CN103822906B

CN103822906B - 一种用于细胞内hap纳米粒子定量检测示踪的方法

Info

Publication number: CN103822906B
Application number: CN201410055732.0A
Authority: CN
Inventors: 韩颖超; 王欣宇; 戴红莲; 李世普
Original assignee: Wuhan University of Technology WUT
Current assignee: Wuhan University of Technology WUT
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2034-02-19
Also published as: CN103822906A

Abstract

本发明涉及一种基于稀土荧光信号的羟基磷灰石纳米粒子定量检测方法，其特征在于包括有以下步骤：1）制定铕离子的荧光－浓度标准曲线；2）建立HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率并确定荧光－浓度标准曲线法的准确性；3）细胞内HAP纳米粒子定量检测；4）细胞内HAP纳米粒子溶解过程示踪。本发明主要优点是：1）生物相容性好、安全可靠，不存在放射性标记使用条件受限的问题；2）检测极限低，检测极限浓度可达0.5nM，所需样品量少；3）更准确的反应HAP纳米粒子在细胞内的溶解情况，铕离子的溶出与HAP纳米粒子的溶解匹配性高。

Description

一种用于细胞内HAP纳米粒子定量检测示踪的方法

技术领域

本发明涉及一种基于稀土荧光信号的羟基磷灰石纳米粒子定量检测方法，该方法可以用于细胞内磷灰石纳米粒子的定量检测以及溶解过程的示踪。

背景技术

羟基磷灰石（HAP）具有良好的生物相容性和生物活性，特别是HAP纳米粒子由于其高的比表面积对于药物、蛋白或基因等表现出强的吸附能力，而且HAP纳米粒子在细胞内溶酶体的酸性环境下（pH值5.0左右）也表现出较块状HAP高的溶解性，因此HAP纳米粒子可被看作是一种生物相容的、细胞内可降解的无机载体材料。对于HAP纳米粒子，除了相关制备技术研究外，进入细胞内HAP纳米粒子的量、HAP纳米粒子在细胞内的溶解过程、HAP纳米粒子在体内的组织分布及代谢等，也是HAP纳米粒子作为载体研究的重要内容，因此需要建立一种可以用于细胞内HAP纳米粒子定量检测和溶解过程示踪的方法，有望为HAP纳米粒子体内分布和代谢研究提供一种研究方法。

细胞内HAP纳米粒子的定量检测和溶解示踪以及体内分布和代谢的研究可以采用高分子荧光物质标记及钙或磷的放射性同位素标记的方法。虽然高分子荧光物质标记信号强，方法成熟，可以对HAP纳米粒子在细胞内以及体内组织分布进行定量检测，但是高分子荧光物质只是标记在HAP纳米粒子表面，HAP纳米粒子的溶解会造成两者的分离，无法实现对HAP纳米粒子细胞内溶解和体内代谢的准确示踪；放射性同位素标记信号强、精度高，可以实现HAP纳米粒子的体内定量检测和代谢过程的精确示踪，但是放射性大大限制了这种方法的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提供一种用于细胞内HAP纳米粒子定量检测示踪的方法，避免放射性同位素标记存在安全隐患、使用条件受限的缺陷，解决高分子荧光物质标记法在HAP纳米粒子溶解过程中荧光物质与HAP纳米粒子表面分离造成无法准确反应HAP纳米粒子溶解过程的问题。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种用于细胞内羟基磷灰石纳米粒子定量检测示踪的方法，其特征在于包括有以下步骤：

1）制定铕离子的荧光－浓度标准曲线；

2）建立HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率并确定荧光－浓度标准曲线法的准确性；

3）细胞内HAP纳米粒子定量检测：将细胞接种到96孔板中，37℃、5%CO₂培养1天后，吸去培养基，加入含有铕掺杂HAP纳米粒子的培养基，培养一定时间后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入硝酸溶液溶解细胞内的铕掺杂HAP纳米粒子，吸出溶液、离心，取上清用增强液稀释进行荧光强度检测，通过荧光－浓度标准曲线计算铕离子的浓度，进而得到HAP纳米粒子的量；

4）细胞内HAP纳米粒子溶解过程示踪：HAP纳米粒子与细胞共培养一定时间后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入新鲜培养基，继续培养不同时间后，对细胞内HAP纳米粒子进行定量分析，得到HAP纳米粒子浓度对时间的关系曲线，由此可以看出HAP纳米粒子的溶解情况。

按上述方案，所述的制定铕离子的荧光－浓度标准曲线的方法是：用荧光增强液将铕离子储存液配制成不同浓度的铕离子溶液，采用荧光分光光度计，测定不同浓度铕离子溶液在340nm激发下在618nm处的荧光发射强度，建立铕离子的荧光－浓度标准曲线。

按上述方案，所述的建立HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率并确定荧光－浓度标准曲线法的准确性的具体操作方法是：将20mg铕掺杂HAP纳米粒子加入到10mL的pH5.0缓冲液中，37℃温浴，采用等离子体发射光谱（ICP法）定时测定溶液中钙离子和铕离子的浓度，确定钙离子与铕离子的溶出比率，同时采用荧光分光光度计检测铕离子的荧光强度，通过铕离子的荧光－浓度标准曲线得到铕离子的浓度，与ICP法得到的铕离子浓度进行比较，确定荧光－浓度标准曲线法的准确性。

本发明的主要设计原理是：1）稀土元素铕掺入到HAP纳米粒子晶格中后表现出稳定的荧光信号，而且铕离子是取代HAP晶格中的钙，因此，将稀土铕离子定量掺入到HAP纳米粒子晶格中，借助铕的荧光信号，将细胞内HAP纳米粒子分离、用酸溶解后，通过铕离子的荧光－浓度标准曲线分析，可对进入细胞内的磷灰石纳米粒子的量进行定量检测；2）建立一定pH值下HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率，通过测定不同培养时间点细胞内铕离子的浓度，可对HAP纳米粒子在细胞内的溶解过程进行示踪，也可为HAP纳米粒子的体内组织分布和代谢过程研究提供一种安全可靠的检测方法。

本发明利用稀土铕离子可掺入到HAP纳米粒子晶格中及其自身的荧光特性，通过铕离子的荧光－浓度标准曲线定量分析铕离子的浓度，基于一定pH值下HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率，对细胞内HAP纳米粒子进行定量检测及溶解示踪。其主要优点是：1）生物相容性好、安全可靠，不存在放射性标记使用条件受限的问题；2）检测极限低，检测极限浓度可达0.5nM，所需样品量少，50－100μL即可满足检测要求；3）与高分子荧光物质标记法相比，可以更准确的反应HAP纳米粒子在细胞内的溶解情况，铕离子的溶出与HAP纳米粒子的溶解匹配性高，可以避免荧光物质在HAP纳米粒子溶解过程中与HAP纳米粒子分离无法准确反应HAP纳米粒子溶解的问题。

附图说明

图1为实施例所得铕离子的荧光－浓度标准曲线；

图2为实施例ICP法测定的铕掺杂HAP荧光纳米粒子在pH值5.0的醋酸－醋酸钠缓冲液中钙离子和铕离子随时间的溶出量；

图3为实施例ICP法测定的铕掺杂HAP荧光纳米粒子在pH值5.0的醋酸－醋酸钠缓冲液中钙离子和铕离子溶出量的摩尔比；

图4为实施例铕离子的荧光－浓度标准曲线法测定的铕掺杂HAP荧光纳米粒子在pH值5.0的醋酸－醋酸钠缓冲液中铕离子随时间的溶出量；

图5为实施例铕离子的荧光－浓度标准曲线法测定的不同培养时间平均每个细胞内HAP纳米粒子的量；

图6为实施例铕离子的荧光－浓度标准曲线法测定的细胞内HAP纳米粒子随时间的溶解百分率。

具体实施方式

下面以不同培养时间细胞内HAP纳米粒子定量分析为例来说明本发明，但是实施例不会构成对本发明的限制。

实施例1

1）称取36.641mg的六水合三氯化铕溶于100mL蒸馏水中得到浓度为1mM的Eu³⁺离子储存液，用荧光增强液将铕离子储存液分别稀释成不同浓度的铕离子溶液（0.5，0.99502，1.48522，1.97044，2.45098，2.92654，3.39789，3.86473，4.32713，4.78469，5.23807，5.68731nM），采用荧光分光光度计，测定不同浓度铕离子溶液在激发波长为340nm，618nm处的荧光发射强度，通过线性拟合得到铕离子的荧光强度y与浓度x间的关系（图1），y＝4.61949－0.65111x，R²＝0.9988。Eu³⁺离子的检测极限为0.5nM；

2）称取20mg的2%Eu掺杂HAP纳米粒子分散到10mL的pH值5.0的醋酸－醋酸钠缓冲液中，在37℃分别温浴0.5h，1.5h，3h，6h后，离心取上清液采用等离子体发射光谱（ICP法）测定溶液中钙离子和铕离子的浓度，得到钙离子和铕离子随时间的溶出浓度（图2），确定钙离子与铕离子的溶出比率（图3）。另外，取上清液用荧光增强液稀释100倍后采用荧光分光光度计检测铕离子的荧光强度，通过铕离子的荧光－浓度标准曲线计算得到铕离子的浓度（图4），与ICP法得到的铕离子浓度对比，结果比较接近，证明荧光－浓度标准曲线法的准确性。

3）称取2%Eu掺杂HAP纳米粒子14mg分散到10mL去离子水中得到1.4mg/mL的悬浮液。将3000个HepG2肝癌细胞接种到96孔板中，37℃、5%CO₂培养1天后，吸去培养基，加入用培养基稀释10倍的2%Eu掺杂HAP纳米粒子悬浮液，分别共培养15min、1h、2h、4h、6h、8h后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入硝酸溶液溶解细胞内的铕掺杂HAP纳米粒子，吸出溶液、离心，取上清用增强液稀释进行荧光强度检测，通过荧光－浓度标准曲线计算铕离子的浓度，得到HAP纳米粒子总量，除以细胞个数（空白组细胞计数）后得到单个细胞内HAP纳米粒子的量（图5），每组实验重复3次取平均值。HAP纳米粒子与细胞共培养15min、1h、2h、4h、6h、8h后，平均单个细胞内的HAP纳米粒子的浓度分别是（3.7±0.3）×10^－4μM、（5.5±0.4）×10^－4μM、（9.7±2.9）×10^－4μM、（6.5±0.3）×10^－4μM、（6.1±0.1）×10^－4μM、（3.8±1.3）×10^－4μM。

4）称取2%Eu掺杂HAP纳米粒子14mg分散到10mL去离子水中得到1.4mg/mL的悬浮液。将3000个HepG2肝癌细胞接种到96孔板中，37℃、5%CO₂培养1天后，吸去培养基，加入用培养基稀释10倍的2%Eu掺杂HAP纳米粒子悬浮液，共培养2h后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入硝酸溶液溶解细胞内的铕掺杂HAP纳米粒子，吸出溶液、离心，取上清用增强液稀释进行荧光强度检测，通过荧光－浓度标准曲线计算铕离子的浓度，得到HAP纳米粒子总量（Q）；平行实验组共培养2h吸去培养基后，加入新鲜培养基再继续培养，分别培养1天、2天、3天，培养后吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入硝酸溶液溶解细胞内的铕掺杂HAP纳米粒子，吸出溶液、离心，取上清用增强液稀释进行荧光强度检测，通过荧光－浓度标准曲线计算铕离子的浓度，分别得到培养1天、2天、3天后细胞内HAP纳米粒子量（Q_d），按照公示计算HAP纳米粒子在细胞内的溶解百分率（R%）：R%＝1－Q_d/Q，得到HAP纳米粒子在细胞内随时间的溶解情况（图6），每组实验重复3次取平均值。1天、2天、3天后细胞内HAP纳米粒子的溶解百分率R%分别达到41%、70%、80%。

Claims

1.一种用于细胞内羟基磷灰石纳米粒子定量检测示踪的方法，其特征在于包括有以下步骤：

1)制定铕离子的荧光－浓度标准曲线；

2)建立铕掺杂HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率并确定荧光－浓度标准曲线法的准确性；

3)细胞内HAP纳米粒子定量检测：将细胞接种到96孔板中，37℃、5％CO₂培养1天后，吸去培养基，加入含有铕掺杂HAP纳米粒子的培养基，培养一定时间后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入硝酸溶液溶解细胞内的铕掺杂HAP纳米粒子，吸出溶液、离心，取上清用增强液稀释进行荧光强度检测，通过荧光－浓度标准曲线计算铕离子的浓度，进而得到HAP纳米粒子的量；

4)细胞内HAP纳米粒子溶解过程示踪：含有铕掺杂HAP纳米粒子的培养基与细胞共培养一定时间后，吸去培养基，用PBS冲洗3遍，加入新鲜培养基，继续培养不同时间后，对细胞内HAP纳米粒子进行定量分析，得到HAP纳米粒子浓度对时间的关系曲线，由此可以看出HAP纳米粒子的溶解情况。

2.按权利要求1所述的用于细胞内羟基磷灰石纳米粒子定量检测示踪的方法，其特征在于所述的制定铕离子的荧光－浓度标准曲线的方法是：用荧光增强液将铕离子储存液配制成不同浓度的铕离子溶液，采用荧光分光光度计，测定不同浓度铕离子溶液在340nm激发下在618nm处的荧光发射强度，建立铕离子的荧光－浓度标准曲线。

3.按权利要求1或2所述的用于细胞内羟基磷灰石纳米粒子定量检测示踪的方法，其特征在于所述的建立HAP纳米粒子中钙离子与铕离子的溶出比率并确定荧光－浓度标准曲线法的准确性的具体操作方法是：将20mg铕掺杂HAP纳米粒子加入到10mL的pH5.0缓冲液中，37℃温浴，采用等离子体发射光谱(ICP法)定时测定溶液中钙离子和铕离子的浓度，确定钙离子与铕离子的溶出比率，同时采用荧光分光光度计检测铕离子的荧光强度，通过铕离子的荧光－浓度标准曲线得到铕离子的浓度，与ICP法得到的铕离子浓度进行比较，确定荧光－浓度标准曲线法的准确性。