CN104962619B - 一种用于原发性肝癌预后评估的探针对、引物及试剂盒 - Google Patents

一种用于原发性肝癌预后评估的探针对、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的探针对和引物；该探针对由如SEQ ID NO:4所示的T探针，以及如SEQ ID NO:5所示的C探针组成；该引物由SEQ ID NO:2所示的上游引物，以及如SEQ ID NO:3所示的下游引物组成；本发明还公开了一种包含该探针对和引物的试剂盒。通过该试剂盒，可以检测早期原发性肝癌患者肿瘤组织标本中是否存在XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变，从而有助于原发性早期肝癌的预后评估。

Description

一种用于原发性肝癌预后评估的探针对、引物及试剂盒
技术领域
本发明属于基因诊断领域，更具体地，涉及一种用于原发性肝癌预后评估的探针对、引物及试剂盒。
背景技术
目前,原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤在世界范围内呈区域性分布，我国是肝癌的主要发生地，其发病率高达十万分之三十五，每年新发肝癌病人达50万，占全世界新发肝癌病人的50％。近年来肝癌发病率有明显上升趋势，严重危害人类的健康与安全。手术治疗是治疗肝癌的首选，也是最有效的方法。但即使进行手术后的病人，癌症复发率也很高。目前，根治性肝切除术的5年生存率只有30％左右；早期原发性肝癌患者肝移植效果较前者稍好，但其5年生存率仅达到50％左右。肿瘤复发和转移导致的远期低存活率严重影响了原发性肝癌患者的预后。术后灌注化疗等方法有一定概率降低肝癌患者术后的复发率，但术后复发风险较低的患者采取这些治疗手法反而会因为药物的副作用而降低患者的生存质量甚至影响患者的健康。如果能够对原发性肝癌患者的复发进行有效的预测，就能采取更加恰当的干预措施，降低复发率，延长患者的寿命并提高生存质量。
XRCC4是一种重要的DNA双链断裂修复基因，该基因定位于5q14.2，编码蛋白含336氨基酸残基，含N端球形结构域(第1～115位氨基酸)、同源二聚体结构域(第116～204位氨基酸)及C端结构域(第205～334位氨基酸)等三个功能结构域，其中第一个结构域与另一个DNA双链断裂修复成分XLF/Cer结合，起结合DNA损伤位点作用，此外也可促进第二个结构域与DNA连接酶IV的结合稳定性，增加后者的连接活性；由此可以看出，XRCC4可直接通过其功能结构域与DNA双链断裂修复途径中的其它DNA修复成分如XLF/Cer等结合而促使连接酶IV修复体的形成，从而在DNA双链断裂修复中起重要的作用。
近年来的研究表明，XRCC4作为一种DNA双链断裂修复的关键成分，在肿瘤的发生发展中也发挥着重要的作用，这种基因的突变将增加肝癌的发病风险，但至今未见有任何XRCC4基因编码区第50位碱基突变与原发性肝癌预后相关的报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明通过肝癌复发与XRCC4基因突变的相关性分析，提供了一种用于原发性肝癌预后评估的探针对、引物及试剂盒，技术方案为：
一种检测人类XRCC4基因编码区(SEQ ID NO:1)第50位碱基C→T突变的探针对，由T探针和C探针组成，其中所述T探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，用于检测变异型的XRCC4基因片段；所述C探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，用于检测野生型的XRCC4基因片段。
优选地，所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有MGB标记，所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的5’端有VIC标记，3’端有MGB标记。
按照本发明的另一方面，还提供了一种检测人类XRCC4基因编码区(SEQ ID NO:1)第50位碱基C→T突变的引物，其核苷酸序列为：
上游引物(SEQ ID NO:2)：5’-TGGAGAGAAAAATAAGCAGAATCCA-3’
下游引物(SEQ ID NO:3)：5’-TTCCAGTGTTTTCTCCCAAGATACT-3’
按照本发明的另一方面，还提供了一种检测人类XRCC4基因编码区(SEQ ID NO:1)第50位碱基C→T突变的试剂盒，其特征在于，包含核苷酸序列为SEQ ID NO:4以及核苷酸序列为SEQ ID NO:5的探针对、核苷酸序列为SEQ ID NO:2以及核苷酸序列为SEQ ID NO:3的引物、PCR扩增试剂、阳性对照品以及阴性对照品。
优选地，所述PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、Taq缓冲液、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸以及无DNA水；
其中所述T探针阳性对照品为含有人类XRCC4基因编码区目的片段，且与XRCC4基因编码区第50位碱基的对应位点具有C→T突变(单核苷酸为T)的DNA序列；
所述C探针阳性对照品为与T探针含有相同目的片段，但与XRCC4基因编码区第50位碱基的对应位点未发生C→T突变(单核苷酸为C)的DNA序列；
所述双阳性品由相同比例的T探针阳性对照品以及C探针阳性对照品组成；
所述阴性对照品为无DNA水。
优选地，所述T探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述C探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述试剂盒所检测的待测DNA的提取方法为：采用蛋白酶K裂解法从早期原发性肝癌患者的肿瘤组织标本中分离出肿瘤细胞，并用酚氯仿法提取所述肿瘤细胞中的样品DNA作为待测DNA。
本发明还通过对早期肝癌患者XRCC4基因编码区(SEQ ID NO:1)第50位碱基C→T突变的检测结果，以及对这些患者的术后随访建立起了该位点突变与肝癌复发的关联，从而证实本发明提供的探针对、引物及试剂盒可应用于原发性肝癌预后评估。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，有以下优点：
1、不仅有检测变异型基因的T探针，还采用了检测野生型基因的C探针，降低了检测出假阳性的概率；
2、探针对优选采用不发荧光的MGB作为淬灭基团，能提高探针的特异性配对概率，实验结果更精确；
3、由于建立了XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变与肝癌复发率的关联，从而实现了对原发性肝癌进行预后评估。
附图说明
图1是实施例3中用本发明试剂盒检测患者DNA样品结果分析示意图。
图2是比较XRCC4基因编码区第50位碱基C→T变异是否存在的情况下，肝癌患者术后肿瘤转移复发数量分析曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1探针和引物的设计
将人类XRCC4基因测序后，通过其核苷酸序列及特异性检测位点(基因编码区第50位碱基C→T)设计探针序列为：5’-AACCCAGTATAATTC-3’，并将5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB，作为T探针，用于检测变异型的XRCC4基因片段；同时设计5’-AACCCAGTATAACTCA-3’，并将5’端标记荧光基团VIC，3’端标记淬灭基团MGB，作为C探针，用于检测野生型的XRCC4基因片段。
并设计PCR扩增引物为：
上游引物：5’-TGGAGAGAAAAATAAGCAGAATCCA-3’
下游引物:5’-TTCCAGTGTTTTCTCCCAAGATACT-3’
用人工合成的变异型的XRCC4基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:6)、野生型的XRCC4基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:7)作为验证，以及无DNA水作为对照用荧光定量PCR方法，对探针对进行验证，结果发现，变异型的XRCC4基因片段能与特异性的与T探针反应而发出荧光，与C探针反应则无荧光；野生型的XRCC4基因片段能与特异性的与C探针反应而发出荧光，与T探针反应则无荧光；无DNA水与两种探针反应都不发出荧光。从而验证得知该探针对可用于检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变。
实施例2用于检测人类XRCC4基因突变的试剂盒
一种用于检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的试剂盒，其主要成分见表1：
表1
编号 组成成分 规格 数量
1 无DNA水 1200μl 1支
2 2×Taqman酶反应液 1200μl 1支
3 10×PCR扩增液 200μl 1支
4 C探针阳性对照品 10μl 1支
5 T探针阳性对照品 10μl 1支
6 T探针和C探针双阳性对照品 10μl 1支
7 阴性对照品 10μl 1支
8 光学96孔反应板 块 1块
9 光学贴膜 张 1张
10 说明书 份 1份
其中2×Taqman酶反应液包括2种荧光标记探针和1对PCR扩增引物。其中荧光标记探针对序列为：
T探针：5’-FAM-AACCCAGTATAATTC-MGB-3’
C探针：5’-VIC-AACCCAGTATAACTCA-MGB-3’
PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-TGGAGAGAAAAATAAGCAGAATCCA-3’
下游引物:5’-TTCCAGTGTTTTCTCCCAAGATACT-3’
T探针、C探针、上游引物以及下游引物在2×Taqman酶反应液中的浓度皆为0.4uM。
10×PCR扩增液包括：10×Taq缓冲液，2mM脱氧核糖核苷三磷酸，20mM氯化镁及3U/μl Taq DNA聚合酶。
阳性对照品为人工合成的含有人类XRCC4基因编码区第50位碱基的DNA序列，T探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，浓度为50ng/μL；C探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，浓度为50ng/μL；T探针和C探针双阳性对照品则含有50％的T探针阳性对照品以及50％的C探针阳性对照品。
阴性对照品为无DNA水。
实施例3肝癌复发与XRCC4基因突变的关联性研究
步骤一：收集肝癌肿瘤样本及提取基因组DNA
从右江民族医学院附属医院采集到散发性的原发性肝细胞癌患者肿瘤组织标本399份，平均年龄47.8±10.4岁(标准差)，其中包括女性标本51例。
采用蛋白酶K裂解法从上述收集到的肿瘤组织标本中分离出肿瘤细胞，并用酚氯仿法提取肿瘤细胞中样品DNA后，将样品DNA统一稀释为50ng/μL，作为待测DNA模板。
步骤二：XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的检测
利用用实施例2的试剂盒，每个待测DNA模板在96孔板的单孔中进行一个总体积为25μL体系的扩增反应，体系成分见表2：
表2
成分 25μl反应(96孔反应板)
2×Taqman酶反应液 12.5μl
10×PCR扩增液 2μl
待测DNA模板 1μl(50ng)
无DNA水 9.5μl
反应在94℃预变性5分钟后，进行到如下重复循环：94℃变性45秒，60℃退火60秒，重复50次后结束。
同时，以1μl的T探针阳性对照品取代待测DNA模板作为T探针阳性对照，以1μl的C探针阳性对照品取代待测DNA模板作为T探针阳性对照,以1μl的T探针和C探针双阳性对照品取代待测DNA模板作为双阳性对照，以1μl的无DNA水取代待测DNA模板作为阴性对照，在同样的条件下进行PCR扩增反应。
使用荧光定量PCR仪对待测DNA模板以及对照品的PCR反应结果进行检测分析，结果如图1所示，因为DNA为双链结构，当两条链上XRCC4基因编码区第50位碱基均为T时，则只能检测出T探针的FAM荧光，而不能检测出C探针的VIC荧光，与T探针阳性对照品的结果相对应；当两条链上的其中一条链XRCC4基因编码区第50位碱基为T，而另一条链上为C时，则既能检测出T探针的FAM荧光，又能检测出C探针的VIC荧光，与T探针和C探针双阳性对照品的结果相对应；当两条链上XRCC4基因编码区第50位碱基均为C时，则只能检测出C探针的VIC荧光，而不能检测出T探针的FAM荧光，与C探针阳性对照品的结果相对应，若DNA失效则表现与阴性对照品的结果相对应；其中前两种情况均能检测出XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变，即：
XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变：T探针阳性对照，T探针和C探针双阳性对照；
XRCC4基因编码区第50位碱基无突变：C探针阳性对照；
DNA失效：阴性对照。
结果判读如图1所示。由图可知，当本发明所示突变发生时(即T探针阳性对照、T探针和C探针双阳性对照)，可检测到FAM荧光基团(纵坐标)所发出的荧光信号。
对步骤一中的待测DNA模板进行检测，结果为：399人中有129人表现为T探针阳性对照或者T探针和C探针双阳性对照，即含有XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变。
步骤三：XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变与肝癌转移复发的相关性分析
运用SPSS18.0专业统计学软件的肝癌术后肿瘤转移复发生存分析，绘制生存曲线；通过多因素风险比例回归模型分析该突变在预测肝癌预后中的具体价值，采用风险值(HR)及其相应置信区间设定位95％(95％CI),统计学的显著性差异水平设定为P＜0.05。统计结果如图2所示。
由图2可以看出，在术后1个月～40个月内的随访期内，与XRCC4基因编码区第50位碱基未发生C→T突变的患者相比，带有C→T突变基因的早期肝癌患者术后肿瘤转移复发的风险增加2.57倍～4.61倍，平均为3.45倍。此结果表示该突变是一种重要的影响早期肝癌病人术后预后的标志物。因此，通过检测该突变可以对原发性肝癌进行预后评估。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的探针对，所述人类XRCC4基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述探针对由T探针和C探针组成，其中所述T探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述C探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.如权利要求1所述的检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的探针对，所述人类XRCC4基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有MGB标记，所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的5’端有VIC标记，3’端有MGB标记。
3.一种检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的引物，所述人类XRCC4基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物(SEQ ID NO:2)：5’-TGGAGAGAAAAATAAGCAGAATCCA-3’
下游引物(SEQ ID NO:3)：5’-TTCCAGTGTTTTCTCCCAAGATACT-3’。
4.一种检测人类XRCC4基因编码区第50位碱基C→T突变的试剂盒，所述人类XRCC4基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，除包含如权利要求1所述探针对以及权利要求3所述引物以外，还包括PCR扩增试剂、阳性对照品以及阴性对照品。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、Taq缓冲液、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸以及无DNA水；
所述阳性对照品包括T探针阳性对照品、C探针阳性对照品以及双阳性 对照品；
其中所述T探针阳性对照品为含有人类XRCC4基因编码区目的片段，且与XRCC4基因编码区第50位碱基的对应位点具有C→T突变的DNA序列；
所述C探针阳性对照品为与T探针含有相同目的片段，但与XRCC4基因编码区第50位碱基的对应位点未发生C→T突变的DNA序列；
所述双阳性品由相同比例的T探针阳性对照品以及C探针阳性对照品组成；
所述阴性对照品为无DNA水。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述T探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQID NO:6所示，所述C探针阳性对照品的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所检测的待测DNA的提取方法为：采用蛋白酶K裂解法从早期原发性肝癌患者的肿瘤组织标本中分离出肿瘤细胞，并用酚氯仿法提取所述肿瘤细胞中的DNA作为待测DNA。
8.根据权利要求1～2所述的探针对、权利要求3所述的引物或权利要求4～7任一权利要求所述的试剂盒在制备原发性肝癌预后评估试剂中的应用。
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