CN104888194B - 肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在预防和/或治疗ev71感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物（HGS）在预防和/或治疗EV71感染中的应用，属于抗病毒药物领域。本发明通过将HGS蛋白加入到细胞中再加EV71，检测EV71 VP1的mRNA水平和蛋白水平，发现VP1的mRNA和蛋白水平与不加HGS相比显著下降，并呈剂量依赖性，表明HGS具有抗EV71的效果。进一步检测HGS对EV71感染细胞存活率的影响，发现加入HGS蛋白的细胞存活率明显高于病毒对照组，HGS蛋白在EV71感染前、后加入都对病毒有抑制作用，即HGS对EV71的感染有预防和治疗作用。本发明发现了HGS新的药用价值，其可用于制备抗EV71药物、预防和/或治疗EV71感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒药物领域，涉及肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate，HGS)的新用途，具体地说是其在预防和/或治疗肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用。
背景技术
人肠道病毒71(简称EV71)是属于小RNA病毒科肠道病毒属的，作用在儿童神经系统而流行的病毒。人肠道病毒71病毒株最早是1969年在美国加利福尼亚州受感染的神经系统疾病病例中分离得到。EV71很少会导致类似脊髓灰质炎综合症永久瘫痪的疾病。
EV71病毒主要引起婴幼儿手、足、口上长出疱疹，因此该病被命名为手足口病(HFMD)。从1970年至今，EV71在美洲、欧洲以及亚太地区大规模爆发。从2012年4月至7月，至少64名7岁以下儿童死于EV71感染，大多数在24小时内死亡，表现出症状包括呼吸系统疾病、发烧和广义神经异常。2013年6月，悉尼发现了超过100例感染病例。在二十世纪八十年代的中国，EV71就被发现，并且在1987年，该病毒株就在湖北医科大学的病毒研究所被分离出来。到了2008年的5月3日中国卫生部门报道了EV71在福建、广东、浙江等省市的大规模流行。有至少8531例儿童感染上了EV71，其中死亡病例22人，重症病例42人，仅一天福建富阳的感染量达到了415人。大部分的感染者是2岁以下的婴幼儿。2012年上半年，越南报道了63780例手足口病病例，其中58.7％的患者是感染了EV71。
EV71的感染和传播主要是通过粪口途径和接触传播，此外，还通过病毒污染的口腔分泌物、水疱液、表皮污染物以及呼吸飞沫等途径。病毒最初从口咽腔(扁桃体)和小肠的淋巴组织中开始复制，随后在淋巴结(深颈和肠系膜淋巴结)大量扩增，导致轻微的病毒血症。大多数感染在这个时期无病症并且能够得到控制。随后，病毒会在网状内膜系统(包括肝脏、骨髓、脾脏和淋巴结)、心脏、胰腺、皮肤、肺部、黏膜及中枢神经系统中进一步扩散，引起一系列的临床症状。
EV71是小核糖核酸(小RNA)病毒科，肠道病毒属，人类肠道病毒A类病毒。EV71颗粒无包膜，球状，直径为30nm。病毒的颗粒含有60个均一的亚单位(或称为原聚体)，每一个亚单位由四个基本结构蛋白构成，VP1-VP4。除了VP4位于病毒颗粒内侧，其余结构蛋白暴露于病毒表面，VP4与病毒的基因组RNA连接在一起。因为VP1-VP3暴露于病毒表面，所以EV71病毒的抗原决定簇位于这三种结构蛋白上。EV71在紫外线照射下或者高温(高于56℃)即可被灭活，对甲醛和氯气敏感。
为了找到EV71感染的有效治疗方法，主要从以下几个方面着手：
受体结合阻断剂：EV71病毒具有两类胞内受体：清道夫受体B2(SCARB2)和PSGL-1。其中PSGL-1是淋巴细胞表面表达的一种唾液黏蛋白，负责早期的炎症反应。而SCARB2高表达在溶酶体膜表面，参与膜转运及内涵体和溶酶体组件的识别。抗SCARB2抗体通过竞争性的结合SCARB2从而阻止EV71的侵入。同样的，PGSL-1的抗体也能起到类似的阻断EV71的感染的作用。但这些阻断剂在大滴度病毒感染的时候就失去了阻断的效应，EV71是否可能存在其他我们不曾了解的结合位点有待研究。
病毒衣壳阻断剂：普拉康纳利(Pleconaril)能够通过和病毒衣壳蛋白相结合从而阻断病毒对细胞的吸附作用的阻断剂，具有广谱抗微小RNA病毒的特性。普拉康纳利的衍生物也有类似抗病毒效果。它的咪唑啉酮衍生物不但细胞毒性很低，而且能够抑制EV71病毒在细胞内的复制。牛和人乳铁蛋白对于早期EV71的感染具有有效的抑制作用。能够抑制HIV病毒复制的苏拉明的类似物可以结合EV71的VP1蛋白，从而抑制病毒复制。
蛋白合成抑制剂：芦平曲韦(Rupintrivir)可以抑制鼻病毒的3C蛋白，研究发现，它对EV71的3C同样具有抑制效果，可以作为EV71的抑制剂。腺苷地尔和N6-苄基腺苷(N6-benzyladenosine)能够抑制EV71的2C蛋白的合成，也具有抑制EV71的潜力。此外，苯并咪唑衍生物恩韦肟(Enviroxime)的靶标是EV71的2A蛋白，对EV71病毒具有很好的抑制效果。
调节宿主细胞环境的物质：干扰素是临床上常使用的一种广谱的抗病毒药物，它能够提高机体抵抗外界不良环境的机能，增强免疫力。在细胞水平，用poly(I:C)刺激若干种不同的人源细胞12小时会导致导致血清中IFN-α上升，再接种EV71，可以明显减少病毒的含量。
肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulatedtyrosine kinase substrate，HGS)是内吞体分选转运复合体(ESCRT)的重要组成部分之一。ESCRT复合体协同其他的辅助蛋白，在膜重构中发挥独特作用导致膜弯曲或者从细胞质中出芽。ESCRT在一系列的细胞进程，如多泡体(MVB)起源、细胞离层、病毒出芽等活动中发挥重要作用。
HGS是一个早期定位在内涵体上的哺乳动物蛋白，大小为86kDa，它可以与一系列的蛋白质相互作用如G蛋白偶联受体激酶底物eps15、微管连接蛋白SNX-1和SNAP-25，在最初的膜运输过程中发挥作用。
HGS是一个六聚体，具有一个筒形结构，中央有核心，末端有圆帽。低聚物的HGS包含三分子的二聚体，呈D3对称分布。
除了上面提到的功能以外，HGS还在内胆固醇转运、HIV-1的释放过程和蛋白酶激活受体2和降钙素受体样受体内吞后转运过程中发挥重要作用。但是目前未有HGS对现在较为流行且致病力较强的肠道病毒71型(EV71)的预防与治疗作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物(HGS)在抗肠道病毒71型(EV71)中的应用。本发明的目的还在于提供HGS在预防和/或治疗肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明将HGS蛋白加入到细胞中再加EV71，检测EV71VP1的mRNA水平和蛋白水平，发现VP1的mRNA水平、蛋白水平与不加HGS相比显著下降，并呈剂量依赖性，该结果表明HGS蛋白具有抗EV71的效果。进一步检测HGS蛋白对EV71感染细胞存活率的影响，发现加入HGS蛋白的细胞存活率明显高于病毒对照组，HGS蛋白在EV71感染前和感染后加入都对病毒有抑制作用，即HGS蛋白对EV71的感染有预防和治疗作用。
基于上述结果表明：HGS可用于制备抗EV71药物，HGS可用于制备预防和/或治疗EV71感染的药物。
本发明发现了肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物新的药用价值，为抗EV71、预防和/或治疗EV71感染提供了新的有效药物。
附图说明
图1是Realtime PCR检测EV71VP1的mRNA水平结果图，ns.：没有显著差异；**：p<0.01，差异极显著。
图2是Western Blot检测EV71VP1的蛋白水平结果图，图中从左到右依次是只加入病毒、加入10μg/mL的HGS蛋白液和病毒、加入20μg/mL蛋白液和病毒。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的制备
(1)克隆肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物基因：以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先通过反转录PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整HGS基因片段。引物如下：
P1(正向引物)：5’-AAGGATCCATGGGGCGAGGCAGCGG-3’，BamHⅠ，
P2(反向引物)：5’-AACTCGAGTCAGTCGAATGAAATGA-3’，XhoⅠ。
通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切、连接将HGS基因克隆到载体pGEX-6p-1的pTAC启动子下，得到HGS的表达载体pGEX-6p-1-HGS。
(2)表达肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的大肠杆菌的获得：将上述表达载体pGEX-6p-1-HGS转化大肠杆菌BL21，获得表达HGS的菌株BL21-pGEX-6p-1-HGS。
(3)肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的表达：挑取上述菌株BL21-pGEX-6p-1-HGS单菌落，接入3mL含有氨苄霉素(Amp+)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床上摇菌过夜；转接1-2mL菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中，在37℃、200rpm摇床上摇菌2h，到细胞达到对数中期(OD600＝0.5-0.6)；在培养液中加入IPTG至终浓度为0.6mM，37℃、200rpm摇床上继续培养6h。
(4)肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的纯化：将(3)得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞，用10mL PBS重悬，破碎收集上清。取2mL GST融合蛋白纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司)，加入柱中，10-15倍柱体积的lysis buffer(Tris-HCl 0.484g，NaCl5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，乙二胺四乙酸(EDTA)40μL(0.5M EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)0.035g，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)4℃进行柱平衡。用柱帽堵上，将澄清的细胞上清用0.45μm的细菌过滤器后加入谷胱甘肽树脂预装柱，4℃摇床孵育过夜。用15-20mLwash buffer(Tris-HCl 0.484g，NaCl 5.84g，二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT)，pH 8.0，蒸馏水定容至200mL)洗柱，用5mL elution buffer(Tris-HCl 1.21g，NaCl 1.752g，0.1％Trition-1000.2mL，乙二胺四乙酸(EDTA)2mL(0.5M EDTA)，还原性谷胱甘肽1.792g，pH8.0，蒸馏水定容至200mL)将目的蛋白洗脱，分三次洗脱收集洗脱液。蛋白液用超滤管4℃12000rpm离心，浓缩蛋白，浓缩后的蛋白浓度为2.1mg/mL，分装冻存于-80℃冰箱，得到HGS冻存液。
实施例2肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物对宿主细胞的毒性检测
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma，RD)长满单层时(MEM培养基+10％胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。将实施例1得到的HGS冻存液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释，配制成四个浓度梯度8、40、200、1000μg/mL，之后再把不同浓度的HGS蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加培养液)，再每孔补加100μL细胞培养液，于37℃、5％CO2细胞培养箱内，培养48小时后，加入20μL/孔CellTiterAQueousOne Solution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式：细胞存活率(％)＝实验孔的OD值/对照孔的OD值×100％计算细胞存活率，找出HGS蛋白液对细胞的最大无毒浓度范围，结果见表1。
表1HGS对RD细胞毒性结果
| HGS蛋白液浓度(μg/mL) | 细胞存活率(％) |
| 1000 | 85.8 |
| 200 | 101.6 |
| 40 | 95.9 |
| 8 | 97.2 |
| 细胞对照组 | 100 |
结果表明：HGS在8-1000μg/mL的范围对RD细胞没有明显细胞毒性，此外在显微镜下观察细胞也没有病变发生，表明HGS的安全性较好。
实施例3肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物抗EV71病毒的作用
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10％胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的终浓度分别为0.6、1.2、2.5、5、10、20μg/mL的HGS蛋白液，孵育24h后用EV71病毒感染，感染复数(multiplicities of infection，MOI)为MOI＝5，12h后收样检测分别用Realtime PCR和Western Blot检测EV71VP1的mRNA水平和蛋白水平。其中，Western Blot以β-actin为内参，所用抗体购买于Abnova公司；Realtime PCR以GAPDH为内参，引物如下：
VP1上游引物：5'-AATTGAGTTCCATAGGTG-3'，
VP1下游引物：5'-CTGTGCGAATTAAGGACAG-3'；
GAPDH上游引物：5'-AAGGCTGTGGGCAAGG-3'，
GAPDH下游引物：5'-TGGAGGAGTGGGTGTCG-3'。
结果见图1-2，当加入HGS蛋白液浓度小于10μg/mL，基本不表现抗病毒效果，但是当浓度达到10μg/mL以后，EV71病毒VP1的mRNA水平和未加HGS蛋白的阴性对照相比有显著下降，并且随着加入蛋白液浓度的升高呈剂量依赖(图1)；图2结果显示，随着加入蛋白液量浓度的升高(10、20μg/mL)，EV71病毒VP1的蛋白水平梯度下降，说明HGS蛋白具有抗EV71病毒的效果。
实施例4肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物对EV71病毒感染的预防作用
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10％胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。将HGS蛋白液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的HGS蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒感染剂量为MOI＝5，加培养液)。HGS蛋白液孵育1h后，弃去上清，加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒，感染剂量为MOI＝5，每孔100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养48h，加入20μL/孔CellTiterAQueous One Solution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(HGS蛋白液处理组OD值－病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值－病毒对照组OD值)×100％。结果见表2。
表2HGS对EV71病毒感染的预防作用
| HGS蛋白液浓度(μg/mL) | 细胞存活率(％) |
| 细胞对照组 | 100 |
| 病毒对照组 | 0 |
| 1000 | 86.09 |
| 200 | 85.58 |
| 40 | 26.35 |
| 8 | 7.26 |
结果表明，细胞在肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物提前孵育后，再被病毒感染，存活率也是明显高于病毒对照组的，并且随着HGS蛋白液浓度的增高，对EV71的感染的预防作用越为明显。上述数据显示肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在浓度为大于8μg/mL，具有预防病毒感染作用。
实施例5肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物对EV71病毒感染的治疗作用
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10％胎牛血清培养)，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层，弃上清。加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒，感染剂量为MOI＝5，每孔100μL，孵育1h后弃去上清液。将HGS蛋白液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释，稀释后再把不同浓度的HGS蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔200μL，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h，加入20μL/孔CellTiterAQueous One Solution Reagent继续孵育4h，终止培养。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(HGS蛋白液处理组OD值－病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值－病毒对照组OD值)×100％。结果见表3。
表3HGS对EV71病毒感染的治疗作用
| HGS蛋白液浓度(μg/mL) | 细胞存活率(％) |
| 细胞对照组 | 100 |
| 病毒对照组 | 0 |
| 1000 | 83.08 |
| 200 | 131.77 |
| 40 | 35.41 |
| 8 | 33.9726 |
结果表明，细胞感染EV71病毒后加入肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物，存活率也是明显高于病毒对照组的，并且当HGS蛋白液浓度达到200μg/mL对感染病毒的细胞生长反而有促进作用。上述数据显示肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在浓度大于8μg/mL，具有较好的治疗作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在预防和/或治疗EV71感染中的应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HGS正向引物
<400> 1
aaggatccat ggggcgaggc agcgg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HGS反向引物
<400> 2
aactcgagtc agtcgaatga aatga 25
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1上游引物
<400> 3
aattgagttc cataggtg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP1下游引物
<400> 4
ctgtgcgaat taaggacag 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH上游引物
<400> 5
aaggctgtgg gcaagg 16
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH下游引物
<400> 6
tggaggagtg ggtgtcg 17
Claims (3)
1.肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在制备抗肠道病毒71型药物中的应用，其特征在于：所述的药物的有效成分是肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物，药物中肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的浓度为10-1000μg/mL。
2.肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在制备预防肠道病毒71型感染药物中的应用，其特征在于：所述的药物的有效成分是肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物，药物中肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的浓度为10-1000μg/mL。
3.肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在制备治疗肠道病毒71型感染药物中的应用，其特征在于：所述的药物的有效成分是肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物，药物中肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物的浓度为10-1000μg/mL。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN105267948A (zh) * | 2015-05-29 | 2016-01-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 |
-
2015
- 2015-06-02 CN CN201510295052.0A patent/CN104888194B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105267948A (zh) * | 2015-05-29 | 2016-01-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| EV71激活的早期生长反应蛋白1通过直接与病毒的5"非翻译区结合从而促进病毒复制;宋煜等;《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》;20131231;第100页 * |
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Also Published As
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| CN104888194A (zh) | 2015-09-09 |
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