CN104962280A

CN104962280A - 杯吡啶-芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器及其对atp水解反应的应用

Info

Publication number: CN104962280A
Application number: CN201510277899.6A
Authority: CN
Inventors: 王魁; 窦虹翕
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明公开了杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器及其对ATP水解反应的应用,主要是以杯吡啶为主体，以芘四磺酸四钠盐为客体，通过主?客体包结配位相互作用构筑超分子荧光传感体系，其中杯吡啶和芘四磺酸四钠盐的浓度分别为0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。本发明的优点是：该超分子荧光传感器可以对碱性磷酸酶CIAP进行选择性检测，由于诸多癌细胞内碱性磷酸酶CIAP的含量都要高于其在正常细胞中的表达值，因而，对于碱性磷酸酶CIAP的选择性检测在生物医药领域有着广泛的潜在应用价值。

Description

杯吡啶-芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器及其对ATP水解反应的应用

本专利得到国家自然科学基金青年科学基金项目（21402141）、天津市应用基础与前沿技术研究计划(青年项目)（15JCQNJC05400）、天津师范大学引进人才基金项目（自然科学）（5RL122）和天津师范大学市级重点实验室开放研究基金课题资助。

技术领域

本发明属于超分子材料技术领域，涉及杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感体系的制备，并利用该体系实现了对ATP在碱性磷酸酶催化下水解反应的动力学及其进程的监测，以及对碱性磷酸酶的选择性检测。

背景技术

酶反应在生物体内无处不在且非常重要，许多疾病都与酶的非正常表达有关，因此对于生理中进行的酶反应的动力学和进程的监测，以及相关酶的检测在生物医药领域是非常有意义的，参见：1）S. Samantaray, R. Sharma, T. Chattopadhyaya, K. S. D. Gupta, R. Ralhan. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2004, 130, 37−44；2）A. Spaltenstein, W. M. Kamierski, J. F. Miller, V. Samano. Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5, 1589−1607；3）T. Guo, D. W. Hobbs. Curr. Med. Chem. 2006, 13, 1811−1829。超分子串联检测技术在这一领域已经体现出独特的优势，参见：R. N. Dsouza, A. Hennig, W. M. Nau. Chem. Eur. J. 2012, 18, 3444−3459。例如：负电荷的磺化杯芳烃和正电荷的荧光染料构筑的超分子荧光传感体系已经成功应用于许多阳离子型酶反应底物在相关酶催化下水解反应的动力学及其进程的监测，以及相关酶的选择性检测，参见：1）D.-S. Guo, V. D. Uzunova, X. Su, Y. Liu, W. M. Nau. Chem. Sci. 2011, 2, 1722−1734；2）M. Florea, S. Kudithipudi, A. Rei, M. J. González-Álvarez, A. Jeltsch, W. M. Nau. Chem. Eur. J. 2012, 18, 3521−3528；3）D.-S. Guo, J. Yang, Y. Liu. Chem. Eur. J. 2013, 19, 8755−8759。然而，应用于阴离子型酶反应底物的超分子串联检测体系还鲜有报道。

ATP是一类阴离子型酶反应底物，且ATP在碱性磷酸酶催化下的水解反应是生物体内十分重要的供能反应，它无时无刻不在发生，对生物机体十分重要！因而，对ATP在碱性磷酸酶催化下水解反应的动力学及其进程的监测意义重大。此外，文献报道在诸多癌细胞内碱性磷酸酶CIAP的含量都要高于其在正常细胞中的表达值，参见：C. Wang, Q.-S. Chen, Z.-Q. Wang, X. Zhang. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 8612−8615。因而，对于碱性磷酸酶CIAP的选择性检测在生物医药领域也有着广泛的潜在应用价值。

杯吡啶是一类富含吡啶阳离子的环状化合物，具有良好的水溶性以及和阴离子客体键合的潜能。该化合物可以以3-溴甲基吡啶为原料简便高效的进行合成，参见：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa, Chem. Commun. 1998, 181−182。然而，基于杯吡啶的超分子应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感体系，并利用该体系实现了超分子串联检测技术对阴离子型酶反应底物ATP在碱性磷酸酶CIAP催化下水解反应的动力学及其进程的监测，以及对CIAP的选择性检测。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器，其特征在于：构筑单元以杯吡啶为主体，以芘四磺酸四钠盐为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子荧光传感体系；其结构式如下：

本发明进一步公开了杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器的制备方法，其特征在于：将杯吡啶和芘四磺酸四钠盐溶解于水中，均匀混合后得到超分子荧光传感器；超分子荧光传感器中杯吡啶和芘四磺酸四钠盐的浓度分别为0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。

本发明更进一步公开了杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器在监控ATP水解反应动力学及其进程以及检测碱性磷酸酶CIAP中的应用。

本发明所述的监控ATP水解反应动力学及其进程以及检测碱性磷酸酶CIAP指的是：当ATP加入到杯吡啶—芘四磺酸四钠盐水溶液中时，由于ATP和杯吡啶的键合能力较强，芘四磺酸四钠盐并未被包结，显示出强荧光信号；再将CIAP酶加入到上述三元体系中，随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行，体系中ATP越来越少，AMP越来越多，但AMP和杯吡啶的键合能力大大减弱了，因而芘四磺酸四钠盐开始逐渐和杯吡啶键合，导致其荧光信号随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行而逐渐猝灭，直至平衡。这样就实现了碱性磷酸酶CIAP催化下ATP水解反应的动力学及其进程被杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器所监测。由于ATP水解反应只能专一在碱性磷酸酶CIAP的催化下进行，所以其它酶无法实现该过程，因而也实现了该荧光传感器对碱性磷酸酶CIAP的选择性检测。

本发明公开的杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器所具有的积极效果在于：

基于杯吡啶—芘四磺酸四钠盐的超分子荧光传感器，制备方法高效简便，主、客体原料用量少；该超分子荧光传感器可以对阴离子型酶反应底物ATP在碱性磷酸酶CIAP催化下水解反应的动力学及其进程进行监测；该超分子荧光传感器可以对碱性磷酸酶CIAP进行选择性检测，由于诸多癌细胞内碱性磷酸酶CIAP的含量都要高于其在正常细胞中的表达值，因而，对于碱性磷酸酶CIAP的选择性检测在生物医药领域将有着广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为芘四磺酸四钠盐水溶液（0.001 mmol/L）和杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液的荧光光谱曲线图,图中显示：未加入杯吡啶时芘四磺酸四钠盐水溶液具有强荧光发射，加入4倍量的杯吡啶后芘四磺酸四钠盐水溶液的荧光就基本完全被猝灭，这表明杯吡啶和芘四磺酸四钠之间通过超分子相互作用形成了具有良好响应性的荧光传感器；

图2为随着杯吡啶的加入，芘四磺酸四钠盐水溶液（0.001 mmol/L）荧光发射强度的变化图；

图3为以杯吡啶的浓度为横坐标，以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，杯吡啶和芘四磺酸四钠盐的键合常数拟合图；

图4为杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液和杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）—ATP（0.060 mmol/L）水溶液的荧光光谱曲线图；

图5为随着ATP的加入，杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液荧光发射强度的变化图；

图6为以ATP的浓度为横坐标，以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，杯吡啶和ATP的键合常数拟合图；

图7为以荧光光谱为测试手段，ATP在存在与不存在碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）的情况下水解反应动力学及其进程的监测图；

图8为以荧光光谱为测试手段，ATP在碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）和失活的碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）存在下水解反应动力学及其进程的监测图；

图9为随着AMP的加入，杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液荧光发射强度的变化图；

图10为以AMP的浓度为横坐标，以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，杯吡啶和AMP的键合常数拟合图；

图11为以荧光光谱为测试手段，ATP在碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）、丁酰胆碱酯酶BChE（1.5 U/mL）和胰蛋白酶Trypsin（1.5 U/mL）存在下水解反应动力学及其进程的监测图；

图12为以荧光光谱为测试手段，ATP在碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）、碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）和丁酰胆碱酯酶BChE（1.5 U/mL）、碱性磷酸酶CIAP（1.5 U/mL）和胰蛋白酶Trypsin（1.5 U/mL）存在下水解反应动力学及其进程的监测图。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中芘四磺酸四钠盐有市售。杯吡啶是以3-溴甲基吡啶为原料简便高效的进行合成的，参见：S. Shinoda, M. Tadokoro, H. Tsukube, R. Arakawa, Chem. Commun. 1998, 181−182。

实施例1：

一种杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器的制备方法，它是将杯吡啶和芘四磺酸四钠盐溶解于水中并均匀混合即可制得超分子荧光传感器目标溶液，所述杯吡啶和芘四磺酸四钠盐的浓度分别为0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。

1）该超分子荧光传感器的响应性：

该超分子荧光传感器的响应性通过荧光光谱所表征，图1为芘四磺酸四钠盐水溶液（0.001 mmol/L）和杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液的荧光光谱曲线，图中显示：未加入杯吡啶时芘四磺酸四钠盐水溶液具有强荧光发射，加入4倍量的杯吡啶后芘四磺酸四钠盐水溶液的荧光就基本完全被猝灭，表明该超分子荧光传感器具有良好的响应性。

2）该超分子荧光传感器的稳定性：

如图2所示，随着芘四磺酸四钠盐的水溶液中逐渐加入阳离子大环主体化合物杯吡啶，芘四磺酸四钠盐的荧光发射强度逐渐下降，直至平衡。由于该荧光强度的下降是由于杯吡啶和芘四磺酸四钠盐之间发生相互作用造成的，因而我们可以利用该荧光光谱的变化来拟合杯吡啶与芘四磺酸四钠盐的键合常数。如图3所示，我们以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，以逐渐加入的杯吡啶的浓度为横坐标来作图并进行拟合，最终得到杯吡啶在中性水溶液中与芘四磺酸四钠盐的键合常数为9.4 × 10⁵ M^– ¹，表明该超分子荧光传感器具有良好的稳定性。

实施例2

实施例1制备的杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器的应用，将阴离子型酶反应底物ATP加入到上述荧光传感体系中，方法如下：

1）将杯吡啶、芘四磺酸四钠盐和ATP溶解于水中后混合均匀得到溶液，所述杯吡啶、芘四磺酸四钠盐和ATP的浓度分别为0.004 mmol/L、0.001 mmol/L和0.060 mmol/L。如图4所示，向上述制备的杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器目标溶液中加入60倍（芘四磺酸四钠盐的倍数）的ATP，芘四磺酸四钠盐的荧光发射强度就可以大幅度恢复。

将阴离子型酶反应底物ATP逐渐加入到杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液中，如图5所示，图中表明，随着ATP的加入，芘四磺酸四钠盐的荧光发射强度逐步恢复，直至平衡。由于该荧光发射强度的恢复是由于ATP客体竞争包结在杯吡啶中心所造成，因而我们可以利用该荧光光谱的变化来拟合杯吡啶与ATP的键合常数。如图6所示，我们以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，以逐渐加入的ATP的浓度为横坐标来作图并进行拟合，最终得到杯吡啶在中性水溶液中与ATP的键合常数为5.0 × 10⁴ M^– ¹，表明ATP与杯吡啶具有很强的键合能力。

2）将碱性磷酸酶CIAP加入到上述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系中，如图7所示，体系的荧光发射强度随着ATP在碱性磷酸酶CIAP催化下水解反应的进行而又逐渐猝灭，直至平衡。表明在碱性磷酸酶CIAP催化下ATP水解反应的动力学及其进程能够被杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器所监测。所述碱性磷酸酶CIAP、杯吡啶、芘四磺酸四钠盐和ATP的浓度分别为1.5 U/mL、0.004 mmol/L、0.001 mmol/L和0.060 mmol/L。

对比试验：

（1）在上述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系中未加入碱性磷酸酶CIAP时，如图7所示，体系的荧光发射强度不随时间变化。表明在没有酶催化下，ATP水解反应不能进行。

（2）在上述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系中加入失活的碱性磷酸酶CIAP时，如图8所示，体系的荧光发射强度也不随时间变化。表明ATP水解反应只能在活性碱性磷酸酶CIAP催化下进行，单纯的CIAP分子结构并不能催化该反应。

上述酶催化水解反应的动力学及其进程监测的机理验证：

将ATP的水解产物AMP逐渐加入到杯吡啶（0.004 mmol/L）—芘四磺酸四钠盐（0.001 mmol/L）水溶液中，如图9所示，图中表明，随着AMP的加入，芘四磺酸四钠盐的荧光发射强度也可以逐步恢复，但恢复的程度远远不及加入ATP时的恢复程度。由于该荧光发射强度的恢复也是由于AMP客体竞争包结在杯吡啶中心所造成，因而我们利用该荧光光谱的变化也可以拟合杯吡啶与AMP的键合能力。如图10所示，我们以385 nm的荧光发射强度为纵坐标，以逐渐加入的AMP的浓度为横坐标来作图并进行拟合，最终得到杯吡啶在中性水溶液中与AMP的键合常数为4.8 × 10² M^– ¹，表明AMP与杯吡啶的键合极弱。起初，当ATP加入到杯吡啶—芘四磺酸四钠盐水溶液中时，由于ATP和杯吡啶的键合能力较强，芘四磺酸四钠盐并未被包结，显示出强荧光信号；再将CIAP酶加入到上述三元体系中，随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行，体系中ATP越来越少，AMP越来越多，但AMP和杯吡啶的键合能力大大减弱了，因而芘四磺酸四钠盐开始逐渐和杯吡啶键合，导致其荧光信号随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行而逐渐猝灭，直至平衡。

3）该超分子荧光传感器对碱性磷酸酶CIAP高选择响应性的实验验证：

在上述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系中分别加入碱性磷酸酶CIAP、丁酰胆碱酯酶BChE和胰蛋白酶Trypsin时，如图11所示，丁酰胆碱酯酶BChE和胰蛋白酶Trypsin存在下杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系的荧光发射强度不随时间变化。表明该超分子荧光传感器对碱性磷酸酶CIAP具有高选择响应性。所述碱性磷酸酶CIAP、丁酰胆碱酯酶BChE、胰蛋白酶Trypsin、杯吡啶、芘四磺酸四钠盐和ATP的浓度分别为1.5 U/mL、1.5 U/mL、1.5 U/mL、0.004 mmol/L、0.001 mmol/L和0.060 mmol/L。

干扰试验：将碱性磷酸酶CIAP分别加入到含有丁酰胆碱酯酶BChE和胰蛋白酶Trypsin的杯吡啶—芘四磺酸四钠盐—ATP三元体系中，如图12所示，体系的荧光发射强度仍然可以随着ATP在碱性磷酸酶CIAP催化下水解反应的进行而逐渐猝灭，直至平衡。表明干扰酶的存在不影响ATP水解反应的进行。

Claims

1.一种杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器，其特征在于：构筑单元以杯吡啶为主体，以芘四磺酸四钠盐为客体，通过主−客体包结配位相互作用构筑超分子荧光传感体系；其结构式如下：

杯吡啶芘四磺酸四钠盐。

2.权利要求1所述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器的制备方法，其特征在于：将杯吡啶和芘四磺酸四钠盐溶解于水中，均匀混合后得到超分子荧光传感器；超分子荧光传感器中杯吡啶和芘四磺酸四钠盐的浓度分别为0.004 mmol/L和0.001 mmol/L。

3.权利要求1所述杯吡啶—芘四磺酸四钠盐超分子荧光传感器在监控ATP水解反应动力学及其进程以及检测碱性磷酸酶CIAP中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的监控ATP水解反应动力学及其进程以及检测碱性磷酸酶CIAP指的是：当ATP加入到杯吡啶—芘四磺酸四钠盐水溶液中时，由于ATP和杯吡啶的键合能力较强，芘四磺酸四钠盐并未被包结，显示出强荧光信号；再将CIAP酶加入到上述三元体系中，随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行，体系中ATP越来越少，AMP越来越多，但AMP和杯吡啶的键合能力大大减弱了，因而芘四磺酸四钠盐开始逐渐和杯吡啶键合，导致其荧光信号随着ATP在CIAP酶作用下的水解反应进行而逐渐猝灭，直至平衡。