CN108379554A - 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 - Google Patents
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108379554A CN108379554A CN201810530730.0A CN201810530730A CN108379554A CN 108379554 A CN108379554 A CN 108379554A CN 201810530730 A CN201810530730 A CN 201810530730A CN 108379554 A CN108379554 A CN 108379554A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nlrp3
- cell
- protein
- albumen
- domain sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗EV71感染药物中的应用,步骤是:A、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3抗病毒活性的评价;B、以从THP‑1细胞中提取的总mRNA为模板,通过反转录PCR扩增得到总的cDNA,再以总的cDNA为模板,用引物扩增得到NLRP3基因片段;C、挑取菌株BL21‑pGEX‑6p‑1‑NLRP3单菌落,接入含有氨苄霉素的LB液体培养基中,摇床上摇菌过夜;转接菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中,摇床上摇菌表达NLRP3蛋白,用亲和层析提取纯化NLRP3蛋白,蛋白液用超滤管离心浓缩,得到NLRP3冻存液;D、将NLRP3蛋白加入到细胞中再加EV71,检测EV71VP1的mRNA水平和蛋白水平。方法易行,操作简便,NLRP3的抗病毒作用机制是通过改变细胞内的信号通路来抑制病毒复制,抗病毒的机制多样化。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒药物领域,更具体涉及一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的用途。
背景技术
人肠道病毒71(简称EV71)是属于小RNA病毒科肠道病毒属的,作用在儿童神经系统而流行的病毒。人肠道病毒71病毒株最早是1969年在美国加利福尼亚州受感染的神经系统疾病病例中分离得到。EV71很少会导致类似脊髓灰质炎综合症永久瘫痪的疾病。
EV71病毒主要引起婴幼儿手、足、口上长出疱疹,因此该病被命名为手足口病(HFMD)。从1970年至今,EV71在美洲、欧洲以及亚太地区大规模爆发。从2012年4 月至7月,至少64名7岁以下儿童死于EV71感染,大多数在24小时内死亡,表现出症状包括呼吸系统疾病、发烧和广义神经异常。2013年6月,悉尼发现了超过100例感染病例。在二十世纪八十年代的中国,EV71就被发现,并且在1987年,该病毒株就在湖北医科大学的病毒研究所被分离出来。到了2008年的5月3日中国卫生部门报道了EV71在福建、广东、浙江等省市的大规模流行。有至少8531例儿童感染上了EV71,其中死亡病例22人,重症病例42人,仅一天福建富阳的感染量达到了415人。大部分的感染者是2岁以下的婴幼儿。2012年上半年,越南报道了63780例手足口病病例,其中58.7%的患者是感染了EV71。
EV71的感染和传播主要是通过粪口途径和接触传播,此外,还通过病毒污染的口腔分泌物、水疱液、表皮污染物以及呼吸飞沫等途径。病毒最初从口咽腔(扁桃体)和小肠的淋巴组织中开始复制,随后在淋巴结(深颈和肠系膜淋巴结)大量扩增,导致轻微的病毒血症。大多数感染在这个时期无病症并且能够得到控制。随后,病毒会在网状内膜系统(包括肝脏、骨髓、脾脏和淋巴结)、心脏、胰腺、皮肤、肺部、黏膜及中枢神经系统中进一步扩散,引起一系列的临床症状。
EV71是小核糖核酸(小RNA)病毒科,肠道病毒属,人类肠道病毒A类病毒。EV71 颗粒无包膜,球状,直径为30nm。病毒的颗粒含有60个均一的亚单位(或称为原聚体),每一个亚单位由四个基本结构蛋白构成,VP1-VP4。除了VP4位于病毒颗粒内侧,其余结构蛋白暴露于病毒表面,VP4与病毒的基因组RNA连接在一起。因为VP1-VP3暴露于病毒表面,所以EV71病毒的抗原决定簇位于这三种结构蛋白上。EV71在紫外线照射下或者高温(高于56℃)即可被灭活,对甲醛和氯气敏感。
为了找到EV71感染的有效治疗方法,主要从以下几个方面着手:
受体结合阻断剂:EV71病毒具有两类胞内受体:清道夫受体B2(SCARB2)和PSGL-1。其中PSGL-1是淋巴细胞表面表达的一种唾液黏蛋白,负责早期的炎症反应。而SCARB2 高表达在溶酶体膜表面,参与膜转运及内涵体和溶酶体组件的识别。抗SCARB2抗体通过竞争性的结合SCARB2从而阻止EV71的侵入。同样的,PGSL-1的抗体也能起到类似的阻断EV71的感染的作用。但这些阻断剂在大滴度病毒感染的时候就失去了阻断的效应,EV71是否可能存在其他我们不曾了解的结合位点有待研究。
病毒衣壳阻断剂:普拉康纳利(Pleconaril)能够通过和病毒衣壳蛋白相结合从而阻断病毒对细胞的吸附作用的阻断剂,具有广谱抗微小RNA病毒的特性。普拉康纳利的衍生物也有类似抗病毒效果。它的咪唑啉酮衍生物不但细胞毒性很低,而且能够抑制EV71 病毒在细胞内的复制。牛和人乳铁蛋白对于早期EV71的感染具有有效的抑制作用。能够抑制HIV病毒复制的苏拉明的类似物可以结合EV71的VP1蛋白,从而抑制病毒复制。
蛋白合成抑制剂:芦平曲韦(Rupintrivir)可以抑制鼻病毒的3C蛋白,研究发现,它对EV71的3C同样具有抑制效果,可以作为EV71的抑制剂。腺苷地尔和N6-苄基腺苷(N6-benzyladenosine)能够抑制EV71的2C蛋白的合成,也具有抑制EV71的潜力。此外,苯并咪唑衍生物恩韦肟(Enviroxime)的靶标是EV71的2A蛋白,对EV71病毒具有很好的抑制效果。
调节宿主细胞环境的物质:干扰素是临床上常使用的一种广谱的抗病毒药物,它能够提高机体抵抗外界不良环境的机能,增强免疫力。在细胞水平,用poly(I:C)刺激若干种不同的人源细胞12小时会导致导致血清中IFN-α上升,再接种EV71,可以明显减少病毒的含量。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerizationdomain-like receptors,NLRs)是一个大家族,NLRP3是整个NLRs家族中探讨的最多,激活机制研究的最清楚的蛋白,NLRP3蛋白经过其N端的PYRIN结构域与ASC蛋白的PYRIN 结构域相互作用,再经过中部的NACHT结构域发生寡聚化导致同源的寡聚体的产生,激活之后招募的ASC蛋白再经过其CARD结构域与Caspase-1的N端CARD结构域相互结合,共同组成NLRP3炎症小体复合物,复合物产生之后,会剪切无活性的Caspase-1产生有活性的Caspase-1p10/p20,有活性的Caspase-1能够识别并切割IL-1β和IL-18的前体,产生有活性的IL-1β和IL-18剪切体,随后经过膜泡运输,IL-1β和IL-18分泌到细胞外行使其细胞因子的功能。NLRP3炎症小体能够被许多的病毒激活,在抗病毒和帮助宿主免疫应答中起十分重要的作用。NLRP3炎症小体的完全活化需要2步,第一步是需要TLR、 NLR或者RLR激活NF-κB通路,诱导产生NLRP3、IL-1β和IL18的前体;第二步则是受到病毒感染或者危险信号的刺激,激活NLRP3炎症小体,形成炎症小体复合体之后,切割产生有活性的Caspase-1p10/p20,随后识别并切割产生有活性的IL-1β和IL-18。已知报道的内源刺激物,例如ATP、MSU(尿酸钠盐)、CPPD(二水焦磷酸钙)、淀粉样蛋白 -β、胆固醇结晶和透明质酸,如果发生细胞内定位异常,均会被NLRP3感应从而激活 NLRP3炎症小体。外源刺激物,例如石棉或者二氧化硅这类结晶或者颗粒状物质、佐剂中的明矾、病原体微生物和病毒刺激细胞之后也能够被NLRP3感应从而激活NLRP3炎症小体。
对NLRP3研究主要集中在以NLRP3为核心的炎症小体上。但是目前未有NLRP3本身对现在较为流行且致病力较强的肠道病毒71型(EV71)的预防与治疗作用的报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用,方法易行,操作简便,从而为临床上EV71的感染治疗提供一类安全高效且毒副作用蛋白。通过单独使用或者与其他抗EV71药物联合使用,NLRP3能够在制备预防或者治疗EV71病毒感染过程中发挥重要作用。
为了实现上述的目的,本发明采用以下技术方案:
一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在制备治疗或预防病毒(EV71)感染药物中的应用,其步骤是:
A、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3抗病毒活性的评价;
B、以从THP-1(Human acute monocytic leukemia cell line)细胞中提取的总mRNA为模板,通过反转录PCR扩增得到总的cDNA,再以总的cDNA为模板,用特异引物扩增得到NLRP3基因片段。通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切、连接将NLRP3基因克隆到载体 pGEX-6p-1(购于YRgene)的pTAC(购于科瑞思博)启动子下,得到NLRP3的表达载体 pGEX-6p-1-NLRP3。将上述表达载体pGEX-6p-1-NLRP3转化大肠杆菌BL21(购于科瑞思博),获得表达NLRP3的菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3。
C、挑取上述菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3单菌落,接入3mL含有氨苄霉素(Amp+) 的LB液体培养基中,37℃、200rpm摇床上摇菌过夜;转接1-2mL菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中,在37℃、200rpm摇床上摇菌2h,到细胞达到对数中期(OD600=0.5-0.6);在培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM,37℃、200rpm 摇床上继续培养6h。得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞,用10mL PBS重悬,破碎收集上清。取2mL GST融合蛋白纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司),加入柱中, 10-15倍柱体积的lysis buffer(Tris-HCl 0.484g,NaCl 5.84g,二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT),乙二胺四乙酸(EDTA)40μL(0.5M EDTA),苯甲基磺酰氟(PMSF)0.035g,pH 8.0,蒸馏水定容至200mL)4℃进行柱平衡。用柱帽堵上,将澄清的细胞上清用0.45μm的细菌过滤器后加入谷胱甘肽树脂预装柱,4℃摇床孵育过夜。用15-20mL wash buffer(Tris-HCl 0.484g,NaCl 5.84g,二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT),pH 8.0,蒸馏水定容至200mL) 洗柱,用5mL elution buffer(Tris-HCl 1.21g,NaCl 1.752g,0.1%Trition-100 0.2mL,乙二胺四乙酸(EDTA)2mL(0.5MEDTA),还原性谷胱甘肽1.792g,pH 8.0,蒸馏水定容至 200mL)将目的蛋白洗脱,分三次洗脱收集洗脱液。蛋白液用超滤管4℃12000rpm离心,浓缩蛋白,浓缩后的蛋白浓度为2.1mg/mL,分装冻存于-80℃冰箱,得到NLRP3冻存液;
D、将NLRP3蛋白加入到细胞中再加EV71,检测EV71VP1的mRNA水平和蛋白水平。
通过上述的技术措施:本发明获得了一个非常好的效果,本实验结果如图1和图2所示。将NLRP3蛋白加入到细胞中再加EV71,检测EV71VP1的mRNA水平和蛋白水平,发现VP1的mRNA水平、蛋白水平与不加NLRP3相比显著下降(mRNA水平、蛋白水平分别下降65.2%、72.8%),并呈剂量依赖性,该结果表明NLRP3蛋白抑制EV71复制,具有抗EV71的活性。
所述的NLRP3表达质粒,其构建过程见实施例1。
所述的抗EV71药物是以NLRP3作为药物活性成分,利用常规技术可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂{活性成分含量5%(质量比,以下相同),其余为相应辅料(90%淀粉和5%PVP)}或注射剂(规格为1mg/mL,溶于生理盐水)任何一种药学上接受的载体(剂型)。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
1.NLRP3是在人体内组成性表达的一种细胞因子,生理浓度下对人体没有毒副作用。
2NLRP3的抗病毒作用机制是通过改变细胞内的信号通路来抑制病毒复制,或直接作用于病毒包膜,或影响病毒吸附,从而抗病毒,因其抗病毒的机制多样化,不易使病毒产生耐药性。
附图说明
图1为一种Realtime PCR检测EV71VP1的mRNA水平结果图。
ns.:没有显著差异;**:p<0.01,差异极显著。
图2为一种Western Blot检测EV71VP1的蛋白水平结果图。
图中从左到右依次是只加入病毒、加入10μg/mL的NLRP3蛋白液和病毒、加入 20μg/mL蛋白液和病毒。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制,在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:
一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptors,NLRP3)在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用,其步骤是:
(1)克隆NLRP3基因(NLRP3的制备):以从THP-1(Human acute monocyticleukemia cell line)细胞中提取的总mRNA为模板,通过反转录PCR扩增得到总的cDNA,再以总的cDNA为模板,用特异引物扩增得到NLRP3基因片段。引物如下:
P1(正向引物):5’-CGCGGATCCATGAAGATGGCAAGCACCCGC-3’BamH Ⅰ
P1(反向引物):5’-CCGCTCGAGCTACCAAGAAGGCTCAAAGAC-3’Xho Ⅰ
通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切、连接将NLRP3基因克隆到载体pGEX-6p-1(购于YRgene) 的pTAC(购于科瑞思博)启动子下,得到NLRP3的表达载体pGEX-6p-1-NLRP3。
(2)表达NLRP3的大肠杆菌的获得:将上述表达载体pGEX-6p-1-NLRP3转化大肠杆菌BL21(购于科瑞思博),获得表达NLRP3的菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3。
(3)NLRP3的表达:挑取上述菌株BL21-pGEX-6p-1-NLRP3单菌落,接入3mL含有氨苄霉素(Amp+)的LB液体培养基中,37℃、200rpm摇床上摇菌过夜;转接1-2mL 菌液至含20mL培养基的50mL摇瓶中,在37℃、200rpm摇床上摇菌2h,到细胞达到对数中期(OD600=0.5-0.6);在培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM,37℃、200rpm摇床上继续培养6h。
(4)NLRP3的纯化:将步骤(3)得到的大肠杆菌培养液离心收集细胞,用10mL PBS重悬,破碎收集上清。取2mL GST融合蛋白纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司),加入柱中,10-15倍柱体积的lysis buffer(Tris-HCl 0.484g,NaCl 5.84g,二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT),乙二胺四乙酸(EDTA)40μL(0.5M EDTA),苯甲基磺酰氟(PMSF) 0.035g,pH8.0,蒸馏水定容至200mL)4℃进行柱平衡。用柱帽堵上,将澄清的细胞上清用0.45μm的细菌过滤器后加入谷胱甘肽树脂预装柱,4℃摇床孵育过夜。用15-20mL wash buffer(Tris-HCl0.484g,NaCl 5.84g,二硫苏糖醇(DTT)200μL(1M DTT),pH 8.0,蒸馏水定容至200mL)洗柱,用5mL elution buffer(Tris-HCl 1.21g,NaCl 1.752g, 0.1%Trition-100 0.2mL,乙二胺四乙酸(EDTA)2mL(0.5M EDTA),还原性谷胱甘肽1.792g, pH 8.0,蒸馏水定容至200mL)将目的蛋白洗脱,分三次洗脱收集洗脱液。蛋白液用超滤管4℃12000rpm离心,浓缩蛋白,浓缩后的蛋白浓度为2.1mg/mL,分装冻存于-80℃冰箱,得到NLRP3冻存液。
实施例2:
NLRP3对宿主细胞的毒性检测:
经24或30或36或42或48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma,RD)(购于CCTCC)长满单层时{MEM培养基+10%(体积比)胎牛血清培养},倾弃培养液,加入胰酶消化,传至96孔无菌细胞培养板中,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养18或20或22或24h,使细胞生长成单层,弃上清。将实施例1得到的NLRP3冻存液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释,配制成四个浓度梯度4、20、 100、500μg/mL,之后再把不同浓度的NLRP3蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中,每孔100μL,每个浓度重复3孔,同时设立细胞对照孔(不加药,只加培养液),再每孔补加100μL细胞培养液,于37℃、5%CO2细胞培养箱内,培养48小时后,加入20μL/ 孔CellTiterAQueous One Solution Reagent继续孵育4h,终止培养。选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,并根据公式:细胞存活率(%)=实验孔的OD值/对照孔的OD值×100%计算细胞存活率,找出NLRP3蛋白液对细胞的最大无毒浓度范围,结果见表1。
表1 NLRP3对RD细胞毒性结果
结果表明:NLRP3在4-500μg/mL的范围对RD细胞没有明显细胞毒性,此外在显微镜下观察细胞也没有病变发生,表明NLRP3的安全性较好。
实施例3:
NLRP3抗EV71病毒的作用:
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10%胎牛血清培养),倾弃培养液,加入胰酶消化,传至96孔无菌细胞培养板中,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养18-24h,使细胞生长成单层,弃上清。加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/mL的 NLRP3蛋白液,孵育24h后用EV71(购于CCTCC)病毒感染,感染复数(multiplicities of infection,MOI)为MOI=5,12h后收样检测分别用Realtime PCR和Western Blot检测EV71 VP1的mRNA水平和蛋白水平。其中,Western Blot以β-actin为内参,所用抗体购买于 Abnova公司;Realtime PCR以GAPDH为内参,引物如下:
VP1上游引物:5'-AATTGAGTTCCATAGGTG-3',
VP1下游引物:5'-CTGTGCGAATTAAGGACAG-3';
GAPDH上游引物:5'-AAGGCTGTGGGCAAGG-3',
GAPDH下游引物:5'-TGGAGGAGTGGGTGTCG-3'。
结果见图1-2,当加入NLRP3蛋白液浓度小于8μg/mL,基本不表现抗病毒效果,但是当浓度达到10μg/mL以后,EV71病毒VP1的mRNA水平和未加NLRP3蛋白的阴性对照相比有显著下降,并且随着加入蛋白液浓度的升高呈剂量依赖(图1);图2结果显示,随着加入蛋白液量浓度的升高(8、16μg/mL),EV71病毒VP1的蛋白水平梯度下降,说明NLRP3蛋白具有抗EV71病毒的效果。
实施例4:
NLRP3对EV71病毒感染的预防作用:
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10%胎牛血清培养),倾弃培养液,加入胰酶消化,传至96孔无菌细胞培养板中,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养18-24h,使细胞生长成单层,弃上清。将NLRP3 蛋白液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的NLRP3蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中,每孔100μL,每个浓度重复3孔,同时设立细胞对照孔 (不加病毒不加药,只加培养液)和病毒对照孔(不加药,加病毒感染剂量为MOI=5,加培养液)。NLRP3蛋白液孵育1h后,弃去上清,加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒,感染剂量为MOI=5,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养48h,加入20μL/孔CellTiterAQueous One SolutionReagent继续孵育4h,终止培养。选择 490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,并根据公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(NLRP3蛋白液处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)×100%。结果见表2。
表2 NLRP3对EV71病毒感染的预防作用
NLRP3蛋白液浓度(μg/mL) | 细胞存活率(%) |
细胞对照组 | 100 |
病毒对照组 | 0 |
500 | 97.09 |
100 | 94.58 |
20 | 35.35 |
4 | 8.26 |
结果表明,细胞在NLRP3提前孵育后,再被病毒感染,存活率也是明显高于病毒对照组的,并且随着NLRP3蛋白液浓度的增高,对EV71的感染的预防作用越为明显。上述数据显示NLRP3在浓度为大于4μg/mL,具有预防病毒感染作用。
实施例5:
NLRP3对EV71病毒感染的治疗作用:
经24-48h培养人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)长满单层时(MEM培养基+10%胎牛血清培养),倾弃培养液,加入胰酶消化,传至96孔无菌细胞培养板中,每孔100μL,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养18-24h,使细胞生长成单层,弃上清。加入用无血清的MEM细胞培养液稀释的病毒,感染剂量为MOI=5,每孔100μL,孵育1h后弃去上清液。将NLRP3蛋白液用无血清的MEM细胞培养液逐倍稀释,稀释后再把不同浓度的NLRP3蛋白液加入弃去上清液的细胞培养孔中,每孔200μL,每个浓度重复3孔,同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药,只加培养液)和病毒对照孔(不加药,加病毒,加培养液)。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h,加入20μL/孔CellTiterAQueous One Solution Reagent继续孵育4h,终止培养。选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,并根据公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(NLRP3 蛋白液处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值) ×100%。结果见表3。
表3 NLRP3对EV71病毒感染的治疗作用
NLRP3蛋白液浓度(μg/mL) | 细胞存活率(%) |
细胞对照组 | 100 |
病毒对照组 | 0 |
500 | 93.08 |
100 | 121.77 |
20 | 33.41 |
4 | 30.97 |
结果表明,细胞感染EV71病毒后加入NLRP3,存活率也是明显高于病毒对照组的,并且当NLRP3蛋白液浓度达到100μg/mL对感染病毒的细胞生长反而有促进作用。上述数据显示NLRP3在浓度大于4μg/mL,具有较好的治疗作用。
Claims (2)
1.一种核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3在制备治疗或预防肠道病毒71型病毒感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的肠道病毒71型病毒感染药物以核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3为药物活性成分,制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂任何一种药学上接受的载体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810530730.0A CN108379554A (zh) | 2018-05-29 | 2018-05-29 | 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810530730.0A CN108379554A (zh) | 2018-05-29 | 2018-05-29 | 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108379554A true CN108379554A (zh) | 2018-08-10 |
Family
ID=63071973
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810530730.0A Pending CN108379554A (zh) | 2018-05-29 | 2018-05-29 | 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108379554A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160023238A (ko) * | 2014-08-21 | 2016-03-03 | 강원대학교산학협력단 | 청고추 추출물을 유효 성분으로 포함하는 인플라마좀 매개 염증성 질환 및 인플루엔자 바이러스 감염 예방, 개선용 조성물 |
US20170056448A1 (en) * | 2015-09-01 | 2017-03-02 | Ifm Therapeutics, Inc | Immune cells having increased immunity or resistance to an immunosuppressive cytokine and use of the same |
-
2018
- 2018-05-29 CN CN201810530730.0A patent/CN108379554A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160023238A (ko) * | 2014-08-21 | 2016-03-03 | 강원대학교산학협력단 | 청고추 추출물을 유효 성분으로 포함하는 인플라마좀 매개 염증성 질환 및 인플루엔자 바이러스 감염 예방, 개선용 조성물 |
US20170056448A1 (en) * | 2015-09-01 | 2017-03-02 | Ifm Therapeutics, Inc | Immune cells having increased immunity or resistance to an immunosuppressive cytokine and use of the same |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HONGBIN WANG等: "Reciprocal Regulation between Enterovirus 71 and the NLRP3 Inflammasome", 《CELL REPORTS》 * |
WENBIAO WANG等: "EV71 3D Protein Binds with NLRP3 and Enhances the Assembly of Inflammasome Complex", 《PLOS PATHOGENS》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Overview of therapeutic drug research for COVID-19 in China | |
JP5709800B2 (ja) | 変えられた空間構造を備えるインターフェロン及びその応用 | |
CN111588721B (zh) | 化合物zl0580用于制备预防或治疗非洲猪瘟药物的新用途 | |
WO2010139193A1 (zh) | 手足口病疫苗及其制备方法和应用 | |
CN107281210A (zh) | 阿奇霉素在抗冠状病毒感染中的应用 | |
CN113082049B (zh) | 碘化钾或含有碘化钾的组合物在制备用于治疗非洲猪瘟的药物中的新用途 | |
US20220389050A1 (en) | Therapeutic double stranded rna and methods for producing the same | |
CN113679716B (zh) | 溴酚-吡唑啉化合物在治疗猫冠状病毒疾病中的应用 | |
CN113491700A (zh) | 牛磺罗定在抗病毒中的应用 | |
CN101340902A (zh) | 用半胱胺化合物处理病毒感染的材料和方法 | |
TWI605822B (zh) | 酪梨萃取物、avocadenol B及(2R,4R)-1,2,4-三羥基十七碳-16-炔的用途,以及包含酪梨萃取物之保健食品 | |
CN108379554A (zh) | 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗ev71感染药物中的应用 | |
JP2023026528A (ja) | シアノバクテリア抽出物、その調製方法と利用方法 | |
CN113209275B (zh) | Stch在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用 | |
CN104888194B (zh) | 肝细胞生长调节因子酪氨酸激酶底物在预防和/或治疗ev71感染中的应用 | |
CN113368089B (zh) | 新型冠状病毒的抑制剂 | |
Pieklarz et al. | Sars-Cov-2–the latest global threat and the prospect of COVID-19 therapy with the use of chitosan | |
DK1663110T3 (en) | APPLICATIONS OF INTERFERONES WITH CHANGED SPACIAL STRUCTURE | |
CN106619591B (zh) | 奥昔卡因在制备药物中的用途及药物组合物 | |
CN109700823A (zh) | 泰利霉素在抗埃博拉病毒感染中的应用 | |
CN108404117B (zh) | 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白在治疗寨卡病毒感染药物中的应用 | |
Bhattacharya et al. | Detailed molecular biochemistry for novel therapeutic design against Nipah and Hendra virus: a systematic review | |
CN110693896B (zh) | 一种肠道病毒小分子抑制剂及其应用 | |
Jain et al. | COVID-19 pandemic: The deadly respiratory disease of 21st century | |
CN108245586B (zh) | 小儿解感颗粒在抗病毒中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180810 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |