CN104926695B - 防治辐射损伤的化合物rl‑66301、单晶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及防治辐射损伤的化合物RL‑66301、单晶及其制备方法和应用。所述化合物化学结构如式I所示：通过药理活性测试及整体动物试验，证实式I化合物具有较好的细胞活性，特别是整体动物试验结果显示式I化合物具有极好的抗辐射活性，且毒性低，因此可用于减轻放射或化疗药物引起的造血功能损伤、升高血液细胞水平以及用于肿瘤辅助治疗。本发明还制备得到了式I化合物的单晶，其稳定性能优异。

Description

防治辐射损伤的化合物RL-66301、单晶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药化合物技术领域，具体地说，涉及一种防治辐射损伤的化合物RL-66301、化合物RL-66301的单晶及其制备方法和应用。

背景技术

核能在众多领域得到了广泛应用，与大众的日常生活息息相关，因此百姓受到放射线辐射的机会日益增多，如高辐射地区生活的居民、核工业领域生产的职工等。随着医疗技术的快速发展，人们有愈来愈多的机会接触到电离辐射，比如利用放射性核素对疾病的观测和诊断，放射免疫分析疾病的发展，X射线透视与断层扫描，在某些肿瘤治疗中使用X射线和γ射线杀死瘤细胞。长期过量的受到辐射影响将导致机体产生一系列损伤，如氧化应激损伤、造血系统的功能异常、免疫系统功能障碍，甚至DNA链断裂、基因突变、染色体重组、细胞转化和细胞死亡等。因此，研究辐射损伤防治手段，寻找行之有效的防治药物，已引起人们的普遍关注。

近年来，氨硫基类化合物、细胞因子、激素类、天然药物等均被用于辐射损伤的化学防护。其中，氨磷汀是FDA批准广泛使用的辐射防护剂，但氨磷汀存在药效差、副作用多等问题。其它辐射防护剂均未达到临床应用程度。临床迫切需要开发出高效低毒的辐射防护新药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治辐射损伤的化合物及其晶体、制备方法和应用。

本发明提供了一种防治辐射损伤的化合物，所述的化合物的化学结构如式I所示：

本发明提供了一种式I化合物的制备方法，包括以下步骤：

a)取盐酸二甲双胍加入至二氯甲烷中，加入25％氢氧化钠溶液、2-氟氯苄与碘化钾，搅拌，室温至完全反应；

b)反应物过滤，用二氯甲烷洗涤，干燥，得粗品；

c)粗品以乙腈加热溶解，趁热过滤，放冷，析晶，得无色结晶，即得所述的式I化合物。

本发明提供了一种式I化合物的单晶，所述的单晶在粉末X-射线衍射图谱中的下述2θ角有特征峰：13.6±0.1°、15.1±0.1°、15.7±0.1°、20.5±0.1°、21.7±0.1°、22.8±0.1°、25.3±0.1°、27.8±0.1°、30.9±0.1°、32.9±0.1°。

本发明提供了一种式I化合物的单晶，所述的单晶表征如下：

晶系：单斜晶系

空间群：P 21/n

晶胞尺寸：

α＝90°

β＝114.238(3)°

γ＝90°

体积：

Z＝4。

本发明提供了所述式I化合物的单晶的制备方法，包括以下步骤：取式I化合物，加入乙腈，回流，澄清，放置，慢慢析晶，得单晶。

在另一优选例中，所述式I化合物的单晶的制备方法包括以下步骤：取式I化合物，加入乙腈，回流1-10小时，澄清，放置1-30小时，慢慢析晶，得单晶；所述的乙腈与式I化合物比例为5-500ml:1g。

本发明提供了所述式I化合物或式I化合物的单晶的药学上可接受的盐，所述的盐为无机酸盐或有机酸盐，所述的无机酸盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐；所述的有机酸盐为乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐或草酸盐。

本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的式I化合物、式I化合物的单晶或所述的药学上可接受的盐，以及余量的药学上可接受的载体。

本发明提供了式I化合物、式I化合物的单晶或所述的药学上可接受的盐的制药用途，用于制备防治辐射损伤的药物。

本发明还提供了式I化合物、式I化合物的单晶或所述的药学上可接受的盐的制药用途，所述的药用于：

a)抑制辐射导致的红细胞和白细胞数目的减少，

b)抑制辐射导致的红细胞和血小板含量的降低，

c)防止辐射导致的脾脏重量的减轻，

d)提高骨髓细胞对辐射的耐受性，或

e)抑制辐射导致的寿命缩短。

本发明优点在于：

1、首次制备得到式I化合物，并通过药理活性测试及整体动物试验，证实式I化合物具有较好的细胞活性，特别是整体动物试验结果显示式I化合物具有极好的抗辐射活性，且毒性低，因此可用于减轻放射或化疗药物引起的造血功能损伤、升高血液细胞水平以及用于肿瘤辅助治疗。

2、首次获得式I化合物的单晶，稳定性好。

附图说明

图1.本发明式I化合物的制备路线图。

图2.RL-66301对辐射损伤小鼠外周血象的影响。60Co-γ射线(7.0Gy)全身辐照，给药剂量为300mg/kg，辐照后给药，给药3天。N＝20，*P<0.05，**P<0.01，与辐射对照组相比。Nor：空白对照组；Rad，辐照对照组；RL-66301：RL-66301化合物组。

图3.RL-66301对辐射损伤小鼠体重、脾脏以及胸腺的影响。60Co-γ射线(7.0Gy)全身辐照，给药剂量300mg/kg，辐照后给药，给药3天。N＝20，*P<0.05，**P<0.01，与辐射对照组相比。Nor：空白对照组；Rad：辐照对照组；RL-66301：RL-66301化合物组。

图4.RL-66301对辐射损伤小鼠骨髓造血功能影响。60Co-γ射线(7.0Gy)全身辐照，给药剂量300mg/kg，辐照后给药，给药3天。第7天骨髓涂片记录骨髓有核细胞(karyocyte)、骨髓小粒(bone narrow particles)(Wright-Giemsa×400)，骨髓HE染色计算造血面积(hematopoietic area)。选择涂片细胞均匀平布处计数至少5个高倍镜视野取平均值，结果以均数±标准差(mean±SD)表示，ANOVA检验。N＝20，**P<0.01，与辐射对照组相比。Nor：空白对照组；Rad：辐照对照组；RL-66301：RL-66301化合物组。

图5.RL-66301降低辐照骨髓细胞凋亡率。Tunel(×200)选择涂片细胞均匀平布处计数各至少5个中高倍镜视野取平均值，并计算调亡细胞比率，结果以均数±标准差(mean±SD)表示，ANOVA检验。N＝3，**P<0.01，与辐射对照组相比。Nor：空白对照组；Rad：辐照对照组；RL-66301：RL-66301化合物组。

图6.本发明式I化合物的晶体的粉末X-射线衍射光谱图，纵轴表示峰强度(cps)，横轴表示衍射角(2θ[°])。

图7-图9.具体每个峰位数据。其中，图8、9续接图7。

图10.本发明式I化合物的单晶分子结构图。

具体实施方式

本发明人经过研究制备了一种如式I所示的结构新颖的化合物，并证实式I化合物具有防治辐射损伤的作用，同时制备得到式I化合物的晶体，发现该晶体具有较好的稳定性。在此基础上完成了本发明。

本发明首先提供了一种化学结构如式I所示的化合物，或该化合物药学上可接受的盐、晶型、前药、溶剂合物或水合物：

该式I化合物的化学名为：N＂-甲基(2-氟苯基)-N,N-二甲基亚氨基二碳亚氨酸酰胺(代号：RL-66301)；

如化学结构式与命名相冲突，则以化学结构式为准。

本发明还包括上述化合物的相应的所有药学上可接受的盐、晶型、前药、溶剂合物或水合物。这些盐可以由化合物中带正电荷的部分与具有相反电性的带负电荷形成；或者由化合物中带负电荷的部分与正电荷形成。

该化合物的制备可以通过附图1的路线实现。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。

以上得到的精制化合物，通过加入乙腈，回流，澄清，放置，慢慢析晶，即可得单晶化合物。

如本文所用，“室温”是指本领域熟知的温度范围，较佳地是20-30℃。

晶体

如本文所用，术语“晶体”是指分子或原子复合物呈特定排列形式的固体。术语“单晶”(single crystal)，即结晶体内部的微粒在三维空间呈有规律地、周期性地排列，或者说晶体的整体在三维方向上由同一空间格子构成，整个晶体中质点在空间的排列为长程有序。当X光透过晶体可以产生一系列的衍射，在实验室中使用X-射线衍射仪即可获得粉末X-射线衍射图谱，在图谱中，不同的衍射线以及各衍射线的强度是由一定结构的原子团所决定的，不同结构的晶体所产生的衍射图谱各不相同，因此可以使用X-射线衍射图谱来确定晶体的构造。

测定晶体的X-射线衍射图谱所采用的方法是本领域已知的。

本发明的式I化合物的单晶具有特定的晶体形态，其粉末X-射线衍射图具有特定的衍射特征峰。

具体地，本发明的式I化合物的单晶在粉末X-射线衍射图谱中具有以下一系列的特征2θ角衍射峰：13.6±0.1°、15.1±0.1°、15.7±0.1°、20.5±0.1°、21.7±0.1°、22.8±0.1°、25.3±0.1°、27.8±0.1°、30.9±0.1°、32.9±0.1°；更佳地，其具有与附图6基本上一致的粉末X-射线衍射图谱。

本发明的式I化合物的单晶具备以下参数：

晶系：单斜晶系

空间群：P 21/n

晶胞尺寸：

α＝90°

β＝114.238(3)°

γ＝90°

体积：

Z＝4。

本发明的式I化合物的单晶分子结构如附图10所示。

式I化合物的单晶的制备方法优选为：加入乙腈，回流，澄清，放置，慢慢析晶，得单晶。但是本领域技术人员有动机尝试使用丙酮、甲醇、乙醇、不同比例乙醇与水、不同比例甲醇与水、不同比例乙腈与水、不同比例丙酮与水等溶剂进行析晶。

药物组合物

本发明同时也涉及包含有式I化合物的药物组合物或药物制剂，它们可以被制成例如适于口服或注射的各种形式，以用于防治辐射损伤，特别是减轻放射或化疗药物引起的造血功能损伤、升高血液细胞水平，或用于肿瘤辅助治疗，具体地包括：a)抑制辐射导致的红细胞和白细胞数目的减少，b)抑制辐射导致的红细胞和血小板含量的降低，c)防止辐射导致的脾脏重量的减轻，d)提高骨髓细胞对辐射的耐受性，或e)抑制辐射导致的寿命缩短。但不仅限于此。优选的药用制剂剂型可以是片剂、胶囊、微粒剂以及混悬剂。本发明所涉及的药物制剂配方中，除了式I化合物以外还包括药学上可接受的载体、赋型剂和/或稀释剂。代表性的例子包括(但并不限于)：

一种或多种填充剂，如微晶纤维素、乳糖、蔗糖、淀粉、改性淀粉、甘露糖、葡聚糖、碳酸钙、磷酸盐、硫酸盐；

一种或多种粘结剂，如乳糖、淀粉、改性淀粉、葡聚糖、微晶纤维素、蔗糖、聚醚多元醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸铝镁；

一种或多种崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基淀粉、淀粉、微晶纤维素等。

此外，如果有需要，药物组合物的配方中还可以包括表面活性剂和色素。

治疗有效量(即：可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量)的本发明的化合物与医学上可以接受的载体(用于治疗给药的载体，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性)可以组成药物制剂，这些药物制剂可以制备成口服制剂、注射剂、片剂、粉制剂、胶囊剂、分散片、缓释制剂等。

治疗有效量的本发明的组合物的用量介于0.001-500mg/kg体重/天之间，任何介于上述范围之内的用量皆为本发明的有效量。所述的“治疗有效量”可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。本领域技术人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物-人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括所用化合物或其前药的药效活性、给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程以及收治医师的判断等。

式I化合物或其组合物可以通过口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内等途径给药。固体载体如：淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体如：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需要的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，如，调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物如细菌和真菌的污染和影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇、它们的适当混合物和植物油。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1本发明式I化合物(代号：RL-66301)的制备

于250ml圆底瓶中，加入盐酸二甲双胍8g(48.3mmol)，二氯甲烷100ml，加入25％氢氧化钠40ml，搅拌，澄清后再加入2-氟氯苄6.98g(48.3mmol)，碘化钾3小粒，磁力搅拌，室温，共反应16小时，后处理。

反应瓶中见固体，过滤，二氯甲烷10ml洗涤，干燥，得无色固体3.5g。滤液浓缩掉三分之二，剩余滤液放置析晶，过滤，干燥，得固体1.1g。合并固体以300ml乙腈加热溶解，趁热过滤，放冷，析晶，得无色结晶2.5g。产率21.82％。

产物的核磁氢谱和质谱数据为：

1H NMR(600MHz,DMSO)δ7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.15(dd,J＝14.1,6.6Hz,1H),7.08(t,J＝7.0Hz,1H),7.02(m,1H),5.21(s,4H),4.18(s,2H),2.78(s,6H).HRMS[M+H]238.32。

实施例2RL-66301的防治辐射损伤试验

辐射损伤将导致机体产生一系列损伤，如氧化应激损伤、造血系统的功能异常、免疫系统功能障碍，甚至DNA链断裂、基因突变、染色体重组、细胞转化和细胞死亡等。依据辐射损伤的特点，在本试验中，我们重点考察了本发明式I化合物对辐射损伤小鼠存活率、体重、骨髓有核细胞数量、骨髓造血面积、脾等脏器损伤、外周血象以及其他功能相关指标的影响，评价了RL-66301对辐射损伤小鼠的保护作用。

1材料

1.1实验动物

ICR小鼠，雄性，体重21-26g左右，购自上海斯莱克动物科技公司。饲养于第二军医大学IVC系统中。实验期间，保持动物房室温在22℃左右，相对湿度70％左右，早8点至晚8点自动照明。动物自由进食，自由饮水。

1.2主要试剂与药物

1.2.1整体实验

生理盐水，北京双鹤药业；羧甲基纤维素钠，上海生工生物科技有限公司；RL-66301，实施例1合成。

1.2.2病理实验

瑞氏吉姆萨染液，上海博光生物科技有限公司；多聚甲醛，上海生工生物科技有限公司；甲醛，国药集团上海化学试剂公司；乙醇，国药集团上海化学试剂公司；二甲苯，国药集团上海化学试剂公司；苏木紫，上海源叶生物科技公司；伊红，上海源叶生物科技公司；氯化铝，国药集团上海化学试剂公司；盐酸，国药集团上海化学试剂公司；甲酸，国药集团上海化学试剂公司。

1.2.3细胞实验

DMEM/High Glucose，Thermo Fisher Scientific Inc.；FBS，Life TechnologiesCorporation；Horse Serum，Life Technologies Corporation；

Antibiotic-Antimycotic，Life Technologies Corporation；trypsogen(0.25％)，Life Technologies Corporation；trypsogen(no EDTA)，Life TechnologiesCorporation；PLL，Sigma-Aldrich,Co.；PBS，Life Technologies Corporation.；DMSO，Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd；Triton X-100，Amresco Inc；Polylysine，Sigma-Aldrich,Co.；DAPI，碧云天生物技术研究所；小鼠淋巴细胞分裂液，上海研谨生物科技公司；红细胞裂解液，碧云天生物技术研究所；细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；Hoechst 33342染色液，碧云天生物技术研究所；In Situ Cell DeathDetection Kit，oche Applied Science；山羊血清，上海生工生物科技有限公司；抗荧光猝灭封片剂，碧云天生物技术研究所。

1.3主要实验器材

Sysmex XT-2000iv型血细胞分析仪，SYSMEX株式会社；低温高速台式离心机，Eppendorf；全自动酶标仪，Thermo Fisher Scientific Inc.；流式细胞仪，BDBiosciences；三气培养箱，Thermo Fisher Scientific；石蜡切片机，Leica GeosystemsAG；自动脱水机，Leica Geosystems AG；烘片机HI1220型，Leica Geosystems AG；涡旋混合器，Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.；电子天平，Sartorius mechatronics.；水平摇床，Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.；微波炉，格兰仕集团；制冰机，ScotsmanIndustries Inc.；蛋白电泳仪，Bio-Rad Laboratories,Inc.；蛋白转膜仪，Bio-RadLaboratories,Inc.；数码凝胶图像分析系统，上海天能科技；CO₂培养箱，Health ForceDevelopment Ltd.；超低温冰箱，New Brunswick Scientific.；荧光共聚焦显微镜，LeicaGeosystems AG；倒置相差显微镜，Olympus Corporation；倒置荧光显微镜，LeicaGeosystems AG；超净台，苏州净化设备有限公司；小鼠IVC系统，上海天环科技发展有限公司。

2实验方法

2.1动物分组与辐照

雄性ICR小鼠适应环境后，随机分为三组：1)空白对照组，2)辐照对照组，3)RL-66301组，每组动物根据实验要求20只。辐照对照组、RL-66301组动物在中国人民解放军第二军医大学辐照中心使用60Co-γ射线(7.0Gy)全身辐照。

2.2动物给药

辐照1小时后给药，采用灌胃给药，溶媒使用0.5％羧甲基纤维素钠，给药体积为20ml/kg。空白对照组以0.5％羧甲基纤维素钠灌胃给药；辐照对照组以生理盐水灌胃；RL-66301组以0.5％羧甲基纤维素钠混悬RL-66301，剂量300mg/kg。连续给药3天。

2.3RL-66301对辐射损伤小鼠生存率的影响

辐照后给药3天，连续观察20天，记录动物状态如自由活动、毛发、体重，并统计死亡情况。

2.4RL-66301对辐射损伤小鼠体重和外周血象的影响

实验分为空白对照组(未行γ射线照射)、辐照对照组、RL-66301治疗组(300mg/kg)，每组各20只小鼠，给予上述药物处理和7.0Gyγ射线照射，并在照后7天称重后眼眶取血，全自动血细胞计数仪检测外周血象。

2.5RL-66301对辐射损伤小鼠胸腺重、脾脏重以及脏器指数影响

分组和处理同2.4。照后第7天称重后颈椎脱臼处死，取胸腺、脾脏称重，计算胸腺、脾系数。

2.6RL-66301对辐射损伤小鼠骨髓细胞的影响

分组和处理同2.4。照后第7天称重后颈椎脱臼处死，取股骨，剪断第2股骨，用镊子夹股骨以挤出骨髓，置于一载玻片上，涂片。每只动物涂片一张。(1)将晾干的待染涂片平放于染色架上；(2)用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1分钟；(3)加入等量的磷酸缓冲液，与染液混匀，室温下染色20-30min；(4)染色结束时，用蒸馏水将涂片上的染液直接冲掉；(5)甩干或晾干玻片；(6)封片；(7)显微镜观察。

2.7RL-66301对辐射损伤小鼠骨髓病理改变的影响

分组和处理同2.4。取双侧股骨行病理染色观察骨髓象变化。骨髓石蜡切片HE染色方法以及步骤：(1)取材同上。将股骨置入专用病理包埋框，编号后置于多聚甲醛液中固定，固定时间不少于24h。(2)脱钙：采用Plank Rycho脱钙液对骨骼组织脱钙。其性质温和，对骨组织破坏小，能够保持结构完整，染色清晰对比明显，且脱钙后无须中和程序可直接进入脱水程序。将固定好的骨组织标本室温下脱钙2～4天，其中至少更换1次脱钙液，以骨组织浮起且大头针能顺利穿过组织表明脱钙完全。(3)脱水、透明、浸蜡、包埋：脱水采用上行梯度酒精，从75％、85％、95％至无水乙醇，各级酒精历时1～2h不等，然后二甲苯透明约1h。(4)切片、贴片、烤片。(5)脱蜡、复水、染色。(6)晾干后中性树胶封片后镜检。(7)利用Image专业软件及网形测微器计点法测定骨髓病理切片内造血组织所占容量百分率，每股骨样本至少取5个高倍视野拍照测量后取平均值。

2.8细胞水平确定RL-66301对骨髓造血功能障碍的保护作用

实验分为空白对照组、辐照对照组、RL-66301处理组。取正常ICR小鼠原代骨髓细胞培养，在细胞水平行60Co-γ射线辐照，辐照剂量8Gy。处理组给予RL-66301(终浓度均为1mM)干预，辐照对照组给予同量PBS，于给药后24h行60Co-γ辐照诱导细胞凋亡，于辐照后24h内利用凋亡试剂盒检测细胞凋亡。

2.9数据统计与分析

实验结果中计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间的比较采用独立t检验方法。多组之间的比较选用单因素方差分析(ANOVA)，采用LSD进行多重两两比较。生存率的比较采用Kaplan-Meier分析方法，Log-Rank用于评定生存曲线的差异。P＜0.05认为差异具有统计学显著性。采用SAS统计软件进行处理。

3结果

3.1RL-66301对辐射损伤小鼠状态及生存率的影响

空白对照组动物20只，辐照对照组动物20只，RL-66301组动物20只，辐照对照组与RL-66301组ICR小鼠经7.0Gy 60Co-γ辐照后，辐照对照组动物从5天始小鼠渐出现懒动、毛发干枯、食欲差、体重逐渐下降；RL-66301组动物从7天始小鼠渐出现懒动、毛发干枯、食欲差、体重逐渐下降；之后RL-66301组小鼠的体重经历了先下降后逐渐上升现象。给药后20天，空白对照组动物全部存活，辐照对照组动物全部死亡，给药组(RL-66301组)动物死亡9只，与辐照对照组比较，RL-66301组动物的生存时间显著延长。20天生存率为55％。

3.2RL-66301对辐射损伤小鼠外周血象的影响

空白对照组小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)等均正常。辐照对照组和RL-66301组小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)等均有不同程度降低。但RL-66301组之后有所回升。RL-66301对于辐射导致的红细胞和白细胞数目的减少有明显抑制作用(见图2)。

3.3RL-66301对辐射损伤小鼠脾脏系数以及胸腺系数的影响

空白对照组小鼠体重正常，辐照对照组和RL-66301组动物体重有下降。脾脏、胸腺系数降低。本实验发现，RL-66301可防止射线导致的脾脏重量的过度减轻。辐射损伤后，造血功能障碍的主要原因之一是射线对赖以维持造血功能的造血干细胞的损伤，而造血干细胞的损伤是决定机体死亡的关键因素。本实验发现RL-66301组受照小鼠内源性脾结节较辐照对照组明显增多，提示RL-66301可保护受照小鼠造血干细胞(见图3)。

3.4RL-66301对辐射损伤小鼠骨髓细胞的影响

辐照后于7天取血检测，空白对照组小鼠骨髓细胞正常，辐照对照组和RL-66301组辐照后小鼠血常规指标(除红细胞外)均有下降，骨髓小粒损伤明显，骨髓有核细胞数及造血面积亦明显下降。RL-66301组小鼠骨髓涂片示骨髓有核细胞计数显著增多，骨髓小粒形态有所恢复，病理示造血组织面积有显著增加(**P＜0.01,*P＜0.05)。上述结果表明小鼠经RL-66301处理后，其骨髓细胞对辐射具有较大的耐受性(见图4)。

3.5RL-66301减轻骨髓造血细胞辐照损伤(细胞水平)

培养原代骨髓细胞(来源ICR小鼠)2天，分别给予PBS(辐照对照组)、RL-66301，化合物终浓度1mM，给药后24h内行60Co-γ辐照，诱导细胞凋亡，辐照剂量8Gy。辐照24h后TUNEL检测细胞凋亡。结果：空白对照组正常，辐照对照组辐照后细胞凋亡率明显增加(28.6％±0.89％vs 9.3％±0.56％in control，P<0.01)，而RL-66301组能显著降低辐照后细胞凋亡率(17.2％±1.02％in model，P<0.01)，提示RL-66301组对辐照导致的细胞损伤具有明显地保护作用(见图5)。

4.结论

根据以上实验结果，RL-66301组能显著地延缓辐照损伤动物生存时间，延长其生存率。RL-66301组对辐照损伤动物骨髓造血功能具有显著地改善作用。RL-66301组在延长动物生存率、骨髓造血功能等方面均有一定的提高。

实施例3RL-66301动物急性毒性试验

根据预实验，药物毒性较小，从3g/kg开始，依次递增到3.5g/kg、4g/kg、以及4.5g/kg，初步确定0％死亡剂量以及100％死亡剂量，确定半数致死量。

结果：给予单次灌胃给药，在3g/kg剂量无动物死亡(n＝10)；在3.5g/kg剂量无动物死亡(n＝10)；在4g/kg剂量无动物死亡(n＝10)；在4.5g/kg剂量无动物死亡(n＝10)。

结论：RL-66301为低毒性物质。

实施例4RL-66301单晶的制备(一)

取实施例1制备的精制后的式I化合物产物1g，加入乙腈100ml，回流时间2小时，澄清，放置20小时，慢慢析晶，得无色颗粒状单晶化合物。

实施例5X-射线晶体学的单晶分析

1.实验方法

223K温度下，在装备有石墨-单色化Mo Kα辐射的BRUKER SMARTCCD衍射仪上收集实施例4制备的RL-66301单晶的晶体数据。使用整个数据集测定最终晶胞参数。

2.实验结果

RL-66301单晶的晶体数据见表1，分级原子坐标见表2。本领域技术人员应知晓，坐标的轻微变化是可能的，并且被认为在本发明的公开范围之内。

表1 RL-66301单晶的晶体数据

上述表1中晶体数据翻译如下，当中英文存在不一致时，以表1记载的英文内容为准。

表2 RL-66301单晶的原子坐标(×10⁴)和等价各向同性位移参数U(eq)被定义为正交化U^ij张量迹线的三分之一

实施例6 RL-66301单晶的粉末X-射线衍射

1.实验方法

使用Bruker D8Advance X射线粉末衍射仪获得粉末X-射线衍射，辐射为Cu靶。

2.实验结果

RL-66301单晶的粉末X-射线衍射光谱图见图6，图7为具体每个峰位数据，图7中的Height即图6中的Y轴，为计数。RL-66301单晶在16.2°、17.8°、18.3°、18.7°、18.9°、25.1°、27.0°、28.0°、36.2°的衍射角出现峰，具体结果以图6和图7为准。

实施例7RL-66301单晶的制备(二)

取实施例1制备的精制后的式I化合物产物1g，加入乙腈150ml，回流时间1小时，澄清，放置30小时，慢慢析晶，得单晶化合物。

该单晶的粉末X-射线衍射光谱与实施例4得到的单晶一致。

实施例8RL-66301单晶的制备(三)

取实施例1制备的精制后的式I化合物产物1g，加入乙腈200ml，回流时间10小时，澄清，放置1小时，慢慢析晶，得单晶化合物。

该单晶的粉末X-射线衍射光谱与实施例4得到的单晶一致。

实施例9RL-66301单晶的制备(四)

取实施例1制备的精制后的式I化合物产物1g，加入乙腈500ml，回流时间30小时，澄清，放置5小时，慢慢析晶，得单晶化合物。

该单晶的粉末X-射线衍射光谱与实施例4得到的单晶一致。

实施例10RL-66301单晶的稳定性实验

1实验方法

常温条件将RL-66301单晶放置在30℃条件下15天，分别于第5、10、15天取样测定粉末X-射线衍射光谱图，判断RL-66301单晶的稳定性。

2实验结果

在30℃条件下15天，RL-66301单晶稳定，外观保持不变，粉末X-射线衍射光谱图未发生明显变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种防治辐射损伤的化合物，其特征在于，所述的化合物的化学结构如式I所示：

2.一种如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)取盐酸二甲双胍加入至二氯甲烷中，加入25％氢氧化钠溶液、2-氟氯苄与碘化钾，搅拌，室温至完全反应；

b)反应物过滤，用二氯甲烷洗涤，干燥，得粗品；

c)粗品以乙腈加热溶解，趁热过滤，放冷，析晶，得无色结晶，即得所述的式I化合物。

3.一种如权利要求1所述的式I化合物的单晶，其特征在于，所述的单晶在粉末X-射线衍射图谱中的下述2θ角有特征峰：13.6±0.1°、15.1±0.1°、15.7±0.1°、20.5±0.1°、21.7±0.1°、22.8±0.1°、25.3±0.1°、27.8±0.1°、30.9±0.1°、32.9±0.1°，所述的单晶表征如下：

晶系：单斜晶系

空间群：P 21/n

晶胞尺寸：

α＝90°

β＝114.238(3)°

γ＝90°

体积：

Z＝4。

4.权利要求3所述的单晶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取式I化合物，加入乙腈，回流，澄清，放置，慢慢析晶，得单晶，所述的乙腈与式I化合物比例为5-500ml:1g。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取式I化合物，加入乙腈，回流1-10小时，澄清，放置1-30小时，慢慢析晶，得单晶。

6.权利要求1所述的化合物的药学上可接受的盐，其特征在于，所述的盐为无机酸盐或有机酸盐，所述的无机酸盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐或硝酸盐；所述的有机酸盐为乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐或草酸盐。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的单晶或权利要求6所述的盐，以及余量的药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的单晶或权利要求6所述的盐的制药用途，其特征在于，用于制备防治辐射损伤的药物。

9.权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的单晶或权利要求6所述的盐的制药用途，其特征在于，所述的药用于：

a)抑制辐射导致的红细胞和白细胞数目的减少，

b)抑制辐射导致的红细胞和血小板含量的降低，

c)防止辐射导致的脾脏重量的减轻，

d)提高骨髓细胞对辐射的耐受性，或

e)抑制辐射导致的寿命缩短。