与体积分数为55～95％的甲醇溶液混合，大青叶粉末和甲醇溶液的料液比为1g：(10～50)mL，然后进行超声辅助提取，得到靛蓝和靛玉红的总提取液。本发明以大青叶为原料，应用超声辅助提取法，能在短时间内使大青叶的细胞破碎，释放出细胞中的靛蓝和靛玉红，体积分数为55～95％的甲醇溶液以及与大青叶的料液比利于靛蓝和靛玉红的充分溶出和扩散，同时能够保证超声波的穿透能力，传质效率高，产生协同效应，从而有效提高靛蓝和靛玉红的提取效率。本发明提取效率高、能耗低、操作简便，具有良好的开发应用前景。

Description

一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法

【技术领域】

本发明涉及化学提取领域，尤其涉及一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法。

【背景技术】

大青叶属常用的叶类中药，是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶，性大寒、味苦；具有凉血消斑、利咽止痛、清热解毒之功效，所含化学成分主要包括色氨酸、棕榈酸、靛蓝、靛玉红、腺甙、色胺酮、β-谷甾醇、γ-谷甾醇等，临床上主要用于治疗流行性乙型脑炎、上呼吸道感染、流行性感冒等病毒性、感染性疾病。随着大青叶有效成分及药理活性的逐步明确，其临床应用也日益受到重视。靛蓝和靛玉红是大青叶的主要活性成分，具有抗菌、保肝等活性，而靛玉红对于慢性粒细胞白血病也具有较好的疗效。

索氏提取是用溶剂将植物药材长期浸润而将所需要的物质浸出来的一种提取方法，此法花费时间长、溶剂用量大、效率不高。

响应面法(RSM)的原理是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，寻求最优工艺参数，解决多变量优化问题。响应面法的最大优点在于试验次数少、预测性好、精度高。该法已广泛地应用于生物、食品、化学等领域。目前，利用响应面法来优化大青叶中靛蓝和靛玉红的超声辅助提取工艺尚未见报道。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种提取效率高的超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

首先取干燥的大青叶粉末与体积分数为55～95％的甲醇溶液混合，大青叶粉末和甲醇溶液的料液比为1g：(10～50)mL，然后进行超声辅助提取，得到靛蓝和靛玉红的总提取液，总提取液过滤后浓缩至干，得到提取物靛蓝和靛玉红。

进一步地，所述的大青叶粉末是通过大青叶在40～60℃的恒温干燥箱中处理至恒重，然后粉碎并过20～60目筛得到的。

进一步地，超声功率为400～600W。

进一步地，提取的温度为20～60℃。

进一步地，提取的时间为15～55min。

进一步地，大青叶粉末和体积分数为80％的甲醇溶液按料液比为1g：34mL进行混合，在41℃超声辅助提取25min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以大青叶为原料，应用超声辅助提取法制备靛蓝和靛玉红，超声波能在短时间内使大青叶的细胞破碎，释放出细胞中的有效成分靛蓝和靛玉红，提取用时短；同时，本发明通过采用体积分数为55～95％的甲醇溶液，与靛蓝和靛玉红极性相近，利于靛蓝和靛玉红的充分溶出，同时能够避免醇溶性杂质的溶出量增加；本发明大青叶粉末和甲醇溶液通过采用1g：(10～50)mL的料液比，在超声波使大青叶细胞破裂，使得有效成分不断溶出时，利于靛蓝和靛玉红的扩散，同时能够保证超声波的穿透能力，传质效率高，产生协同效应，从而有效提高靛蓝和靛玉红的提取效率，验证结果表明，本发明制备得到的靛蓝和靛玉红的最大提取效率分别为112.72％和116.42％，其综合评分为101.87，与综合评分理论值(99.25)基本吻合，提取效率高、能耗低，且操作简便，具有安全、简单、快速等优点，能够有效提高大青叶靛蓝和靛玉红的利用率，具有良好的开发应用前景，为合理有效地利用菘蓝资源提供了依据。

进一步，本发明中通过在20～60℃下进行提取，此时分子运动速率较快，有利于细胞内靛蓝和靛玉红的溶出，同时能够保证靛蓝和靛玉红的化学结构完整性，而且还能避免溶剂甲醇挥发。

【附图说明】

图1为靛蓝标准工作曲线图；

图2为靛玉红标准工作曲线图；

图3为甲醇浓度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；

图4为提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；

图5为料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；

图6为提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；

图7(a)为甲醇浓度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图7(b)为甲醇浓度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图；

图8(a)为甲醇浓度和料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图8(b)为甲醇浓度和料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图；

图9(a)为甲醇浓度和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图9(b)为甲醇浓度和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图；

图10(a)为料液比和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图10(b)为料液比和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图；

图11(a)为料液比和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图11(b)为料液比和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图；

图12(a)为提取温度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的响应面图，图12(b)为提取温度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的等高线图。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一、材料与试剂

大青叶(购自陕西省道地中药材有限公司)，经西北濒危药材资源开发国家工程实验室鉴定为十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶；

靛蓝和靛玉红标准品(购自中国药品生物制品检定所，≧99.9％)；

甲醇、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯。

二、仪器设备

手提式粉碎机(温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-50)；分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BSA1245)；SHB-HIA循环水式多用真空泵(陕西太康生物科技有限公司)；超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12DTD)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；LC-2010A HT高效液相色谱仪(日本SHIMADZU)

三、靛蓝和靛玉红的提取步骤

(1)大青叶的处理

将大青叶在40～60℃的恒温干燥箱中处理12h至恒重，粉碎并过20～40目筛，得到大青叶粉末；

(2)提取

将步骤(1)处理好的大青叶粉末与体积分数为55％～95％的甲醇溶液按照料液比(g/mL)1:10～1:50进行混合，在提取温度20℃～60℃条件下，进行超声辅助提取15～55min，超声功率为400～600W，得到靛蓝和靛玉红总提取液。

四、靛蓝和靛玉红的测定：

标准曲线的确定

1、靛蓝标准曲线的绘制

精确称取10.0mg靛蓝标准品，加入少量二甲基亚砜(DMSO)溶液助溶，用甲醇溶液定容至10.0mL，配制成1.0mg/mL的母液；将母液稀释成浓度分别为0.0004、0.002、0.01、0.05l、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL的靛蓝标准溶液，各进样5.0μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程：Y＝4.2×10⁶X+675.71，R²＝0.9998，线性范围为：0.002～1.25μg，靛蓝标准曲线如图1所示。

2、靛玉红标准曲线的绘制

精确称取10.0mg靛玉红标准品，加入少量DMSO溶液助溶，以甲醇溶液定容至10.0mL，配制成1.0mg/mL的母液；将母液稀释成浓度分别为0.0008、0.004、0.02、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的靛玉红标准品溶液，各进样2.0μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程：Y＝6.7×10⁶X+2238.7，R²＝0.9996，线性范围为：0.00016～0.8μg，靛玉红标准曲线如图2所示。

制备好的供试液用0.22μm微孔滤膜过滤后，吸取1.5mL于进样瓶中，在289nm波长下利用HPLC法检测靛蓝与靛玉红的吸收峰面积，计算样品中靛蓝和靛玉红的含量，并与索氏提取法进行比较，计算提取效率。

以下通过具体实施例和对比例对本发明做进一步详细说明。

对比例：索氏提取法

大青叶药材于60℃下干燥至恒重，经粉碎后过40目筛，精密称取三份，每份0.50g，置于索氏提取器中；用80％的甲醇溶液在80℃水浴中提取8h，滤液滤过，滤液减压浓缩至干，用75％的甲醇溶液定容至10mL，低温避光保存，待测。本发明拟定索氏提取中靛蓝和靛玉红的提取效率为100％，并以此为参照，计算超声辅助提取所获靛蓝和靛玉红的提取效率。

实施例：超声辅助提取法

精确称取干燥至恒重且过20～40目筛的大青叶粉末0.50g于50mL离心管中，超声辅助提取，提取液滤过；滤液减压浓缩至干，用75％的甲醇溶液定容至10mL，低温避光保存，待测。

首先进行单因素实验，以靛蓝和靛玉红的提取效率为响应值，分别研究甲醇浓度(55％、65％、75％、85％、95％)，提取时间(15min、25min、35min、45min、55min)，料液比(g/mL)(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)，提取温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)对靛蓝和靛玉红提取效率的影响。在单因素实验中，对其中一个因素进行探讨时，其余各因素分别为：甲醇浓度为75％，料液比为1:30，提取时间为25min，提取温度为40℃，超声功率为600w。

实施例一 甲醇浓度对靛蓝和靛玉红提取效率的影响

如图3所示，当甲醇浓度低于75％时，靛蓝和靛玉红的提取效率均随着甲醇浓度的升高而逐渐增大；而当甲醇浓度大于75％时，靛蓝和靛玉红的提取效率随甲醇浓度的升高而逐渐降低。本实验结果表明，甲醇浓度过高或过低均不利于二者的充分提取，可能是由于当甲醇溶液的极性与靛蓝和靛玉红相近时，甲醇浓度升高则有利于靛蓝和靛玉红的溶出；而当甲醇浓度继续升高时，使得一些醇溶性杂质溶出量增加，与靛蓝和靛玉红竞争与甲醇水分子体系结合，致使靛蓝和靛玉红的提取效率降低。因此，初选甲醇浓度为75％。

实施例二 提取时间对靛蓝和靛玉红提取效率的影响

如图4所示，当提取时间小于30min时，靛蓝的提取效率随着提取时间的延长而升高；当提取时间小于20min时，靛玉红的提取效率随着提取时间的延长而逐渐升高。此结果表明，超声波能在短时间内使细胞破碎，有效释放靛蓝和靛玉红。但当提取时间超过30min后，靛蓝和靛玉红的提取效率均呈现下降的趋势，可能是由于长时间、强效的超声波机械振动作用导致更多的细胞发生破裂，细胞内大量黏液质及不溶物等溶出，使提取液中杂质增多，黏度增大，从而传质阻力增大而抑制了靛蓝和靛玉红的有效溶出；另一方面随着提取时间的延长，超声波较强的空化和机械振动也有可能会破坏靛蓝和靛玉红的化学结构，而使得提取效率降低。

实施例三 料液比对靛蓝和靛玉红提取效率的影响

如图5所示，当料液比(g/mL)小于1:30时，随着料液比的增加，靛蓝和靛玉红的提取效率不断增大，这可能是超声波促使细胞破裂，致有效成分不断溶出，增加溶剂的比例，可在一定程度上降低溶液的黏度，有利于靛蓝和靛玉红的进一步扩散；但随着溶剂量的增加，即料液比(g/mL)超过1:30时，超声波的穿透能力逐步下降，传质效率降低，使得靛蓝和靛玉红提取效率也随之降低。因此，初选1:30为最佳料液比。

实施例四 提取温度对靛蓝和靛玉红提取效率的影响

如图6所示，在20～40℃范围内，靛蓝和靛玉红提取效率随着温度的升高逐渐增大，而当温度超过40℃时，靛蓝和靛玉红的提取效率呈现下降的趋势。在较适宜的温度范围内，随着温度的升高，分子运动速率逐渐加快，有利于细胞内靛蓝和靛玉红的溶出，而温度过高则可能破坏靛蓝和靛玉红的化学结构，导致提取效率降低；且当提取温度升高至一定水平时，提取溶剂还可能挥发，靛蓝和靛玉红在甲醇中的溶解受到一定的影响。因此，初选40℃为最佳提取温度条件。

实施例五 响应面设计

在单因素实验的基础上，选择甲醇浓度、提取时间、料液比和提取温度为随机因素，进行四因素三水平的Box-Behnken中心组合设计，优化大青叶中靛蓝和靛玉红的提取工艺，其中超声功率为400w，响应面设计方案详见表1。

表1.响应面设计因素与水平

采用多指标试验设计优选工艺参数时，通常可针对指标间的重要性差异给出不同的权重系数，综合评分后再进行统计分析。本实验中靛蓝和靛玉红权重系数均设为0.5，其工艺评价指标如下式：

综合评分＝(0.5×100/样品最大靛蓝提取效率)×靛蓝提取效率+(0.5×100/样品最大靛玉红提取效率)×靛玉红提取效率

回归方程的建立与方差分析

响应面设计方案与实验结果见表2。利用Design-Expert8.0软件对表2实验数据进行回归拟合，得到二次多项回归方程为：

Y＝95.14+11.12A+2.44B+5.48C+3.19D-2.73AB-0.41AC-1.71AD-4.18BC+3.40BD-0.96CD-10.9A²-7.6B²-6.03C²-7.5D²

实验各因素方差分析详见表3。由表可知，该模型极显著(P＜0.0001)，说明所选用的二次多项模型具有极高的显著性。失拟项不显著(P＝0.6621＞0.05)，表明该模型能够较好地描述各因素与响应值间的真实关系。R²＝0.95，表明该回归方程拟合度较好，实验误差小；R² _Adj＝0.90，则表明有90％的数值可以用该模型解释。从回归模型的P值可知，各因素对响应值的影响程度为：A(甲醇浓度)＞C(料液比)＞D(提取温度)＞B(提取时间)。

表2.响应面设计方案与实验结果

表3.实验各因素方差分析

注:***为超显著(P＜0.0001)；**为极显著(P＜0.001)；*为显著差异(P＜0.05)。

利用Design-Expert8.0软件对表3数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应曲面图和等高线图详见图7(a)～图12(a)和图7(b)～图12(b)。

根据响应曲面图和等高线图，分析各因素交互作用对靛蓝和靛玉红提取效率的影响，若响应曲面陡峭，表明独立变量的交互作用对响应值的影响越大；若响应曲面趋于平坦，表明独立变量的交互作用差异显著性不大；若等高线呈椭圆形且排列比较紧密，则表明独立变量的交互作用对响应值的影响显著。

以图10(a)和图10(b)为例，该响应曲面陡峭，等高线呈椭圆且排列紧密，表明提取时间与料液比的交互作用对响应值(Y)的影响显著，与表3中方差分析结果一致。料液比对应的曲面较提取时间陡峭，其等高线也相对密集，即料液比对响应值(Y)的影响较提取时间大。同理可知，图7(a)和图7(b)、图8(a)和图8(b)、图9(a)和图9(b)中甲醇浓度对响应值的影响比提取时间、料液比及提取温度都显著；图11(a)和图11(b)中料液比对响应值的影响比提取温度显著；图12(a)和图12(b)中提取温度对响应值的影响比提取时间显著。

验证性试验：

利用Design-Expert8.0软件，根据实施例五响应面实验数据得出靛蓝和靛玉红提取效率的综合评分最高时的工艺条件为：甲醇浓度为80％，料液比(g/mL)为1：34，提取温度为41℃，提取时间为25min，靛蓝和靛玉红提取效率的综合评分理论值为99.25。在此优化条件下，大青叶药材中靛蓝和靛玉红实际提取效率分别为112.72％和116.42％，其综合评分为101.87，与理论值较为吻合。

结果与分析：

本发明采用超声辅助提取法，运用单因素和响应面实验设计，以索氏提取法测得结果为参考标准，以靛蓝和靛玉红提取效率为综合评价指标，考察甲醇浓度、提取时间、料液比及提取温度等四个因素交互作用对靛蓝和靛玉红提取效率的影响，通过响应面法对甲醇浓度、提取时间、料液比及提取温度进行优化，得到了超声辅助提取靛蓝和靛玉红的最佳提取工艺，提高靛蓝和靛玉红的提取效率，为菘蓝资源的合理开发利用提供了依据。

本发明超声辅助提取法是利用超声波的热效应、空化作用和机械作用加速植物药材细胞壁的破碎，致使细胞内物质溶出。与索氏提取相比，超声辅助提取具有提取效率高；提取时间短，通常在超声功率为400～600W，20～40min即可获得最佳提取率；提取温度低，对遇热不稳定的有效成分具有保护作用；提取液杂质少，有效成分易于分离、纯化等优点。

本发明利用响应面分析法(RSM)对大青叶中靛蓝和靛玉红的提取工艺参数进行了优化，所建立的靛蓝和靛玉红超声辅助提取工艺的二次多项数学模型具有显著性(P＜0.0001)。结果表明：各因素与响应值之间的关系不是简单的线性关系，二次项对响应值的影响也较大。优化后靛蓝和靛玉红超声辅助提取的最佳工艺条件为：甲醇浓度为80％，料液比(g/mL)为1：34，提取温度为41℃，提取时间为25min。该条件下的靛蓝和靛玉红的提取效率较高，分别为112.72％和116.42％，其综合评分为101.87，与综合评分理论值(99.25)基本吻合，说明采用响应面法优化得到的提取工艺参数准确可靠，可以运用于实践。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的实例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (6)

1.一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：首先取干燥的大青叶粉末与体积分数为55～95％的甲醇溶液混合，大青叶粉末和甲醇溶液的料液比为1g：(10～50)mL，然后进行超声辅助提取，得到靛蓝和靛玉红的总提取液，总提取液过滤后浓缩至干，得到提取物靛蓝和靛玉红。

2.根据权利要求1所述的一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：所述的大青叶粉末是通过大青叶在40～60℃的恒温干燥箱中处理至恒重，然后粉碎并过20～60目筛得到的。

3.根据权利要求1所述的一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：超声功率为400～600W。

4.根据权利要求1所述的一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：提取的温度为20～60℃。

5.根据权利要求1所述的一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：提取的时间为15～55min。

6.根据权利要求1所述的一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法，其特征在于：大青叶粉末和体积分数为80％的甲醇溶液按料液比为1g：34mL进行混合，在41℃超声辅助提取25min。