CN104946657A

CN104946657A - 白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

Info

Publication number: CN104946657A
Application number: CN201510423177.7A
Authority: CN
Inventors: 刘玉娣; 安兴奎; 侯茂林
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: CN104946657B

Abstract

本发明涉及“白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用”，属于生物技术领域。内参基因A1TU，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱不同龄期最稳定的内参基因A1TU，从而为今后研究不同龄期基因表达水平以及白背飞虱的基因功能方面建立坚实的基础。

Description

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学中昆虫体内稳定表达的内参基因技术领域，具体地涉及白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因及其筛选方法及应用。

背景技术

白背飞虱White-backed planthopper(Sogatella furcifera(Horváth))，属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，飞虱科，一生经历3个发育阶段，包括卵期、若虫期和成虫期，成虫具有迁飞习性。水稻是白背飞虱适宜寄主，白背飞虱不仅可以刺吸水稻韧皮部汁液，还可以传播多种病毒病，给水稻生产造成重大损失。白背飞虱在我国分布广泛，包括华南、华中、华北、东北以及西南稻区，西北稻区可达新疆自治区的米泉等地都有其分布。

白背飞虱完成一个生命周期需要经过卵、若虫、成虫三种虫态，属于渐变态昆虫。白背飞虱一年发生3～4代，雄成虫较雌成虫羽化早，雌成虫一生只交配1次，雄成虫可交配3～4次，雌虫产卵的部位集中于稻株基部。白背飞虱存在着形态和行为的多态现象，即迁飞型(以长翅型为代表)和居留型(以短翅型为代表)，温度对白背飞虱翅型的分化起着重要的作用，但一般情况下白背飞虱短翅型雄虫极少见。

近年来，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术以其快速、灵敏、准确、重复性高、可定量、适用范围广等特点优势，已被广泛应用于基因表达分析。在使用相对定量方法时需要一个在实验组和对照组中表达量恒定的参考基因作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物，用来归一化二者的实验数据，这里的参考基因即为内参基因。一个内参基因在特定的实验条件下能持续稳定的表达是其可应用的基本前提。理想的内参基因应该满足以下条件：不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增；高度或中度表达；稳定表达于不同类型的细胞和组织；表达水平与目标基因相似；不受任何内源性或外源性因素的影响。常用的内参基因都是维持正常的细胞生命活动所必须的基因，如Actin、18S、GAPDH、Tublin等，但是没有一种内参基因mRNA表达水平在所有的条件下是一成不变的，一些内参基因在某种特定条件下，其表达可能发生变化。因此，研究不同的环境条件下，某一有机体内基因的表达情况，内参基因的选择至关重要。

发明内容

本发明提供的白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因，为白背飞虱不同龄期内参基因的选择提供依据。

同时本发明还提供其筛选方法及应用。

本发明根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱不同龄期最稳定的内参基因，从而为今后研究不同龄期基因表达水平以及白背飞虱的基因功能方面建立坚实的基础。

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU的筛选方法，包括如下步骤：

(1)白背飞虱饲养：白背飞虱为实验室饲养种群，饲养于人工气候箱中，饲养条件是27±1℃，75±5％，光周期为16h光照：8h黑暗；

(2)获得内参基因序列：GenBank数据库公开的白背飞虱18S序列，登录号为JX556779.1；RPL9和RPL10的序列由转录组测序获得，其获得具体过程为利用Ion Proton II测序平台，对白背飞虱唾液腺组织总RNA进行高通量测序，根据注释结果查找获得RPL9和RPL10的序列，与数据库中的序列Blast比对，确定了RPL9和RPL10的部分序列，见SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；基于NCBI已经公开的相关基因序列，设计合成了6个白背飞虱内参基因简并引物，序列如下：

(3)确定白背飞虱内参基因序列：简并引物PCR扩增获得序列进行克隆并测序，将获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定内参基因序列，见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8；

(4)设计特异性的荧光定量引物：基于获得白背飞虱9个内参基因序列，设计特异性荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性，并设置10倍梯度稀释建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；

(5)提取白背飞虱1龄、2龄、3龄、4龄、5龄、雄性成虫和雌性成虫总RNA，分别反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；

(6)将实时荧光定量PCR实验数据输入到在线分析软件Refinder进行内参基因稳定性分析，确立最稳定表达的内参基因。

步骤(3)中PCR扩增的反应条件如下：94℃，3min，(94℃，30sec，55℃，30sec,72℃，1min)35个循环，72℃延伸1min，4℃保存。

步骤(3)中核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

纯化步骤(2)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含目的片段的阳性克隆菌株，对所获得的阳性克隆进行序列测序，测序所得的序列与NCBI数据库进行BLAST比较分析，进而确定所得的核苷酸序列为白背飞虱内参基因序列。

所述步骤(4)的方法为：提取白背飞虱的总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR扩增，荧光染料为SYBR GreenⅠ。

所述的qPCR扩增采用两步法，即95℃预变性15min，PCR反应为95℃，10sec，60℃，32sec，40个循环，最后是溶解曲线分析，步骤为：95℃，15sec，60℃1min，95℃，30sec，60℃，15sec。

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU作为内参基因在研究不同龄期基因表达水平中的应用。

本发明采用以下技术方案：

选取同一饲养条件(27±1℃，75±5％，光周期为16h光照：8h黑暗)下不同龄期的白背飞虱1龄、2龄、3龄、4龄、5龄、雄性成虫和雌性成虫，提取总RNA，反转录合成cDNA。然后进行荧光定量PCR验证9个内参基因稳定性情况，筛选出白背飞虱不同龄期中最稳定的内参基因。这9个内参基因包括：延伸因子1-α(Elongation factor 1-alpha，EF1A)、泛素(Polyubiquitin，UB)、核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18，RPS18)、肌动蛋白(Actin1，ACTIN)、α-1微管蛋白(Alpha-1-tubulin，A1TU)、3-磷酸甘油醛(Glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、核糖体蛋白L9(Ribosomal protein L9，RPL9)、核糖体蛋白L10(Ribosomal proteinL10，RPL10)和18SrRNA(18S)。其中18S序列在数据库已经公开发表、RPL9和RPL10的序列是根据转录组测序获得。另外6个内参基因包括：EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU，GAPDH是根据数据库已经公开的相关序列设计简并引物，PCR扩增并克隆测序，确定了部分序列。随后基于此序列设计荧光定量相关的引物，进行实时荧光定量PCR验证。所获得数据，采用在线分析软件RefFinder(http://www.leonxie.com/referencegene.php)进行数据分析。从而筛选出白背飞虱不同龄期下最稳定表达的内参基因。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次克隆得到白背飞虱的6个内参基因(EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU，GAPDH)部分基因片段。

2.本发明首次验证和比较了9个常用内参基因(EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU，GAPDH，RPL9，RPL10，18S)在白背飞虱虫体中的表达量。

3.本发明设计的定量PCR引物具有特异性，并具有90％以上的扩增效率，能够为准确定量提供坚实基础。

4.本发明利用荧光定量PCR技术首次验证并筛选出了白背飞虱不同龄期稳定的内参基因A1TU。

附图说明

图1.白背飞虱6个内参基因(EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU，GAPDH)简并引物的PCR电泳图；

其中：M代表DL2000DNA Marker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1：GAPDH；2：A1TU；3：ACTIN；4：UB；5：RPS18；6：EF1A。

图2.白背飞虱9个内参基因的溶解曲线。

其中：横坐标代表在溶解曲线扩增阶段，从60℃到95℃之间的温度范围；纵坐标代表SYBRGreen I荧光染料结合到目标片段的双链DNA后，进入溶解曲线扩增阶段，随温度升高，被ROX标准化后的SYBR Green I荧光信号值即R_n的导数值，峰值指在所对应的温度下R_n急剧降低的拐点处的导数值。

图3.白背飞虱9个内参基因的10倍梯度稀释扩增曲线。

其中：横坐标代表qPCR扩增时的循环数，即Ct值；纵坐标代表在对应循环数下的R_n值。

图4.荧光定量PCR实验9个内参基因的Ct值绘制成盒须图，Ct值越大基因表达量越小，Ct值越小基因表达量越大。从图中可以看出18S表达量最高，UB表达量最小。

其中横坐标为基因名称，纵坐标为Ct值。盒须图上下边缘分别代表最大值和最小值，盒子中间的一条横线代表中位数，盒子内部的小正方形代表平均值，盒须图外部的线代表异常值。

图5.Refinder对9个内参基因的稳定性分析结果。

其中横坐标为内参基因名称，从左至右稳定性排序，越靠近坐标轴右侧稳定性越高。纵坐标代表Refinder计算出的内参基因的稳定值。

具体实施方式

以下对本发明具体的实施方法做进一步的说明，其中涉及分子生物学相关操作的参照Sambrook J，Russell DW编著的《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版，黄培堂译，2002年)进行，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，定量PCR在ABI 7500Real-Time PCRSystem上按照仪器操作指南和荧光定量试剂使用说明进行。

1、白背飞虱虫源的饲养。本实验所用虫源均来自本实验室人工气候箱饲养的白背飞虱种群，饲养条件为温度：27±1℃；湿度：75±5％；光周期为16h光照：8h黑暗。用Taichung Native1(TN1)分蘖期水稻饲养。

各发育龄期白背飞虱的收集。各样品的组成为：一龄若虫50头，二龄若虫50头，三龄若虫30头，四龄若虫30头，五龄若虫20头，雌性成虫20头和雄性成虫20头。每个处理组有四个生物学重复。

2、RNA提取过程：将白背飞虱样本放入1.5ml离心管中，加入1000μlTrizol试剂，加入6粒小钢珠(直径1mm)，利用研磨机(MM400德国莱驰混合型球磨仪)研磨3min，静置后加入0.2mL的氯仿，充分振荡混匀15sec，室温放置5min，在4℃条件下12000rpm离心15min；吸取上清液于另一EP管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃条件下12000rpm离心15min；弃上清液，加入1mL75％的乙醇，在4℃条件下8000rpm离心5min；弃上清液，并在超净工作台放置5min，待RNA干燥，加入50μL的DEPC处理水，使RNA沉淀充分溶解，-80℃保存以备用。

总RNA完整性检测：1％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，100V，15min；质量和浓度检测：1μl检测样品，NanoDrop-2000微量分光光度计检测OD260/280值和浓度，OD260/280值介于1.9～2.1且单峰度为合格样品。

3、第一链cDNA反转录合成，按照Fast Quant RT Kit(With gDNase)试剂盒的说明配置20μl反转录体系：0.8μg总RNA，5×gDNA Buffer 2μl，配制成10μl，42℃反应3min；然后向反应液中加入l0×Fast RT Buffer2μl，FQ-RT Primer Mix 2μl，RT Enzyme Mix1μl，RNase-Free水5μl，轻柔混匀后42℃反应15min，接下来95℃，3min，-20℃保存备用。所用反转录反应操作均在冰上操作进行。反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

以上述反转录合成的cDNA为模板，利用设计合成的各内参基因的简并引物(见下表1)PCR扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与目的片段一致，然后切胶纯化回收目的片段，进行克隆和测序，然后采用NCBI Blastn进行序列比对分析。PCR扩增体系：30μl反应体系包括：10×PCR Buffer(含15mmol/L Mg²⁺)3μl，dNTP(各2.5mM)2.4μl，F/R引物各1.2μM，cDNA模板3μl，DNA Taq酶0.75U，加灭菌水至30μl。见图1。

表1扩增内参基因的简并引物

另外，设计基于获得的内参基因各片段的序列设计荧光定量PCR扩增的特异性引物。(见表2)。配制20μL荧光定量PCR体系如下：Super RealPreMix(2×)10μL，cDNA2μL，F/R引物各0.2μM，添加灭菌蒸馏水至20μL。反应程序为：95℃，15min，接下来95℃,15sec，60℃，32sec，40个循环，循环结束后是溶解曲线分析，步骤为：95℃，15sec，60℃，1min，95℃，30sec，60℃，15sec。定量PCR仪为ABI 7500Real-Time PCR System。见图2。

以溶解曲线是否为单峰判断各引物的特异性。另外，以10倍梯度稀释cDNA模板，建立内参基因引物扩增标准曲线(图3)，根据标准曲线斜率确立每对引物的扩增效率(E)，E＝10^(-1/斜率)-1，以扩增效率是否介于80％～110％之间为标准判断引物是否适用。标准曲线荧光定量反应体系及循环程序同前述。SYBR荧光试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。

表2内参基因的引物序列、扩增效率、扩增长度和相关系数列

不同龄期的白背飞虱实验样本按照上述的方法进行荧光定量PCR，导出各候选内参基因在各处理样本中的荧光定量PCR循环阈值Ct值。见图4。

将所获得Ct按照在线分析软件Refinder的要求导入到软件中进行稳定性分析。见图5。稳定性排序为：A1TU>GAPDH>RPL9>RPL10>EF1A>ACTIN>RPS18>18S>UB。

本发明按照定量PCR要求对不同龄期白背飞虱的9个内参基因进行了定量PCR验证，并进行了稳定性验证，最终筛选出了白背飞虱不同龄期最稳定的内参基因为A1TU，为未来白背飞虱不同龄期相关功能基因准确定量研究提供了坚实的基础。另外，实验中建立的定量PCR方法，为未来白背飞虱相关的定量PCR实验提供了有益的借鉴。

Claims

1.白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述的白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU的筛选方法，包括如下步骤：

(2)获得内参基因序列：GenBank数据库公开的白背飞虱18S序列，登录号为JX556779.1；RPL9和RPL10的序列由转录组测序获得，所述获得的具体过程为利用IonProton II测序平台，对白背飞虱唾液腺组织总RNA进行高通量测序，根据注释结果查找获得RPL9和RPL10的序列，并通过与数据库Blast比对确定RPL9和RPL10的部分序列，见SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；基于NCBI已经公开的相关基因序列，设计合成了6个白背飞虱内参基因简并引物，序列如下：

(4)设计特异性的荧光定量引物：基于获得白背飞虱内参基因序列，设计特异性荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性，并设置10倍梯度稀释建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；

3.根据权利要求2所述的方法，步骤(3)中PCR扩增的反应条件如下：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec,72℃，1min35个循环；72℃延伸1min，4℃保存。

4.根据权利要求2所述的方法，步骤(3)中核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

5.根据权利要求2所述的方法，所述步骤(4)的方法为：提取白背飞虱的总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR扩增，荧光染料为SYBR GreenⅠ。

6.根据权利要求4所述的方法，所述的qPCR扩增采用两步法，即95℃预变性15min，PCR反应为95℃，10sec，60℃，32sec，40个循环，最后是溶解曲线分析，步骤为：95℃，15sec，60℃1min，95℃，30sec，60℃，15sec。

7.权利要求1所述的白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU作为内参基因在研究不同龄期基因表达水平中的应用。