CN108103203A

CN108103203A - 暗黑鳃金龟内参基因及其应用

Info

Publication number: CN108103203A
Application number: CN201711321016.2A
Authority: CN
Inventors: 鞠倩; 曲明静; 李晓; 姜晓静; 杜龙; 杨珍; 江晨; 李建文; 曾庆朝
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Qingdao Russell Ipm Biotech Co ltd
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108103203B

Abstract

一种暗黑鳃金龟内参基因，所述内参基因为延伸因子1α(EF1α)、核糖体蛋白S5(RPS5)和真核肽链释放因子3(eRF3)；其中EF1α的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，RPS5的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，eRF3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。本发明从多个候选内参基因中筛选出表达最稳定的暗黑鳃金龟内参基因，以及基于内参基因序列设计的实时荧光定量PCR引物，解决了现有暗黑鳃金龟荧光定量PCR实验中没有可靠内参基因的现状。筛选出的内参基因适用于分析功能基因在暗黑鳃金龟不同发育阶段或不同组织部位的表达水平，能够提高检测数据的可靠性、稳定性和重复性。

Description

暗黑鳃金龟内参基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种暗黑鳃金龟内参基因及其应用。

背景技术

暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)属节肢动物门，昆虫纲，鞘翅目，鳃金龟科，是重要的世界性农林业害虫，在我国危害性具各类金龟子之首。暗黑鳃金龟一年发生一代，一生经历卵气、幼虫期、蛹期、成虫期四个发育阶段，成虫属夏季发生型，一般羽化的成虫在6月上中旬开始发生，8月中下旬结束。成虫取食榆树、杨树、柳树、槐树等树叶，具有暴食性特点。幼虫主要在地下为害，取食花生、大豆、薯类、麦类等多种作物中的地下部分，常造成作物大面积减产甚至绝收。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术由于其灵敏、准确、低成本、易造作性等优点被广泛应用于基因表达模式的分析，其中的相对定量方法通常用来检测目的基因表达量的改变。然而，在qRT-PCR的实际应用中，样品准备、RNA质量，反转录效率等会导致系统性误差，为了消除这种误差，通常选择一个或者几个表达量恒定的基因作为参照物来归一化定量PCR的数据。持家基因由于其在维持正常生命活动中的重要性，通常可以在不同细胞或组织稳定表达，故常被选作内参基因，例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，β-肌动蛋白(β-actin)等。通常有两种选择内参基因的方式，第一个是参考其他研究者的相关报道，第二个是选择近源物种已经应用的持家基因。然而，越来越多的证据表明，通常所认为的可以稳定表达的基因在不同实验条件下可能出现表达水平的变化，而且这种不稳定性会直接影响检测实验结果的准确性和可靠性。由此可见内参基因的选择是非常重要的。但目前国内外尚未见基于qRT-PCR技术筛选暗黑鳃金龟内参基因并分析其表达稳定性的研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种暗黑鳃金龟内参基因，并提供了利用该内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。

本发明选择肌动蛋白1(actin-1)、肌动蛋白2(actin-2)、核糖体蛋白S5(RPS5)、核糖体蛋白S8(RPS8)、延伸因子1α(EF1α)、真核肽链释放因子3(eRF3)、转录因子(E2F2)、3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)这8个基因作为候选内参基因，以暗黑鳃金龟的卵、1龄、2龄、3龄幼虫、蛹、雄性成虫和雌性成虫总RNA，以及成虫的触角、头、胸、腹、腿部等部位总RNA为材料分析上述候选内参基因的表达稳定性，为深入研究暗黑鳃金龟基因表达模式提供可靠的内参基因。

一种暗黑鳃金龟内参基因，所述内参基因为延伸因子1α(EF1α)、核糖体蛋白S5(RPS5)和真核肽链释放因子3(eRF3)；其中EF1α的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，RPS5的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，eRF3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。

EF1α序列：CGAATGTACGTCTGTAGATGCATTTCTACTGACTGTTACTTCAGTAGTTAAGTTCGCTGGAGCGAATACTACTACCATACCAGGTTTAAGGACACCAGTTTCAACACGGCCTACTGGTACTGTACCAATACCACCAATTTTGTAGACATCCTGTAATGGCAAACGGAGGGGTTTTTCAGTGGGACGAGATGGTGGTAGAATAGCGTCAAGGGCTTCAATTAAACATTTGCCATCAGCTTTTCCTTCTTTACGTTCAATAGCCCATCCTTTGAACCACGGCATTTTTGAAGATGGTTCCAACATGTTGTCTCCATGCCACCCAGAAATAGGAACGAAGGCTACAGCTGCTGGGTTGTAACCAATCCTTTTAATGTATGAGGATACTTCTTTTTTGATTTCTTCGAAACGAGGTTCAGAATATGGAGGTTCAGTAGAATCCATTTTGTTAACGCCTACAATCAATTGCTTGACACCAAGTGTAAAGGCCAGAAGAGCATGTTCACGAGTTTTCCGTTCTTTTAGA。

RPS5序列：CGTCTCTTCTGACAGGTGAACGTCGACAGCTTGTCTTCTAACTGTACCAGCACGTCCGATACGAGTTGAATCTTCACGTGGACCAGAATTAATAATGGCTGTTACTAGAATCTGTAATGGGTTCTCCCCCGTGAGCAAATGAATAATTTCAAACGCGTGCTTTACGATACGAACAGCCATTAATTTTTTTCCGTTGTTACGTCCATGCATCATAAGAGAATTGGTAAGACGTTCAACAATAGGACATTGAGCTTTCCTGAATCGTTTGGCGGCATAACGTCCTGCTGAATGCGGTAAATATTTCGCGTTCTTTTCTTTCACTGCAATATAATCCTGCAAAGACATTTCATCCACTTGCACATCATCCAAAACTCCAT。

eRF3序列：ATCGTAGCGTGATCGTCCATCTGTGGGATAATTGTAGAAAACTTCCAGACAAATAACAGCCTGCAGCATTCTATCCTCATAATACGCTACTTGATCTTGTTTTACGAATCTCGGTCTAGTTTTACTTTTATCACCTGTTTTCTTATCTACCAAACAGATTAAGGCTTTAACGGTAACCTCTTAGTGGCACAATAGA

进一步地，所述内参基因序列由转录组测序获得，并进行验证，验证方法如下：以暗黑鳃金龟成虫全身总RNA反转录获得的cDNA为模板，以如下引物对进行PCR扩增并测序；

内参基因EF1α对应的引物对为：正向引物5'-CTAAAGACGGACAAACTCGT-3'，反向引物5'-GAAACCAACATTATCTCCAG-3'；

内参基因RPS5对应的引物对为：正向引物5'-ATGGAGTTGCGATGATGTGC-3'，反向引物5'-CCCGTGCATAATAACCAGAT-3'；

内参基因eRF3对应的引物对为：正向引物5'-ATTGTGCCGCTGAAGAGGTT-3'，反向引物5'-CTTTTCCGATGGCGATTGTT-3'。

进一步地，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

进一步地，所述内参基因EF1α、RPS5和eRF3在分析不同组织部位及不同发育时期基因表达模式的实时荧光定量PCR实验中作为内参基因。

本发明还提供一种实时荧光定量PCR引物，以权利要求1所述的内参基因核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

内参基因EF1α的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-GATGGTGGTAGAATAGCGTCAAGG-3'，反向引物5'-AATGCCGTGGTTCAAAGGATGG-3'；

内参基因RPS5的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-GCGTGCTTTACGATACGAACAG-3'，反向引物5'-TATGCCGCCAAACGATTCAGG-3'；

内参基因eRF3的实时荧光定量PCR引物为：正向引物5'-AATGCCGTGGTTCAAAGGATGG-3'，反向引物5'-TAGCGTGATCGTCCATCTGTG-3'。

进一步地，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，58℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。

本发明从多个候选内参基因中筛选出表达最稳定的暗黑鳃金龟内参基因，以及基于内参基因序列设计的实时荧光定量PCR引物，解决了现有暗黑鳃金龟荧光定量PCR实验中没有可靠内参基因的现状。筛选出的内参基因适用于分析功能基因在暗黑鳃金龟不同发育阶段或不同组织部位的表达水平，能够提高检测数据的可靠性、稳定性和重复性。

附图说明

图1为实时定量PCR中各候选基因的表达水平，图中，1:actin-1；2:actin-2；3:eRF3；4:EF1α；5:E2F2；6:GPDH；7:RPS5；8:RPS8。

图2为RefFinder软件对持家基因稳定性分析的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1暗黑鳃金龟内参基因序列的获得

暗黑鳃金龟内参基因序列的获得方法，包括如下步骤：

(1)暗黑鳃金龟采集及饲养：成虫采集于山东省花生研究所莱西试验田，在覆有20-30cm土壤的饲养箱中饲养，饲养箱置于人工气候箱中，饲养条件是26±1℃，光周期为16L：8D，土壤含水量18％～20％。

(2)获得候选内参基因序列：、actin-1(SEQ ID NO:4)、actin-2(SEQ ID NO:5)、RPS5(SEQ ID NO:2)、RPS8(SEQ ID NO:6)、EF1α(SEQ ID NO:1)、eRF3(SEQ ID NO:3)、E2F2(SEQ ID NO:7)、GPDH(SEQ ID NO:8)的序列由转录组测序获得，具体过程为利用lluminaHiSeq2000测序平台，对暗黑鳃金龟成虫触角组织总RNA进行高通量测序，使用Trinity软件进行序列拼接，根据注释结果查找获得上述unigene的序列，并与数据库中的序列Blast比对，确定了unigene的全部或部分序列；并利用RT-PCR技术对上述来自转录组的持家基因序列进行了验证，具体方法为：基于上述持家基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0软件设计合成了RT-PCR引物(序列见表1)，提取暗黑鳃金龟总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板，上述引物进行PCR扩增，反应体系及反应程序如下：

PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含25ng模板、2.5mMdNTP、10mM正向引物、10mM反向引物、25mM MgCl2、1U Ex-Taq DNA聚合酶(Takara)。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

所获得序列进行克隆并测序，将获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定候选内参基因序列，见SEQ ID NO：1-8。

表1RT-PCR引物序列

实施例2内参基因的筛选

筛选在暗黑鳃金龟不同发育时期及不同组织部位稳定表达的内参基因，具体步骤如下：

按照Trizol试剂(Invitrogen)说明书对暗黑鳃金龟的卵、1龄、2龄、3龄幼虫、蛹、雄性成虫和雌性成虫以及雌雄成虫的触角、头、胸、腹部、腿部样品提取总RNA，并按照PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA。

以实施例1获得的各条内参基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1-8)为基础，利用Primer Premier5.0软件分别设计合成一对特异性扩增的荧光定量特异引物(表2)，利用上述cDNA为模板、以上述引物进行荧光定量PCR实验，每个样品重复4次，每组3个技术重复。反应体系与反应程序如下：

反应体系：总体积为20μL，含上述cDNA模板1μL、10μM上下游引物各0.8μL、10μLSYBR Premix Ex Taq II(Takara)。

反应程序：95℃预变性3min；95℃10s，58℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。反应结果后确认荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线。

利用内参基因稳定性分析软件RefFinder来分析实验结果得到的各候选基因的Ct值(图1)。RefFinder可以综合评价ΔCt、BestKeeper、NormFinder和geNorm四种方法的分析结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。最终筛选出在最稳定的内参基因为EF1α(表3；图2)。

表2qRT-PCR引物序列

表3各分析方法对候选内参基因稳定性的排名

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 暗黑鳃金龟内参基因及其应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 1

cgaatgtacg tctgtagatg catttctact gactgttact tcagtagtta agttcgctgg 60

agcgaatact actaccatac caggtttaag gacaccagtt tcaacacggc ctactggtac 120

tgtaccaata ccaccaattt tgtagacatc ctgtaatggc aaacggaggg gtttttcagt 180

gggacgagat ggtggtagaa tagcgtcaag ggcttcaatt aaacatttgc catcagcttt 240

tccttcttta cgttcaatag cccatccttt gaaccacggc atttttgaag atggttccaa 300

catgttgtct ccatgccacc cagaaatagg aacgaaggct acagctgctg ggttgtaacc 360

aatcctttta atgtatgagg atacttcttt tttgatttct tcgaaacgag gttcagaata 420

tggaggttca gtagaatcca ttttgttaac gcctacaatc aattgcttga caccaagtgt 480

aaaggccaga agagcatgtt cacgagtttt ccgttctttt aga 523

<210> 2

<211> 377

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 2

cgtctcttct gacaggtgaa cgtcgacagc ttgtcttcta actgtaccag cacgtccgat 60

acgagttgaa tcttcacgtg gaccagaatt aataatggct gttactagaa tctgtaatgg 120

gttctccccc gtgagcaaat gaataatttc aaacgcgtgc tttacgatac gaacagccat 180

taattttttt ccgttgttac gtccatgcat cataagagaa ttggtaagac gttcaacaat 240

aggacattga gctttcctga atcgtttggc ggcataacgt cctgctgaat gcggtaaata 300

tttcgcgttc ttttctttca ctgcaatata atcctgcaaa gacatttcat ccacttgcac 360

atcatccaaa actccat 377

<210> 3

<211> 196

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 3

atcgtagcgt gatcgtccat ctgtgggata attgtagaaa acttccagac aaataacagc 60

ctgcagcatt ctatcctcat aatacgctac ttgatcttgt tttacgaatc tcggtctagt 120

tttactttta tcacctgttt tcttatctac caaacagatt aaggctttaa cggtaacctc 180

ttagtggcac aataga 196

<210> 4

<211> 304

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 4

gatacttcgg atcaccttgg acatacgctc aaacgtgaaa gctcacagaa ataatgtttg 60

aaaaatacaa ggtcccagca ttttttcttg tgaaaaatgc tgcattggct gcttttgcaa 120

atgggcgatc aactgcttta gttatagata gtggggccac tcacacatca gctgtacctg 180

ttctagatgg atacgtgata tctaatgctg ttgttaaatc tccattagga ggtgattacc 240

tgattttaag agctcgggaa ttactagaaa gtcaggggat tgatctaaca ctttctgctt 300

tata 304

<210> 5

<211> 1003

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 5

atcaggatgg atcggtatgt gcaggcaggt tttgccggag atgatgcccc acgagcagtc 60

tttccatcca ttgttggtcg cccacgtcac cagggtgtta tggttggtat gggtcaaaaa 120

gattcatatg taggagatga agcacaaagc aaaagaggta tccttacctt gaaatatcca 180

attgaacatg gtatcgtcac aaattgggat gacatggaga aaatttggca tcacaccttc 240

tataatgaac ttcgtgttgc accagaggaa catccagttc tccttactga agcaccattg 300

aatccaaaag ctaaccgaga aaagatgaca caaattatgt ttgaaacatt caacacaccc 360

gctatgtatg ttgccatcca agctgtattg tcactgtatg cctctggtag gactactggt 420

attgtattgg attcaggaga tggtgtttca cacacagtac caatctatga aggttatgcc 480

ttacctcatg ctattttgcg tttggatttg gctggtagag atttgaccga ctacctcatg 540

aaaattctta cagaacgtgg ttattccttt acaaccacag ctgaaagaga aattgtacgt 600

gatatcaaag agaaactttg ttatgtagcc ctagacttcg aacaagaaat ggccacggcc 660

gctagctcaa gttcattaga aaaaagctat gaacttcctg atggacaggt tatcacaatt 720

ggcaatgaaa ggttccgttg cccagaagct ctcttccaac catcattcct gggtatggaa 780

gcttgtggaa tccatgaaac cacttacaat tcaattatga agtgcgacgt agacatccgt 840

aaagatttgt acgctaacac agttctatct ggtggtacta cgatgtaccc tggtattgct 900

gaccgtatgc agaaggaaat cactgcattg gccccatcca caatgaaaat caagatcatt 960

gcgccaccag aaaggaaata ctccgtatgg actaggatgt cga 1003

<210> 6

<211> 478

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 6

ctctacgatt aattgttctt ccagagcagc ttcgactttt gcagtacgtt gcctaacttc 60

atatttcttt tgaacttttt tacttctttt cttagacaat aatagcttct tctgcttcag 120

tcaattttgc tcccttcttt cacaccagag gtaaaatata atgtccttca taccattgcc 180

tgaatggtgt agcatcaatt acaacaattg cattttttac caatgtcttg gtacgaacca 240

attcattatt gctggcatta tacactacat caataatacg cgttttccgt gttgtacctt 300

cagaacccca cgcgaaattt cctgtatcga gacgcaatgc tctgtattta gtatttccac 360

ctctagtacg tacataatgc actctacgcg gtccaagctt agtgtttgcg gctgggcgac 420

ctaattcgaa cttcctcttc ttgcgaaggg gtttcctctt gccaccagtg gcccttct 478

<210> 7

<211> 859

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 7

ataacttatc ctataacaca tctactagat cacgggtatg gggcaacacc acgaaatcaa 60

ataataacaa atttcacaaa tcaagctcct gctgtaaaaa gaaaactcaa tatggataca 120

caacatatta ttgttccaat aaaacaagaa tttaaacaac ctcctcaacc taagaaacca 180

aaaagaacat cacctacaaa aaaaaacaca agatatgata cgtcacttgg tttattaacc 240

aaaaaattta ctgctttact tgagcaatca ccaaatggag ttgttgattt gaataaagcc 300

tctagtgata tgaaagtacc taaacgtagg atatatgata tcacaaatgt attagaaggg 360

ataggcatac ttgagaaaaa atctaaaaat aatattcagt ggaaaggtgg cagtaaaagt 420

tgttgctcaa taaaagcact gagaagagac atagaagctt tagataatca agaaaatgaa 480

cttaatgctt taataaaaat ggttacaaca gatttacata gcttaaacaa cagcaaacat 540

ggatatataa cttatcatga tttaagatcg atacctaaat ttaaaaataa aactgttatg 600

gctatccgtg ctcctcctaa tgctaattta gatgtgccag cagatacaga tgatggatat 660

aaaatacact tgaagagtga atcggaagag attgaagtat ttttatgtcc agaaacagtt 720

tcaccaccta aagtaaagaa cgttccaccc atggattcat tacttaagga ttatcctact 780

agcccaggac tctttacttt tacaactccg cctgtgcctc aatttgacag tccaacagca 840

gatctataaa cccatataa 859

<210> 8

<211> 1019

<212> DNA

<213> 暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)

<400> 8

gcctccaagg gggtgcagcc atagccaatt gttggagtaa tgtcacacac ttaccgaatt 60

tcgaaaacaa agttactatg tatgtttatg aagaaatgat aaatggcaaa aaattaacag 120

aaatcataaa tgaaacgcac gaaaatgtga agtatttacc aggacataaa ttaccagaga 180

acgtcgttgc aatcgctgat gttgttgagg ctgccaaaga tgcagatata ctaatttttg 240

tattgccaca tcaattcatt cgaacaattt gctcaacatt actaggaaaa attaagccca 300

cagcaattgg attatctctg attaagggtt ttgatcaagc tgagggaggc ggtatcgaat 360

taatttcaca tatcatcacg aaacacctga aaatacaatg cgcagtactt atgggcgcca 420

atcttgccgg cgaggtagcc gaagaaaagt tctgcgaaac gactataggc tgcagagatt 480

cgagattggc cccgcttctt cgggatatca tccaaactga ttacttcaga gtcgtcgtcg 540

ttgacgatga agacgccgtt gaaatctgtg gcgccctgaa gaatatcgtc gcctgcggtg 600

cgggattcgt ggacggctta ggattagggg acaacacgaa agcggcggtc atacgtttag 660

gcctaatgga aatgataaag ttcgtggacg tcttttatcc aggtagtaaa ttggcaacct 720

tctttgaaag ttgcggcgta gcggatttaa tcacaacgtg ttacggtggt aggaatagga 780

aagtaagcga agcctttgtg aaaacrcaga aatctataaa acagttagaa gacgagatgt 840

tgaatggaca gaaattgcaa gggccgatta cagctgaaga agtgaatttc atgttaaaat 900

cgaaaagaat ggaagatagg ttcccactct tcacagccat tcataaaata tgtactggtg 960

gcattaaagc taatgaatta ataaattgta taaaaatcat ccagacgttc atggtacgg 1019

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctaaagacgg acaaactcgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaaccaaca ttatctccag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagttgc gatgatgtgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccgtgcata ataaccagat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attgtgccgc tgaagaggtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttttccgat ggcgattgtt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccaatcggaa tcagaatatc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaagcagaag gtgttagatc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgtgtgacg aagaagttgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctgttggaat gtagaaagtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cactggcata aaagaagggc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aggacgagac gctaaacaag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgccgtcgac acctgaaatg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgacacctg aaatggtaac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcaagagagt cagcatcatc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tttggattgg acttggcgat 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gatggtggta gaatagcgtc aagg 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aatgccgtgg ttcaaaggat gg 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcgtgcttta cgatacgaac ag 22

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tatgccgcca aacgattcag g 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tagcgtgatc gtccatctgt g 21

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccgttaaagc cttaatctgt ttgg 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgctgttgtt aaatctccat tagg 24

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcagaaagtg ttagatcaat ccc 23

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctgtattgtc actgtatgcc tctg 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gtcaaatctc taccagccaa atcc 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cgagacgcaa tgctctgtat ttag 24

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gcccagccgc aaacactaag 20

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agcactgaga agagacatag aagc 24

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cattaggagg agcacggata gc 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

agacgccgtt gaaatctgtg 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ttcgtgttgt cccctaatcc t 21

Claims

1.一种暗黑鳃金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因为延伸因子1α(EF1α)、核糖体蛋白S5(RPS5)和真核肽链释放因子3(eRF3)；其中EF1α的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，RPS5的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，eRF3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的暗黑鳃金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因序列由转录组测序获得，并进行验证，验证方法如下：以暗黑鳃金龟成虫全身总RNA反转录获得的cDNA为模板，以如下引物对进行PCR扩增并测序；

3.根据权利要求2所述的暗黑鳃金龟内参基因，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸8min。

4.权利要求1所述的暗黑鳃金龟内参基因，其特征在于，所述内参基因EF1α、RPS5和eRF3在分析不同组织部位及不同发育时期基因表达模式的实时荧光定量PCR实验中作为内参基因。

5.一种实时荧光定量PCR引物，其特征在于，以权利要求1所述的内参基因核苷酸序列为基础，利用PrimerPremier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

6.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，58℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。