CN105961587A

CN105961587A - 一种富硒酸奶的制备方法及应用

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Publication number: CN105961587A
Application number: CN201610273002.7A
Authority: CN
Inventors: 陈鹤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明公开了一种富硒酸奶的制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的发酵剂作为主发酵剂；将短乳杆菌活化后，接种至含有亚硒酸钠的培养基中，培养并收集菌泥，作为辅助发酵剂；将主发酵剂和辅助发酵剂加入到脱脂乳中，经过发酵和后熟处理后制备得到富硒酸奶。本发明方法可以提高富硒酸奶硒含量，同时降低对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的影响，适用于制备富硒酸奶。

Description

一种富硒酸奶的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种富硒酸奶的制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

硒是人体必需微量元素，大量研究表明硒的生理功能主要有：免疫调控、肿瘤的预防与辅助治疗、维持脑健康、Ⅱ型-糖尿病的辅助治疗。由于其在体内发挥着重要作用，且膳食中硒的摄入往往不足，因此许多人群需要补充硒。而硒作为膳食补充剂的特点是：低剂量有益，高剂量会产生生物毒性，严重时会导致生物体死亡。因此，美国对于成年男女推荐补硒的安全剂量是每人补食亚硒酸钠55μg/day。但是，上述推荐补食剂量较低，无法发挥其在疾病辅助治疗中的作用。因此，寻找低生物毒性、高生物利用度的硒的膳食补充剂，一直是食品营养与健康学领域研究的热点。

硒的生物毒性还与其补充形式有关。目前硒的主要补充形式有：无机硒、有机硒(硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸等)、富硒酵母(无机硒被酵母转化为有机硒)、单质硒(也称纳米硒)以及富硒乳酸菌(无机硒被乳酸菌转化为单质硒)。在上述硒的膳食补充剂中生物毒性最低的是富硒乳酸菌，大量研究表明富硒乳酸菌具有较丰富的生物学作用。富硒酸奶是以富硒乳酸菌为载体将硒引入酸奶，其同样具有生物毒性低的优点。

近年来，由于国家重视并采用一系列严格的监管方法，我国乳制品行业快速发展，乳制品行业已经成为食品产业中发展最快的行业。各式各样的乳制品已经走上了老百姓的餐桌，随着乳制品样式越来越多，消费者已经不满足于风味和口感的改进，更多消费者会选择养乐多、N多益具有功能性的乳制品；如何在乳制品中加入功能因子，在提高其营养成分的同时，提高乳制品的附加值，是乳制品生产企业首要解决的问题。黑龙江是我国原料乳生产大省，具有优质的生产环境和完备的乳品资源，拥有完达山、龙丹、飞鹤、太子乐、华威等自主知名品牌，还引入了雀巢、伊利、光明、蒙牛、贝因美等国内外著名品牌。开发功能性乳制品，提高产品附加值，既符合企业利益，也为地方经济发展做了贡献。

因此，本发明利用从开菲尔基质中筛选出的一株富硒优势菌株(Lb.brevis CGMCCNO.6683)，将其作为辅助发酵剂与商业发酵剂联合来制备富硒酸奶。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种富硒酸奶的制备方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种富硒酸奶的制备方法，该方法将含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的发酵剂作为主发酵剂；将短乳杆菌活化后，接种至含有亚硒酸钠的培养基中，培养并收集菌泥，作为辅助发酵剂；将主发酵剂和辅助发酵剂加入到脱脂乳中，经过发酵和后熟处理后制备得到富硒酸奶。

优选地，所述含有亚硒酸钠的培养基中亚硒酸钠含量为0.01mM-20mM。

优选地，所述短乳杆菌为CGMCC NO.6683。

优选地，所述方法，步骤如下：

1)将含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的混合发酵剂作为主发酵剂；

2)将短乳杆菌CGMCC NO.6683活化后接种至含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养至稳定期，离心获得发酵离心液，收集菌泥，作为辅助发酵剂；

3)将步骤1)的主发酵剂和步骤2)获得的辅助发酵剂加入到脱脂乳中，于43℃发酵，当pH值降至4.5以下时，置于4℃后熟12h，获得富硒酸奶。

优选地，步骤2)所述发酵培养基中加入终浓度为0.2mM-5mM的亚硒酸钠，培养24小时。

优选地，所述亚硒酸钠终浓度为1mM。

优选地，步骤2)所述培养至稳定期，是在30℃、150r/min下培养。

优选地，步骤2)所述接种，接种量为12％。

更优选地，所述方法，具体步骤为：

2)将CGMCC NO.6683菌体接种至MRS培养基中，活化后接入含有1mM亚硒酸钠的MRS发酵培养基中，在30℃、150r/min下培养至稳定期后离心，获得发酵离心液，收集菌泥，作为辅助发酵剂；所述MRS培养基，初始pH值为6.5，包含35g/L葡萄糖，15g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏；

以上所述任一方法在制备富硒酸奶中的应用。

本发明有益效果：

本发明提供了一种富硒酸奶的制备方法，以富硒短乳杆菌为发酵剂制备富硒酸奶，其硒含量明显高于添加亚硒酸钠制备的富硒酸奶，富硒短乳杆菌将亚硒酸钠转化为更安全的单质硒，短乳杆菌作为载体将其带入富硒酸奶发酵过程，提高了富硒酸奶硒含量，降低了其对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的影响。

附图说明

图1富硒短乳杆菌制备得到富硒酸奶的扫描电镜分析；

(A，不添加富硒短乳杆菌的酸奶；B添加1mM组富硒短乳杆菌的酸奶)。

图2扫描电镜分析富硒酸奶。

图3扫描电镜分析菌体表面颗粒状物质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用的实验菌株以及复习酸奶的完整制备方法如下:

实验菌株

短乳杆菌保藏编号为CGMCC NO.6683，保藏在中国普通微生物菌种保藏中心。CGMCCNO.6683是从开菲尔基质中筛选出的一株富硒优势菌株，开菲尔基质采自西藏地区牧民家中。

酸奶发酵剂(主发酵剂)YO-MIX购自Danisco，含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

富硒酸奶的完整制备方法：

2)将CGMCC NO.6683菌体按照12％的接种量接种至MRS培养基中，活化后接入含有0.01mM-20mM亚硒酸钠的MRS发酵培养基中，在30℃、150r/min下培养至稳定期后离心，获得发酵离心液，收集菌泥，作为辅助发酵剂；所述MRS培养基，初始pH值为6.5，包含35g/L葡萄糖，15g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏；

更优选地，步骤2)所述亚硒酸钠终浓度为1mM。

实施例1：

1.添加亚硒酸钠制备的富硒酸奶

1.1不同浓度亚硒酸钠对富硒酸奶质构的影响

传统发酵酸奶的制备，是在酸奶发酵过程中加入亚硒酸钠。我们采用市售酸奶发酵剂在发酵前分别加入0mg/L、2mg/L、5mg/L、20mg/L和50mg/L亚硒酸钠，将其放置于43℃发酵，pH降至4.5以下时，置于4℃后熟12h。通过观察可知，加入不同浓度亚硒酸钠制备的酸奶均呈现表面光滑，当加入亚硒酸钠浓度为0、2、5mg/L时，酸奶呈均匀一致的乳白色，当加入亚硒酸钠浓度为20、50mg/L时，酸奶呈现均匀一致的淡粉色，以上富硒酸奶具有酸乳固有的乳香味，无任何不良气味；组织均匀细腻，无粗颗粒或杂质，无乳清析出。

采用TA.XT.Plus质构仪测定不同亚硒酸钠浓度富硒酸奶的质构，结果如表1所示。当亚硒酸钠浓度为2mg/L时，亚硒酸钠的加入对于酸奶质构影响不大，硬度、粘度、凝聚性、弹性、保水力等指标未出现明显差异；当亚硒酸钠浓度为于5mg/L时，除了硬度和保水力外，其他指标与市售酸奶发酵剂无明显差异。当亚硒酸钠浓度为20mg/L或50mg/L时，对酸奶质构所有指标影响明显。

对于采用添加亚硒酸钠方式制备的富硒酸奶，亚硒酸钠添加量需要严格控制，应控制在5mg/L以下，优选为2mg/L。

表1 添加亚硒酸钠制得酸奶质构

1.2富硒酸奶中硒残余量的测定

通过利用原子吸收分光光度火焰法测定酸奶发酵上清液中硒含量，通过下面公式计算富硒酸奶中亚硒酸钠转化率。

由表2可知，当添加2mg/L亚硒酸钠时，酸奶上清液中硒含量仅为0.29mg/L，当添加5mg/L亚硒酸钠时，酸奶上清液中硒含量为0.22mg/L，当添加20mg/L和50mg/L时，酸奶上清液中硒含量分别6.77mg/L和18.75mg/L。当亚硒酸钠浓度低于5mg/L时，酸奶上清液中硒的残余量极少，说明加入酸奶中的无机硒绝大部分基本转化为有机硒。实验结果说明，酸奶中亚硒酸钠添加量在5mg/L以下时，富硒酸奶中的发酵剂对于亚硒酸钠转化率较高。

表2 添加不同浓度亚硒酸钠酸奶发酵上清液中硒残余量

2添加富硒短乳杆菌制备的富硒酸奶

2.1富硒短乳杆菌作为酸奶发酵剂发酵性能的研究

分别在MRS初始培养基中加入0mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM和20mM亚硒酸钠，接入短乳杆菌后30℃发酵36小时，测定发酵上清液中硒含量以及通过平板计数法测定富硒短乳杆菌生物量，结果如表3所示。分别取10mL发酵液离心后收集菌泥作为富硒短乳杆菌并置于脱脂乳中4℃备用。

表3 不同浓度亚硒酸钠对富硒短乳杆菌生物量和上清液中硒含量的影响

2.2富硒酸奶中短乳杆菌生物量以及硒元素含量

富硒酸奶的制备是将10mL发酵液离心收集的菌泥加入40mL脱脂乳中，同时加入酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，43℃发酵，pH降至4.5以下时，置于4℃后熟12h。将上述短乳杆菌制备的富硒酸奶分别命名为0mM组、0.5mM组、1mM组、2mM组、5mM组、10mM组和20mM组。

根据表2并经过计算，在酸奶发酵前0mM组中实际加入了1.5x10⁸CFU mL^-1的短乳杆菌；0.5mM组加入了1.1x10⁸CFU mL^-1的短乳杆菌以及12.9mg/L的硒；1mM组加入了0.6x10⁸CFU mL^-1的短乳杆菌以及24.7mg/L的硒；2mM组加入了3.7x10⁷CFU mL^-1的短乳杆菌以及35.5mg/L的硒；5mM组加入了2x10⁶CFU mL^-1的短乳杆菌以及60.9mg/L的硒；10mM组加入了4.5x10³CFU mL^-1的短乳杆菌以及90.8mg/L的硒；20mM组加入了0.8x10⁶CFU mL^-1的短乳杆菌以及151.4mg/L的硒。

上述短乳杆菌发酵剂随着亚硒酸钠含量的升高，颜色从淡红色到深红色逐步加深，其中10mM组和20mM组发酵剂的颜色未见明显变化。

2.3富硒酸奶质构的研究

我们采用市售酸奶发酵剂在发酵前分别加入上述富硒酸奶发酵剂，将其放置于43℃发酵，pH降至4.5以下时，置于4℃后熟12h。采用TA.XT.Plus质构仪测定不同亚硒酸钠浓度富硒酸奶的质构，结果如表4所示。

通过观察可知，加入不同组别的富硒短乳杆菌制备的酸奶均呈现表面光滑的特征，各组差异主要在颜色上，其中0mM组、0.5mM组、1mM组发酵酸奶呈均匀一致的乳白色，2mM组、5mM组、10mM组和20mM组发酵酸奶呈现均匀一致的淡粉色。以上富硒酸奶具有酸乳固有的乳香味，无任何不良气味；组织均匀细腻，无粗颗粒或杂质，无乳清析出。

如表4可知，0.5mM组、1mM组和2mM组的发酵酸奶质构与0mM组非常接近，说明富硒短乳杆菌作为发酵剂对于富硒酸奶质构影响不大。5mM组的硬度略高于0mM组，其保水力略低于0mM组。10mM组和20mM组的质构相对于0mM组差别较明显，尤其是硬度降低较明显，其原因可能是富硒短乳杆菌引入的硒对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生物量产生了影响。

表4 添加富硒短乳杆菌制得富硒酸奶质构

添加亚硒酸钠制备的富硒酸奶，当亚硒酸钠浓度超过2mg/L时，对于富硒酸奶的质构影响明显。而富硒短乳杆菌作为发酵剂制备的富硒酸奶，通过富硒短乳杆菌引入的硒浓度更高，2mM组引入了35.5mg/L，并且其质构与空白相比未发生明显变化。

2.4添加富硒短乳杆菌的酸奶上清液中亚硒酸钠含量的研究

收集0mM组、0.5mM组、1mM组、2mM组、5mM组、10mM组和20mM组制备的富硒酸奶，将酸奶置于冷冻离心机中10000rpm离心10分钟后收集酸奶上清液用于测定硒含量。由表1可知，加入不组别富硒短乳杆菌制备的富硒酸奶上清液中硒元素含量都非常低。其中，20mM组中硒元素含量最高，也仅为0.33mg/L。

表1 添加不同含量富硒短乳杆菌酸奶发酵上清液中硒残余量

酸奶上清液中硒含量较低说明酸奶中无机硒(亚硒酸钠或者硒酸钠)含量较低。因此，硒元素在富硒酸奶中是以非无机硒形式存在。实验数据同样说明短乳杆菌作为载体，将硒元素引入酸奶过程，可以提高酸奶中硒元素的含量。

2.5两种方式制备的富硒酸奶感官评定

分别制备0mg/L、2mg/L、5mg/L、0mM组、0.5mM组、1mM组、2mM组、5mM组、10mM组、20mM组酸奶，在酸奶后熟后，进行感官评定。以上各组富硒酸奶的感官分数如表2所示，添加亚硒酸钠制备的富硒酸奶，当亚硒酸钠浓度为2mg/L时发酵酸奶呈淡红色，各感官指标均较好，当亚硒酸钠浓度达到5mg/L时，感官指标出现明显下降，可能是亚硒酸钠对酸奶发酵剂产生了影响。添加0mM组、0.5mM组、1mM组、2mM组、5mM组、10mM组、20mM组富硒短乳杆菌制备得到的富硒酸奶，其感官指标均低于添加0mg/L或2mg/L亚硒酸钠制备得到的富硒酸奶，说明富硒短乳杆菌的加入对酸奶发酵剂性能产生了一定的影响，特别是添加10mM组和20mM组，感官指标下降明显。

表2 4℃成熟12h后对酸奶的感官分数

3富硒酸奶中微生物组成的研究

3.1添加亚硒酸钠制备的富硒酸奶中活菌数研究

对加入0mg/L、2mg/L、5mg/L、20mg/L和50mg/L亚硒酸钠制备的酸奶进行均质，均质后稀释一定梯度进行平板计数，分别采用M17平板培养基厌氧条件下对嗜热链球菌进行计数，MRS培养基37℃厌氧条件下对保加利亚乳杆菌进行计数，结果如表2所示。

由表3可知，当添加20mg/L亚硒酸钠时，嗜热链球菌生物量为1.45x10⁷±0.12x10⁷，保加利亚乳杆菌生物量为5.75x10⁶±0.55x10⁶Cfu/mL。当添加50mg/L亚硒酸钠时，嗜热链球菌生物量为5.45x10⁶±0.35x10⁶Cfu/mL，保加利亚乳杆菌生物量为7.32x10⁵±0.41x10⁵Cfu/mL。添加20mg/L和50mg/L亚硒酸钠相对于不添加亚硒酸钠的实验，活菌数下降了1-2个数量级。

表3 添加不同浓度亚硒酸钠酸奶中发酵剂菌种生物量

以上实验说明亚硒酸钠的添加对于酸奶发酵剂嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生物量均产生了一定的影响，随着亚硒酸钠浓度从2mg/L增至50mg/L，酸奶发酵剂生物量呈下降趋势。以上实验还解释了添加亚硒酸钠导致酸奶质构性能发生变化的原因，是由于影响了发酵剂的生物量，从而影响了富硒酸钠的发酵性能。

3.2添加富硒短乳杆菌制备的富硒酸奶中活菌数研究

取0mM组、0.5mM组、1mM组、2mM组、5mM组、10mM组和20mM组制备的富硒酸奶，将样品稀释后采用平板计数的方法测定发酵剂的生物量。嗜热链球菌是涂布在M17培养基上43℃厌氧培养48小时；短乳杆菌是在MRS培养基上30℃好氧培养36小时；保加利亚乳杆菌是在MRS培养基上37℃厌氧培养5天。保加利亚乳杆菌和短乳杆菌形态学差异较明显。短乳杆菌为圆形菌落，呈亮白色，表面光滑，而保加利亚乳杆菌菌落较长并呈细丝状。

表4 添加不同浓度富硒短乳杆菌酸奶中发酵剂菌种生物量

由表4可见，由于发酵温度高于短乳杆菌最适生长温度，短乳杆菌生物量与发酵前相比有所下降，但每组均只下降一至两个数量级，影响不是很显著。不加入短乳杆菌时，嗜热链球菌生物量为2.57x10⁸±0.38x10⁸CFU mL-1，保加利亚乳杆菌生物量为5.80x10⁷±0.50x10⁷CFU mL^-1。对于嗜热链球菌，仅在10mM组和20mM组其生物量下降了一个数量级。对于保加利亚乳杆菌，同样仅在10mM组和20mM组，其生物量下降了一个数量级。富硒酸奶中发酵剂生物量的情况可以解释富硒酸奶质构数据的原因。10mM组和20mM组质构数据与0mM组差异明显是由于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生物量下降的原因。

3.3富硒酸奶中微生物形态分析

为了进一步观察嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和短乳杆菌在富硒酸奶中的菌体形态，采用扫描电镜对富硒酸奶进行分析，结果如图1所示。

由图1可知，8A为不添加富硒短乳杆菌的酸奶，视野中可以发现球状的嗜热链球菌以及长杆状的保加利亚乳杆菌。8B为添加1mM组富硒短乳杆菌的酸奶，视野中可以看到嗜热链球菌、短乳杆菌以及保加利亚乳杆菌。图1中除了发酵剂外还有颗粒状物质，这些颗粒状物质可能是乳中种类繁多的蛋白质。通过图1可知，添加1mM组富硒短乳杆菌制备的酸奶，其电镜下的形态与普通酸奶未见明显差别。

3.4富硒酸奶中存在单质硒的证明

短乳杆菌可以将亚硒酸钠转化为单质硒，为了确定将富集单质硒短乳杆菌作为发酵剂制备得到的富硒酸奶是否存在单质硒，我们采用扫描电镜结合能谱分析仪的方法分析发酵酸奶中颗粒状物质，观察其是否出现硒元素特异性吸收峰。酸奶中存在大量粒径在100-200nm的蛋白质，因此在富硒酸奶中寻找单质硒存在一定难度。

由图2可知，在酸奶中存在大量直径在50nm-200nm的颗粒状物质，采用能谱分析仪进行扫描后未发现硒元素(图3B)。

对菌体表面凸起物进行能谱分析，结果如图3所示，在1.5kev附近出现了0价硒元素特异性吸收峰，说明通过添加富硒短乳杆菌制备的富硒酸奶中存在单质硒。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种富硒酸奶的制备方法，其特征在于，将含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的发酵剂作为主发酵剂；将短乳杆菌活化后，接种至含有亚硒酸钠的培养基中，培养并收集菌泥，作为辅助发酵剂；将主发酵剂和辅助发酵剂加入到脱脂乳中，经过发酵和后熟处理后制备得到富硒酸奶。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述含有亚硒酸钠的培养基中亚硒酸钠含量为0.01mM-20mM。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述短乳杆菌为CGMCC NO.6683。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养基中加入终浓度为0.2mM-5mM的亚硒酸钠，培养24小时。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤2)所述亚硒酸钠终浓度为1mM。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养至稳定期，是在30℃、150r/min下培养。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述接种，接种量为12％。

9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤为：

10.权利要求1-9所述任一方法在制备富硒酸奶中的应用。