CN104926739A

CN104926739A - 基于氮杂环修饰的维生素d2衍生物、合成及应用

Info

Publication number: CN104926739A
Application number: CN201510314467.8A
Authority: CN
Inventors: 方志杰; 潘峰
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: CN104926739B

Abstract

本发明公开了一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物、合成及其应用。以维生素D₂为原料，通过取代反应，环加成等系列反应合成了基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物。本发明的合成原料易得、反应条件温和，操作简单，且产率较高，新合成的维生素D₂衍生物对人体乳腺癌细胞MCF-7具有很好的抑制作用，具有潜在的药用价值。

Description

基于氮杂环修饰的维生素D2衍生物、合成及应用

技术领域

本发明涉及一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物、合成及其应用，属于医药化学领域。

背景技术

维生素D₂是维生素D类的一种重要的活性物质，其在人体内的代谢途径是人体内获得的维生素D首先和血浆蛋白相结合，被血浆蛋白运往肝脏，在酶的作用下转化成25-(OH)-VD，在肝脏中生成的25-(OH)-VD接着被运往肾脏，在羟化酶的作用，使得C-1位上一个羟基，成为具有生物活性的1,25-(OH)₂-VD。维生素D₂具有促进钙吸收、骨钙释放和维持对机体起重要作用的钙离子的恒定，同时能够调节人体对磷的代谢，抑制癌细胞增殖、调节血压和免疫系统等功能。麦角固醇经过紫外光作用下发生光异构化等一系列反应可以转化成维生素D₂。如下结构所示，化合物a和化合物b中的甾体的立体结构与维生素D₂的结构具有高度的相似性，经过开环反应都能转变成维生素D。然而，目前文献报道的关于应用click反应修饰维生素D衍生物的合成存在合成路线长、产率低、合成成本高等不足。

发明内容

本发明的目的在于提供以天然存在的维生素D₂为原料合成基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物，研究其制备方法和它在治疗癌症方面的应用。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物式I的合成方法，包括如下步骤：

将化合物2溶于二氯甲烷和水的混合溶剂中，加入CuSO₄、抗坏血酸、3-氨基苯乙炔，然后继续搅拌回流反应，反应结束后经萃取、提纯得到目标化合物，其中，化合物2的结构如下：

上述步骤中，混合溶剂中二氯甲烷与水的体积比为1∶1。

上述步骤中，化合物2与3-氨基苯乙炔、CuSO₄、抗坏血酸的摩尔比为1∶1.5：0.1：0.2。

上述步骤中，搅拌回流反应的温度为40-65℃。

上述步骤中，柱层析纯化过程中采用的硅胶为200-300目，采用的洗脱液为按2∶1体积比混合的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物用在抑制人体乳腺癌细胞MCF-7上的应用。

本发明具有以下显著优点：(1)本次合成的为一种具有显著生理活性的维生素D₂衍生物；(2)首次公开了一类氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法；(3)合成原料易得、反应条件温和，操作简单，且产率较高。(4)初步的MTT实验表明该类化合物对MCF-7细胞具有很好的抑制作用，是一类具有潜在应用抗癌的候选药物。

附图说明

图1化合物3的(¹H NMR，500MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

图2化合物3的(¹³C NMR，126MHz，溶剂：CDCl₃)核磁共振谱图。

具体实施方式

本发明的原理：基于我们实验小组已有的工作，根据药物化学中药物设计的经典原理与方法中的相似性原理和拼接原理，我们以维生素D₂为原料，通过取代反应，环加成反应等合成了目标化合物Ⅰ，以期得到具有优良的抗癌等生物活性的药物。

本发明维生素D₂衍生物的合成路线如下：

(一)目标产物(式I)的合成路线

(a)：TsCl(对甲基苯磺酰氯)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)，二氯甲烷，三乙胺，室温；(b)：叠氮化钠，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，45℃；(c)：硫酸铜，抗坏血酸，3-氨基苯乙炔，二氯甲烷：水＝1：1，回流。

下面结合实例详细的说明本发明氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法。实例不代表限制本专利的发明范围。

实施例1

结合式(I)的合成路线，化合物1的合成如下：

于100mL的单口烧瓶中分别加入维生素D₂(2g，5.04mmol)和30mL二氯甲烷，置于低温反应器中，待温度降至-5℃以下，然后缓慢的滴加三乙胺(4mL,28.9mmol)，控制反应体系的温度不超过0℃，待滴加完毕之后，在加入对甲基苯磺酰氯(2.90g,15.2mmol)的二氯甲烷30mL的溶液，加完之后室温下继续搅拌反应。TLC监测反应(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)，反应结束后，搅拌下将反应液缓慢倒入饱和的碳酸氢钠溶液中，搅拌20分钟，二氯甲烷萃取至有机层无荧光为止，合并有机层，水洗(2×100mL)，饱和的氯化钠溶液洗(2×100mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，得到粗产物。通过柱层析(硅胶：200-300目，V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10)进行纯化，得纯品化合物1(2.48g，89.4％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ0.54(3H，s)，0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，0.84(3H，d，J＝6.3Hz)，0.91(3H，d，J＝6.3Hz)，1.01(3H，d，J＝7.2Hz)，1.20-1.38(3H，m)，1.40-1.55(3H，m)，1.60-1.78(4H，m),1.80-1.90(3H，m)，1.95-2.04(3H，m)，2.05-2.15(1H，m)，2.37-2.41(2H，m),2.46(3H，s)，2,51(1H，dd，J＝3.6，13.8Hz)，2.75(1H，dd，J＝3.6，13.8Hz)，4.68(1H，m)，4.81(1H，s)，5.03(1H，s)，5.19(2H，m)，5.96(1H，d，J＝11.1Hz)，6.09(1H，d，J＝11.1Hz)，7.34(2H，d，J＝8.4Hz)，7.81(2H，d，J＝8.4Hz).

实施例2

结合式(I)的合成路线，化合物2的合成如下：

于100mL的单口烧瓶中分别加入化合物1(1.2g，2.18mmol)和二甲基甲酰胺10mL，氮气保护，于45℃下继续搅拌反应。TLC监测反应(V乙醚∶V石油醚＝1∶50)。反应完全后，搅拌下将反应液缓慢倒入水中，乙酸乙酯萃取至有机层无荧光为止，合并有机层，冰水洗(2×100mL)，饱和的氯化钠溶液洗(2×100mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，得到粗产物。通过柱层析(硅胶：200-300目，V乙醚∶V石油醚＝1∶50)进行纯化，得纯品化合物2(0.46g，50.2％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.31(d,J＝11.5Hz,1H),6.01(d,J＝11.3,1H),5.31–5.14(m,2H),5.09(s,1H),4.87(d,J＝12.3Hz,1H),3.69–3.48(m,1H),2.82(t,J＝18.8Hz,1H),2.58(t,J＝20.6Hz,1H),2.44(m,1H),2.40–2.27(m,1H),2.18(m,2H),2.12–1.95(m,4H),1.95–1.82(m,1H),1.82–1.64(m,4H),1.63–1.54(m,2H),1.53–1.41(m,3H),1.42–1.23(m,3H),1.14–1.00(m,3H),0.93(t,J＝9.9Hz,3H),0.84(m,5H),0.57(d,J＝12.3Hz,2H).

实施例3

结合式(I)的合成路线，化合物3的合成如下：

于50mL的单口烧瓶中分别加入化合物2(0.15g，0.36mmol)，二氯甲烷5mL，水5mL，然后加入CuSO₄、抗坏血酸、3-氨基苯乙炔，搅拌回流反应。TLC监测反应(V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶4)。反应完全后，加入30mL水和20mL二氯甲烷萃取，萃取至有机层无荧光为止，合并有机层，水洗(2×60mL)，饱和的氯化钠溶液洗(2×60mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，得到粗产物。通过柱层析(硅胶：200-300目，V乙醚∶V石油醚＝1∶4)进行纯化，得纯品化合物3(0.162g，84.5％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.76(d,J＝11.0Hz,1H),7.20(dd,J＝9.9,5.5Hz,1H),7.12(dd,J＝14.7,5.0Hz,1H),6.66(d,J＝7.6Hz,1H),6.33(d,J＝11.2Hz,1H),6.08(d,J＝11.3Hz,1H),5.23–5.15(m,3H),4.96(d,J＝16.6Hz,1H),4.71(m,1H),2.98–2.69(m,3H),2.53(dt,J＝7.6,4.9Hz,1H),2.43–2.24(m,2H),2.10(m,5H),1.92–1.82(m,1H),1.79–1.63(m,4H),1.64–1.40(m,5H),1.39–1.17(m,10H),1.13–0.98(m,4H),0.93(t,J＝7.4Hz,4H),0.83(dt,J＝9.3,5.1Hz,7H),0.59(s,3H).见图1所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ147.69,147.10,143.91,143.59,135.74,134.06,132.21,131.86,129.92,123.26,117.78,117.35,116.15,115.04,114.13,112.40,59.80,56.69,46.12,43.99,43.01,40.58,33.90,33.68,33.29,29.89,29.27,27.93,23.91,22.49,21.32,20.15,19.84,17.79,12.39.见图2所示。

细胞毒性试验：

为研究化合物对癌细胞(人体乳腺癌细胞MCF-7)的抑制能力，我们用化合物3进行MTT实验，具体步骤如下：

(1)细胞培养:用10％胎牛血清的RMPI-1640培养MCF-7细胞，并制备悬浮液，然后置于37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。然后取对数期细胞进行MTT试验。

(2)浓度配置：本实验设置了样品组和对照组。其中样品组用PBS溶液溶解样品配置6个浓度：10^-10mol/L、10^-9mol/L、10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L、10^-5mol/L，每个浓度设置3个平行孔；对照组只加培养液。

(3)MTT试验：(a)在96孔板加入细胞培养液100μL(约1×10⁴)，置37℃，5％CO₂

细胞培养箱培养24h。(b)样品组加入适当浓度的受试化合物，每孔25μL，每种药物组合设三个平行孔，培养48h。对照组，只加入等量的PBS溶液。(c)将96孔板在37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育48小时。(d)将5×MTT用Dilution Buffer稀释成1×MTT。(e)每孔加50μL1×MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲臢。(f)吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲臢溶解，用平板摇床摇匀10分钟。(g)酶标仪在550nm波长处检测每孔的吸光值，通过吸光度值间接计算出受试化合物的半抑制浓度IC₅₀值。测试结果见表1。

(4)结果分析：

化合物对人体乳腺癌细胞MCF-7的半抑制率(IC₅₀)值如表1所示，根据《新药(西药)临床前研究指导原则》中说明，当IC₅₀<10μg/mL时，化合物对癌细胞具有一定的抑制作用。

表1为化合物对两种细胞的半抑制率(IC₅₀)值

从本发明实验数据结果看化合物3作用于人体乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用，表明这种维生素D₂衍生物对人体乳腺癌细胞有很好的抗癌活性，可以作为潜在的抗癌药物。

Claims

1.一种基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物，其特征在于，其结构如下所示：

。

2.如权利要求1所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，化合物2与3-氨基苯乙炔、CuSO₄、抗坏血酸的摩尔比为1∶1.5：0.1：0.2。

4.如权利要求2所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，二氯甲烷和水的混合溶剂中，以体积比计，二氯甲烷∶水＝1∶1。

5.如权利要求2所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，搅拌回流反应温度为40-65℃。

6.如权利要求2所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物的合成方法，其特征在于，萃取采用二氯甲烷，提纯采用柱层析纯化，柱层析纯化采用的硅胶为200-300目，采用的洗脱液为按2:1体积比混合的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

7.如权利要求1或2所述的基于氮杂环修饰的维生素D₂衍生物在抑制人体乳腺癌细胞MCF-7上的应用。