CN104902934A - 移植用人工真皮及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供移植用人工真皮，其具有创伤接触层，所述创伤接触层包含基于生物降解性材料构成的多孔质片材，上述多孔质片材满足下述的式子。式：X2/X1≤0.8。在上述多孔质片材中，以相同长度绘制与创伤接触面平行的直线和垂直的直线时，X1为上述平行的直线与气孔的壁的交点数，X2为上述垂直的直线与气孔的壁的交点数。

Description

移植用人工真皮及其制造方法
技术领域
本发明涉及移植用人工真皮及其制造方法。
背景技术
难治性皮肤溃疡的原因有糖尿病、动脉不全、静脉不全、褥疮、外伤等。特别是近年来，伴随着糖尿病患者的增加，糖尿病的合并症之一即糖尿病性皮肤溃疡一味地增加。该难治性皮肤溃疡即使进行保守的治疗等治疗也不会治愈，大多需要皮瓣移植术或四肢切断术等侵袭性大的手术。
目前，作为其治疗之一，正在进行使用以胶原等生物降解性材料作为主要成分的人工真皮的治疗。该人工真皮在真皮再生时作为支架起作用。其结果是，通过来自移植床的成纤维细胞及血管的侵入及增殖而形成真皮成分(真皮样肉芽组织)，随着患者自身的拟真皮的再生，构成人工真皮的生物降解性材料被降解、吸收。
通过将人工真皮的基于生物降解性材料构成的创伤接触层制成多孔质结构，能够促进该层的基于自身组织的置换。已知有在这样的创伤接触层上层叠有水蒸汽透过调节层等的人工皮肤(参照日本特开平5-184662号公报及日本特开平5-285211号公报)。
发明内容
发明所要解决的课题
然而，日本特开平5-184662号公报及日本特开平5-285211号公报等中记载的以往的具有多孔质结构的人工皮肤虽然在皮肤缺损部具有真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力，但期望真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力更优异的人工真皮。
因此，本发明的目的在于提供皮肤缺损部的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力优异的移植用人工真皮。
此外，本发明的其他目的在于提供所述移植用人工真皮的制造方法。
用于解决课题的方案
本发明人们为了解决上述课题，对人工真皮继续进行了深入研究，结果发现，通过将包含基于生物降解性材料构成的多孔质片材的创伤接触层的多孔质制成特定的形状，从而人工真皮发挥优异的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力，由此完成本发明。
本发明的移植用人工真皮具有创伤接触层，所述创伤接触层包含基于生物降解性材料构成的多孔质片材，且上述多孔质片材满足下述的式子。
式：X2/X1≤0.8
上述多孔质片材中，以相同长度绘制与创伤接触面平行的直线和垂直的直线时，X1为上述平行的直线与气孔的壁的交点数，X2为上述垂直的直线与气孔的壁的交点数。
本发明的移植用人工真皮的制造方法是制造本发明的移植用人工真皮的方法，在制造上述多孔质片材时，包含将生物降解性材料的水溶液冷冻的工序。
发明效果
本发明的移植用人工真皮通过将多孔质片材的多孔质制成特定的形状，从而在皮肤缺损部具有优异的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力。此外，本发明的移植用人工真皮的制造方法可以采用公知的制造手段，简便地制造本发明的移植用人工真皮。
附图说明
图1是将实施例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像。
图2是将实施例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像(1,500μm×1,500μm的放大图)。
图3是使用实施例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行真皮样组织(肉芽样组织)形成试验，通过HE染色通过组织学方式观察到的图像。
图4是将实施例2中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像。
图5是将实施例2中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像(1,500μm×1,500μm的放大图)。
图6是使用实施例2中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行真皮样组织(肉芽样组织)形成试验，通过HE染色通过组织学方式观察到的图像。
图7是将比较例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像。
图8是将比较例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像(1,500μm×1,500μm的放大图)。
图9是使用比较例1中由基因重组明胶制作的多孔质片材进行真皮样组织(肉芽样组织)形成试验，通过HE染色通过组织学方式观察到的图像。
图10是将比较例2的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像。
图11是将比较例2的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜观察内部截面结构而得到的图像(1,500μm×1,500μm的放大图)。
图12是使用比较例2的多孔质片材进行真皮样组织(肉芽样组织)形成试验，通过HE染色通过组织学方式观察到的图像。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。另外，这些说明及实施例是例示本发明的，并不限制本发明的范围。
本说明书中使用“～”表示的数值范围表示包含“～”的前后记载的数值分别作为下限值及上限值的范围。
本说明书中“工序”这一词语不仅包括独立的工序，在无法与其他工序明确区别的情况下只要可达成本工序的所期望的作用，也就包含在本用语中。
本说明书中，有时将氨基酸序列中的氨基酸残基以本技术领域中周知的单字母表述(例如，将甘氨酸残基记载为“G”)或三字母表述(例如，将甘氨酸残基记载为“Gly”)来记载。
本发明中，关于蛋白质及多肽的氨基酸序列的“％”只要没有特别说明，则以氨基酸残基的个数为基准。
本说明书中的关于氨基酸序列的“同源性”可以是指使用BLAST包(参照Ausubel等、1999Short Protocolsin Molecular Biology、4thEd-Chapter18)计算的值。例如，相对于序列号1同源性为80％以上表示BLAST中的Max.Identities的值为80以上。
本发明的移植用人工真皮(以下也称为“本发明的人工真皮”。)具有创伤接触层，所述创伤接触层包含基于生物降解性材料构成的多孔质片材，且上述多孔质片材满足下述的式子。
式：X2/X1≤0.8
上述多孔质片材中，以相同长度绘制与创伤接触面平行的直线和垂直的直线时，X1为上述平行的直线与气孔的壁的交点数，X2为上述垂直的直线与气孔的壁的交点数。
为了求出X1及X2，上述平行的直线及上述垂直的直线优选分别绘制3条，优选1条直线的长度为1,500μm，3条直线的合计的长度为4,500μm。即，此时，在上述多孔质片材中，绘制3条与创伤接触面平行的直线(长度为1,500μm的直线3条。合计为4,500μm)和3条与创伤接触面垂直的直线(长度为1,500μm的直线3条。合计为4,500μm)时，X1为上述3条平行的直线与气孔的壁的交点数，X2为上述3条垂直的直线与气孔的壁的交点数。
X1及X2例如可以如下求出：获取以与创伤接触面平行的直线和垂直的直线为边的1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像，绘制将该截面图像等分成16个正方形的3条平行线及3条垂直线，由此求出。即，此时，从上述多孔质片材获取以与创伤接触面平行的直线和垂直的直线为边的截面图像(1,500μm×1,500μm的正方形)，绘制将该截面图像等分成16个正方形的3条平行线及3条垂直线时，X1为上述3条平行线与气孔的壁的交点数，X2为上述3条垂直线与气孔的壁的交点数。1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像优选从多孔质片材的中央部获取。
X1及X2更详细而言如下求得。
当多孔质片材的创伤接触面为大致平面时，任意地取与该大致平面平行的平面(以下称为“平行面”。)、及垂直的平面(以下称为“垂直面”。)，获取在该平行面及垂直面具有两条边的1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像。按照将获取的正方形的截面图像的边中通过平行面形成的边、及通过垂直面形成的边分别分割成四等分的方式，相对于各边沿垂直方向绘制3条分割线。其中，将分割通过平行面形成的边的分割线称为垂直线，将分割通过垂直面形成的边的分割线称为平行线。该垂直线为与创伤接触面垂直的线，该平行线为与创伤接触面平行的线。在截面图像中，3条平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计为X1，3条垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计为X2。
当多孔质片材的创伤接触面不为大致平面时，在使创伤接触面变形为平面的基础上，使创伤接触面朝下，将人工真皮置于平面上，任意地取与该平面平行的平面(平行面)、及垂直的平面(垂直面)，获取在该平行面及垂直面具有两条边的1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像。由1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像求出X1及X2的方法与上述的方法相同。
当多孔质片材的创伤接触面不为大致平面、且为无法使创伤接触面变形为平面的形状时，使创伤接触面朝下，将人工真皮置于平面上，任意地取与该平面平行的平面(平行面)、及垂直的平面(垂直面)，获取在该平行面及垂直面具有两条边的1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像。由1,500μm×1,500μm的正方形的截面图像求出X1及X2的方法与上述的方法相同。
X2/X1为表示多孔质片材的气孔的形状的参数。X2/X1小于1且越小，意味着在厚度方向上形成气孔的壁部相对地少，例如，各个气孔的形状在厚度方向上细长。X2/X1越接近1，意味着在厚度方向及平面方向上形成气孔的壁部的分布均等，例如，各个气孔的形状各向同性。X2/X1超过1且越大，意味着在平面方向上形成气孔的壁部相对地少，例如，各个气孔的形状在平面方向上细长。
本发明的人工真皮的特征在于，X2/X1为0.8以下，在厚度方向上形成气孔的壁部相对地少，由此，在移植床中，成纤维细胞及血管的侵入及增殖能够更容易，发挥优异的、例如在短期间内形成真皮样组织(肉芽样组织)的能力。通过该优异的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力，即使是不使用增殖因子和/或细胞等的情况，也能够形成真皮样组织(肉芽样组织)。另外，作为本发明的人工真皮的实施方式，并不排除包含增殖因子和/或细胞等的形态。
本发明中，X2/X1为0.8以下，作为X2/X1的上限的范围，优选为0.7以下，更优选为0.6以下，进一步优选为0.5以下，进一步优选为0.4以下。作为X2/X1的下限的范围，优选为0.1以上，更优选为0.2以上，进一步优选为0.3以上。作为X2/X1的范围，优选为0.1～0.8，更优选为0.2～0.7，进一步优选为0.3～0.6，进一步优选为0.3～0.4。
设为上述上限的范围时更可得到本发明的效果即优异的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力，所以优选。设为上述下限的范围从移植用人工真皮的物理强度的观点考虑是优选的。
X1的数值(3条长度为1,500μm的平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计)没有特别限制，但优选为10～500，更优选为30～300，进一步优选为40～150，进一步优选为50～100。
X2的数值(3条长度为1,500μm的垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计)没有特别限制，但由上述X2/X1的优选的范围和上述X1的优选的范围求得的范围为优选的范围。
(生物降解性材料)
本发明所述的生物降解性材料只要可在生物体内降解，则其种类没有特别限定。本发明中使用的生物降解性材料在以Grand average ofhydropathicity(GRAVY)值表示的亲疏水性指标方面，优选为0.0以上且5.0以下，进一步优选为0.3以上且3.0以下，特别优选满足上述范围的亲水性多肽。GRAVY值可以通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：TheProteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”的方法而获得。
作为生物降解性材料的具体例子，优选选自蛋白质、多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid；PLGA)、壳多糖、壳聚糖、纤维素、及透明质酸中的至少1种。上述中，优选蛋白质或多肽，特别优选明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白等。这些蛋白质可以是基因重组体，也可以是天然体，从感染症的担心少的方面、能够设计所期望的结构的方面考虑，优选基因重组体。作为基因重组蛋白质的具体例子，可列举出基因重组明胶、基因重组ProNectin、基因重组纤连蛋白、基因重组层粘连蛋白。上述中最优选为基因重组明胶。
(基因重组明胶)
基因重组明胶由于明胶本来的性能即生物体适应性优异，且并非来源于天然，所以BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy)等感染症的担心少，非感染性优异。此外，基因重组明胶由于与天然的明胶相比较均一，序列确定，所以在强度、分解性方面也能够通过后述的交联等变动少地精密地进行设计。
基因重组明胶的分子量优选为2kDa以上且100kDa以下。更优选为2.5kDa以上且95kDa以下，进一步优选为5kDa以上且90kDa以下，最优选为10kDa以上且90kDa以下。
基因重组明胶优选具有胶原所特有的Gly-X-Y所示的序列(GXY序列)的重复。其中，Gly表示甘氨酸残基，X及Y分别独立地表示任意的氨基酸残基(优选除甘氨酸残基以外的任意的氨基酸残基)，多个Gly-X-Y可以全部相同，也可以部分相同，还可以互不相同。胶原所特有的GXY序列是在氨基酸组成及序列方面其他蛋白质中基本不存在的、胶原及明胶的非常特异性的部分结构。在该部分结构中甘氨酸残基占整体的约三分之一，成为每3个氨基酸残基中甘氨酸残基重复的氨基酸序列。甘氨酸是结构最单纯的氨基酸，对分子链的配置的束缚也少，大大有助于凝胶化时的螺旋结构的再生。X及Y所表示的氨基酸残基的大部分优选被亚氨基酸残基(脯氨酸残基、羟脯氨酸残基)占据，优选亚氨基酸残基占基因重组明胶整体的10％～45％。基因重组明胶优选该序列的80％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的氨基酸残基优选为GXY序列的重复结构。
一般的明胶中，极性氨基酸中，具有电荷的氨基酸和无电荷的氨基酸以1：1存在。其中，极性氨基酸具体地是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸，其中，极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。本发明中使用的基因重组明胶中，构成该明胶的全部氨基酸残基中的极性氨基酸残基的比例优选为10％～40％，更优选为20％～30％。进而，该极性氨基酸残基中的无电荷氨基酸残基的比例优选为5％以上且低于20％，更优选为7％以上且低于10％。本发明中使用的基因重组明胶进一步优选在序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、半胱氨酸中的任1种氨基酸的残基、优选不包含2种以上的氨基酸的残基。
一般，在蛋白质及多肽中，已知有作为细胞粘附信号起作用的最小氨基酸序列。本发明中使用的基因重组明胶优选在一分子中具有2个以上作为细胞粘附信号起作用的最小氨基酸序列。作为最小氨基酸序列的具体的序列，从粘附的细胞的种类多的方面考虑，优选以氨基酸单字母表述表现的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列、及HAV序列，进一步优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列、及HAV序列，特别优选RGD序列。RGD序列中，优选ERGD序列。
本发明中使用的基因重组明胶中，从细胞的粘附性及增殖性的观点出发，上述最小氨基酸序列的个数优选在1分子蛋白质中为3～50个，进一步优选为4～30个，特别优选为5～20个，最优选为12个。
当本发明中使用的基因重组明胶中包含多个RGD序列(也称为“RGD基序”。)时，关于RGD序列的配置，RGD序列间的氨基酸残基数优选为0～100，更优选为25～60，RGD序列间的氨基酸残基数优选不均一。
本发明中使用的基因重组明胶中，RGD基序相对于氨基酸残基总数的比例(RGD基序的合计氨基酸残基数÷氨基酸残基总数×100)优选至少为1.2％，当基因重组明胶包含250个以上的氨基酸残基时，250个氨基酸残基的各伸出部(stretch)优选包含至少1个RGD基序。RGD基序的1.2％的比例与每250个氨基酸残基至少1个RGD序列对应。例如由251个氨基酸残基构成的明胶为了满足至少1.2％，必须至少包含2个RGD序列。
RGD基序相对于氨基酸残基总数的比例更优选至少为1.8％，进一步优选至少为2.4％，进一步优选至少为3.0％，进一步优选至少为3.6％，最优选至少为4.5％。基因重组明胶内的RGD基序的个数在每250个氨基酸残基中更优选至少为2，进一步优选至少为3，进一步优选至少为4，进一步优选至少为6，进一步优选至少为8，进一步优选为12以上且16以下。
本发明中使用的基因重组明胶也可以经过了部分水解。
本发明中使用的基因重组明胶优选具有A-[(Gly-X-Y)n]m-B的氨基酸序列。其中，A表示1个或2个以上的任意的氨基酸残基，B表示1个或2个以上的任意的氨基酸残基，Gly表示甘氨酸残基，n个X分别独立地表示任意的氨基酸残基，n个Y分别独立地表示任意的氨基酸残基，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。n个Gly-X-Y可以全部相同，也可以部分相同，还可以互不相同。n更优选为15～70，最优选为50～65。m更优选为3～5。
作为上述氨基酸序列中的A所示的1个或2个以上的任意的氨基酸残基，优选甘氨酸残基、及至少包含1个甘氨酸残基的2～6个氨基酸残基，更优选至少包含1个甘氨酸残基的3氨基酸残基。
作为上述氨基酸序列中的B所示的1个或个2以上的任意的氨基酸残基，优选甘氨酸残基、及至少包含1个甘氨酸残基的2～6个氨基酸残基，更优选甘氨酸残基。
作为基因重组明胶中包含的重复单元，优选将天然存在的胶原的序列单元多个结合而成的重复单元。这里所谓的天然存在的胶原只要是天然存在的胶原则可以是任意胶原，优选为I型、II型、III型、IV型、及V型。更优选为I型、II型、及III型。根据其它方式，该胶原的来源优选为人、牛、猪、小鼠、或大鼠，更优选为人。
本发明中使用的基因重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。
优选基因重组明胶未经脱氨基化。
优选基因重组明胶不具有端肽。
优选基因重组明胶为通过编码天然胶原的核酸制备的实质上纯的胶原样材料。
本发明中使用的基因重组明胶更优选具有下述的氨基酸序列。
Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
Gly表示甘氨酸残基，Ala表示丙氨酸残基，Pro表示脯氨酸残基，63个X分别独立地表示任意的氨基酸残基，63个Y分别独立地表示任意的氨基酸残基。63个Gly-X-Y可以全部相同，也可以部分相同，还可以互不相同。
本发明中使用的基因重组明胶特别优选为下述的(1)或(2)。
(1)具有序列号1中记载的氨基酸序列的基因重组明胶。
(2)具有与序列号1中记载的氨基酸序列有80％以上(更优选90％以上、进一步优选95％以上)的同源性的氨基酸序列、且具有生物降解性的基因重组明胶。
序列号1：GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
本发明中使用的基因重组明胶可以通过本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如可以按照EP1014176A2、US6992172B1、WO2004/85473A2、WO2008/103041A1等中记载的方法来制造。具体而言，获取编码规定的基因重组明胶的氨基酸序列的基因，将其组装入表达载体中，制作重组表达载体，将其导入适当的宿主中而制作转化体。通过将所得到的转化体用适当的培养基进行培养，产生基因重组明胶，所以通过由培养物回收基因重组明胶，可以制备本发明中使用的基因重组明胶。
(交联)
本发明中的生物降解性材料可以是经过了交联的，也可以是未经交联的，但优选经过了交联的材料。作为交联方法，可以采用热交联、化学交联、利用醛类(例如甲醛、戊二醛等)的交联、利用缩合剂(碳二亚胺、氨腈等)的交联、酶交联、光交联、UV交联等公知的方法。还优选除了交联(共价键)以外还通过疏水性相互作用、氢键、及离子性相互作用中的至少任一者进一步高级结构化的材料。
(多孔质片材)
对于本发明中的基于生物降解性材料构成的多孔质片材，以下进行说明。
(a)气孔率(porosity)
气孔率(P(％))由体积密度(ρ)和真密度(ρc)通过式：P＝1-ρ/ρc(％)求出。体积密度(ρ)由干燥重量和体积算出，真密度(ρc)可以通过使用了Hubbard型比重瓶的比重瓶法而求出。气孔率优选为81％以上且99.99％以下，更优选为95.01％以上且99.9％以下。
(b)气孔间连通孔
在本发明中的多孔质片材中，也可以存在气孔间连通孔。通过气孔间连通孔的存在，气孔从多孔质片材表面连通至多孔质片材深部为止，在移植床中，成纤维细胞及血管的侵入及增殖能够更容易。
(c)吸水率
吸水率(％)可以由干燥重量(W0)和水溶胀时的重量(W1)通过式：W1÷W0×100(％)算出，所述水溶胀时的重量(W1)为在25℃下自然吸收超纯水5分钟并在塑料浅皿上充分除去多余的水后的重量。吸水率优选为1000％以上且9900％以下，更优选为2000％以上且5000％以下。
基于生物降解性材料构成的多孔质片材可以采用公知的方法来制造。例如，通过将将上述的生物降解性材料溶解于溶剂中而得到的溶液(优选水溶液)冷冻，之后进行冷冻干燥、热交联，可以制造基于生物降解性材料构成的多孔质片材。多孔质片材的气孔率、气孔尺寸、X1、X2、及X2/X1根据所使用的生物降解性材料的种类、冷冻及冷冻干燥的条件(例如冷冻前的生物降解性材料的水溶液的浓度、水溶液量、冷冻速度、冷冻温度)等而改变。通过将它们进行调整，可以得到所期望的气孔率、气孔尺寸、X1、X2、及X2/X1。例如，通过将冷冻时的冷冻速度设定得较快，可见到X2/X1变低的倾向。
本发明中的多孔质片材为创伤接触层，在多孔质片材的创伤接触面与创伤接触时，在多孔质片材中发生成纤维细胞及血管的侵入及增殖，作为真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力优异的人工真皮发挥功能。因此，优选在多孔质片材的创伤接触面上没有层叠其他的层。但是，若是不会阻碍由本发明的人工真皮带来的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力的层，则也可以层叠。
在本发明中的创伤接触层的与创伤接触面相反侧的面上，还可以层叠其他的层。作为其他的层，可列举出例如人工真皮可具备的公知的层，具体而言，为水蒸汽透过调节层、有机硅层、网眼层等。
本发明的人工真皮也可以在其中包含增殖因子和/或细胞等，例如也可以在多孔质片材中(即创伤接触层中)包含增殖因子和/或细胞等。但是，本发明的人工真皮由于即使不包含增殖因子和/或细胞等，也可得到良好的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力，所以不包含增殖因子和/或细胞从制造成本等观点考虑是优选的。
本发明的人工真皮可以适宜用于皮肤的缺损部、粘膜的缺损部等。
本发明的移植用人工真皮的制造方法是制造本发明的移植用人工真皮的方法，在制造上述多孔质片材时，包含将生物降解性材料的水溶液冷冻的工序(冷冻工序)。本发明的移植用人工真皮的制造方法优选进一步包含将生物降解性材料水溶液的冷冻物冷冻干燥的工序(冷冻干燥工序)，更优选进一步包含使冷冻干燥后的生物降解性材料交联的工序(交联工序)。该交联工序优选为通过热使冷冻干燥后的生物降解性材料交联的工序(热交联工序)。冷冻方法及之后的冷冻干燥的方法、热交联的方法可以采用公知的方法。
本发明的移植用人工真皮的制造方法可以通过调整所使用的生物降解性材料的种类、冷冻及冷冻干燥的条件(例如冷冻前的生物降解性材料的水溶液的浓度、水溶液量、冷冻速度、冷冻温度)等，来调整多孔质片材的气孔率、气孔尺寸、X1、X2、及X2/X1。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。然而，本发明并不限定于这些实施方式。
[实施例1]
(基因重组明胶)
作为基因重组明胶(重组明胶)，准备了下述的CBE3(CBE3在WO2008/103041A1中有记载)。
CBE3
·分子量：51.6kDa
·结构：GAP[(GXY)63]3G
·氨基酸数：571个
·RGD序列：12个
·亚氨基酸含量：33％
·大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。
·CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。
·CBE3具有ERGD序列。
·等电点：9.34
·氨基酸序列(序列表的序列号1)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
(多孔质片材的制作)
使用基因重组明胶CBE3，制作3％明胶水溶液，将该水溶液流入到铝制杯子(直径53mm×高度37mm)中。之后，在-80℃的冷库内，于在铝块上放置有玻璃板的台上静置1小时。之后进行冷冻干燥，在160℃下进行3小时热交联，得到由基因重组明胶构成的多孔质片材(平均厚度为2300μm)。将所得到的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜确认结构(参照图1)。图2为1,500μm×1,500μm的放大图，通过上述的方法，绘制3条平行线和3条垂直线，分别求出交点数。3条平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X1为98(平行线1：交点数37、平行线2：交点数30、平行线3：交点数31)，3条垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X2为68(垂直线1：交点数19、垂直线2：交点数25、垂直线3：交点数24)，X2/X1为0.7。另外，本实施方式是仅由多孔质片材即创伤接触层构成的人工真皮。
(在大鼠背部的真皮样组织(肉芽样组织)形成试验)
使用Wistar大鼠(雄、10周龄以后)，通过将盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪分别以90mg/kg和10mg/kg投与到腹腔内而麻醉。将大鼠的背部脱毛后，制作直径为19mm的圆形的真皮缺损。将所得到的人工真皮贴附到真皮缺损部后，依次放上带凡士林的纱布(ADAPTIC(注册商标)、Johnson&Johnson K.K.)、湿棉花、及纱布并固定。第2周在麻醉下，将包含人工真皮的背部组织摘出。将该摘出组织通过HE(Hematoxylin Eosin)染色并通过组织学方式进行观察，结果与后述的比较例1及比较例2相比显著确认到真皮样组织(肉芽样组织)的形成(参照图3)。
[实施例2]
(多孔质片材的制作)
使用基因重组明胶CBE3，制作3％明胶水溶液，将该水溶液流入到铝制杯子(直径53mm×高度37mm)中。之后，在-60℃的冷库内，于在铝块上放置有玻璃板的台上静置1小时。之后进行冷冻干燥，在160℃下进行3小时热交联，得到由基因重组明胶构成的多孔质片材(平均厚度为2500μm)。将所得到的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜确认结构(参照图4)。图5为1,500μm×1,500μm的放大图，通过上述的方法，绘制3条平行线和3条垂直线，分别求出交点数。3条平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X1为108(平行线1：交点数36、平行线2：交点数34、平行线3：交点数38)，3条垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X2为32(垂直线1：交点数11、垂直线2：交点数7、垂直线3：交点数14)，X2/X1为0.3。另外，本实施方式是仅由多孔质片材即创伤接触层构成的人工真皮。
(在大鼠背部的真皮样组织(肉芽样组织)形成试验)
通过与实施例1同样的方法进行评价(参照图6)。与后述的比较例1及比较例2相比显著地见到真皮样组织(肉芽样组织)的形成。此外，与实施例1相比见到同等以上的真皮样组织(肉芽样组织)的形成。
[比较例1]
(多孔质片材的制作)
除了将实施例1的“-80℃的冷库内”变更为“-40℃的冷库内”以外，进行与实施例1同样的操作，得到由基因重组明胶构成的多孔质片材(平均厚度为2200μm)。将所得到的多孔质片材进行曙红染色，用光学显微镜确认结构(参照图7)。图8为1,500μm×1,500μm的放大图，通过上述的方法，绘制3条平行线和3条垂直线，分别求出交点数。3条平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X1为58(平行线1：交点数19、平行线2：交点数18、平行线3：交点数21)，3条垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X2为57(垂直线1：交点数20、垂直线2：交点数19、垂直线3：交点数18)，X2/X1为1。另外，本实施方式是仅由多孔质片材即创伤接触层构成的人工真皮。
(在大鼠背部的真皮样组织(肉芽样组织)形成试验)
通过与实施例1同样的方法进行评价(参照图9)。可以确认实施例1及实施例2更明显地形成真皮样组织(肉芽样组织)。
[比较例2]
(多孔质片材的制作)
代替实施例1的人工真皮，使用市售的真皮缺损用移植片Terudermis(注册商标)(Olympus Terumo Biomaterials Corp.)(平均厚度为3300μm)，进行同样的试验。将Terudermis进行曙红染色，用光学显微镜确认结构(参照图10)。图11为1,500μm×1,500μm的放大图，通过上述的方法，绘制3条平行线和3条垂直线，分别求出交点数。3条平行线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X1为41(平行线1：交点数13、平行线2：交点数12、平行线3：交点数16)，3条垂直线与形成气孔的壁部的交点数的合计即X2为40(垂直线1：交点数12、垂直线2：交点数13、垂直线3：交点数15)，X2/X1为1。另外，本实施方式是仅由多孔质片材即创伤接触层构成的人工真皮。
(在大鼠背部的真皮样组织(肉芽样组织)形成试验)
通过与实施例1同样的方法进行评价(参照图12)。可以确认实施例1及实施例2更明显地形成真皮样组织(肉芽样组织)。
如以上所示的那样，本发明的实施例所述的人工真皮通过将多孔质制成特定的形状，具有优异的真皮样组织(肉芽样组织)的形成能力。
2013年1月25日申请的日本专利申请2013-012626号的公开内容其整体通过参照纳入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请、及技术标准与具体且分别记载各个文献、专利申请、及技术标准通过参照纳入的情况相同程度地通过参照纳入本说明书中。

Claims (10)

1.一种移植用人工真皮，其具有创伤接触层，所述创伤接触层包含基于生物降解性材料构成的多孔质片材，所述多孔质片材满足下述的式子，
式：X2/X1≤0.8
在所述多孔质片材中，以相同长度绘制与创伤接触面平行的直线和垂直的直线时，X1为所述平行的直线与气孔的壁的交点数，X2为所述垂直的直线与气孔的壁的交点数。
2.根据权利要求1所述的移植用人工真皮，其中，所述X2/X1为0.1以上且0.8以下。
3.根据权利要求1或2所述的移植用人工真皮，其中，所述生物降解性材料为选自蛋白质、多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、壳多糖、壳聚糖、纤维素及透明质酸中的至少1种。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的移植用人工真皮，其中，所述生物降解性材料为选自明胶、纤连蛋白、及层粘连蛋白中的至少1种。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的移植用人工真皮，其中，所述生物降解性材料为基因重组明胶。
6.根据权利要求5所述的移植用人工真皮，其中，所述基因重组明胶具有下述的氨基酸序列，
A-[(Gly-X-Y)n]m-B
A表示1个或2个以上的任意的氨基酸残基，B表示1个或2个以上的任意的氨基酸残基，n个X分别独立地表示任意的氨基酸残基，n个Y分别独立地表示任意的氨基酸残基，n表示3以上且100以下的整数，m表示2以上且10以下的整数；n个Gly-X-Y可以全部相同，也可以部分相同，还可以互不相同。
7.根据权利要求5或6所述的移植用人工真皮，其中，所述基因重组明胶具有下述的氨基酸序列，
Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
63个X分别独立地表示任意的氨基酸残基，63个Y分别独立地表示任意的氨基酸残基；63个Gly-X-Y可以全部相同，也可以部分相同，还可以互不相同。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的移植用人工真皮，其中，所述基因重组明胶为下述的(1)或(2)，
(1)具有序列号1中记载的氨基酸序列的基因重组明胶；
(2)具有与序列号1中记载的氨基酸序列有80％以上的同源性的氨基酸序列、且具有生物降解性的基因重组明胶。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的移植用人工真皮，其中，所述生物降解性材料经过了交联。
10.一种移植用人工真皮的制造方法，其是权利要求1到9中任一项所述的移植用人工真皮的制造方法，
在制造所述多孔质片材时，包含将生物降解性材料的水溶液冷冻的工序。
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