CN104957264A - 一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法及应用，属于食品加工技术领域。本发明所提供的方法为将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，杀菌后冷却，添加主发酵剂和辅助发酵剂进行恒温发酵，加入CaCl2后再次恒温发酵，加入凝乳酶凝乳后进行切割，室温静置，升温搅拌凝块后进行保温搅拌，加盐后进行成熟处理；辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉。利用本发明方法可以制备富含γ-氨基丁酸的干酪，干酪GABA产量高达108.34mg/100g，本发明加入Lb.plantarumNDC 75017对干酪的理化指标、微生物指标和感官特性等没有任何不良影响，同时显著增加总游离氨基酸含量，能够改善干酪滋味气味，感官评分显著高于空白对照组。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法及应用，属于食品加工技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是自然界中存在的一种非蛋白类氨基酸，是人类大脑中的一种神经递质，直接影响人的性格以及压力的释放。γ-氨基丁酸通过增加氧气供应，来激活大脑血流速度，促进脑细胞代谢。γ-氨基丁酸还可以作用于血管运动中枢延髓来抑制抗利尿激素的分泌(抗利尿激素)。此外，GABA具有调节生长激素的分泌，降低血压扩张血管，并有利尿、抗抑郁、抗氧化、缓解疼痛等作用。γ-氨基丁酸可作为功能因子应用于食品中，生产富含GABA的功能食品，可以更好更广泛的发挥GABA的功能特性。
目前，采用生物合成法合成GABA，其反应过程简单，催化效率高，反应条件温和，并且该反应对环境条件要求较低。在谷氨酸脱羧酶(GAD)催化下，一步反应即可合成GABA。尽管在植物中GABA广泛存在，并且植物来源的GABA可作为食品的添加剂，但是从植物中提取GABA原料成本较高，导致产品价格昂贵，难以大面积推广。许多具有GABA生产能力的微生物被用于功能食品的生产，用以提高产品中GABA的含量，其产品具有成本低、含量高和安全可食用等特点，可作为功能因子应用于保健食品及普通食品中。与其他微生物相比，乳酸菌在富含GABA功能食品的生产中具有一定的优势，它可以利用食品工业中的副产品来生产富含GABA的功能食品，其成本较为低廉。
干酪是指凝结的新鲜的或成熟的乳制品，如牛奶，奶油，脱脂(或半脱脂)牛奶，酪乳，或者是它们的混合物。干酪容易消化且含有丰富的营养成分，干酪是维生素、矿物和其他微量元素，如氨基酸和蛋白质的重要来源。干酪的成熟方式有很多种。新鲜干酪不需要成熟，而半成熟乳酪的成熟期大于一个月。成熟干酪的成熟期至少是3个月，该过程会赋予干酪等浓厚更持久的风味味道。蛋白水解是干酪成熟过程中一个重要的过程，其降解产物有助于干酪风味的形成。干酪的感官特性与发酵过程中乳酸菌(LAB)的性质密切相关。在干酪制作过程中，主要用乳球菌作为乳酸发酵菌株，乳球菌将牛奶酸化，使得pH值降低到制作干酪所需要达到的酸度。此外，在干酪成熟的过程中，发酵剂中的乳酸菌可以赋予干酪特有风味。干酪成熟过程中，乳酸菌分泌的蛋白水解酶将酪蛋白降解成肽和氨基酸。游离氨基酸(FAA)是一系列分解反应的底物，是很多风味物质的前体。一些氨基酸如谷氨酸在酸性和厌氧条件下，经谷氨酸脱羧酶的作用，可能会发生脱羧反应，产生二氧化碳和γ-氨基丁酸(GABA)。
近几年，我国乳制品行业蓬勃发展，乳制品的消费量逐年增加，已经成为老百姓餐桌上不可或缺的食物之一。而且，消费者对于乳制品的需求不仅仅局限于对其口感和风味的要求，在乳制品中添加其他功能因子，提高乳制品的附加值，让老百姓在消费乳制品的同时，又能改善其他方面的机能，这是目前最有待于解决的问题。干酪容易消化且含有丰富的营养成分，它是维生素、矿物和其他微量元素，如氨基酸和蛋白质的重要来源。干酪成熟过后，其蛋白质被分解成胨、肽、氨基酸等可溶性物质，极易被人体消化吸收，不易引起肥胖。一些氨基酸如谷氨酸在酸性和厌氧条件下，经谷氨酸脱羧酶的作用，发生脱羧反应，生成二氧化碳和GABA。通过乳酸菌的作用生产富含GABA的干酪，使得干酪既具有干酪的营养价值及其保健功能，又具有GABA的特殊的生理功能，这种新型功能干酪具有很好的发展前景。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法，该方法是将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，杀菌后冷却，添加主发酵剂和辅助发酵剂进行恒温发酵，加入CaCl2后再次恒温发酵，加入凝乳酶凝乳后进行切割，室温静置，升温搅拌凝块后进行保温搅拌，加盐后进行成熟处理；所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉。
所述方法步骤如下：
1)将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，获得活化的主发酵剂和辅助发酵剂；所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉，活菌数在2.2×1010cfu/g以上；
2)向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，将原料乳杀菌后冷却至31℃，按照0.5％(W/V)的接种量添加步骤1)所得活化的主发酵剂，按照2％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的辅助发酵剂，40℃恒温发酵至pH为5.8；
3)向步骤2)的发酵液中加入原料重量0.01％-0.02％的CaCl2，40℃恒温发酵至pH为4.6；
4)向步骤3)的发酵液中加入凝乳酶凝乳，切割静置获得粗凝块；
5)31℃下缓慢升温搅拌步骤4)所得粗凝块，55℃时停止加热，然后进行保温搅拌，过滤切割获得凝块；
6)按步骤5)所得凝块重量的2％加盐，25～26℃下静置，然后置于温度为4℃、湿度为85％-90％的条件下成熟90天，获得富含γ-氨基丁酸的干酪。
步骤1)所述主发酵剂，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)，活菌数在108cfu/mL以上，并采用直投式活化；所述直投式活化，是直接将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化。
步骤1)所述所述辅助发酵剂，活化温度为30℃，活化过程为：将菌种按照2％(v/v)的接种量接种到脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h。
优选地，所述脱脂乳培养基，包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳。
优选地，步骤2)所述谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，添加至终浓度分别为：70-75mmol/L、10-15μmol/L。
优选地，步骤2)所述原料乳，为无抗生素鲜乳，总固形物12.25％，总蛋白3.00％，脂肪3.90％，乳糖5.3％。
优选地，步骤4)所述凝乳酶，添加量为12mg/kg，凝乳温度为35℃，凝乳时间为35min。
所述方法，具体步骤为：
1)将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，获得活化的主发酵剂和辅助发酵剂；所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉，活菌数在2.2×1010cfu/g以上；所述主发酵剂包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)，活菌数在108cfu/mL以上，采用直投式活化；所述直投式活化，是直接将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化；所述辅助发酵剂，活化过程为：将菌种按照2％(V/V)的接种量接种到脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h；所述脱脂乳培养基，包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳；
2)向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，将原料乳杀菌后冷却至31℃，按照0.5％(W/V)的接种量添加步骤1)所得活化的主发酵剂，按照2％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的辅助发酵剂，42℃恒温发酵至pH为5.8；所述谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，添加浓度分别为：75mmol/L、15μmol/L；所述原料乳，为无抗生素鲜乳，总固形物12.25％，总蛋白3.00％，脂肪3.90％，乳糖5.3％；
3)向步骤2)的发酵液中加入原料重量0.01％-0.02％的CaCl2，42℃恒温发酵至pH为4.6；
4)向步骤3)的发酵液中加入凝乳酶凝乳，切割静置获得粗凝块；所述凝乳酶，添加量为12mg/kg，凝乳温度为35℃，凝乳时间为35min；
5)31℃下缓慢升温搅拌步骤4)所得粗凝块，55℃时停止加热，然后进行保温搅拌，过滤切割获得凝块；
6)按步骤5)所得凝块重量的2％加盐，25～26℃下静置，然后置于温度为4℃、湿度为85％-90％的条件下成熟90天，获得富含γ-氨基丁酸的干酪。
以上所述任一方法应用于制备富含γ-氨基丁酸的干酪。
本发明采用两步发酵法，即在植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的最适温度(30℃)下进行活化，当菌数达到最高时，转入到产品中，选择谷氨酸脱羧酶的最适酶活温度(40℃)进行发酵，得到的干酪产品中GABA的含量非常高。本发明采用了谷氨酸钠(L-MSG)、磷酸吡哆醛(PLP)的最佳浓度，在最适酶活温度下进行发酵，大大提高了谷氨酸脱羧酶的活力，大大提高了GABA的产量。本发明加入植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017对干酪的理化指标、微生物指标、风味、质地和感官特性等没有任何不良影响。
本发明有益效果：
1.本发明利用从内蒙古通辽地区传统发酵乳制品中分离得到的一株高产GABA的植物乳杆菌NDC 75017和发酵剂联合生产富含GABA的干酪。采用优化后的培养基培养植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017，优化了谷氨酸钠和磷酸吡哆醛、谷氨酸脱羧酶的浓度，同时优化了发酵条件，采用两步法最终获得了一种富含GABA的干酪的制备方法。本研究为植物乳杆菌NDC 75017作为发酵剂应用于富含GABA的功能食品生产中奠定了基础。
2.在发明以植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017作为附属发酵剂与商业发酵剂结合生产富含GABA的干酪，实验结果表明，经过90d的成熟期后，干酪GABA产量达到108.34mg/100g，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的活菌数大于7.0log CFU/g。
3.本发明加入Lb.plantarumNDC 75017对干酪的理化指标、微生物指标、风味、质地和感官特性等没有任何不良影响，同时添加植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017可以显著增加干酪中总游离氨基酸的含量，并且能够改善干酪的滋味气味，感官评分显著高于空白对照组干酪。
4.本发明所采用的优化后的培养基活菌数可达到9.89±0.87log CFU/mL，比优化前增加了约一个数量级。植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017产酸能力也大幅度提高，显著低于优化前。与优化前相比，提前了12h进入GABA生产稳定期，而且GABA产量是未优化时的5.6倍。
附图说明
图1为不同碳源对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图2为不同浓度麦芽糖对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图3为不同氮源对植物乳杆菌NDC 75017活菌数及GABA产量的影响。
图4为不同复合氮源对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图5为不同复合氮源浓度对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图6为不同生长因子对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图7为不同浓度硫酸镁对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图8为谷氨酸钠浓度对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图9为磷酸吡哆醛浓度对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图10为发酵温度对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。
图11为植物乳杆菌NDC 75017在优化前的发酵曲线。
图12为植物乳杆菌NDC 75017在优化后的发酵曲线。
图13为干酪成熟过程中水分含量的变化。
图14为干酪成熟过程中蛋白质含量的变化。
图15为干酪成熟过程中脂肪含量的变化。
图16为干酪成熟过程中pH的变化。
图17为干酪成熟过程中乳酸菌的变化情况。
图18为干酪成熟过程中植物乳杆菌NDC 75017的变化情况。
图19为干酪成熟过程中总游离氨基酸的变化。
图20为空白对照组干酪成熟过程中各种游离氨基酸的变化。
图21为GABA干酪成熟过程中各种游离氨基酸的变化。
图22为干酪成熟过程中质构的变化。
图23为干酪成熟过程中GABA浓度的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：植物乳杆菌NDC75017的最佳培养基的确定
本实施例研究了不同碳源、氮源、生长因子对植物乳杆菌NDC75017合成γ-氨基丁酸的影响，以确定植物乳杆菌NDC75017的最佳培养基。
向含有12％脱脂乳的培养基中，分别添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖，作为唯一碳源进行实验，添加量为10g/L，于30℃静置培养48h，考察碳源对Lb.plantarum NDC75017生长及GABA产量的影响。同时考察了不同麦芽糖质量浓度对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响。最终确认最优的碳源为麦芽糖(图1)，添加量为20g/L(图2)。
考察了不同氮源对Lb.plantarum NDC 75017的菌数和发酵培养基中GABA的质量浓度的影响。结果(图3)发现：酵母粉效果最好，能够提高谷氨酸脱氢酶(GAD)的活性，但是酵母粉能有效提高GABA的质量浓度，但是不能有效增加菌数。而牛肉膏为单一氮源时恰好相反，能有效增加菌数，但是GABA的质量浓度较低。因此，实验在选择酵母粉作为氮源的基础上，配合其它氮源进行复配试验。研究表明：使用复合氮源时GABA的产量均优于酵母粉作为单一氮源的情况，并且以胰蛋白胨与酵母粉为复合氮源时GABA的产量最高。因此以胰蛋白胨与酵母粉为最佳复合氮源(图4)，确定最佳复合氮源质量浓度为25g/L(图5)。
通过考察不同生长因子：吐温80、硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌、维生素C对植物乳杆菌NDC 75017生长及GABA产量的影响发现：硫酸镁还可以促进GABA的生成，究其原因可能是菌体生长导致GAD合成量的增加，也有可能是由于Mg2+对GAD合成分泌具有刺激作用。因此，以最佳生长因子为硫酸镁，最佳质量浓度为0.8g/L(图6，图7)。
通过响应面法确定植物乳杆菌NDC75017的最佳培养基配方为：麦芽糖浓度为20g/L，复合氮源浓度为25g/L，MgSO4为0.6g/L，12％脱脂乳。
实施例2：产γ-氨基丁酸的最适发酵条件的确定
本实施例通过对植物乳杆菌NDC 75017产γ-氨基丁酸发酵条件进行优化，以确定产γ-氨基丁酸的最适发酵条件。分别考察了谷氨酸钠、磷酸吡哆醛及发酵温度对植物乳杆菌NDC75017生长及γ-氨基丁酸产量的影响。
通过考察谷氨酸钠发现：谷氨酸钠只能在一定范围内促进GABA的合成，谷氨酸钠的最适添加量为75mmol/L(图8)。
通过考察磷酸吡哆醛发现：磷酸吡哆醛最适添加量为15μmol/L(图9)。
通过考察发酵温度发现：发酵温度对乳酸菌的生长繁殖和GABA的产量影响很大，温度过高或过低均会影响GABA的产量。在30℃时活菌数最大，为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的最适生长温度(图10)，然而当发酵温度为35℃时，GABA的产量最高，但是植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的菌数略低。说明菌体的生长与GABA的产量是不一致的，这可能与菌体内部GAD的活性有关。
实施例3：优化前后植物乳杆菌NDC75017的发酵情况的对比
通过对比优化前后植物乳杆菌NDC75017的发酵曲线(优化前图11，优化后图12)发现，发酵的0～24h属于菌体生长阶段，此过程中，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的活菌数迅速增加，在24h时菌数达到最大，活菌数可达到9.89±0.87log CFU/mL，比优化前增加了约一个数量级。植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017产酸能力也大幅度提高，在发酵过程的前9h，发酵液的pH无明显变化，当发酵时间在9h～24h之间时，发酵液的pH迅速下降到最低点为4.49，显著低于优化前。随着发酵的继续进行，发酵液的pH会逐渐升高直至稳定，原因是酸性环境先诱导谷氨酸脱羧酶表达再进行谷氨酸钠脱羧反应，随着反应的进行需要消耗溶液中的H+，所以在发酵后期发酵液的pH有一个升高的过程。发酵的24～48h属于GABA生成阶段，在24～36h时，GABA生成速度较快，在36～48h时GABA的增长速度放缓。48h时，GABA产量达到最高值，48h后GABA的含量趋于稳定。与优化前相比，提前了12h进入GABA生产稳定期，而且GABA产量是未优化时的5.6倍。
实施例4：菌株的活化及干酪的制作
1)菌株的活化
商业干酪发酵剂R-707(汉森，丹麦)作为主发酵剂，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactisssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)。商业干酪发酵剂采用直投式活化，即直接按一定的比例将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化备用。按照0.5％(W/V)的接种量接种到灭菌的原料乳中，作为干酪制作的主发酵剂。
植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017冻干菌粉的活菌数在2.27×1010CFU/g以上。将菌种接种到优化的脱脂乳培养基(包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳)中进行活化，使菌体生长旺盛，达到对数生长期。然后按照2％(V/V)的接种量接种到优化的脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h。此时优化脱脂乳培养基中植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的活菌数在2.27×108cfu/mL以上。然后按照2％(V/V)的接种量接种到灭菌的原料乳中，作为干酪制作的辅助发酵剂。
空白对照组干酪：商业干酪发酵剂R-707，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)(活菌数在108CFU/g以上)；原料乳中添加75mmol/L谷氨酸钠和15μmol/L磷酸吡哆醛。
富含GABA的干酪：商业干酪发酵剂R-707，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)(活菌数在108CFU/g以上)，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017(活菌数在108CFU/g以上)，原料乳中添加75mmol/L谷氨酸钠和15μmol/L磷酸吡哆醛。
单独用商业发酵剂R-707制备的干酪为空白对照样。
2)干酪的制作
利用实施例1和实施例2优化得到的最优培养基和最优发酵条件进行下方实验。
1.干酪加工工艺流程
原料乳→均质→杀菌(63℃，30min)→冷却(至30～31℃)→加主发酵剂和辅助发酵剂→42℃条件下恒温发酵至pH值到5.8→加CaCl2(0.01％-0.02％)→40℃条件下恒温发酵至pH值到4.6→切割凝块(0.8cm3～1cm3)→静置→搅拌凝块升温→升温至55℃，保温搅拌→排除乳清→压榨(过夜)→4℃冷藏
2.干酪加工工艺具体步骤如下：
1)将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，获得活化的主发酵剂和辅助发酵剂；
所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉，活菌数在2.27×1010cfu/g以上；
主发酵剂包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactisssp.Cremoris),活菌数在108cfu/mL以上，采用直投式活化；直投式活化，是直接将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化；
辅助发酵剂，活化过程为：将菌种按照2％(V/V)的接种量接种到脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h；
脱脂乳培养基，包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳，12％脱脂乳；
2)向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，将原料乳杀菌(采用巴氏消毒63℃，保持30min)后冷却至31℃，按照0.5％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的主发酵剂，按照2％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的辅助发酵剂，40℃恒温发酵至pH为5.8；
谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，添加浓度分别为：75mmol/L、15μmol/L；
原料乳，为无抗生素鲜乳，总固形物12.25％，总蛋白3.00％，脂肪3.90％，乳糖5.3％；
3)缓慢均匀的向步骤2)的发酵液中加入原料重量0.01％-0.02％的CaCl2进行预酸化发酵，42℃恒温发酵至pH为4.6；
4)向步骤3)的发酵液中加入凝乳酶凝乳，切割静置获得粗凝块；所述凝乳酶，添加量为12mg/kg，凝乳温度为35℃，凝乳时间为35min；
5)31℃下缓慢升温搅拌步骤4)所得粗凝块，55℃时停止加热，然后进行保温搅拌，过滤切割获得凝块；
6)按步骤5)所得凝块重量的2％加盐，25～26℃下静置，然后置于温度为4℃、湿度为85％-90％的条件下成熟90天，获得富含γ-氨基丁酸的干酪。
3.工艺要点：
切割：凝乳酶添加30min后，当凝乳完全后进行切割。切割后凝块大小为0.7cm3～1cm3的，置于室温条件下15min，凝乳收缩，排出部分乳清。
堆酿：在温度为31℃的条件下进行缓慢的匀速升温搅拌，搅拌过程中避免将凝块打得过碎，当温度升至55℃时应该停止加热，但是要缓慢搅拌一会儿。然后用纱布过滤第二次排乳清，再将纱布吊起过夜排出剩余的乳清。
加盐：将凝块切割为手指大小的小块，按凝块重的2％加盐，充分搅拌，放置15min.温度控制在25～26℃，以防加盐时脂肪受损。
实施例5：富含GABA的干酪理化指标和微生物指标的测定
测定实施例4中富含GABA的干酪在成熟过程中水分、蛋白质、脂肪、pH、微生物指标。
干酪成熟过程中水分含量的变化见图13。随着成熟时间的延长，干酪中的水分含量呈缓慢下降趋势，GABA干酪的水分含量略高于与空白对照组干酪，但差异不显著(P>0.05)。
干酪成熟过程中总蛋白含量的变化见图14。随着干酪成熟期的延长，其总蛋白质含量逐渐增加，这种变化主要是由于干酪在成熟过程中一部分乳清继续排出和干酪自身一部分水分的蒸发，从而引起干酪的总的质量降低，因而蛋白质含量相对增加。实验组干酪的蛋白质含量与空白对照组干酪的蛋白质含量没有显著差异(P>0.05)。
干酪成熟过程中脂肪的变化见图15。随着干酪成熟期的延长，其脂肪含量逐渐增加，这种变化主要是由于干酪在成熟过程水分的蒸发，使得干酪的总质量降低，因而脂肪含量相对增加。空白对照组与GABA干酪中脂肪含量差异不显著(P>0.05)。
干酪4℃储藏过程中pH变化曲线见图16。从干酪成熟过程中的pH变化曲线可以看出，空白对照组干酪在成熟的前28d，pH呈下降趋势，28d以后，pH又略呈上升趋势。GABA干酪在成熟的前28d，pH值下降较快，28d以后，pH值下降缓慢缓。然后基本趋于稳定，GABA干酪的pH高于空白对照组干酪的pH要高(P<0.05)。这是因为在成熟的前28d，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017消耗大量的谷氨酸和谷氨酸钠用于合成GABA，此过程会消耗一部分H+，使得干酪pH下降较慢。同时，在此过程中商业发酵剂会消耗乳糖产生乳酸，因此，GABA干酪在这一阶段，pH的呈现下降趋势，但是与空白对照组相比，下降速度较为缓慢。然而在成熟的第28d～90d，由于GABA的合成基本完成，因此pH的变化趋于平缓。
分别对干酪成熟的第0、7、14、21、28、45、60、90天，对植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017以及GABA干酪和空白对照组干酪的乳酸菌总数进行测定。采用MRS培养基对干酪中的乳酸菌总数进行测定。对于植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017选择乳酸杆菌选择性培养基(RSL)进行活菌计数。干酪成熟过程中乳酸菌活菌变化趋势见图17。在干酪成熟的0～28天，两组干酪的乳酸菌活菌总数迅速下降，其中空白对照组干酪下降到更低的水平(P<0.05)。在干酪成熟的90d里，GABA干酪的乳酸菌活菌数始终高于空白对照组。这说明植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的加入不会影响商业发酵剂中乳球菌的生长。在干酪成熟的前30d，GABA干酪中的乳酸菌总数会高于空白对照组干酪。
干酪成熟过程中，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017活菌数的变化见图18。从图18可以看出，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017在干酪成熟的前14d，其活菌数较高，成熟14d后，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的活菌数开始下降。在成熟的第28d～90d，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017添加组及空白对照组之间乳酸菌菌数差异不显著(p>0.05)。在成熟期终止时，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017活菌数为7.89logCFU/g，超过了益生菌食品对于益生菌活菌数的要求：活菌数>7.0log CFU/g。说明植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017是可以用于干酪加工的辅助发酵剂，用来生产益生性干酪。
实施例6：干酪成熟过程中游离氨基酸和质构的测定
测定实施例4中富含GABA的干酪在成熟过程中总游离氨基酸、各种游离氨基酸含量和质构的变化。
1)干酪成熟过程总游离氨基酸(FAA)含量的变化
由图19可以看出，干酪成熟期间总FAA随成熟期延长逐渐增加，GABA干酪与空白对照组干酪所产生的FAA总量是有差别的，同一成熟时间GABA干酪比空白对照组干酪的FAA总量要高，这主要与干酪含水量和乳酸菌有关。后熟第90d GABA干酪和空白对照组干酪的氨基酸总量达到最高值，分别为166.02±9.32mg/100g，136.89±7.67mg/100g。说明植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017作为辅助发酵剂可以显著增加干酪中游离氨基酸的质量分数、加速蛋白质的降解。
2)干酪成熟过程各种游离氨基酸(FAA)含量的变化
本实验考察两组干酪在成熟0d～90d之间，17种游离氨基酸的变化如图20、21所示。空白对照组干酪成熟的过程中Glu，Val，Leu，Phe和Lys为蛋白质降解生成的主要FAA，这些氨基酸也是很多其他干酪成熟过程中的主要氨基酸。然而，GABA干酪的Glu明显低于空白对照组干酪。GABA干酪中，除了Val，Leu，Phe和Lys含量较高外，His与Ser的含量也明显高于空白对照组的含量。该结果说明不同乳酸菌产生的酶是不同的。
3)干酪成熟过程中质构的变化
从图22中可以看出在干酪成熟过程中，硬度总体呈现上升趋势，粘聚性、弹性总体呈现下降趋势。随着储存时间的延长，干酪中蛋白质开始逐渐水解，干酪硬度逐渐升高，而干酪的粘聚性和蛋白质水解度成反相关，因此随着干酪的成熟、蛋白水解增加，干酪的粘聚性降低。成熟前期，干酪硬度、粘聚性、弹性变化不大，但当成熟时间超过28d以后，空白对照组干酪和GABA干酪的硬度、粘聚性、弹性变化较为显著(P<0.05)。干酪成熟第90d时，空白对照组干酪和GABA干酪的硬度、粘聚性、弹性分别为467.12、0.423、0.671和472.88、0.408、0.659。成熟过程中，空白对照组干酪的硬度始终高于GABA干酪(P>0.05)，这可能是由于空白对照组干酪水分含量低于GABA干酪水分含量造成的，但是GABA干酪和空白对照组干酪之间没有显著性差异，所以植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017对干酪的质构没有不良的影响。
实施例7：干酪成熟过程中γ-氨基丁酸含量的变化
测定实施例4中干酪在成熟过程中γ-氨基丁酸含量的变化。
在干酪成熟的过程中，添加植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017干酪的GABA含量显著增加，平均值从87.12mg/100g增加到108.34mg/100g。由图23中可以看出，在干酪成熟的前14d，GABA含量迅速增加(P<0.05)，成熟第14d至28d，GABA含量增加较缓慢。在成熟第28d～90d，GABA含量趋于稳定。该结果与植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017菌数变化密切相关，在干酪成熟前14d，植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的菌数较高，而在第14d～30d菌数下降，影响了GABA的生产速度。对于空白对照组干酪，由含有的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)的商业发酵剂制成，由于未添加植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017，因此未检出GABA。实施例8：干酪成熟过程中感官评价结果
干酪在4℃成熟过程中，分别在第14d、28d、60d、90d进行感官评价。空白对照组干酪和GABA干酪的感官分数如表1所示，随着成熟时间的延长，两组干酪的色泽、滋味、气味、纹理、组织状态得评分均显著增加(P<0.05)。成熟期90d的干酪具有较好的感官品质，GABA干酪与空白对照组干酪在外型、色泽及纹理图案方面差异不显著，但添加了植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的干酪，具有较好的滋味和气味，说明植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017在一定程度上可以改善干酪的风味。
表14℃成熟90d后对干酪的感官分数
注：表中a、b、c、d、e、f表示差异显著性，字母不同表示差异显著，P<0.05；字母相同表示差异不显著，P>0.05。
实施例9：
本实施例与实施例4的区别在于：原料乳中添加72mmol/L谷氨酸钠和13μmol/L磷酸吡哆醛。经过90d的成熟，测定干酪中GABA的含量为98.67mg/100g。
实施例10：
本实施例与实施例4的区别在于：原料乳中添加70mmol/L谷氨酸钠和10μmol/L磷酸吡哆醛。经过90d的成熟，测定干酪中GABA的含量为93.22mg/100g。
实施例11：对照实施例
本实施例与实施例4的区别在于：辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)ATCC 14917菌，同样可以产生GABA。
采用实施例4的方法制备干酪后，对干酪成熟过程中GABA含量进行检测发现：90d的对照组的GABA含量为17.37mg/100g，明显低于利用植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017制备的干酪中GABA的含量(108.34mg/100g)，由此可见，利用本发明所提供的方法及使用植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017制备的干酪中GABA的含量显著高于现有技术，GABA的产量是植物乳杆菌(Lb.plantarum)ATCC 14917的6.2倍。
同时，实验发现，添加Lb.plantarum ATCC 14917对干酪滋味有不良影响，感官评分显著低于添加植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017组。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种富含γ-氨基丁酸干酪的制备方法，其特征在于，将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，杀菌后冷却，添加主发酵剂和辅助发酵剂进行恒温发酵，加入CaCl2后再次恒温发酵，加入凝乳酶凝乳后进行切割，室温静置，升温搅拌凝块后进行保温搅拌，加盐后进行成熟处理；所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，获得活化的主发酵剂和辅助发酵剂；
所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉，活菌数在2.2×1010cfu/g以上；
2)向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，将原料乳杀菌后冷却至31℃，按照0.5％(W/V)的接种量添加步骤1)所得活化的主发酵剂，按照2％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的辅助发酵剂，40℃恒温发酵至pH为5.8；
3)向步骤2)的发酵液中加入原料重量0.01％-0.02％的CaCl2，40℃恒温发酵至pH为4.6；
4)向步骤3)的发酵液中加入凝乳酶凝乳，切割静置获得粗凝块；
5)31℃下缓慢升温搅拌步骤4)所得粗凝块，55℃时停止加热，然后进行保温搅拌，过滤切割获得凝块；
6)按步骤5)所得凝块重量的2％加盐，25～26℃下静置，然后置于温度为4℃、湿度为85％-90％的条件下成熟90天，获得富含γ-氨基丁酸的干酪。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述主发酵剂，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)，活菌数在108cfu/mL以上，并采用直投式活化；所述直投式活化，是直接将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述所述辅助发酵剂，活化温度为30℃，活化过程为：将菌种按照2％(v/v)的接种量接种到脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脱脂乳培养基，包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，添加至终浓度分别为：70-75mmol/L、10-15μmol/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述原料乳，为无抗生素鲜乳，总固形物12.25％，总蛋白3.00％，脂肪3.90％，乳糖5.3％。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述凝乳酶，添加量为12mg/kg，凝乳温度为35℃，凝乳时间为35min。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为：
1)将主发酵剂和辅助发酵剂分别进行活化，获得活化的主发酵剂和辅助发酵剂；
所述辅助发酵剂为植物乳杆菌(Lb.plantarum)NDC 75017的冻干菌粉，活菌数在2.2×1010cfu/g以上；
所述主发酵剂包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lc.lactis ssp.lactis)和乳酸球菌乳脂亚种(Lc.lactis ssp.Cremoris)，活菌数在108cfu/mL以上，采用直投式活化；所述直投式活化，是直接将菌种投入脱脂乳培养基中，30℃活化；所述辅助发酵剂，活化过程为：将菌种按照2％(V/V)的接种量接种到脱脂乳培养基中，置于30℃培养18h；所述脱脂乳培养基，包含20g/L的麦芽糖，25g/L的酵母粉和胰蛋白胨，0.6g/L的MgSO4，12％脱脂乳；
2)向原料乳中添加谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，将原料乳杀菌后冷却至31℃，按照0.5％(W/V)的接种量添加步骤1)所得活化的主发酵剂，按照2％(V/V)的接种量添加步骤1)所得活化的辅助发酵剂，42℃恒温发酵至pH为5.8；
所述谷氨酸钠和磷酸吡哆醛，添加浓度分别为：75mmol/L、15μmol/L；所述原料乳，为无抗生素鲜乳，总固形物12.25％，总蛋白3.00％，脂肪3.90％，乳糖5.3％；
3)向步骤2)的发酵液中加入原料重量0.01％-0.02％的CaCl2，42℃恒温发酵至pH为4.6；
4)向步骤3)的发酵液中加入凝乳酶凝乳，切割静置获得粗凝块；
所述凝乳酶，添加量为12mg/kg，凝乳温度为35℃，凝乳时间为35min；
5)31℃下缓慢升温搅拌步骤4)所得粗凝块，55℃时停止加热，然后进行保温搅拌，过滤切割获得凝块；
6)按步骤5)所得凝块重量的2％加盐，25～26℃下静置，然后置于温度为4℃、湿度为85％-90％的条件下成熟90天，获得富含γ-氨基丁酸的干酪。
10.权利要求1-9所述任一方法，其特征在于，应用于制备富含γ-氨基丁酸的干酪。
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