CN103864829A

CN103864829A - 水溶性三芳基硼化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN103864829A
Application number: CN201410098721.0A
Authority: CN
Inventors: 杨国强; 李晓艳; 王双青; 李沙瑜
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN103864829B

Abstract

本发明提供一系列水溶性三芳基硼化合物及其制备方法。该化合物对ATP有很好的选择性，可用作ATP荧光探针，将其配在水溶液或缓冲溶液中，可用于检测体外ATP。此类化合物不用借助任何载体，可自主渗透细胞膜进入到细胞中，并可用于细胞内ATP成像。本发明的荧光探针具有高效专一性、光稳定性、响应范围宽等优点。

Description

水溶性三芳基硼化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一系列水溶性三芳基硼化合物以及该类化合物的制备方法及其在ATP检测中的应用。

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）是生物体内最小的能量单位，直接参与各种生命活动，它被称为细胞内的分子货币。ATP是活细胞赖以生存的能量来源，机体内ATP的含量与细胞代谢和细胞凋亡有很重要的关系，许多疾病如心血管疾病、帕金森综合症及阿尔兹海默症的发生都伴随着ATP含量异常。因此，对ATP的检测在生命科学及医学临床研究中具有重要意义。

目前ATP的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、生物荧光法、电化学以及荧光生物传感器检测等。高效液相色谱法需要耗费大量的有机溶剂，对环境污染大，检测费用高，且难以达到微量检测水平；而目前广泛采用的基于荧光素酶的ATP检测方法尽管灵敏度较高但准确性受基质中成分荧光淬灭的影响较大；而低特异性及低灵敏度也一直是电化学生物传感器设计中的难题。总之，如何更加简便，高特异性及高灵敏度检测ATP是一个研究热点。

由于荧光传感器具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，因此其迅速成为现代化学的前沿研究领域。目前研究的ATP荧光传感器与ATP的结合主要依赖于静电作用、氢键作用及π-π相互作用，通过这些作用，ATP改变了荧光分子的结构，从而其发光光谱发生变化，以此检测出ATP。

发明内容

本发明的目的在于提供一类水溶性三芳基硼化合物。

本发明的另一目的在于提供上述水溶性三芳基硼化合物的制备方法。

本发明的又一目的在于提供上述水溶性三芳基硼化合物在ATP检测中的应用。

本发明提供了一类水溶性三芳基硼化合物，其结构为如下通式（I）所示：

其中独立的任选为-W⁺-、-W⁺-(CH₂)_m-W⁺-、或-R¹ ₂N⁺-，m为0、1、2、或3，W⁺为含N杂芳基阳离子，R¹独立的选自烷基、芳基，n=1或2；R独立的任选为C_1-8烷基、

X^-独立的任选为F^-、Cl^-、Br^-、I^-。

根据本发明，所述优选为

所述的烷基代表碳原子数为1-8的直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。

所述的芳基指具有6-20个碳原子的单环、多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基等。

所述的含N杂芳基阳离子，是指具有3-20个碳原子、1-4个N杂原子的单环或多环杂芳族基团的阳离子，代表性的含N杂芳基阳离子包括：咪唑基阳离子、吡啶基阳离子。

本发明的水溶性三芳基硼化合物的合成途径如下：

X^-独立的任选为F^-、Cl^-、Br^-、I^-。

本发明通式（I）化合物的具体合成方法如下：

（a）将1-溴芘溶于溶剂（优选二氯甲烷）中，加入1,1-二氯甲醚与四氯化钛，得到6/8-溴芘-1-甲醛；（化合物2）；

（b）将化合物2溶于溶剂（优选四氢呋喃）中，加入硼氢化钠，得到（6/8-溴芘-1-基）甲醇（化合物3）；

（c）将化合物3溶于溶剂（优选二氯甲烷）中，加入对甲苯磺酸吡啶盐与3,4-2H-二氢吡喃，得到2-（（6-溴芘-1-基）甲氧基）四氢-2H-吡喃（化合物4）；

（d）将化合物4溶于溶剂（优选脱气乙醚）中，加入正丁基锂搅拌，再加入2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，得到双（6-（（四氢-2H-吡喃-2-基氧）甲基）芘-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼（化合物5）；

（e）将三苯基膦溶于溶剂（优选二氯甲烷）中，加入溴素搅拌，加入化合物5，得到双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼（化合物6）；

（f）将RW、(W-(CH₂)_m-RW⁺)X^-、或R R¹ ₂N（W为含N杂芳基）溶于溶剂（优选DMF）中，加入化合物6，然后，再先后与六氟磷酸钾和四丁基卤（氯、氟、溴或碘）化铵进行两次离子交换，得到化合物I。

根据本发明，所述步骤（a）中1-溴芘与1,1-二氯甲醚按1:1.3摩尔比投料，四氯化钛作催化剂，二氯甲烷作溶剂，反应温度为0-20℃，反应时间为2-3h。

根据本发明，所述步骤（b）中6-溴芘-1-甲醛与硼氢化钠按1:3摩尔比投料，THF作溶剂，反应温度为0-10℃，反应时间为1-2h。

根据本发明，所述步骤（c）中（6-溴芘-1-基）甲醇与3,4-2H-二氢吡喃按1:1.5摩尔比投料，对甲苯磺酸吡啶盐作催化剂，二氯甲烷作溶剂，反应温度为20-30℃，反应时间为4-6h。

根据本发明，所述步骤（c）中用四氢吡喃作保护基团，可以将6/8位取代的异构体用石油醚/乙酸乙酯过硅胶色谱柱分离出来，并保证其在丁基锂反应中6位不被破坏。

根据本发明，所述步骤（d）中其反应条件为氩气保护，脱气乙醚作溶剂，在-78℃下加入正丁基锂和2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，反应时间为8-12h。根据本发明，所述步骤（f）中双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼与所述嗡盐或叔胺按1:4摩尔比投料，反应温度为70-80℃，反应时间为24-48h。

本发明合成的水溶性三芳基硼化合物，将其溶在缓冲溶液中可以作为ATP荧光探针，其发光能力随ATP浓度增加而变强。其原因是所述化合物中含有多个正电荷，可以与带负电荷ATP相互作用，形成聚集体，从而使其荧光增强。

本发明合成的水溶性三芳基硼化合物，对ATP的选择具有专一性，与ATP结构类似的ADP（腺苷二磷酸）、AMP（腺苷单磷酸）及PPi（焦磷酸）对所述化合物的发光能力几乎无影响，同样其他阴阳离子对于所述化合物的发光能力几乎也无影响。

本发明合成的水溶性三芳基硼化合物，对于ATP的检测可以在水溶液中，也可以在多种缓冲溶液中进行，如HEPES缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，磷酸缓冲溶液等。所述化合物对于ATP检测所适用的pH范围为6.0-7.4。

本发明合成的水溶性三芳基硼化合物，可自主进入到小鼠成纤维细胞中，并用于细胞内ATP成像。所述化合物进入细胞后，在荧光显微镜下通过荧光探针可以观察到ATP被ATP分解酶分解的过程。

本发明所述的ATP荧光探针优点在于：对ATP具有高效的选择性；对ATP的选择具有很宽的响应范围（2-2000μM）；所述化合物与ATP形成聚集体后光稳定性提高；所述化合物具有亲水亲油两性基团，可自主渗透细胞膜进入到细胞内。

附图说明

图1为实施例7制备的DPTB-IMI-EG在HEPES缓冲溶液中，随ATP浓度变化而变化的荧光光谱图。

图2为实施例7制备的DPTB-IMI-EG在HEPES缓冲溶液中，随ATP、ADP、AMP、PPi浓度变化，其在510nm处荧光变化曲线。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的指导思想，给出下列系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。

实施例1

制备6-溴芘-1-甲醛（化合物2）

将1-溴芘28.1g（0.1mol）溶于600mL二氯甲烷中，加入1.2当量的1,1-二氯甲醚，冰浴，加入1.8当量的四氯化钛，冰浴反应1小时，室温反应2小时，反应完成后水洗，硫酸镁干燥，过滤，旋干，得黄绿色固体粉末（30.0g，97%），直接用于下一步反应。

实施例2

制备（6-溴芘-1-基）甲醇（化合物3）

将30g化合物2（0.1mol）溶于500mL四氢呋喃中，冰浴，加入3当量的硼氢化钠乙醇溶液，冰浴反应1小时，室温2小时，加入稀盐酸淬灭反应，加入大量水稀释，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，过滤，旋干，得白色固体粉末（29.6g，98%），直接用于下一步反应。

实施例3

制备2-（（6-溴芘-1-基）甲氧基）四氢-2H-吡喃（化合物4）

将29.6g化合物3（0.1mol）溶于300mL二氯甲烷中，加入1.5当量的3,4-2H-二氢吡喃和0.1当量的对甲苯磺酸吡啶盐，室温下反应6小时，水洗，硫酸镁干燥，用石油醚/乙酸乙酯过硅胶柱色谱，得白色固体粉末（15g，42%）。TOF MSEI+(C₂₂H₁₉BrO₂):m/z=394。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ:8.45-8.39(dd,2H,J=22Hz),8.26-8.20(dd,2H,J=24.4Hz),8.17-8.08(m,3H),8.04(d,1H,J=8Hz),5.54(d,1H,J=12.4Hz),5.24(d,1H,J=12Hz),4.85(t,1H,J=7.2Hz),4.02(m,1H),3.64(m,1H),1.77(m,1H),1.65(m,5H)。

实施例4

制备双（6-（（四氢-2H-吡喃-2-基氧）甲基）芘-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼（化合物5）

氩气保护下，将10g化合物4（25mmol）溶于200mL脱气乙醚，-78℃条件下加入1当量正丁基锂的乙烷（2.2M）溶液，缓慢恢复至室温，反应2小时，再次降温至-78℃，加入0.45当量的2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，缓慢恢复至室温，反应过夜，二氯甲烷稀释，水洗，硫酸镁干燥，用石油醚/乙酸乙酯过硅胶柱色谱，得黄色固体粉末（2.4g，45%）。MALDI-TOF(C₅₉H₆₁BO₄):[M+Na]⁺=867.5。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ:8.50(d,2H,J=9.2Hz),8.25-8.17(m,6H),8.03-7.96(m,6H),7.53(d,2H,J=9.2Hz),7.07(s,2H),5.54(d,2H,J=12Hz),5.23(d,2H,J=12Hz),4.85(s,2H),4.04(m,2H),3.65(m,2H),2.89(m,1H),2.87(m,2H),1.91(m,2H),1.75(m,10H),1.36(d,6H,J=6.8Hz),0.94(d,6H,J=4.4Hz),0.76(d,6H,J=4.4Hz)。

实施例5

制备双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼（化合物6）

氩气保护下，将1.89g三苯基膦（7.2mmol）溶于20mL二氯甲烷中，滴加0.37mL溴素（7.2mmol），滴加完后加入2g化合物5（2.4mmol）的二氯甲烷溶液，反应2小时，水洗，硫酸镁干燥，用石油醚/乙酸乙酯过硅胶柱色谱，得黄色固体粉末（1.5g，79%）。MALDI-TOF(C₄₉H₄₃BBr₂):[M–H]^-=801.1。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ:8.50(d,2H,J=9.2Hz),8.29-8.26(m,6H),7.98-7.89(m,6H),7.52(d,2H,J=9.2Hz),7.08(s,2H),5.27(s,4H),3.03(m,1H),2.90(m,2H),1.36(d,6H,J=6.8Hz),0.97(d,6H,J=6Hz),0.75(d,6H,J=6Hz)。

实施例6

制备IMI-EG

氩气保护下，将7.4g二咪唑基甲烷（50mmol）溶于50mL乙腈，加热至80℃，加入0.2当量的乙二醇-2-溴乙基甲醚，反应48小时，冷却，将溶液旋干，加丙酮溶解，加入乙酸乙酯析出黄色粘稠物，倒掉上清液，乙酸乙酯搅拌洗涤4小时，倒掉上清液，得到黄色粘稠物IMI-EG（3.66g,98%）。ESI-MS(C₁₄H₂₃N₄O₃Br):[M-Br]⁺=295.1。¹H-NMR(400MHz,DMSO),δ:9.42(s,1H),8.04(s,1H),8.00(s,1H),7.80(s,1H),7.50(s,1H),6.99(s,1H),6.51(s,2H),4.40(t,2H,J=12.8Hz),3.79(t,2H,J=12.8Hz),3.55-3.53(m,2H),3.49-3.45(m,4H),3.41-3.38(m,2H),3.23(s,3H)。

实施例7

制备DPTB-IMI-EG

氩气保护下，将1g化合物6（1.2mmol）溶于DMF中，加入4当量的IMI-EG，80℃反应48小时，旋干，加水溶解，将其加入到过量的六氟磷酸钾水溶液中，将沉淀物溶于丙酮，然后加入到过量的四丁基氯化铵丙酮溶液中，过滤得黄色粉末DPTB-IMI-EG（1.53g,93%）。ESI-MS Spectrum(C₇₇H₈₉BC_l4N₈O₆):[M-2Cl]²⁺/2=651.3。¹H-NMR(400MHz,DMSO),δ:9.91(s,2H),9.71(s,2H),8.66(d,2H,J=9.2Hz),8.49(d,2H,J=8Hz),8.42(d,2H,J=9.2Hz),8.19(d,10H,J=7.6Hz),8.00(s,2H),7.84(s,4H),7.77(d,2H,J=8.8Hz),7.15(s,2H),6.77(s,4H),6.33(s,4H),4.40(t,4H,J=12.8Hz),3.78(t,4H,J=12.8Hz),3.53(t,4H,J=4.4Hz),3.47-3.42(m,8H),3.37-3.36(m,4H),3.31(s,6H),3.03(m,1H),2.90(m,2H),1.31(d,6H,J=6.8Hz),0.93(s,6H,J=6Hz),0.68(s,6H,J=6Hz)。

实施例8

将实施例7中的DPTB-IMI-EG用于ATP检测：将DPTB-IMI-EG溶于10mmol HEPES缓冲溶液中，得到DPTB-IMI-EG的浓度为10^-5M。向该溶液中加入不同浓度的ATP水溶液，使ATP的最终浓度范围为0-2000μM。最后测得不同ATP浓度下DPTB-IMI-EG的荧光光谱（见附图1），随着ATP浓度增加，溶液荧光增强。相同条件加入ADP、AMP、PPi，溶液荧光强度受其影响很小。取510nm处荧光强度变化与ATP、ADP、AMP、PPi浓度作图（见附图2），随ADP、AMP、PPi浓度增加，溶液在510nm处的荧光强度变化很小，而随ATP浓度增加，溶液在510nm处的荧光强度逐渐增加。

实施例9

将实施例7中的DPTB-IMI-EG用于细胞内ATP成像：取两组小鼠成纤维细胞，一组作为实验组加入ATP分解酶，一组作为对照组不加ATP分解酶，培养30min。向两组培养液中加入DPTB-IMI-EG水溶液，使DPTB-IMI-EG的最终浓度为10^-6M，继续培养30min。在荧光显微镜下成像，对照组细胞内荧光很强，而实验组细胞内荧光很弱，这是由于细胞内ATP被ATP分解酶消耗所致。

Claims

1.通式（I）的化合物，

其中

独立的任选为-W⁺-、-W⁺-(CH₂)_m-W⁺-、或-R¹ ₂N⁺-，m为0、1、2、3，W⁺为含N杂芳基阳离子，R¹独立的选自烷基、芳基；n=1或2；R独立的任选为C_1-8烷基、

X^-独立的任选为F^-、Cl^-、Br^-、I^-。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的W⁺为咪唑基阳离子、吡啶基阳离子。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的

为

4.权利要求1中所述化合物的制备方法，包括以下步骤：将RW、(W-(CH₂)_m-RW⁺)X^-、或RR¹ ₂N于溶剂中，加入双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼，然后，再先后与六氟磷酸钾和四丁基卤（氟、氯、溴、或碘）化铵进行两次离子交换，得到通式（I）化合物，其中，R、R¹、W⁺、m、X^-如权利要求1中所定义，W为含N杂芳基。

5.根据权利要求1中所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：

其中R、R¹、W⁺、m、X^-如权利要求1中所定义，

（a）将1-溴芘溶于溶剂中，加入1,1-二氯甲醚与四氯化钛，得到6-溴芘-1-甲醛；

（b）将6-溴芘-1-甲醛溶于溶剂中，加入硼氢化钠，得到（6-溴芘-1-基）甲醇；

（c）将（6-溴芘-1-基）甲醇溶于溶剂中，加入对甲苯磺酸吡啶盐与3,4-2H-二氢吡喃，得到2-（（6-溴芘-1-基）甲氧基）四氢-2H-吡喃；

（d）将2-（（6-溴芘-1-基）甲氧基）四氢-2H-吡喃溶于溶剂中，加入正丁基锂搅拌，再加入2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，得到双（6-（（四氢-2H-吡喃-2-基氧）甲基）芘-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼；

（e）将三苯基膦溶于溶剂中，加入溴素搅拌，加入双（6-（（四氢-2H-吡喃-2-基氧）甲基）芘-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼，得到双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼；

（f）将RW、(W-(CH₂)_m-RW⁺)X^-、或RR¹ ₂N于溶剂中，加入双（6-（溴甲基芘）-1-基）（2,4,6-三异丙基苯基）硼，然后，再先后与六氟磷酸钾和四丁基卤（氟、氯、溴、或碘）化铵进行两次离子交换，得到通式（I）化合物，其中，W为含N杂芳基。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中其反应条件为氩气保护，脱气乙醚作溶剂，在-78℃下加入正丁基锂和2,4,6-三异丙基苯基硼酸酯，反应时间为8-12h；所述步骤（f）中，反应温度为70-80℃，反应时间为24-48h。

7.权利要求1-3任一项所述的化合物的用途，其用作三磷酸腺苷（ATP）荧光探针。

8.权利要求7所述的化合物的用途，在水溶液或缓冲溶液中识别ATP，适用pH范围优选为6.0-7.5，对ATP的响应范围优选为2-2000μM。

9.权利要求7所述的化合物的用途，其中所述通式（I）化合物在无任何载体携带下，可自主渗透细胞膜进入到细胞中。

10.权利要求7所述的化合物的用途，其中所述通式（I）化合物可用于细胞内ATP成像，优选的，所述化合物进入细胞后，在荧光显微镜下通过荧光探针可以观察到ATP被ATP分解酶分解的过程。