CN104892438B - 一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，但分离纯化是最终获得高纯度羧甲基赖氨酸的关键步骤，目前现有技术主要为制备液相色谱、离子交换色谱分离纯化方法，这些方法较繁琐，效率低，不适合大量制备。探索快速、高效、低廉的分离纯化方法成为获得大量低成本高纯度羧甲基赖氨酸单体的关键。本发明对羧甲基赖氨酸分离纯化方法大胆创新，提出一种新的硅胶柱层析分离纯化方法，使羧甲基赖氨酸的合成量提高到克级，大大提升羧甲基赖氨酸的纯化效率，降低实验成本，为羧甲基赖氨酸各项毒理学评价工作的开展奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于化学品的合成及其分离纯化领域，具体涉及一种合成羧甲基赖氨酸的硅胶柱层析分离纯化方法。
背景技术
近年来，羧甲基赖氨酸成为食品加工安全研究热点。由于准确检测不同种类食品中羧甲基赖氨酸含量有一定难度，极大多数研究都在关注羧甲基赖氨酸检测方法的建立与验证，以及食品中羧甲基赖氨酸的形成原因、抑制方法、含量检测分析等。作为食品中广泛存在的化合物，羧甲基赖氨酸毒理学评价工作一直没有开展，毒理学资料也相对比较缺乏。目前，羧甲基赖氨酸的危害研究主要集中在生理医学领域，且主要以人体内源性的羧甲基赖氨酸或富含羧甲基赖氨酸的食品为对象，探讨它对人体各种慢性疾病的影响和健康效应关系。然而，单纯游离态羧甲基赖氨酸的毒理学安全性评价未有文献报道，羧甲基赖氨酸毒性大小以及是否具有生殖毒性、神经毒性、免疫毒性等却无从得知。羧甲基赖氨酸作为一种潜在的有害物，其在食品中安全隐患越来越受到业内关注。因此有必要开展对羧甲基赖氨酸各项毒理学安全评价工作。
商业化羧甲基赖氨酸标准品价格昂贵，毒理学评价的体内动物实验用量大，实验成本不可估量。基于文献报道的羧甲基赖氨酸合成方法已较为成熟，通过实验室化学合成羧甲基赖氨酸，成为降低毒理学评价实验成本的有效途径。
羧甲基赖氨酸合成方法虽已有多篇文献报道，但分离纯化是最终获得高纯度羧甲基赖氨酸的关键步骤。目前文献报道的制备液相色谱、离子交换色谱分离纯化方法较繁琐，效率低，探索快速、高效、低廉的分离纯化方法成为获得大量低成本高纯度羧甲基赖氨酸单体的关键。
发明内容
本发明对羧甲基赖氨酸分离纯化方法大胆创新，提出一种新的硅胶柱层析分离纯化方法，使羧甲基赖氨酸的合成量提高到克级，大大提升羧甲基赖氨酸的纯化效率，降低实验成本，为羧甲基赖氨酸各项毒理学评价工作的开展奠定基础。
一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，其特征在于：
A)还原胺化反应式Ⅰ所示的化合物
以合成式Ⅱ所示的化合物
在还原胺化反应过程中，乙醛酸为羰基供体，还原剂为NaBH3CN，溶剂为0.1mol/L的Na2CO3水溶液，反应过程中使用氮气保护，反应温度控制在30～40℃，反应时间为15～25h；
B)将式Ⅰ和式Ⅱ所示的化合物酯化得式Ⅲ、Ⅳ所示的化合物
在酯化反应中，使用3mol/L的盐酸正丁醇溶液溶解，充分混匀后真空抽滤过0.45μm有机滤膜，取滤过液在60～70℃不断搅拌条件下反应2h，然后将反应液真空浓缩；
C)将酯化反应后的混合物柱层析分离得到式Ⅳ所示的化合物
柱层析分离选用反相硅胶200～300目，54～75μm，湿法装柱，常压分离；
采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱，使用二氯甲烷:甲醇＝60:1、40:1、20:1各洗脱1～2个柱体积，收集Rf值相同的组分；
D)将层析分离后Rf相同的组分收集，除去溶剂后水解浓缩干燥后得到式Ⅴ所示的化合物
Rf＝0.6；
采用6mol/L的盐酸水溶液水解，水解温度为110℃，水解时间为20～40h。
所述酯化反应前使用37％的浓盐酸去除还原胺化反应中添加的过量NaBH3CN，然后真空减压浓缩，回收溶剂至干。
所述层析分离中使用的洗脱剂中添加有1％的氨水，并且在使用前添加适量的无水硫酸钠干燥过滤。
本发明的有益效果是：本发明一种新的硅胶柱层析分离纯化方法，使羧甲基赖氨酸的合成量提高到克级，大大提升羧甲基赖氨酸的纯化效率，降低实验成本，为羧甲基赖氨酸各项毒理学评价工作的开展奠定基础。
附图
图1是式Ⅳ所示化合物的一级质谱和二级质谱结构图；
图2是式Ⅲ与式Ⅳ所示化合物的薄层色谱(TLC)分离效果图；
图3是式Ⅴ所示化合物的结构表征H-NMR谱图；
图4是式Ⅴ所示化合物的结构表征1H-1H COSY谱图；
图5是式Ⅴ所示化合物的结构表征13C-1H HSQC谱图；
图6是式Ⅴ所示化合物的结构表征二级质谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。
本发明所述的一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，其特征在于：
A)还原胺化反应式Ⅰ所示的化合物
以合成式Ⅱ所示的化合物
在还原胺化反应过程中，还原剂为NaBH3CN，溶剂为0.1mol/L的Na2CO3水溶液，反应过程中使用氮气保护，反应温度控制在37℃，反应时间为20h；
在这个过程中一个非限制性的合成路线实例如下：
B)将式Ⅰ和式Ⅱ所示的化合物酯化得式Ⅲ、Ⅳ所示的化合物
在酯化反应中，使用3mol/L的盐酸正丁醇溶液溶解，充分混匀后真空抽滤过0.45μm有机滤膜，取滤过液在65℃不断搅拌条件下反应2h，然后将反应液真空浓缩；
在这个过程中非限制性的合成路线实例如下：
C)将酯化反应后的混合物柱层析分离得到式Ⅳ所示的化合物
柱层析分离选用反相硅胶200～300目，54～75μm，湿法装柱，常压分离；
采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱，使用二氯甲烷:甲醇＝60:1、40:1、20:1各洗脱1～2个柱体积，收集Rf值相同的组分；
D)将柱层析分离后Rf相同的组分收集，除去溶剂后水解浓缩干燥后得到式Ⅴ所示的化合物
Rf＝0.6；
采用6mol/L的盐酸水溶液水解，水解温度为110℃，水解时间为24h。
所述水解反应的非限制性的合成路线实例如下：
所述酯化反应前使用37％的浓盐酸去除还原胺化反应中添加的过量NaBH3CN，然后真空减压浓缩，回收溶剂至干。
所述柱层析分离中使用的洗脱剂中添加有1％的氨水，并且在使用前添加适量的无水硫酸钠干燥过滤。
实施例
还原胺化反应：称取1.88g(10mmol)N-乙酰基-L-赖氨酸和1.47g(20mmol)乙醛酸一水合物置于250mL圆底烧瓶中加入80mL0.1mol/L的Na2CO3溶液溶解，继续加入6.5g还原剂NaBH3CN于反应体系中，排空反应装置中的空气后通入氮气保护，37℃反应20h。。
酯化反应：反应结束后，向反应液中缓慢加入足量的37％浓盐酸以除去过量未反应完的NaBH3CN，真空减压浓缩，回收溶剂至干。干燥出的残留物加入40mL 3mol/L的盐酸正丁醇溶液溶解，充分混匀后真空抽滤过0.45μm有机滤膜除去未溶解的盐分。得到的澄清溶液在65℃不断搅拌条件下反应2h。反应结束后将溶液真空旋转蒸发浓缩制得酯化物，取少量粗品以甲醇/水(v:v＝50:50)溶解，质谱鉴定有目标酯化物(一级质谱母离子m/z 359，二级质谱特征碎片离子m/z155，198，211，243，257，303，317)，如附图1所示，出现后进行分离纯化。
硅胶柱层析步骤中淋洗剂选择：柱层析的关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当，而淋洗剂的选择则是通过薄层色谱(TLC)筛选。本发明通过TLC确定的展开剂为二氯甲烷/甲醇(v:v＝10:1)体系。向该展开体系中加入1％氨水可减少拖尾程度、增加分离度。TLC爬板结果如附图2所示，计算目标化合物Rf＝0.63。
本发明采用碘蒸气显色，显色效果明显，分离后的各组分斑点可清晰辨认，如附图2所示。
本发明选用25mm×46mm尺寸、具砂芯、聚四氟乙烯旋塞层析柱，反相硅胶(200～300目，54～75μm)与适量二氯甲烷预先在烧杯中搅拌均匀，湿法装柱，常压分离。
TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，极性偏大，应稀释适当倍数后做淋洗剂。本发明根据TLC分析结果采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱，洗脱梯度60:1、40:1、20:1。
本发明得出，不同配比的淋洗剂中加1％氨水有助于提高分离度，减少拖尾现象。淋洗剂使用前加适量无水硫酸钠干燥过滤。
称取50倍于上样量的层析硅胶(200～300目)置于烧杯中，加入两倍体积的二氯甲烷浸没，玻璃棒搅拌混匀，通过漏斗缓慢加入到层析柱中，用适量二氯甲烷将粘在漏斗和管壁上的硅胶冲入柱内。
上样前用二氯甲烷洗脱一个柱体积，双联球加压，直至流速恒定，硅胶面平整，关闭聚四氟乙烯旋塞。
滴管吸取待分离样品，缓慢加入层析柱中液面上方，加少量二氯甲烷冲洗管壁。
打开层析柱旋塞，分别用60:1、40:1、20:1的二氯甲烷/甲醇体系各洗脱1个柱体积。
利用TLC监测两组分洗脱顺序，分段收集Rf值相同的组分。
脱乙酰基与酯水解：合并收集Rf＝0.6左右的组分，真空旋转蒸发除去溶剂，干燥的残留物加入40mL 6mol/L盐酸溶液溶解，110℃下水解24h以脱去乙酰基和正丁醇基团。反应后水解液进行真空浓缩-水洗-浓缩-冷冻干燥，得类白色固体粉末，-20℃冰箱密封保存。
CML结构表征与纯度分析：利用1H-NMR、2D-NMR(1H-1HCOSY、13C-1H HMBC)和LC-MS/MS一级质谱和二级质谱鉴定确证所得化合物结构，结果如附图3～6所示。两图谱结构信息与商品化CML标准品谱图信息比对结果一致。产品得率56.3％，纯度分析结果为97.8％。
Claims (3)
1.一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，其特征在于：
A)还原胺化反应式Ⅰ所示的化合物
以合成式Ⅱ所示的化合物
在还原胺化反应过程中，乙醛酸为羰基供体，还原剂为NaBH3CN，溶剂为0.1mol/L的Na2CO3水溶液，反应过程中使用氮气保护，反应温度控制在30～40℃，反应时间为15～25h；
B)将式Ⅰ和式Ⅱ所示的化合物酯化得式Ⅲ、Ⅳ所示的化合物
在酯化反应中，使用3mol/L的盐酸正丁醇溶液溶解，充分混匀后真空抽滤过0.45μm有机滤膜，取滤过液在60～70℃不断搅拌条件下反应2h，然后将反应液真空浓缩；
C)将酯化反应后的混合物柱层析分离得到式Ⅳ所示的化合物，
柱层析分离选用反相硅胶200～300目，54～75μm，湿法装柱，常压分离；
采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱，使用二氯甲烷:甲醇＝60:1、40:1、20:1各洗脱1～2个柱体积，收集Rf值相同的组分；
D)将柱层析分离后Rf相同的组分收集，除去溶剂后水解浓缩干燥后得到式Ⅴ所示的化合物
Rf＝0.6；
采用6mol/L的盐酸水溶液水解，水解温度为110℃，水解时间为20～40h。
2.根据权利要求1所述的一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，其特征在于：所述酯化反应前使用37％的浓盐酸去除还原胺化反应中添加的过量NaBH3CN，然后真空减压浓缩，回收溶剂至干。
3.根据权利要求1所述的一种有机合成的羧甲基赖氨酸分离纯化方法，其特征在于：所述柱层析分离中使用的洗脱剂中添加有1％的氨水，并且在使用前添加适量的无水硫酸钠干燥过滤。
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| Synthesis, tandem MS- and NMR-based characterization, and quantification of the carbon 13-labeled advanced glycation endproduct, 6-N-carboxymethyllysine;T. Delatour et al.;《Amino Acids》;20050929;第30卷;第25-34页 * |
| 羧甲基赖氨酸的研究进展;魏芹 等;《东南大学学报（医学版）》;20050731;第24卷(第4期);第269-273页 * |
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