CN105384746B - 从植物水鬼蕉的鳞茎中提取多花水仙碱的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从石蒜科水鬼蕉中提取具有抗癌作用的多花水仙碱的方法，采用石蒜科水鬼蕉属植物的鳞茎为原料，粉碎，加入碱性的混合夹带剂进行超临界CO2萃取，酸水析胶，加入有机溶剂脱脂，碱化后进行硅胶柱色谱提取，收集二氯甲烷‑甲醇15:1到8:1的洗脱液，浓缩，最后采用特戊二醇和环己烷混合溶剂的重结晶，得到高纯度多花水仙碱。本发明方法简单，能有效从植物水鬼蕉中获取高纯度多花水仙碱，纯度高达99％以上。

Description

从植物水鬼蕉的鳞茎中提取多花水仙碱的方法
技术领域
本发明属于从植物水鬼蕉的鳞茎中提取多花水仙碱的方法。
背景技术
水鬼蕉鳞茎中的多花水仙碱(Tazettine)具有抗肿瘤作用。从水鬼蕉中提取分离多花水仙碱的研究文献很少。而且采用该方法对水鬼蕉鳞茎进行提取、分离，可以获得相对大量、高纯度的多花水仙碱，对从水鬼蕉大规模生产多花水仙碱来说具有显著的经济价值。
水鬼蕉(Hymenocallis littoralis)归属于石蒜科水鬼蕉属植物，水鬼蕉在我国广西、海南资源非常丰富且价格低廉，由于其鳞茎中含有大量的生物碱成分，而且生物碱成份结构相似，影响多花水仙碱的分离。
发明内容
本发明要解决的技术问题是研究如何从资源合理利用的角度出发，利用资源更为丰富且价格低廉的水鬼蕉的鳞茎，提取多花水仙碱的可工业化方法。该提取分离方法可使多花水仙碱结构、药效保持稳定，提高纯度。
为解决上述问题，本发明提供技术方案如下。
一种多花水仙碱的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取石蒜科水鬼蕉的鳞茎为原料，粉碎至50-100目，按水鬼蕉鳞茎粉末：乙醇：三乙胺的质量比10:5:1依次加入70-95％乙醇、1-3％三乙胺，在萃取釜以超临界CO2萃取；
(2)将步骤(1)萃取得到的混合生物碱转溶于酸水中析胶，滤除酸水液中沉淀，加入亲脂性有机溶剂，除去亲脂性有机层，碱化至pH为7至10，用二氯甲烷或氯仿萃取获得有机相，回收有机溶剂；
(3)将步骤(2)获得的产物上硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇的混合溶液比例为100:1、20:1、15:1、10:1、8:1的洗脱剂进行梯度洗脱；并收集洗脱之后的比例为15:1到8:1的二氯甲烷-甲醇的混合洗脱液，浓缩；
(4)将步骤(3)浓缩后得到的粗品用特戊二醇和环己烷的混合溶剂进行重结晶，得到高纯度多花水仙碱化合物。
该制备方法所述步骤(1)中的萃取条件为：萃取压力为10-50MPa，萃取温度为15-50℃，萃取时间为1-3h。
该制备方法所述步骤(2)中碱化所用的碱为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水溶液，其质量分数为1-5％。
该制备方法所述步骤(4)中的重结晶混合溶剂中特戊二醇和环己烷的体积比为15:1到5:1。
本发明从资源合理利用角度出发，利用资源更为丰富的石蒜科水鬼蕉的鳞茎，提取分离多花水仙碱。从经济效益来说，工艺简单、原料价格低廉、生产成本低，适合工业化成产。
附图说明
图1：多花水仙碱核磁1H谱图；
图2：多花水仙碱核磁13C谱图；
图3：多花水仙碱结构式；
图4：多花水仙碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。
具体实施方式
实施例一
1、含量测定方法
仪器与试剂：高效液相色谱仪waters系列，二极管阵列检测器，色谱柱：waterssymmetryshisld RP18(3.9×150mm,5μm)，实验用水(娃哈哈纯净水)，甲醇为色谱纯。
色谱条件：等度洗脱，水—甲醇(70：30)，流速为1ml/min，检测波长210nm，柱温25℃。
2、药材选择石蒜科水鬼蕉属植物水鬼蕉的鳞茎作为本发明提取分离多花水仙碱化合物的原料。
3、提取分离纯化工艺
取水鬼蕉的鳞茎鲜品30kg，将鳞茎切片，阴干得原料4.2kg，粉碎至100目，按水鬼蕉鳞茎粉末:乙醇:三乙胺的质量比10:5:1依次加入70％乙醇、1％三乙胺，在萃取釜以超临界CO2萃取，萃取压力为20MPa，萃取温度为20℃，萃取时间为1h；萃取得到的混合生物碱转溶于酸水中析胶，滤除酸水液中沉淀，加入乙酸乙酯，除去亲脂性有机层，用质量分数为1％氢氧化钠水溶液碱化至pH为8，用二氯甲烷萃取获得有机相，回收有机溶剂；减压浓缩有机溶剂得浸膏102g上硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇的混合溶液比例为100:1、20:1、15:1、10:1、8:1的洗脱剂进行梯度洗脱；每个比例的洗脱液都冲洗4个柱体积，更换下一个洗脱比例，并收集洗脱之后的比例为15:1到8:1的二氯甲烷-甲醇的混合洗脱液，浓缩；将浓缩后得到的粗品用特戊二醇：环己烷为15:1的混合溶剂进行重结晶，得到高纯度多花水仙碱化合物7.27g，用甲醇溶解，通过高效液相色谱法进行纯度检测，其纯度可达99.5％。
实施例二
取水鬼蕉的鳞茎鲜品50kg，将鳞茎切片，阴干得原料7.1kg，粉碎至50目，按水鬼蕉鳞茎粉末:乙醇:三乙胺的质量比10:5:1依次加入85％乙醇、2％三乙胺，在萃取釜以超临界CO2萃取，萃取压力为45MPa，萃取温度为50℃，萃取时间为3h；萃取得到的混合生物碱转溶于酸水中析胶，滤除酸水液中沉淀，加入二氯甲烷，除去亲脂性有机层，用质量分数为2％氢氧化钾水溶液碱化至pH为9，用氯仿萃取获得有机相，回收有机溶剂；减压浓缩有机溶剂得浸膏167g上硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇的混合溶液比例为100:1、20:1、15:1、10:1、8:1的洗脱剂进行梯度洗脱；每个比例的洗脱液都冲洗4个柱体积，更换下一个洗脱比例，并收集洗脱之后的比例为15:1到8:1的二氯甲烷-甲醇的混合洗脱液，浓缩；将浓缩后得到的粗品用特戊二醇：环己烷为10:1的混合溶剂进行重结晶，得到高纯度多花水仙碱化合物12.36g，用甲醇溶解，通过高效液相色谱法进行纯度检测，其纯度可达99.4％。
实施例三
取水鬼蕉的鳞茎为原料15KG，将鳞茎切片，阴干得原料2.2kg，粉碎至80目，按水鬼蕉鳞茎粉末:乙醇:三乙胺的质量比10:5:1依次加入95％乙醇、3％三乙胺，在萃取釜以超临界CO2萃取，萃取压力为30MPa，萃取温度为30℃，萃取时间为2h；萃取得到的混合生物碱转溶于酸水中析胶，滤除酸水液中沉淀，加入甲苯，除去亲脂性有机层，用质量分数为5％氨水溶液碱化至pH为10，用氯仿萃取获得有机相，回收有机溶剂；减压浓缩有机溶剂得浸膏49.0g上硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇的混合溶液比例为100:1、20:1、15:1、10:1、8:1的洗脱剂进行梯度洗脱；每个比例的洗脱液都冲洗4个柱体积，更换下一个洗脱比例，并收集洗脱之后的比例为15:1到8:1的二氯甲烷-甲醇的混合洗脱液，浓缩；将浓缩后得到的粗品用特戊二醇：环己烷为5:1的混合溶剂进行重结晶，得到高纯度多花水仙碱化合物3.58g，用甲醇溶解，通过高效液相色谱法进行纯度检测，其纯度可达99.3％。
多花水仙碱结构解析
1H和13C核磁共振数据，如图1-2所示。
多花水仙碱(Tazettine)，C18H21NO5，多花水仙碱结构式如图3所示，无色方晶，IH-NMR(CDCI3,300MHz)：6.65(1H,s,H-12),6.59(1H,s,H-9),6.01(1H,d,J＝10.5Hz,H-2),5.97(1H,d,J＝10.5Hz,H-1),4.79(1H,d,J＝15.0Hz,H-8a),4.52(1H,d,J＝15.0Hz,H-8b),3.98(1H,m,H-3),3.35(1H,m,H-6a),2.66(1H,m,H-5),2.53(1H,d,J＝4.2Hz,H-6b),2.11(1H,d,J＝12.9Hz,H-4a),1.37(1H,t,J＝11.6Hz,H-4b),5.94(2H,s,OCH2O),3.32(3H,s,-OCH3),2.27(3H,brs,-NCH3)；13C-NMR(CDCI3,75MHz):26.4,42.3,49.9,55.8,61.2,65.7,69.9,73.0,101.2,101.5,104.6,108.9,126.8,128.4,129.6,130.0,146.1,146.2。
抗肿瘤研究
MTT法检测多花水仙碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，采用实施例1获得的多花水仙碱进行实验。将对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔培养板中，在37℃、CO2培养箱中培养24h。每孔加100μL的药液，每孔总液体量为200μL，每个药物浓度设12个平行孔，多花水仙碱的浓度分别为5、10、20、40、80、160μmol/L，空白对照组每孔加100μL的RPMI 1640培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。多花水仙碱作用48h后弃上清，每孔加入100μL MTT(0.5mg/mL)，置于37℃培养4h后弃上清，每孔加入200μL的DMSO，在微型振荡器上振荡5min后，用酶标仪在检测波长570nm测定吸光度OD570nm值，实验结果如图4所示。
以上实施例中所提供的本发明细节只是用于详细说明而不是为了限定本发明的范围。

Claims (4)

1.一种从石蒜科水鬼蕉中提取多花水仙碱的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取石蒜科水鬼蕉的鳞茎为原料，粉碎至50-100目，按水鬼蕉鳞茎粉末:乙醇:三乙胺的质量比10:5:1依次加入70-95％乙醇、1-3％三乙胺，在萃取釜以超临界CO2萃取；
(2)将萃取得到的混合生物碱转溶于酸水中析胶，滤除酸水液中沉淀，加入亲脂性有机溶剂，除去亲脂性有机层，碱化至pH为7至10，用二氯甲烷或氯仿萃取获得有机相，回收有机溶剂；
(3)将步骤(2)获得的产物上硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇的混合溶液比例为100:1、20:1、15:1、10:1、8:1的洗脱剂进行梯度洗脱；并收集洗脱之后的比例为15:1到8:1的二氯甲烷-甲醇的混合洗脱液，浓缩；
(4)将步骤(3)浓缩后得到的粗品用特戊二醇和环己烷的混合溶剂进行重结晶，得到多花水仙碱化合物。
2.权利要求1所述的一种从石蒜科水鬼蕉中提取多花水仙碱的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的萃取条件为：萃取压力为10-50MPa，萃取温度为15-50℃，萃取时间为1-3h。
3.权利要求1所述的一种从石蒜科水鬼蕉中提取多花水仙碱的方法，其特征在于：所述步骤(2)中碱化所用的碱为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液或氨水溶液，其质量分数为1-5％。
4.权利要求1所述的一种从石蒜科水鬼蕉中提取多花水仙碱的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的重结晶混合溶剂中特戊二醇和环己烷的体积比为15:1到5:1。
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