CN104910294A - 一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法及其应用，通过将透明质酸用含1％硫酸联氨的无水肼溶解，脱氧氮气保护后在60℃反应72h，反应产物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于5％的冰乙酸中，加入0.5M的碘酸，4℃放置2h,过量的碘酸通过加入57％氢碘酸。再通过乙醚萃取去掉生成的碘，中和，冻干既得。本发明中的两性离子透明质酸多糖用于免疫疾病的用途，疗效显著，无副作用。

Description

一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于多糖修饰技术领域，具体涉及一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法及其应用。

背景技术

多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的初始研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现。至50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节，特别是免疫功能的调节。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是由乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3交替连接而成的酸性多糖，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分之一，是细胞间的填充物，对于皮肤的形态、结构、功能起着重要的作用平均相对分子质量为105～107。1934年Meyer和Palmer从牛眼玻璃体中首次分离出透明质酸，这是个以葡萄糖胺和葡萄糖酸为最小单位的粘性多糖、广泛存在于哺乳动物的水晶体，关节液、脐带儿中。在非哺乳动物中主要存在于公鸡的鸡冠，鱼皮、蚕的胃腔壁和连锁球菌的夹膜中。由于透明质酸具有保湿、修护、营养等作用，对皮肤有良好的亲合性且使用安全，其在医药、化妆品、食品等领域有广泛而独特的应用价值。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。

透明质酸大量存在于人体的结缔组织及真皮层中，在老年人体内经特有的去乙酰化酶脱乙酰化修饰后，实际上形成了去乙酰化透明质酸两性离子多糖，其与两性离子多糖，PSA和SP1有着类似的。同时发现，与青年人相比，老龄人体内存在更多的调节性T细胞，其在阻止老龄化过程中因细胞碎屑累积而诱发的炎症反应中发挥着重要作用。目前尚不清楚老龄人体内特有的这种内源性两性离子多糖是否与该年龄群体富含调节性T细胞现象有关。

现有的透明质酸的去乙酰化的方法包括氢氧化钠去乙酰化以及水合肼去乙酰化的，通过实验证明，氢氧化钠的方法由于碱性太强，高浓度的氢氧化钠同意造成糖苷键的急剧断裂，无法得到高分子量的产物，而低浓度的氢氧化钠又无法取得很好的去乙酰化效果，同样，水合肼的去乙酰化效果也不是很理想，无法得到高去乙酰化高分子量的两性离子化透明质酸。因此，我们发明了一种有效的方法来克服这一难题。并将其应用于免疫治疗，实验显示有良好的应用前景。

发明内容

本发明针对现有透明质酸去乙酰化技术手段存在的缺陷，提出一种有效的高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，该两性离子多糖具有激活巨噬细胞分泌炎症因子以及促进脾淋巴细胞增殖的作用，且效果显著，无副作用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

1)无水肼的制备

在30mL一水合肼中加入12g氢氧化钾，4℃过夜，取上清，加入12g氢氧化钠，氮气保护下，加热回流2h，收集蒸馏液，得到无水肼；

2)将透明质酸用含无水肼溶解，脱氧氮气保护后在60℃反应72h；

3)反应产物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于浓度5％的冰乙酸中，加入浓度为5g/L的碘酸，4℃放置2h；

4)利用浓度2g/L氢氧化钠溶液中和，透析，冻干，得到最终高分子量两性离子透明质酸多糖。

本发明步骤(1)中所得无水肼的纯度为90～94％。

本发明步骤(2)中所述的无水肼含有重量质量浓度1％的硫酸联氨。

本发明步骤(3)中过量的碘酸通过加入浓度57％氢碘酸，通过乙醚萃取去掉生成的碘。

本发明的另一目的在于上述所得高分子量去乙酰化透明质酸在制备治疗免疫性疾病药物中的应用。

本发明所述的免疫性疾病为原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、自身免疫疾病或急性感染。

本发明所述的药物可以按需要加工成任何医药上可接受的剂型，其中较优选的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、冻干粉针剂或注射液。其配制可由通常的本领域技术人员所公知的加工方法制备，即将高分子量去乙酰化透明质酸与液体溶剂或固体载体混合后，再加入填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、溶剂、表明活性剂、香味剂、防腐剂、润滑剂、甜味剂或色素中的一种或几种。

本发明所述的药物可以由使用者在使用前经稀释或直接使用。

本发明的有益效果为：不同分子量的透明质酸多糖在体内具有不同的生物功能，在疾病状况下也会发生降解，而且透明质酸的去乙酰化程度随着年龄的增长逐渐增加，所以获得高分子量的去乙酰化透明质酸有着重要的意义。现有的透明质酸的去乙酰化的方法无法取得很好的去乙酰化效果。本发明的去乙酰化的方法过程易于操作，时间短，最重要的是能够同时满足高分子量高去乙酰化的要求，从而对其生物活性及应用的研究。

附图说明

图1是本发明高分子量去乙酰化透明质酸的合成路线；

图2是本发明高分子量去乙酰化透明质酸dHA-72的高效液相凝胶色谱图；

图3是本发明再乙酰化的透明质酸HA-72的高效液相凝胶色谱图；

图4是高分子量去乙酰化透明质酸dHA-72和再乙酰化的透明质酸HA-72单独以及在ConA和LPS存在下对脾细胞的增值作用；A为dHA-72、HA-72、LPS单独对脾细胞的增值作用；B为在ConA和LPS存在下对脾细胞的增值作用；

图5是dHA-72和HA-72对脾细胞的增值作用；A为小鼠B6脾细胞的增值作用；B为小鼠B10脾细胞的增值作用；

图6是对CD3+T细胞的作用；A为PBS；B为ConA；C为HA-72；D为dHA-72；

图7是对CD19B细胞的增值作用；A为PBS；B为LPS；C为HA-72；D为dHA-72。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1高分子量去乙酰化透明质酸的制备

如图1所示，一种高分子量去乙酰化多糖的制备方法，具体包括以下步骤：

1)无水肼的制备：30mL一水合肼加入12克氢氧化钾，4℃过夜，取上清，加入12克氢氧化钠，氮气保护，加热回流2小时，改为蒸馏装置，收集蒸馏液，得到90-94％的无水肼。

2)将透明质酸用含重量质量浓度1％的硫酸联氨的无水肼溶解，脱氧氮气保护后在60℃反应72h；

3)反应产物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于浓度5％的冰乙酸中，加入浓度为5g/L的碘酸，4℃放置2h，过量的碘酸通过加入浓度57％氢碘酸，通过乙醚萃取去掉生成的碘；

4)利用浓度2g/L氢氧化钠溶液中和，透析，冻干，得到最终高分子量两性离子透明质酸多糖dHA-72。用高效液相凝胶色谱检测其分子量为110kD(图2)。

5)通过将去乙酰化透明质酸再乙酰化的方法得到了相似分子量的透明质酸，用于活性的比较。具体为将冻干多糖溶于含5％的乙酸酐的饱和碳酸氢钠溶液中，常温搅拌反应30min，透析，冻干得HA-72。用高效液相凝胶色谱检测其分子量为120kD(图3)

实施例2多糖脾淋巴细胞的增值作用

1)脾淋巴细胞的获得：取5只B6小鼠，充氮气处死，70％酒精浸泡10min，无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾，用注射器内芯研磨过70微米的筛网，PBS液冲洗，再过40微米筛网，收集分离的脾细胞悬液分成五管，1000r/min离心5min，弃上清。每个离心管加氯化铵红细胞裂解液12mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5min，弃上清去除红细胞，PBS洗1-2遍，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)重悬细胞，计数调整细胞浓度为8～10×10⁶个/mL；

2)药物刺激脾细胞增值实验：将获得的脾淋巴细胞混合均匀，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分别加10微升PBS，HA-72(1mg/mL)和dHA-72(1mg/mL)，每组做六个平行孔，37℃培养箱培养48h，每孔加10微升MTT(5mg/mL)，继续培养4h，离心，去掉上清，每孔加入200微升二甲基亚砜，用酶标仪在570nm测定吸光度；

3)药物与ConA和LPS协同刺激脾细胞中T，B细胞的增值：同步骤2)，将获得的脾细胞铺板，加药，然后分别加PBS，Con和LPS，Con+HA-72(1mg/mL)，LPS+HA-72(1mg/mL)，Con+dHA-72(1mg/mL)，LPS+dHA-72(1mg/mL)，每组做六个平行孔，培养48h，加MTT，培养4h，加DMSO，测定吸光度。

4)根据吸光度作图，比较药物对脾细胞的增值作用，如图4所示，结果显示HA-72和dHA-72对脾细胞均有增值作用，而且两性离子化透明质酸dHA-72的作用明显强于HA-72。此外，HA-72和dHA-72可以协同ConA和LPS刺激脾细胞增殖。

实施例3用TLR2-/-和TLR4-/-缺陷鼠做脾细胞增殖实验

1)脾淋巴细胞的获得同实施例2，分别获得TLR2-/-和TLR4-/-以及其对照小鼠B6和B10的脾细胞；

2)药物刺激脾细胞增值实验：同实施例2铺板加药，培养，检测；

3)根据吸光度作图，计算增殖率，比较药物对脾细胞的增值作用是否依赖于TLR2或者TLR4途径，如图5所示，结果显示HA-72对脾淋巴细胞的增值依赖于TLR4途径，然而dHA-72对脾淋巴细胞的增值依赖于TLR2途径。

实施例4多糖对CD3+T细胞增值作用

1)脾细胞的获取步骤同实施例2；

2)CFSE染色：准备单个细胞悬液，PBS洗两次，洗掉血清，用预热的PBS调整细胞浓度到5～10×10⁶个/mL，加CFSE到终浓度3微摩，混合，37℃避光培养10min，停止，加入4～5倍体积预冷的1640完全培养基，冰浴5min，用完全培养基洗涤三次，终止反应；

3)铺板，加药：预染好的细胞调整细胞浓度到1×10⁶个/mL，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分别加10微升PBS，HA-72(1mg/mL)和dHA-72(1mg/mL)，37℃培养箱培养48h，收集细胞，PBS洗涤，anti-CD3+抗体4摄氏度避光染色30min，离心去掉多余的抗体，PBS洗涤3次，并加入1毫升PBS重悬细胞，流失细胞仪检测CD3+T细胞的增值。

4)如图6所示，对结果进行处理和分析，可以得出结论HA-72和dHA-72能够促进CD3+T细胞增值，且作用相当。

实施例5多糖对CD19B细胞增值作用

1)脾细胞的获取步骤同实施例2；

2)CFSE染色同案例4；

3)铺板，加药：预染好的细胞调整细胞浓度到1×10⁶个/mL，加入到96孔板中，每孔加90微升，然后分别加10微升PBS，HA-72(1mg/mL)和dHA-72(1mg/mL)，37℃培养箱培养48h，收集细胞，PBS洗涤，anti-CD19抗体4摄氏度避光染色30min，离心去掉多余的抗体，PBS洗涤3次，并加入1毫升PBS重悬细胞，流失细胞仪检测CD19B细胞的增值；

4)如图7所示，对结果进行处理和分析，可以得出结论HA-72和dHA-72能够促进CD19B细胞增值，且dHA-72的促增值作用明显强于HA-72。

Claims (7)

1.一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)无水肼的制备

在30mL一水合肼中加入12g氢氧化钾，4℃过夜，取上清，加入12g氢氧化钠，氮气保护下，加热回流2h，收集蒸馏液，得到无水肼；

2)将透明质酸用含无水肼溶解，脱氧氮气保护后在60℃反应72h；

3)反应产物用冷乙醇沉淀，沉淀溶于浓度5％的冰乙酸中，加入浓度为5g/L的碘酸，4℃放置2h；

4)利用浓度2g/L氢氧化钠溶液中和，透析，冻干，得到最终高分子量两性离子透明质酸多糖。

2.根据权利要求1所述的一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所得无水肼的纯度为90～94％。

3.根据权利要求1所述的一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的无水肼含有重量质量浓度1％的硫酸联氨。

4.根据权利要求1所述的一种高分子量去乙酰化透明质酸的制备方法，其特征在于：步骤(3)中过量的碘酸通过加入浓度57％氢碘酸，通过乙醚萃取去掉生成的碘。

5.权利要求1制备方法所得高分子量去乙酰化透明质酸在制备治疗免疫疾性疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5的应用，其特征在于：所述的免疫性疾病为原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、自身免疫疾病或急性感染。

7.根据权利要求5的应用，其特征在于：所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、冻干粉针剂或注射液。