CN104910125A - 小花山小橘中分离的抗虫成分 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从植物小花山小橘中分离的抗虫成分。本发明还从小花山小橘提取分离出一种具有害虫拒食性的新化合物——式I。用小花山小橘的提取物或式I化合物可制备抗虫制品。

Description

小花山小橘中分离的抗虫成分

技术领域

本发明涉及一种从植物小花山小橘中分离的抗虫成分，包括粗提物和一种新化合物。 

背景技术

小花山小橘（G.parviflora（Sims）Kurz），芸香科山小橘属，为灌木或小乔木。小花山小橘的根及叶可以作草药，其味苦，微辛，气香，性平。其中根行气消积，化痰止咳；而叶则有散瘀消肿的功效。可用于感冒咳嗽，胃腹胀痛，消化不良，跌打瘀痛，风湿关节痛等。对于小花山小橘，不论该植物本身，或其分离出的化学成分的生物活性的研究，都少有报道。 

发明内容

本发明的目的是从天然植物中提取分离出具有害虫拒食性的新物质。 

本发明发现小花山小橘的提取物具有害虫拒食性。 

本发明采用硅胶柱层析方法，从小花山小橘提取分离出一种新化合物——式I，经鉴定，其化学结构式如下所示： 

式I的化学命名是3-amino-6,8-dimethoxy-3-(2-oxopropyl)-[1,5]dioxocane-2,4,7-trione，（3-氨基-6,8-二甲氧基-3-(2-羰基丙基)-[1,5]二氧八环-2,4,7-三酮）。 

将式I化合物进行赤拟谷盗成虫拒食实验证实，式I具有对害虫的拒食活性功能。 

可将式I化合物制成各种药物可接受的盐和制剂，用于制备抗虫制品。 

经试验证实，式I化合物对害虫拒食效果较为显著（见实施例）。 

本发明优点： 

式I化合物是从小花山小橘植物中提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。 

附图说明

图1是式I化合物的1H-NMR谱图； 

图2是式I化合物的COSY谱图； 

图3是式I化合物的HSQC谱图； 

图4是式I化合物的HMBC谱图； 

图5是式I化合物的APT谱图； 

图6是式I化合物的ESI谱图。 

具体实施方式

式I化合物的分离 

仪器： 

Bruker ACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞士Bruker公司； 

玻璃色谱柱：直径与长度85×550mm，40×400mm、35×400mm、30×400、25×400mm、20×350mm，购于北京博美玻璃有限公司。 

材料与试剂： 

层析硅胶（200-300目）采自青岛海洋研究所， 

薄层层析硅胶GF254购于青岛海洋化工有限公司； 

石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均购自北京化学试剂公司； 

95%酒精采购自北京广达恒益有限公司。 

分离方法 

1小花山小橘乙醇提取物一级硅胶柱层析分离 

首先采用薄层层析确定起始洗脱剂。将样品用丙酮稀释，用毛细管点样于GF254薄层板上，在层析缸中加入1ml按一定比例配比的石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇洗脱剂。将点好样品的薄层板放入层析缸中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.3-0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄层板上沿0.5-1.0cm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，随后将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在0.2～0.3时，即可确定此展开剂为起始洗脱剂。 

采用湿装法装柱，将玻璃色谱柱（85×550mm）垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏。将200～300目硅胶放入烧杯中，加入适当量的洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅胶加完后，仍使洗脱剂流滴一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的洗脱剂几乎全部流入接受瓶内。然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使其静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果。 

样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出，丙酮溶解样品加入适当量的200-300目硅胶拌匀，搅拌或者在用吹风机吹干溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量洗脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离。 

洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，按极性从小到大梯度洗脱，采用等馏分收集法（500mL）收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，在回收过程中将馏分经薄层层析（TLC）检验后将成分相同或相似者合并。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集5-6个500mL馏分，按从小到大增加洗脱剂（石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇）极性。加到50%无水乙醇后，当收集5-6个收集瓶后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集5-6个收集瓶时，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入水洗脱，洗脱下来的溶液用三氯甲烷萃取，萃取液经旋转蒸发仪回收试剂。小花山小橘乙醇提取物经一级柱层析分离，并通过薄层层析检测合并后相同的组分，然后继续进行二级硅胶柱层析分离。 

2小花山小橘乙醇提取物二级硅胶柱层析分离 

采用薄层层析检验，确定各部分起始洗脱剂。方法同3.2.1。 

采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35×400mm，30 

×400mm，40×400mm，其余同3.2.1方法。 

样品的加入，采用干法加样。方法同3.2.1。 

二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馏分收集法（150mL）收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，经薄层层析（TLC）检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗脱后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。 

3NMR和MS分析 

将样品用氘代氯仿（CDCl3）溶解，加入核磁管，由北京师范大学分析测试中心核磁共 振实验室应用Bruker DRX500核磁共振波谱仪测定1H-NMR，13C-NMR，COSY，HSQC，HMBC和APT。由北京师范大学放射性药物教育部重点实验室应用Quattro Micro串联四级杆质谱仪测定EI和ESI。 

4结果与分析 

通过NMR和MS测定，分析鉴定出新结构化合物生物碱，为无色油状物，结构见式I，分子式为C11H15NO8，改良碘化铋钾反应为良性，说明结构中含N。 

（+）ESI-MS m/s：290.6[M+H]+。1H-NMR（500MHz,CDCl3）δ（ppm）:5.45（2H,s,6,8-H），3.78（6H,s,6,8-OCH3），3.03（2H,s,9H），2.22（3H,s,11H）；13C-NMR（125MHz,CDCl3）δ（ppm）:207.3（C-10），186.7（C-7），170.2（C-2,4）100.5（C-6,8），71.2（C-3），56.4（8-OCH3）,56.2（6-OCH3）,47.3（C-9），31.8（C-11）。13C-NMR结合APT谱，有11个碳信号，其中δ170.2，δ186.7和207.3为四个羰基的碳信号，δ56.2和δ56.4为两个甲氧基的碳信号，δ100.5为两个叔碳信号，δ71. 

2为连接氨基的季碳信号，δ47.3为一仲碳信号，δ31.8为一甲基碳信号。H-H COSY谱图中，δ3.03（9-H）与δ2.22（11-H）为W型耦合，δ5.45（6-H）与δ3.78（6-OCH3）为W型耦合，δ5.45（8-H）与δ3.78（8-OCH3）为W型耦合。HMBC谱中，δ2.22（H-11）与δ47.3（C-9）、δ207.3（C-10）远程相关，δ3.03（9-H）与δ71.2（C-3）、δ170.2（C-4）、δ207.3（C-10）远程相关，δ3.78（6H-OCH3）与δ56.4（8-OCH3）、δ170.2（C-2）远程相关，δ5.45（6-H）与δ71.2（C-3）、δ100.5（C-8）、δ170.2（C-4）、δ186.7（C-7）远程相关。 

据此鉴定结构为3-amino-6,8-dimethoxy-3-(2-oxopropyl)-[1,5]dioxocane-2,4,7-trione（3-氨基-6,8-二甲氧基-3-(2-氧丙基)-[1,5]二氧八环-2,4,7-三酮）。 

式I化合物对害虫的拒食活性测定 

试验药物：上述获得的式I化合物 

阳性对照药物：川楝素，是从川楝皮中分离得到的四环三萜类化合物，1983年赵善欢等对其拒食活性进行研究，结果表明，川楝素对多种农业害虫如三化螟、稻小叶夜蛾、菜青虫、亚洲玉米螟及褐稻虱均有显著的拒食作用。近年来，川楝素作为昆虫拒食剂被商品化生产，通常作为衡量其他物质拒食活性的阳性对照品。 

试虫：赤拟谷盗成虫，（中国农业大学昆虫系人工饲养）试验方法： 

试验方法： 

1面饼制备 

采用面饼法进行试验，称取0.4g面粉放入玻璃小瓶中。称取药品用无水乙醇配制成1mg/ml的溶液，加1～2滴DMSO，用移液枪取不同体积的药品母液加入水中，定容至2ml水溶液中，摇匀后加入面粉，搅拌均匀，配制成不同浓度的面粉浑浊液（5个浓度：1500ppm，500ppm，150ppm，50ppm，15ppm）。对照组用2ml蒸馏水与面粉混匀。将移液枪的枪头减掉1cm，取200μl面粉浑浊液加到干净、平整、无划痕的培养皿上形成面饼，放到通风处过夜，然后将面饼放入白色塑料瓶中备用。 

2拒食活性测定 

将制作好的面饼放入28～30℃，相对湿度70～80%的恒温培养箱中平衡水分。挑选试虫放入玻璃小瓶中，每个小瓶为一个重复，每个浓度5个重复，每个重复20头试虫。实验前将试 虫进行饥饿处理24h。分别称量空瓶重量，加入面饼后的重量，加入面饼和20头试虫后的重量。拧紧瓶盖，置于28～30℃，相对湿度70～80%的恒温培养箱中培养。三天后，先称量瓶、面饼和试虫的总重量，然后将试虫取出，称量面饼和瓶的总重量，计算试虫的取适量。拒食率经反正弦平方根转换，进行方差分析和Tukey检验，并做浓度与拒食率的回归方程，计算EC50。 

拒食率（%）=100×（对照组面饼取食量—处理组面饼取食量）/对照组面饼取食量 

3拒食活性测定结果 

见表1。 

表1.式I化合物对赤拟谷盗成虫拒食活性 

表2.阳性对照川楝素对赤拟谷盗成虫拒食活性 

试验结果： 

式I化合物对赤拟谷盗成虫的拒食EC50是阳性对照川楝素的2.2倍。 

试验结论： 

式I化合物对赤拟谷盗成虫具有拒食活性。 

式I化合物是与现有技术的抗虫化合物结构完全不同新化合物，可以作为开发抗虫化合物的又一新的母体结构。 

Claims (7)

1.一种具有害虫拒食性的化合物，其结构如式I：

2.权利要求1所述的式I化合物，包括其药物可接受的盐。

3.权利要求1或2所述的式I化合物在制备抗虫制品中的应用。

4.含权利要求1或2所述的式I化合物的制剂。

5.小花山小橘的提取物在制备抗虫制品中的应用。

6.权利要求5所述的应用，所述提取物是通过硅胶柱层析分离小花山小橘的所得到的提取物。

7.含小花山小橘的提取物的制剂。