CN105712921B - 分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害防治技术，具体涉及一种分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用途。所述化合物的结构如式(I)所示，是采用乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层析法从臭常山根部提取而得，其化学命名是(Z)‑3‑(4‑hydroxybenzylidene)‑4‑(4‑hydroxyphenyl)‑1‑methylpyrrolidin‑2‑one。将所述化合物分别对南方根结线虫和松材线虫进行室内毒力测定，结果表明该化合物具有较强的杀线虫活性。该化合物在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。

Description

分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用途

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术，具体涉及一种分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用途。

背景技术

臭常山(Orixa japonica)为芸香科臭常山属植物，分布于河南、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、湖南、贵州、四川、云南等地。在民间常用于治疗风热感冒、疟疾等。对于臭常山，无论是医学方面药效药理的研究，还是对其本身化学成分和生物活性的研究，都少有报道。

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)属垫刃目(Tylenchida)，垫刃亚目(Tylenchina)，异皮科(Heteroderidae)，根结亚科(Meloidogyninae)，根结线虫属(Meloidogyne)。南方根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，雌雄异体，主要危害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状，被害株地上部分生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)属滑刃目(Aphelenchida)，滑刃亚目(Aphelenchina)，滑刃总科(Aphelenchoidoidea)，滑刃科(Aphelenchoididae)，伞滑刃属(Bursaphelenchus)。松材线虫病又称松枯萎病，是一种毁灭性虫害。它是通过松墨天牛(Monochamus alternatus)等媒介昆虫传播于松树体内，从而引发松树病害。被松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂。

目前，对南方根结线虫和松材线虫的防治主要采用化学防治的方法。常用杀根结线虫剂多为有机磷或氨基甲酸酯类的单剂或复配制剂，如噻唑磷、硫线磷、涕灭威、克百威等。在松材线虫侵染前数星期，用丰索磷、乙伴磷、治线磷等内吸性杀虫和杀线剂施于松树根部土壤中，或用丰索磷注射树干，预防松材线虫侵入和繁殖。采用内吸性杀线剂注射树干，能有效地预防松材线虫的侵入。化学防治在南方根结线虫和松材线虫的防治过程中占有重要地位,见效快、防效好,深受青睐。但目前使用的化学杀线剂存在毒性大、环境污染严重、易产生抗药性等诸多问题。因此,随着农民环保意识的增强和线虫抗药性的增加，化学杀线虫剂的应用前景黯淡。

因此，需要开发一种毒性小、不易使线虫产生抗药性的环保型药物，提高蔬菜的产量和品质，保护我国森林资源安全和造林绿化成果。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一种从臭常山根的正丁醇提取物中分离的新化合物，该化合物能够有效杀灭南方根结线虫和松材线虫。本发明请求保护的技术方案如下：

如式(I)所示的化合物：

式(I)所示化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

式(I)所示化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。

式(I)所示化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以臭常山根为原料进行分离提纯获得式(I)所示的化合物或其盐。

优选地，所述分离提纯包括采用乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层析。

优选地，所述乙醇浸提：将干燥的臭常山根依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天；

所述正丁醇萃取：所得乙醇浸提液在50℃蒸发浓缩后，室温下经过正丁醇萃取将水相弃去，留正丁醇相在60-70℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正丁醇得正丁醇萃取物；

所述大孔树脂分离：先用5％氢氧化钠浸泡大孔树脂4-6h，然后用蒸馏水洗至中性，再用5％盐酸浸泡4-6h，然后用蒸馏水洗至中性；将预处理后的大孔树脂装入玻璃色谱柱，然后将臭常山根的正丁醇萃取物用蒸馏水溶解后，加入玻璃色谱柱中；最后用蒸馏水-无水乙醇按极性从大到小进行梯度洗脱，采用等馏分收集法收集得到粗分离物；

所述硅胶柱层析：用丙酮溶解粗分离物，加30-50g硅胶搅拌均匀，用电吹风将拌过样品的硅胶吹干后加入硅胶柱中，以石油醚:乙酸乙酯为洗脱剂进行等梯度洗脱，按等馏分收集法收集活性成分。

臭常山根在防治线虫中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭常山根的正丁醇提取物。

本发明提供一种新化合物，其结构如图1所示，所述新化合物是采用乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层析法从臭常山根部分离而得。经鉴定，该化合物是一种生物碱，为无色结晶，碘化铋钾反应显阳性，分子式为C₁₈H₁₇NO₃，分子量为295.34，其化学命名是(Z)-3-(4-hydroxybenzylidene)-4-(4-hydroxyphenyl)-1-methylpyrrolidin-2-one。将所述化合物分别对南方根结线虫二龄幼虫和松材线虫幼虫进行室内毒力测定，结果表明该化合物具有杀线虫活性。与杀线虫化合物2％阿维菌素相比，新化合物对南方根结线虫二龄幼虫和松材线虫幼虫的LD₅₀分别是阳性对照2％阿维菌素的107倍和59倍，有望成为新一代生物农药。

本发明分离获得的新化合物，可使用二甲苯、甲苯、C10芳烃、乙醇、乙腈等作为溶剂，加入吐温、甘油等作为助溶剂，制成抗虫制品，用于杀灭线虫。由于本发明分离获得的新化合物是从臭常山根部提取而得，在自然条件下易分解，因此不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。在本发明的一些实施例中，所述抗虫制品也可以包含化学上相容的其它的本领域已知的具有抗虫活性的化合物，从而增强抗虫效果。

在本发明的一些实施例中，将本发明的新化合物与无机酸或有机酸形成生理上可接受的盐，使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备抗虫制品，发挥抗虫活性。

实验证明，臭常山根的正丁醇提取物也具有杀线虫活性，可将其粗提物直接用于杀灭线虫，或与适合的溶剂及辅助试剂一起制成抗虫制品。在本发明的一些实施例中，可以将臭常山根的正丁醇提取物与本领域公知的具有杀虫活性的其它化合物同时使用，发挥综合的抗虫作用。

附图说明

图1.式(I)化合物的结构式；

图2.式(I)化合物的¹H-NMR谱图；

图3.式(I)化合物的¹³C-NMR谱图；

图4.式(I)化合物的HMBC谱图；

图5.式(I)化合物的HSQC谱图；

图6.式(I)化合物的HRMS谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施方式仅作为解释说明，而不构成对本发明保护范围的任何限制。

生物材料：

臭常山：采自贵州省安顺市西秀区。

南方根结线虫：为中国农业大学昆虫系人工饲养。

松材线虫：为中国农业大学昆虫系人工饲养。

实验仪器：

Bruker ACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞士Bruker公司；

玻璃色谱柱：直径与长度85×550mm、40×400mm、35×400mm、30×400mm、25×400mm、20×350mm，购于北京博美玻璃有限公司。

材料与试剂：

层析硅胶(200-300目)采自青岛海洋研究所；

薄层层析硅胶板(GF254)购于青岛海洋化工有限公司；

石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均购自国药集团化学试剂有限公司；

95％酒精采购自北京广达恒益有限公司。

本实施例未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方法配制而得，或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、式(I)化合物的分离

1、臭常山根的正丁醇萃取物的制备

将干燥的臭常山根剪碎后，依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在50℃水浴锅中旋转蒸发器浓缩后，得到的乙醇浸提物先在室温下用正己烷萃取，分层后，取水相，在室温下用三氯甲烷萃取，分层后取水相，在室温下用乙酸乙酯萃取分层，取水相(由于目标产物存在于极性较大的正丁醇相中，将酒精浸提物先依次用极性小于正丁醇的正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取后，除去极性较小的非目标化合物，得到的水相再用正丁醇萃取，可以提高提取分离效率)，室温经过正丁醇萃取，将水相弃去，留正丁醇相在60-70℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正丁醇，得到正丁醇萃取物，即本发明中的臭常山根正丁醇萃取物。

2、提取物的大孔树脂粗分离

(1)大孔树脂预处理

取1000g新购入的AB-8型大孔树脂(郑州艾诺化工科技有限公司)，先用2-3L 5％氢氧化钠溶液浸泡4-6h，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馏水洗至中性，再用2-3L 5％盐酸溶液浸泡4-6h，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馏水洗至中性备用。

(2)装柱

将玻璃色谱柱(85×550mm)垂直固定在铁架台上，在玻璃色谱柱底部塞一小块脱脂棉，以防树脂流失。将预处理后的大孔树脂在蒸馏水中摇匀，缓慢倒入玻璃色谱柱中，沉淀后，打开色谱柱下面的阀门，待蒸馏水流干后，关掉阀门。

(3)加样

将臭常山根的正丁醇萃取物(30g)用蒸馏水溶解稀释后，沿玻璃色谱柱壁缓慢倒入色谱柱中，下端阀门打开，用三角瓶接收，将接收到的液体从上端倒回色谱柱中，使更多的样品吸附在大孔树脂上。待接收到的液体接近淡黄色至无色时，表示上样完毕，将柱内的液体放干，弃去。

(4)洗脱

洗脱剂采用蒸馏水-无水乙醇，按极性从大到小进行梯度洗脱(100:10,100:30,100:50，100:70,100:90)，采用等馏分收集法(400-600mL)收集，使用旋转蒸发仪(60-70℃)回收溶剂。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集7-8个馏分，相同极性洗脱下来的馏分进行合并。梯度洗脱结束后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，使用旋转蒸发仪回收溶剂。臭常山根正丁醇萃取物经大孔树脂粗分离并对相同极性的馏分进行合并后，共得到5个馏分，然后继续进行二级硅胶柱层析细分离。

3、提取物的二级硅胶柱层析分离

(1)确定起始洗脱剂

首先采用薄层层析确定起始洗脱剂，具体步骤为：各取1μL步骤2获得的5个馏分，分别用丙酮稀释至200-300μL，用毛细管点样于GF254薄层色谱板上，在层析缸中加入1-2mL按一定比例配比(100:2～0:100)极性递增的石油醚:乙酸乙酯洗脱剂。将点好样品的薄层板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.3～0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄层板上沿0.5～1.0cm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，并将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在0.2～0.3时，即可确定此展开剂为起始洗脱剂。最后确定各个馏分的起始洗脱剂的石油醚:乙酸乙酯配比范围是100:20-100:100。

(2)装柱：采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35×400mm，30×400mm，40×400mm。将玻璃色谱柱垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏。将200～300目硅胶放入烧杯中，加入适当量的起始洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅胶加完后，仍使起始洗脱剂流一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的起始洗脱剂几乎全部流入接收瓶内。然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使其静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果。

(3)加样：样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出。用丙酮溶解样品，加入适当量的200-300目硅胶拌匀，用吹风机吹干溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量起始洗脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离。

(4)洗脱：二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馏分收集法(150mL)收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，经薄层层析(TLC)检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗脱后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。

4、NMR和MS分析

将样品用氘代甲醇(MeOD)溶解，加入核磁管，由北京师范大学分析测试中心核磁共振实验室应用Bruker DRX500核磁共振波谱仪测定¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC-NMR和HSQC-NMR。由北京师范大学分析测试中心质谱实验室测定HRMS。

实验结果：

分析鉴定出的新结构化合物是一种生物碱，为无色结晶，碘化铋钾反应显阳性，分子式为C₁₈H₁₇NO₃，分子量为296.12，其结构如图1所示，其化学命名是(Z)-3-(4-hydroxybenzylidene)-4-(4-hydroxyphenyl)-1-methylpyrrolidin-2-one。

¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.39(1H,s,H-6),7.23(2H,d,J＝8.2Hz,H-8,12),7.05(2H,d,J＝8.0Hz,H-14,18),6.72(2H,d,J＝8.0Hz,H-15,17),6.66(2H,d,J＝8.1Hz,H-9,11),4.48(1H,d,J＝7.8Hz,H-4),3.98(1H,d,J＝9.3Hz,H-5α),3.27(1H,d,J＝9.9Hz,H-5β),2.98(3H,s,H-19).

¹³C NMR(125MHz,MeOD)δ170.8(C-2),158.2(C-10),156.1(C-16),133.5(C-13),132.2(C-6),131.8(C-8,12),127.7(C-14,18),125.9(C-7),115.3(C-15,17),114.9(C-9,11),57.0(C-5),40.3(C-4),29.0(C-19).

HMBC:H-4/C-14,C-18；H-6/C-8,C-12；H-8/C-6,C-10；H-9/C-7,C-10；H-11/C-7,C-10；H-12/C-6,C-10；H-14/C-4,C-16；H-15/C-13,C-16；H-17/C-13,C-16；H-18/C-4,C-16；H-19/C-2,C-5.

HRMS m/z:294.1136

实施例2、式(I)化合物及臭常山根的正丁醇萃取物对线虫的毒力测定

试验药物：实施例1中获得的式(I)化合物及臭常山根的正丁醇萃取物。

试虫：南方根结线虫二龄幼虫和松材线虫幼虫。

试验方法：

以无水乙醇为溶剂配制浓度为20mg/250μL的式(I)化合物母液备用。试验中用含有1％无水乙醇的蒸馏水溶液作为稀释剂，配制浓度分别为800ppm、400ppm、200ppm、100ppm、50ppm的式(I)化合物溶液各4ml，每个浓度重复三次。将试虫放置在24孔培养板内，每孔放入40-60头均一大小的南方根结线虫。记录放入活虫数，每个重复加入1mL已配制好的式(I)化合物溶液，加入溶液时从培养板边沿缓慢加入，以免对试虫造成不利影响。将培养板置于温度为25℃恒温培养箱内，72h后检查活虫数，即得死亡虫数。判断方法为：卷曲或者游动均为活。利用SPSS软件计算得到式(I)化合物的致死中浓度。以2％阿维菌素作为阳性对照，浓度设定为15ppm、5ppm、1.5ppm、0.5ppm。

臭常山根的正丁醇萃取物的毒力测定步骤与化合物相同，只是母液配制为20mg/250μL，并稀释为1600ppm、800ppm、400ppm、200ppm这四个浓度进行测定。

死亡率(％)＝100×死虫数/试虫数

校正死亡率(％)＝100×处理组死亡率-对照组死亡率/1-对照组死亡率

半致死剂量(LD₅₀)即引起50％试虫死亡率的剂量，使用Probit软件包计算得到半致死剂量。

实验结果：

式(I)化合物及臭常山根的正丁醇萃取物对南方根结线虫和松材线虫幼虫的毒性测定结果如表1所示。

表1.式(I)化合物及臭常山根的正丁醇萃取物对线虫的毒性测定

实验数据表明，式(I)化合物具有较强的杀线虫活性，虽然式(I)化合物对南方根结线虫和松材线虫的LD₅₀与2％阿维菌素相比高出许多，但是该化合物是从臭常山的根部中提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。

从表1中还可以看出，臭常山根的正丁醇萃取物也具有杀线虫活性，只是活性不及式(I)化合物强。

Claims (8)

1.如式(I)所示的化合物：

2.权利要求1所述的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

3.权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。

4.权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在制备抗线虫制品中的用途。

5.一种抗线虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

6.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)臭常山根的正丁醇萃取物的制备

将干燥的臭常山根剪碎后，依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在50℃水浴锅中蒸发浓缩后，得到的乙醇浸提物先在室温下用正己烷萃取，分层后，取水相，在室温下用三氯甲烷萃取，分层后取水相，在室温下用乙酸乙酯萃取分层，取水相，室温经过正丁醇萃取，将水相弃去，留正丁醇相在60-70℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩，除去正丁醇，即得到臭常山根的正丁醇萃取物；

(2)萃取物的大孔树脂粗分离

大孔树脂预处理：取1000g AB-8型大孔树脂，先用2-3L 5％氢氧化钠溶液浸泡4-6h，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馏水洗至中性，再用2-3L 5％盐酸溶液浸泡4-6h，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馏水洗至中性备用；

装柱：将85×550mm的玻璃色谱柱垂直固定在铁架台上，在玻璃色谱柱底部塞一小块脱脂棉，以防树脂流失；将预处理后的大孔树脂在蒸馏水中摇匀，缓慢倒入玻璃色谱柱中，沉淀后，打开色谱柱下面的阀门，待蒸馏水流干后，关掉阀门；

加样：样品为臭常山根的正丁醇萃取物，具体步骤为：用蒸馏水溶解稀释样品后，沿玻璃色谱柱壁缓慢倒入色谱柱中，下端阀门打开，用三角瓶接收，将接收到的液体从上端倒回色谱柱中，使更多的样品吸附在大孔树脂上；待接收到的液体接近淡黄色至无色时，表示上样完毕，将柱内的液体放干，弃去；

洗脱：洗脱剂采用蒸馏水-无水乙醇，按极性从大到小进行梯度洗脱，采用400-600mL等馏分收集法收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂；洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集7-8个馏分，相同极性洗脱下来的馏分进行合并；梯度洗脱结束后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，使用旋转蒸发仪回收溶剂；臭常山根正丁醇萃取物经大孔树脂粗分离并对相同极性的馏分进行合并后，共得到5个馏分，然后继续进行二级硅胶柱层析细分离；

(3)萃取物的二级硅胶柱层析分离

确定起始洗脱剂：首先采用薄层层析确定起始洗脱剂，具体步骤为：各取1μL步骤(2)获得的5个馏分，分别用丙酮稀释至200-300μL，用毛细管点样于GF254薄层色谱板上，在层析缸中加入1-2mL比例配比为100:2～0:100的石油醚:乙酸乙酯洗脱剂，将点好样品的薄层板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.3～0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄层板上沿0.5～1.0cm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，并将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在0.2～0.3时，即可确定此展开剂为起始洗脱剂，最后确定各个馏分的起始洗脱剂的石油醚:乙酸乙酯配比范围是100:20-100:100；

装柱：采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35×400mm，30×400mm，40×400mm；将玻璃色谱柱垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏；将200～300目硅胶放入烧杯中，加入适当量的起始洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加；硅胶加完后，仍使起始洗脱剂流一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的起始洗脱剂几乎全部流入接收瓶内；然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净；色谱柱装好后，使其静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果；

加样：样品的加入，采用干法加样，所述样品分别为步骤(2)获得的5个馏分，具体步骤为：待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱剂放出；用丙酮溶解样品，加入适当量的200-300目硅胶拌匀，用吹风机吹干溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中；样品加入后，用滴管吸取少量起始洗脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离；

洗脱：二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按150mL等馏分收集法收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，经薄层层析检验后将成分相同或相似者合并；当活性成分成功洗脱后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。

7.臭常山根的正丁醇萃取物在防治线虫中的用途，其特征在于，所述正丁醇萃取物按照如下步骤制备而得：

将干燥的臭常山根剪碎后，依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在50℃水浴锅中蒸发浓缩后，得到的乙醇浸提物先在室温下用正己烷萃取，分层后，取水相，在室温下用三氯甲烷萃取，分层后取水相，在室温下用乙酸乙酯萃取分层，取水相，在室温下经过正丁醇萃取，将水相弃去，留正丁醇相在60-70℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正丁醇，即得到臭常山根的正丁醇萃取物。

8.一种抗线虫制品，其特征在于，其药效成分为臭常山根的正丁醇萃取物，所述正丁醇萃取物按照如下步骤制备而得：

将干燥的臭常山根剪碎后，依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在50℃水浴锅中蒸发浓缩后，得到的乙醇浸提物先在室温下用正己烷萃取，分层后，取水相，在室温下用三氯甲烷萃取，分层后取水相，在室温下用乙酸乙酯萃取分层，取水相，在室温下经过正丁醇萃取，将水相弃去，留正丁醇相在60-70℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正丁醇，即得到臭常山根的正丁醇萃取物。