CN104771392B

CN104771392B - 一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及应用

Info

Publication number: CN104771392B
Application number: CN201510114671.5A
Authority: CN
Inventors: 乔春华; 俞洋; 闫星
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2035-03-16
Also published as: CN104771392A

Abstract

本发明为一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及应用，属于医药技术领域，尤其涉及一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及在抗肿瘤细胞增殖方面的应用。本发明的目的是提出一类新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为抗细胞增殖化合物。本发明选取具有代谢稳定性及来源充足的合成类过氧桥药效团，所合成的化合物具有释放活性氧及抑制组蛋白去乙酰化酶的双重活性；为设计合成更高效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂提供了新思路，并作为抗肿瘤的候选药物。

Description

一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂及在抗肿瘤细胞增殖方面的应用。

背景技术

肿瘤被列为人类的一大杀手，是发病率和死亡率极高的一种疾病。2012年，全球肿瘤发病人数1400万，其中有820万死亡。预计到2030年，肿瘤发病和死亡人数将增加一倍左右。鉴于肿瘤治疗的严峻形式，寻求结构新颖且高效低毒的靶向药物依旧是目前抗肿瘤研究的一大热点。

异常的表观遗传调控是肿瘤发生早期常见的现象。组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases,HDACs)属于表观遗传酶家族成员，与组蛋白乙酰化转移酶(histoneacetyltransferase,HAT)共同调节染色质组蛋白骨架的乙酰化水平，两者处于动态平衡状态。在肿瘤细胞中，HDAC过表达导致组蛋白乙酰化水平降低，染色质结构紧缩，阻碍转录因子与DNA的结合，从而抑制转录，并影响细胞分化，凋亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histonedeacetylase inhibitor，HDACI)，简称HDACIs，是一类化合物，有干扰与组蛋白去乙酰化酶的功能。目前研究较多的HDACIs按结构主要分为四类：1)羟肟酸类，如Vorinostat(SAHA，见图1)；2)环状多肽类，如Romidepsin；3)苯甲酰胺类，如MS-275；4)脂肪酸类，如Valproicacid，其中羟肟酸类化合物含有羟肟酸的结构。

青蒿素(Artemisinin，见图1)是从植物黄花蒿中提取的一种含过氧桥结构的抗疟药物。研究表明，青蒿素还具有较强的抗细胞增殖的活性，作用机制可能为分子中的过氧桥结构能释放活性氧，是其抗疟、及抗细胞增殖活性的药效基团。然而，由于其药代动力学性质较差，人工合成成本高，来源有限，目前研究较多的是合成类含过氧桥的化合物，如同样含有过氧桥的化合物PKA182和OZ439等(见图1)，其中OZ439正在进行抗疟的临床研究。

专利CN200810187307.1公开了“含有青蒿素及青蒿素类衍生物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药物组合物及其应用”，该药物组合物具有显著的协同效应，由此可推测组蛋白去乙酰化酶抑制剂与抗氧化剂共孵育会降低肿瘤细胞增殖活性。因此，本发明将能释放活性氧的过氧桥结构与上市药物SAHA偶联，设计合成了5个化合物，均为未见文献报道的全新化合物，并对这些化合物进行抗肿瘤细胞增殖试验，发现全部具有活性。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一类新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为抗细胞增殖化合物，并从中获得活性较好的化合物，以发掘结构新颖，更为高效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，并作为抗肿瘤的候选药物。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，包括所述抑制剂及其药学上可接受的盐，所述抑制剂具有通式(Ⅰ)所示的结构：

其中，Alkyl选自二甲基、环己基、金刚烷基；

Y选自O-O、O、或者CH₂O；

X选自O、或者NH。

上述的一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其包括下列抑制剂及其药学上可接受的盐：

4a其中，R＝金刚烷基，Y＝O-O；

4b其中，R＝金刚烷基，Y＝O；

4c其中，R＝金刚烷基，Y＝CH₂-O；

4d其中，R＝环己基，Y＝O-O；或

4e其中，R＝二甲基，Y＝O-O。

上述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

上述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，及其药学上可接受的盐在制备用于治疗肺癌、白血病或乳腺癌的药物中的应用。

本发明提供了将过氧桥结构与羟肟酸通过含有6个碳原子的长链偶联，即以含有过氧桥的结构片段替代原SAHA药物的苯环，共设计合成了化合物5个未见文献报道的全新化合物。

本发明所设计和合成的化合物与现有组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA相比具有下列优点：

1)本发明选取具有代谢稳定性及来源充足的合成类过氧桥药效团，所合成的化合物具有释放活性氧及抑制组蛋白去乙酰化酶的双重活性；2)MTT试验表明其活性与阳性对照SAHA相当；3)本发明为设计合成更高效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂提供了新思路。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是含有过氧桥药效团的化合物Artemisinin、PKA182、OZ439和组蛋白去乙酰化药物SAHA的结构式；

图2是实施例一化合物4a-4e的合成路线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例一(1)化合物2a-2e的合成(以2a为例，见图2)

将1a(100mg,0.34mmol,1.0eq)，辛二酸单甲酯(77mg,0.41mmol,1.2eq)溶于5mL无水吡啶中，搅拌下加入EDCI(105mg,0.54mmol,1.6eq)，室温搅拌24h。反应完毕后加入30mL乙酸乙酯稀释，有机相用2M HCl及brine分别洗涤两遍。有机相用Na₂SO₄干燥过滤，浓缩得粗产物，柱层析分离纯化(D:M＝200:1)得产物2a为白色固体，产率89％。

由于化合物2b、2c、2d、2e的合成方法与化合物2a步骤相同，因此省略合成相应化合物的步骤描述。

2a:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.49(d,J＝7.8Hz,1H),3.87(dt,J＝10.7,9.1Hz,1H),3.64(br s,3H),3.12(br s,1H),2.98(s,1H),2.28(t,J＝7.2Hz,2H),2.12(t,J＝7.6Hz,2H),2.04–1.51(m,22H),1.51–1.36(m,2H),1.36–1.26(m,4H).

2b:

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ5.47(s,1H),3.92–3.76(m,1H),3.65(s,3H),2.29(t,J＝7.2Hz,2H),2.14(t,J＝6.4Hz,2H),2.04–1.56(m,26H),1.37–1.27(m,4H).

2c:

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ5.42(d,J＝7.2Hz,1H),4.07(br s,1H),3.92–3.79(m,1H),3.66(br,1H),3.65(s,3H),2.74(s,2H),2.29(t,J＝7.2Hz,2H),2.25–2.02(m,2H),2.11(t,J＝7.2Hz,2H),1.95–1.25(m,26H).

2d:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.38(d,J＝7.6Hz,1H),3.96–3.81(m,1H),3.66(s,3H),2.99(s,1H),2.29(t,J＝7.2Hz,4H),2.13(s,2H),1.95–1.37(m,22H).

2e:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.36(d,J＝7.2Hz,1H),3.97–3.82(m,1H),3.66(s,3H),2.95(s,1H),2.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.13(t,J＝7.6Hz,2H),1.93–1.29(m,22H).

(2)化合物3a-3e的合成(以3a为例，见图2)

将2a(93mg,0.2mmol,1.0eq)溶于EtOH/H₂O混合溶液中(10mL,3:1v/v)，搅拌下加入NaOH(12mg,0.3mmol,1.5eq)，回流搅拌4h。反应液冷却至室温并加入2M HCl将体系调至酸性。浓缩除去大部分溶剂，水相用乙酸乙酯(3×15mL)萃取有机相合并，brine洗涤两遍，有机相用无水Na₂SO₄干燥过滤，浓缩柱层析(D:M＝50:1)得3a为白色固体，产率91％。

由于化合物3b、3c、3d、3e的合成方法与化合物3a步骤相同，因此省略合成相应化合物的步骤描述。

3a:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.46(d,J＝7.2Hz,1H),3.89–3.85(m,1H),3.14(s,1H),3.01(s,1H),2.26(t,J＝7.2Hz,2H),2.14(t,J＝7.6Hz,2H),2.14–1.60(m,22H),1.60–1.35(m,2H),1.35–1.24(m,4H).

3b:

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ5.48(s,1H),3.90–3.74(m,1H),2.30(t,J＝7.2Hz,2H),2.14(t,J＝6.4Hz,2H),2.01–1.54(m,26H),1.38–1.26(m,4H).

3c:

¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)δ5.42(d,J＝7.2Hz,1H),4.06(s,1H),3.90–3.78(m,1H),3.66(s,1H),2.74(s,2H),2.30(t,J＝7.2Hz,2H),2.26–2.02(m,2H),2.10(t,J＝7.6Hz,2H),1.96–1.26(m,26H).

3d:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.38(d,J＝7.6Hz,1H),3.99–3.81(m,1H),2.99(s,1H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),2.27(s,2H),2.13(t,J＝7.6Hz,2H),1.58(m,22H).

3e:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.46(m,1H),3.97–3.84(m,1H),2.95(s,1H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),2.14(t,J＝7.6Hz,2H),1.99–1.23(m,22H).

3.化合物4a-4e的合成(以4a为例，见图2)

将3a(135mg,0.3mmol,1.0eq)，O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺(70mg,0.6mmol,2.0eq)溶于5mL无水DCM中，搅拌均匀后加入EDC(116mg,0.6mmol,2.0eq)，室温搅拌8h。反应完毕后，浓缩柱层析(D:M＝200:3)，得米色固体。溶于5mL甲醇中，滴入2M HCl调节体系pH约为1，室温搅拌12h。反应完毕后加入20mL乙酸乙酯稀释，用brine洗涤三遍,有机相干燥浓缩，柱层析纯化(D:M＝50:1到20:1)得4a为白色固体，两步产率52％。

由于化合物4b、4c、4d、4e的合成方法与化合物4a步骤相同，因此省略合成相应化合物的步骤描述。

4a:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.69(br s,1H),3.86(s,1H),3.13(br s,1H),2.99(br s,1H),2.38–2.08(m,4H),2.06–1.20(m,28H).

¹³C-NMR(75 MHz,CD₃OD)δ175.6,172.9,111.3,108.1,37.9,37.0,35.6,34.1,33.7,31.4,30.9,29.8,28.5,26.9,26.6.

ESI-HRMS calcd.for C₂₄H₃₈N₂O₇Na(M+Na)⁺489.2571,found 489.2558.

4b:

¹H-NMR(300 MHz,CDCl₃)δ9.82(br s,1H),6.01(s,1H),3.79(s,1H),2.24–2.04(m,4H),2.04–1.48(m,26H),1.38–1.24(m,4H).

¹³C-NMR(75 MHz,CD₃OD)δ175.6,172.9,112.7(112.4),109.0,37.8,37.0,35.9,35.8,33.8,33.7,33.6,30.5,30.2,29.8,28.4,27.9,26.9,26.6.

ESI-HRMS calcd.for C₂₄H₃₈N₂O₆Na(M+Na)⁺473.2622,found 473.2616.

4c:

¹H-NMR(400 MHz,CDCl₃)δ10.20(br s,1H),6.50–6.10(m,1H),4.19–3.91(m,1H),3.92–3.72(m,1H),3.64(br s,1H),2.92–2.50(m,2H),2.30–1.10(m,32H).

¹³C-NMR(75 MHz,CD₃OD)δ175.6,172.9,102.1(102.0),82.3,65.0(64.6),38.8,38.7,37.0,36.8,36.0,34.5,33.7,33.0,30.6,29.8,29.0,28.9,26.9,26.6.

ESI-HRMS calcd.for C₂₅H₄₀N₂O₆Na(M+Na)⁺487.2779,found 487.2770.

4d:

¹H-NMR(400 MHz,DMSO-d₆)δ10.33(s,1H),8.66(s,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),3.68(s,1H),2.73(s,1H),2.19(s,2H),2.02(t,J＝7.2 Hz,2H),1.92(t,J＝7.2 Hz,2H),1.72–1.17(m,23H).

¹³C-NMR(75 MHz,CD₃OD)δ175.6,172.9,109.3,108.1,37.0,33.7,32.7,30.9,30.5,29.8,29.7,28.5,28.2,26.9,26.6,26.4,23.3,22.9.

ESI-HRMS calcd.for C₂₀H₃₄N₂O₇Na(M+Na)⁺437.2264,found 437.2257.

4e:

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.33(s,1H),8.66(s,1H),7.75(d,J＝7.6Hz,1H),3.68(s,1H),2.73(s,1H),2.02(t,J＝7.2Hz,2H),1.91(t,J＝7.2Hz,2H),1.85–1.15(m,21H).

¹³C-NMR(75MHz,CD₃OD)δ175.6,172.9,109.0,107.9,36.9,33.7,30.8,29.8,28.8,28.3,28.1,26.9,26.6,22.6,20.9.

ESI-HRMS calcd.for C₁₇H₃₁N₂O₇(M+H)⁺375.2131,found 375.2137.

实施例二：体外抗肿瘤增殖活性研究

采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定上述目标化合物对人非小细胞肺癌细胞株(A549)、人早幼粒白血病细胞株(HL60)、人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,MCF-7)以及人正常肝细胞株(HL7702)的半数抑制浓度IC₅₀。

(1)细胞孵育：培养基为RPMI-1640(内含10％胎牛血清)，取对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度为2.0－2.1×10⁴mL^-1。在96孔培养板中每孔加细胞悬液190μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

(2)配药：待测化合物用DMSO溶解，配成浓度为10mM的储备液，放置-20℃备用，加药时以PBS稀释至目标浓度。

(3)加药：培养24h后，分别加入10μL不同浓度的测试药液，每个浓度设3个平行孔，每个目标化合物平行测定三次。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

(4)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加20μL MTT的PBS溶液(5mg_.mL^-1)。37℃继续培养4h，移去上清液(HL60细胞2500rpm离心5min后再移去上清液)。每孔重新加入200μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：

生长抑制率＝(1－存活率)×100％＝[1－(OD_实验－OD_空白)/(OD_对照－OD_空白)]×100％(OD_实验表示测试药物组的平均光密度，OD_对照表示对照组的平均光密度，OD_空白表示对照组的平均光密度)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。实验结果表明该5种化合物是具有较好的抗细胞增殖活性的化合物，并且具有选择性，表现为该5种化合物对MCF-7的抗增殖活性较A549、MDA-MB-231、HL60，同时该5种化合物半数抑制浓度(IC₅₀)与阳性对照SAHA相当，即活性与阳性对照SAHA相当，结果见表1。从表1还可以看出，该5种化合物对肿瘤细胞(MCF-7)的抑制效果均好于对非肿瘤细胞(HL-7702)，即对肿瘤细胞具有2.1-2.8倍的选择性。

表1.体外抗肿瘤增殖活性(IC₅₀)^a

^aAverage of triplicate runs,μM.

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂或其药学上可接受的盐在制备治疗乳腺癌药物中的应用，具体为下列抑制剂及其药学上可接受的盐：

4d其中，R＝环己基，Y＝O-O；或

4e其中，R＝二甲基，Y＝O-O。