CN104874007A - 手术用水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种手术用水凝胶，具体地，本发明提供适合用于伤口愈合的，尤其是用于减轻术后粘连的水凝胶。该水凝胶含有壳聚糖和葡聚糖多聚体的交联衍生物。该水凝胶在结合所述多聚体溶液时形成。

Description

手术用水凝胶
本申请是申请号为200880108319.9，申请日为2008年8月26日，发明名称为“手术用水凝胶”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于改善手术结果的新型聚合材料的领域，具体地，本发明涉及可应用于伤口而帮助伤口愈合的水凝胶。
背景技术
许多手术后经常和不幸地形成粘连。粘连是将正常为分隔开的组织表面连接起来的纤维束。在腹部和盆腔手术后，如疝修补术，妇科手术与结肠直肠手术后，粘连特别常见。
在手术过程中由于操作和干燥所造成的组织创伤造成纤维性渗出物被释放。如果渗出物未被吸收或分解，其可在腹腔或盆腔聚集而转变为粘连。渗出物与成纤维细胞长在一起，胶原沉积，且血管开始形成，使粘连形成。
粘连的形成可导致严重的并发症，如小肠梗阻，女性不孕和慢性疼痛。患者可能需要接受进一步手术以解除粘连，同时无法保证不形成新的粘连。
减少粘连形成的技术包括腹腔灌洗，给予药物制剂和机械分离组织。手术后止血，这一出血停止的生理过程，也可以降低粘连形成的风险，并提供其他好处。
不幸的是，目前减少粘连和/或达到止血的程序不是特别有效，并使病人不愉快。此外，在某些情况下，目的是止血的治疗可能会增加粘连形成的风险。
例如，在用于治疗慢性鼻窦炎的内窥镜鼻窦手术(ESS)后，患者必须忍受不舒服的鼻腔填塞物以控制出血。然而，去除鼻腔填塞物可导致粘膜创伤而增加了粘连形成的可能性。研究显示，即使是纳入了已知局部止血剂(如凝血酶、纤维蛋白，纤维蛋白原和胶原)的敷料可导致粘连形成的显著增加(见例如，Chandra R.K.,Kern R.C.,Advantages and disadvantages of topical packing in endoscopic sinussurgery,Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2004,12,21-26)。需要进一步手术的粘连形成发生在10-30％的接受ESS的患者中。
多聚体溶液和凝胶已用于目标区域以减轻粘连。例如，凝胶已用于在关闭手术部位之前覆盖在手术暴露的组织上。一些方法使得该多聚体可以以溶液形式原位加在患者身上，然后发生化学反应形成共价交联以便产生多聚体网络。例如，SprayGelTM是一种基于PEG的材料，当将其应用于组织时形成粘连的障碍。
如壳聚糖的多糖多聚体也是众所周知的形成凝胶的药用制剂。壳聚糖被认为有伤口愈合特性。例如，US 5,836,970披露了壳聚糖和海藻酸盐的伤口敷料，其可制成纤维，粉末，薄膜，泡沫，或遇水膨胀的水状胶体。US 5,599,916披露了遇水膨胀的，水不溶性壳聚糖盐，其能在伤口敷料中使用，且US 6,444,797披露了壳聚糖微片，其能用作伤口敷料或皮肤覆盖物。
还显示了壳聚糖对大鼠腹膜粘连具有预防作用(Preventive effects of chitosanon peritoneal adhesion in rats,Zhang,Zhi-Liang et al.,World J Gastroenterol,2006,12(28)4572-4577)。
还研究了壳聚糖衍生物对伤口愈合和粘连预防的效果。例如，PCT公布WO96/35433描述N,O-羧甲基壳聚糖用于预防手术粘连的用途。关于N,O-羧甲基壳聚糖的讨论还见于下列文章：
(i)Kennedy R et al.,Prevention of experimental postoperative adhesionsby N，O-carboxymethyl chitosan,Surgery,1996,120,866-70；
(ii)Costain DJ et al.,Prevention of postsurgical adhesions withN,O-carboxymethylchitosan:Examination of the most efficaciouspreparation and the effect of N,O-carboxymethyl chitosan onpostsurgical healing,Surgery,1997；121,314-9；
(iii)Krause TJ et al.,Prevention of pericardial adhesions withN,O-carboxymethylchitosan in the Rat Model,Journal of InvestigativeSurgery,2001,14,93-97；
(iv)Diamond,Michael P.et al.,Reduction of postoperative adhesions by N，O-carboxymethylchitosan:a pilot study,Fertil Steril 2003,80,631-636；
(v)Diamond Michael P et al.,Reduction of post operative adhesions byN,O-carboxymethylchitosan:A Pilot Study,The Journal of theAmerican Association of Gynecologic Laparoscopists,2004,11(1),127；和
(vi)Lee,Timothy D.G et al.,Reduction in postoperative adhesionformation and re-formation after an abdominal operation with the use ofN,O-carboxymethyl chitosan,Surgery,2004,135,307-312。
PCT公布WO 98/22114讨论了壳聚糖与硫酸化的单糖，二糖或寡糖合并用于促进含胶原组织的伤口愈合。PCT公布WO96/02260描述了与肝素，硫酸肝素或硫酸葡聚糖合并的壳聚糖。据说这种合并可促进皮肤伤口愈合。
PCT公布WO 04/006961描述了通过使中性壳聚糖与双功能的多功能醛或醛处理的含羟基多聚体交联而形成的用于固定和封装细胞的凝胶。
尽管有这些努力，粘连形成仍然普遍发生在许多手术区域。
因此，仍然非常需要可用于改善手术结果的新型聚合材料，其对于止血和预防粘连是医学上有效的。
因此，本发明的目标是提供一种可应用于伤口而帮助伤口愈合的水凝胶，或为公众提供一个有用的选择。
发明内容
本发明涉及一种可用于手术和其他伤口的水凝胶。该水凝胶可通过合并两种多聚体的水溶液而制备，这两种多聚体的水溶液混合时交联形成多聚体网络(Polymer network)。随着交联发生，由此产生的多聚体网络在水溶液中形成水凝胶。水凝胶可以在原位形成，例如，通过将多聚体溶液喷雾，注射或倾倒在目标区域。或者，水凝胶可以预先形成，然后应用到目标区域。在另一具体实施方式中，水凝胶可在纳入多聚体成分的伤口敷料湿润时形成。
本发明所述的水凝胶有助于伤口愈合，并可有助于预防损伤的相邻组织间形成粘连，所述损伤使这些组织易形成粘连。本发明所述的水凝胶还可通过减少或停止伤口出血而影响止血。水凝胶在手术条件下可生物降解，并在数日或数周内逐渐瓦解。
在一个方面本发明提供一种包含与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络。
在另一个方面本发明提供一种由与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体所组成的多聚体网络。
在上述方面的一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体通过双羧基衍生的壳聚糖多聚体的氨基和醛衍生的葡聚糖多聚体的醛基交联。
在上述方面的一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖多聚体。
在另一个方面本发明提供一种包含与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络。
在另一个方面本发明提供一种由与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖而组成的多聚体网络。
在上述方面的一个具体实施方式中，N-琥珀酰壳聚糖与醛衍生的葡聚糖多聚体通过N-琥珀酰壳聚糖的氨基和醛衍生的葡聚糖多聚体的醛基交联。
在另一个方面本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络，其中所述多聚体网络在水溶液中在混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约1秒至大约5分钟内形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络，其中所述多聚体网络在水溶液中在混合N-琥珀酰壳聚糖和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约1秒至大约5分钟内形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约1秒至大约30秒内形成，优选在大约1秒至大约20秒内形成，更优选在大约1秒至10秒内形成。在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约30秒至大约5分钟内形成。在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约5秒至大约1分钟内形成。
在另一个方面本发明提供了一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在水溶液中在混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约5分钟至大约20分钟内形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在水溶液中在混合N-琥珀酰壳聚糖和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约5分钟至大约20分钟内形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约5分钟至大约10分钟内形成。
在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约10分钟至大约20分钟内形成。
在另一个方面本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在水溶液中在混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约20分钟至大约2小时内形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在水溶液中在混合N-琥珀酰壳聚糖和醛衍生的葡聚糖多聚体的大约20分钟至大约2小时内形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约20分钟至大约2小时内形成，优选在大约30分钟至大约1小时内形成。
在一个方面本发明提供一种伤口愈合组合物，其包括水溶液中的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生物为N-琥珀酰壳聚糖。
在一个具体实施方式中，组合物包括大约2％至10％w/v双羧基衍生的壳聚糖多聚体。在一个具体实施方式中，组合物包括大约2％至10％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体。
在另一个方面本发明提供一种包括水溶液中与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水凝胶。
在一个具体实施方式中，水凝胶包括大约2％至大约10％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体。在一个具体实施方式中，水凝胶包括大约2％至大约10％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体。
优选地，水凝胶包括大约2％至大约8％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，更优选地大约2％至大约6％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体。最优选地，水凝胶包括大约5％w/v双羧基衍生的壳聚糖多聚体。
优选地，水凝胶包括大约2％至大约8％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体，更优选地大约2％至大约6％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。最优选地，水凝胶包括大约5％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体为N-琥珀酰壳聚糖。
在一个具体实施方式中，水溶液选自水、盐水、缓冲液或其混合物。优选地，水溶液是大约0.9％w/v的盐溶液。
在另一个方面本发明提供一种制备多聚体网络的方法，该多聚体网络包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，其中所述方法包括将双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液与醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液混合。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液包括大约2％至大约10％w/v双羧基衍生的壳聚糖多聚体。优选地，水溶液包括大约2％至大约8％w/v，更优选地大约5％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液有大约6至8的pH值。优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液有大约6.5至7.5的pH值。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖为N-琥珀酰壳聚糖。
在一个具体实施方式中，醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液包括大约2％至大约10％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。优选地，水溶液包括大约2％至大约8％w/v，更优选地，大约5％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液有大约6至8的pH值。优选地，醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液有大约6.5至7.5的pH值。
在一个具体实施方式中，醛衍生的葡聚糖多聚体是50-100％醛衍生的，优选地是70-100％醛衍生的，更优选地是80-100％醛衍生的。
在一个具体实施方式中，所述方法包括等体积混合(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液。
在一个具体实施方式中，多聚体网络和水溶液共同构成水凝胶。
在一个具体实施方式中，通过将溶液搅拌在一起而混合多聚体的水溶液。在另一具体实施方式中，当将其应用于目标区域时混合多聚体的水溶液，如通过同时将溶液喷雾、注射或倾倒至目标区域。
在一个具体实施方式中，水溶液选自水、盐水、缓冲液或其混合物。优选地，水溶液是大约0.9％w/v盐溶液。
在一个具体实施方式中，多聚体的水溶液可以包含一种或多种药学上可接受的辅料。
在一个方面本发明提供了一种水凝胶，其包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，其中水凝胶包括一种或多种生物活性剂。
在一个具体实施方式中，一种或多种生物活性剂选自血浆蛋白、激素、酶、抗生素、抗菌剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、局部麻醉剂、生长因子、类固醇、细胞悬液、细胞毒素或细胞增殖抑制剂。
在一个方面本发明提供了一种水凝胶，其包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，其中水凝胶包括一种或多种非生物活性剂。
在一个具体实施方式中，一种或多种非生物活性剂选自增稠剂或染料。
在一方面本发明提供预防或减少易形成粘连的组织粘连的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理组织。
在一个具体实施方式中，粘连是手术后的粘连。
在一个具体实施方式中，所述方法包括将本发明所述的水凝胶应用于组织。优选地，将水凝胶层涂布在组织表面。
在一个具体实施方式中，该方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于组织，以至(a)和(b)在组织表面结合而形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时应用于组织。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时喷洒到组织上。在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时注射至组织上。在另一个具体实施方式中，(a)和(b)同时倾倒至组织上。
在另一个方面本发明提供预防或减少手术后易形成粘连的组织粘连的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理组织，其中所述方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于组织，以至(a)和(b)在组织表面结合而形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供一种加速或促进伤口愈合的方法，其包括以本发明所述的凝胶处理伤口。
在一个具体实施方式中，所述方法包括将本发明所述的水凝胶应用于伤口。优选地，将水凝胶层涂布在伤口表面。
在一个具体实施方式中，所述方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于伤口，以至(a)和(b)结合而形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时应用于伤口。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时喷洒在伤口上。在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时注射在伤口上。在另一个具体实施方式中，(a)和(b)同时倾倒在伤口上。
在另一个方面本发明提供一种加速或促进伤口愈合的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理伤口，其中该方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于伤口，以至(a)和(b)在伤口表面结合而形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供减轻或停止伤口出血的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理伤口。
在一个具体实施方式中，所述方法包括以本发明所述的水凝胶应用于伤口。优选地，将水凝胶层涂布在伤口的表面。
在一个具体实施方式中，所述的方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于伤口，以至(a)和(b)结合而形成水凝胶。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时应用于伤口。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时喷洒在伤口上。在一个具体实施方式中，(a)和(b)同时注射至伤口上。在另一个具体实施方式中，(a)和(b)同时倾倒在伤口上。
在另一个方面本发明提供一种减轻或停止伤口出血的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理伤口，其中所述方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于伤口，以至(a)和(b)在伤口表面结合而形成水凝胶。
在另一个方面本发明提供一种释放一种或多种生物活性剂至组织的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理组织，其中水凝胶包括一种或多种生物活性剂。
在一个具体实施方式中，所述方法包括以本发明所述的水凝胶应用于组织，其中该水凝胶包括一种或多种生物活性剂。优选地，水凝胶层涂布在组织表面。
在一个具体实施方式中，所述方法包括将(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液应用于组织，以至(a)和(b)在组织表面结合而形成水凝胶，其中(a)和(b)之一或两者均包括一种或多种生物活性剂。
在一个方面本发明提供本发明所述的水凝胶在制备用于预防或减轻易形成粘连的组织发生术后粘连的药物中的用途。
在另一个方面本发明提供(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液在制备用于预防或减轻易形成粘连的组织粘连的药物中的用途，其中(a)和(b)结合，形成本发明所述的水凝胶。
在另一个方面本发明提供本发明所述的水凝胶在制备用于加速或促进伤口愈合的药物中的用途。
在另一个方面本发明提供了(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液在制备用于加速或促进伤口愈合的药物中的用途，其中(a)和(b)结合，形成本发明所述的水凝胶。
在另一个方面本发明提供了本发明所述的水凝胶在制备用于减少或停止伤口出血的药物中的用途。
在另一个方面本发明提供了(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液在制备用于减少或停止伤口出血的药物中的用途，其中(a)和(b)结合，形成本发明所述的水凝胶。
在另一个方面本发明提供本发明所述的水凝胶在制备用于向组织释放一种或多种生物活性剂的药物中的用途，其中所述药物包括一种或多种生物活性剂。
在另一个方面本发明提供了(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和(b)醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液在制备用于向组织释放一种或多种生物活性剂的药物中的用途，其中(a)和(b)结合，形成本发明所述的水凝胶，且其中(a)和(b)之一或两者均包括一种或多种生物活性剂。
在上述本发明的方法和用途中：
在一个具体实施方式中，水凝胶在混合(a)和(b)以制备药物的大约1秒至大约5分钟之内形成。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约1秒至大约30秒内形成，优选在大约1秒至大约20秒内形成，更优选地在大约1秒至大约10秒内形成。在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约30秒至大约5分钟内形成。在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约5秒至大约1分钟内形成。
在一个具体实施方式中，水凝胶在将(a)和(b)组合制成药物的大约5分钟至大约20分钟内形成。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约5分钟至大约10分钟内形成。在另一个具体实施方式中，水凝胶在大约10分钟至大约20分钟内形成。
在一个具体实施方式中，水凝胶在将(a)和(b)组合制成药物的大约20分钟至大约2小时内形成。
在一个具体实施方式中，水凝胶在大约30分钟至大约2小时内形成，优选在大约30分钟至大约1小时内形成。
在一个具体实施方式中，(a)包括大约2％至大约10％w/v双羧基衍生的壳聚糖多聚体，优选地大约2％至大约8％w/v，更优选地大约5％w/v。在一个具体实施方式中，(b)包括大约2％至大约10％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体，优选地大约2％至大约8％w/v，更优选大约5％w/v。
在一个具体实施方式中，(a)有大约6至8的pH值，优选地是大约6.5至7.5。
在一个具体实施方式中，(b)有大约6至8的pH值，优选地是大约6.5至7.5。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖为N-琥珀酰壳聚糖。
在另一个方面本发明提供当湿润时能释放本发明所述的水凝胶的伤口敷料。
在一个具体实施方式中，伤口敷料包括双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体。在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体为N-琥珀酰壳聚糖。
在一个具体实施方式中，伤口敷料选自绷带，条，垫，纱布，膜，长袜或带。
在另一个方面本发明提供了用于本发明所述的方法的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，以及
(b)醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，试剂盒还包括(a)和(b)能在其中溶解以使交联发生的水溶液。在另一个具体实施方式中，该试剂盒还包括(a)和(b)其中之一的或两者的水溶液。
在另一个方面本发明提供了用于本发明所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒在分隔开的容器中包括：
(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，以及
(b)醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，试剂盒还包括(a)和(b)能在其中溶解以使交联发生的水溶液。在另一个具体实施方式中，该试剂盒还包括(a)和(b)其中之一的或两者的水溶液。
在上述的本发明的试剂盒中：
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒还包括了用于预防或减少易形成粘连的组织发生手术后粘连的方法的使用说明。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒还包括用于加速或促进伤口愈合的方法的使用说明。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒还包括用于减少或停止伤口出血的方法的使用说明。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒中提供的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体是冷冻干燥的。在一个具体实施方式中，试剂盒还包括溶解双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体中至少一个，优选两个以水溶液分别提供。在一个具体实施方式中，水溶液是冰冻的。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液包括大约2％至大约10％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体。优选地，水溶液包括大约2％至大约8％w/v，更优选地大约5％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液有大约6至8的pH值。优选地，双羧基衍生的多聚体的水溶液有大约6.5至7.5的pH值。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖为N-琥珀酰壳聚糖。
在一个具体实施方式中，醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液包括大约2％至大约10％w/v醛衍生的葡聚糖多聚体。优选地，水溶液包括大约2％至大约8％w/v，更优选地，大约有5％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
在一个具体实施方式中，醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液有大约6至8的pH值。优选地，醛衍生的葡聚糖的水溶液有大约6.5至7.5的pH值。
可选地，两种水溶液中有一种或两种可包含一种或多种药学上可接受的辅料。
在一个具体实施方式中，水溶液选自水、盐水、缓冲液或其混合物。优选地，水溶液是大约0.9％w/v盐溶液。
在一个具体实施方式中，两种水溶液中有一种或两种可包含一种或多种生物活性剂和/或一种或多种非生物活性剂。
在一个具体实施方式中，(a)和(b)中的一种或多种还包括一种或多种生物活性剂。
需要指出的是，有关本文公开的数字范围(例如1至10)还包括此范围内的有关的所有合理的数字(例如，1，1.1，2，3，3.9，4，5，6，6.5，7，8，9和10)，还包括在此范围内的合理数字的任何范围(例如，2至8，1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，本文清楚披露的所有范围的所有子范围在本文是清楚披露的。仅有特定目的的例子和列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合，应认为是在本申请中以相似方式清楚地陈述的。
在本说明书中对专利说明书、其他外部文件或其他信息来源做出了引用，这通常是为了提供讨论本发明特征的上下文的目的。除非另有说明，否则对这些外来文件的引用不应被解释为在任何司法权中，承认这些文件或这些信息的来源是现有技术或形成本领域公知常识部分。
也可以广泛地说本发明单独地或组合地以两种或多种所述部分、元素或特征的任意或所有组合方式由本申请的说明书中引用的或提示的部分、元素和特征组成，并且本文提及的特定的整数，在本领域中与本发明所涉及的有已知的等值，这种已知的等值被认为包含在本文中就像单独列出的一样。
附图说明
图1是显示处理后在鼻侧壁上有粘连的实施例6中描述的每个试验组中的绵羊的百分数的图。
图2是显示在鼻侧壁上粘连的平均程度的图(实施例6)。
图3是显示每个筛骨粘连组的绵羊的百分数的图(实施例6)。
图4是显示与匹配的对照组相比的所有治疗组的平均筛骨粘连程度的图(实施例6)。
图5是显示上皮高度随时间变化的光学显微镜比较的图(实施例6)。
图6是显示再上皮化百分数的光学显微镜比较的图(实施例6)。
图7是显示发生再纤毛化的表面积的百分数的扫描电子显微镜比较的图(实施例6)。
图8是显示纤毛级别的扫描电子显微镜比较的图(实施例6)。
图9是显示每组平均纤毛摆动频率(CBF)的图(实施例6)。
图10是显示用Boezaart分级标准的活性剂相对于安慰剂的手术区域分级评分的图(实施例7)。
图11是显示用Wormald分级标准的活性剂相对于安慰剂的手术区域分级评分的图(实施例7)。
图12是显示用Wormald分级标准的活性剂相对于对照的手术区域分级评分的图(实施例8)。
图13是显示活性剂相对于对照的完全止血时间的图(实施例8)。
图14是比较活性剂相对于对照的随时间的结痂得分的图(实施例8)。
具体实施方式
1、定义
本文所使用的术语“壳聚糖”是指，由随机分布的β-(1,4)连接的D-氨基葡萄糖和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖组成的线性多糖。壳聚糖能通过壳多糖脱乙酰而生成。α-和β-壳聚糖都适合用于本发明。脱乙酰的程度(％DA)影响壳聚糖的溶解度和其他特性。市售壳聚糖通常的脱乙酰的程度为大约50至100％。完全脱乙酰的壳聚糖单体单位如下面通式I所示。
本文所使用的术语“双羧基衍生的壳聚糖多聚体”是指环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基之间的反应衍生的壳聚糖多聚体。双羧基基团的例子包括N-琥珀酰基、N-羟基丁二酰基和N-邻苯二甲酰基。N-琥珀酰基是首选的。
“双羧基衍生的壳聚糖多聚体”也可与其他功能基团部分地衍生。这个二级衍生可能发生在未与双羧基基团衍生的氨的位置或发生在D氨基葡萄糖残基的羟基基团上。例如，环酐与壳聚糖的OH基团的反应可生成一些含有酯基的单体，而不是含有酰胺取代基的单体或额外含有酰胺取代基的单体。
如果二级衍生出现在双羧基衍生的壳聚糖多聚体的氨的位置上，则该多聚体必须保持足够的游离氨基以能与醛衍生的葡聚糖多聚体形成交联。优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体仅通过环酐与一些D-氨基葡萄糖残基的氨基的反应而衍生得到。
本文所使用的术语“N-琥珀酰壳聚糖多聚体”是指通过在壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基上添加N-琥珀酰基而衍生的壳聚糖。N-琥珀酰壳聚糖多聚体的单体单位显示在下面通式II中。
琥珀酰化的程度可不同。通常，其介于大约30％至70％之间，但是N-琥珀酰壳聚糖多聚体必须保持足够的游离氨基以能与醛衍生的葡聚糖形成交联。N-琥珀酰壳聚糖多聚体可还包括如对“双羧基衍生的壳聚糖多聚体”讨论的二级衍生(上文)。
本文所使用的术语“N-琥珀酰壳聚糖”是指仅与N-琥珀酰基团在氨的位置上衍生的N-琥珀酰壳聚糖多聚体，且不包括与其他功能基团的二级衍生。
本文所使用的术语“葡聚糖”是指具有短的α-(1,3)侧链的由α-(1,6)糖苷键组成的葡萄糖多糖。葡聚糖的单体单位显示在下面通式III中。
葡聚糖能通过肠膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B512F发酵含有蔗糖的培养基而得到。可从商家获得分子量在1KDa至2000KDa的葡聚糖。
本文所使用的术语“醛衍生的葡聚糖多聚体”是指如下的葡聚糖多聚体：其中一些邻位二级醇基团已经氧化以产生活性双醛的功能性。醛衍生的葡聚糖多聚体也可在其它位置上与其它功能基团衍生得到。优选地，醛衍生的葡聚糖多聚体仅在邻位二级醇基团上衍生得到。醛衍生的葡聚糖多聚体的代表性的单体单位显示在下面通式IV中。
本文所使用的术语“控制性释放”在生物活性剂的控制性释放的上下文中是指与预期的仅基于扩散相比生物活性剂的预期递送的时间长。
本文所使用的术语“水凝胶”是指由多聚体链的三维网络和填充大分子间空间的水组成的二-或多成分系统。
本文所使用的术语“组织”是指形态学上类似的细胞的聚集物，其与结合的细胞间物质一同在包括人在内的生物体内发挥一种或多种特定的功能。组织的例子包括但不限于肌肉、表皮、神经和结缔组织。
术语“组织”还包括器官，其包括一种或多种组织类型，这些组织类型包括但不限于胸部组织如主动脉、心脏、胸膜腔、气管、肺、心包和心包腔；腹部组织及腹膜后组织如胃、小肠和大肠、肝脏、胰腺、胆囊、肾脏及肾上腺；盆腔组织，包括男性和女性生殖和泌尿道组织；中枢和外周神经系统组织如脊柱和神经、硬膜(dura)和周围神经；骨骼肌系统组织如骨骼肌、肌腱、骨和软骨；头部和颈部组织如眼、耳、颈、喉、鼻和鼻旁窦。
本文所使用的术语“粘连”是指在炎性刺激例如手术后形成的组织或器官之间或组织与埋植物之间的不正常的附着。
易形成粘连的组织是暴露于炎性刺激的组织。例如，这些涉及手术过程的组织，例如但不限于内窥镜鼻窦手术、腹部手术、妇科手术、骨骼肌手术、眼科手术、矫形手术和心血管手术。组织在经过下列其它事件后也易形成粘连：如机械损伤、疾病，例如盆腔炎症性疾病，放射治疗以及外来材料的存在，例如，手术埋植物。
本文所使用的术语“伤口”是指对活的生物体包括人有机体中的组织的任何损伤。组织可以是内部组织如内部器官或外部组织如皮肤。损伤可起因于手术切口或对组织非故意性压迫的应用。伤口包括由机械损伤造成的损害，如擦伤、撕裂伤、穿透伤(penetration)等，以及烧伤和化学损伤。这些损害也可逐渐发生，如发生在溃疡、损伤(lesion)、疮(score)或感染中。伤口的例子包括但不限于挫伤、切割伤、穿透伤、穿孔伤、刺伤和皮下伤。
本文所使用的如在本说明书中使用的术语“包括”意思是“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包括术语“包括”的每一个陈述时，除此之外的其它特征或那些以该术语开头的特征也存在。相关的术语例如“包括”和“包含”应以同样的方式理解。
2、多聚体网络
本发明涉及一种新型多聚体网络，其通过两种熟知多聚体：壳聚糖和葡聚糖的衍生和交联而形成。该多聚体迅速形成三维多聚体网络，在水溶液中形成水凝胶。该水凝胶的特性可以通过修饰两种多聚体成分的衍生和交联而为特定应用定制。
在其最广泛的方面，本发明提供包括与醛衍生的葡聚糖交联的双羧基衍生的壳聚糖的多聚体网络。
2.1壳聚糖成分
壳聚糖广泛存在并能从许多来源购得，例如从Sigma-Aldrich(www.sigma-aldrich.com)。
或者，壳聚糖可通过壳多糖的脱乙酰制备。本领域中已知多种脱乙酰方法，例如，在加热时水解氢氧化钠浓溶液中的壳多糖，然后通过过滤和水洗回收壳聚糖。壳多糖以α-壳多糖或β-壳多糖而存在，取决于氨基葡萄糖单位之间的键是α还是β。壳多糖被发现存在于甲壳类、昆虫、真菌、藻类和酵母菌。α-壳多糖主要获自甲壳类如龙虾、螃蟹和虾的甲壳，而β-壳多糖来自鱿鱼鞘。这两种类型的壳多糖能用来制备用于本发明的双羧基衍生的壳聚糖。
一般来说，商售的壳聚糖的平均分子量(MWav)是大约1至1000kDa。低分子量壳聚糖有大约1至50kDa的MWav。高分子量的壳聚糖有大约250至800kDa的MWav。任何MWav的壳聚糖能用于本发明。
壳多糖的脱乙酰是指所产生的壳聚糖在其多聚体的骨架上有大多数的游离伯氨基。壳聚糖的脱酰化程度可能会影响到本发明所述的多聚体网络的特性，因为只有那些脱乙酰的氨基葡萄糖单位可用于衍生或交联。此外，壳聚糖的溶解性取决于脱酰化的程度。
最适合用于本发明的壳聚糖多聚体有大约40％至100％的脱乙酰程度。优选地，脱酰化程度为大约60％至95％，更优选地，为大约70％至95％。
用于本发明的壳聚糖在通过壳多糖的脱乙酰而游离出来的氨上发生双羧基衍生。双羧基衍生的壳聚糖多聚体可通过使壳聚糖与环酸酐反应而制得。适用于本发明的环酸酐包括琥珀酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基戊烯二酸酐、甲基琥珀酸酐等等。
优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体由壳聚糖与一个或多个琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐或戊烯二酸酐的反应而制成。更优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体由壳聚糖与琥珀酸酐的反应而制成。
通过本领域已知的任何方法可以实现衍生。例如，固体壳聚糖可以在DMF中的环酐溶液中加热或溶解于在甲醇/水的混合物，然后与酸酐反应。其他适合用于衍生过程的溶剂包括二甲基乙酰胺。可以添加酸如乳酸、HCl或醋酸以改善壳聚糖的溶解度。通常添加碱如NaOH以使一些乙酰氨基脱酰化。
实施例1提供了通常的方法。使用的方法可以根据使用的环酐和/或壳聚糖的平均分子量而选择。无论是壳聚糖还是环酐应该能够在所使用的溶剂中基本上溶解或膨胀。
在优选的具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖为N-琥珀酰壳聚糖。制备N-琥珀酰壳聚糖的方法为本领域所熟知。见例如"N-琥珀酰壳聚糖的制备及其物理化学特性"，J Pharm Pharmacol.2006,58,1177-1181。
环酐与壳聚糖的反应使一些具有双羧基基团的游离氨位置酰化。例如，当使用的环酐是琥珀酸酐时，一些氨基是N-琥珀酰化的。N-琥珀酰化之后的NaOH处理将一些酰基基团从壳聚糖中的氨基上移除。升高NaOH处理的温度增加出现的游离氨基的百分数，如实施例4所证明的。
酰化的程度以产物中C:N的比值表示。酰化的程度也能通过‘H nmr确定。N-琥珀酰壳聚糖多聚体表示如下。通式V显示存在于多聚体的三种类型的D-氨基葡萄糖单位—N-琥珀酰-D-氨基葡萄糖，游离的D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
在一个具体实施方式中，x为大约60至80％，y为大约1至15％，且z为大约10到25％。
在另一具体实施方式中，x为大约60至80％，y为大约1至30％，且z为大约2至25％。
高度的酸酐取代使双羧基衍生的壳聚糖多聚体更易溶解，但可能阻碍与醛衍生的葡聚糖多聚体的交联。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体为大约20％至80％双羧基衍生的。优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是大约30％至60％双羧基衍生的。更优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是大约45％至50％双羧基衍生的。
在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是大约50％至90％双羧基衍生的。优选地，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是大约60％至80％双羧基衍生的。
2.2葡聚糖成分
葡聚糖是由主要通过α-1，6键连接的D-葡萄糖单位制成的多糖。粗制的高分子量的葡聚糖通过在蔗糖中培养肠膜样明串珠菌而从商业上获得。所产生的多糖被水解以产生低分子量的葡聚糖。
在葡聚糖能与双羧基衍生的壳聚糖多聚体交联之前，它必须被活化。活性双醛功能性可以从葡聚糖上的邻位二级醇基团通过氧化而产生。实施例2提供了通常的方法。然后，所产生的醛衍生的葡聚糖多聚体可以被还原性地耦合至双羧基衍生的壳聚糖的伯氨基以形成本发明所述的交联的多聚体网络。
在一个具体实施方式中，氧化剂是高碘酸钠。其他适当的氧化剂包括高碘酸钾等。
氧化产物，醛衍生的葡聚糖多聚体，实际上仅包含了少量的游离醛基。绝大多数醛基作为缩醛和半缩醛被掩盖，其与葡聚糖的游离醛形式平衡。一些游离醛基的反应导致平衡从缩醛和半缩醛形式转向形成更多的游离醛基。
所使用的氧化剂摩尔比可影响氧化程度。较高的氧化程度将提供具有更多可用于交联的位点的醛衍生的葡聚糖多聚体。然而，较低的氧化程度将导致更可溶的醛衍生的葡聚糖多聚体。在高碘酸盐反应也大幅降低了葡聚糖多聚体的分子量。
在一个具体实施方式中，氧化程度为大约30％至大约100％，更优选为大约50％至大约100％。最优选地，氧化程度为大约80至大约100％。
实施例5比较了使用不同程度的醛衍生(氧化)的醛衍生的葡聚糖多聚体制备的本发明所述的多聚体网络的凝胶化时间。较高的醛衍生的葡聚糖多聚体具有较低的分子量且当其溶液与N-琥珀酰壳聚糖溶液混合时较快成胶。
可以使用与盐酸羟胺的延长反应测定衍生的程度，然后滴定释放的质子(Zhao，Huiru，Heindel，Ned D，“Determination of degree of substitution of formylgroups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method,”Pharmaceutical Research(1991),8,Page 400-401)。
2.3将壳聚糖成分与葡聚糖成分交联
本发明提供一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络。在一个具体实施方式中，双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖多聚体。在一个具体实施方式中，N-琥珀酰壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体通过N-琥珀酰壳聚糖多聚体的氨基和醛衍生的葡聚糖多聚体的醛基交联。优选地，N-琥珀酰壳聚糖多聚体为N-琥珀酰壳聚糖。
本发明还提供了生产上文所述的多聚体网络的方法。
为了制备本发明所述的多聚体网络，双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体交联。这可以通过混合两种多聚体的水溶液而实现。例如，见实施例3。
一旦制备完成，每种多聚体成分的水溶液既可以留在溶液中，也可以干燥，例如通过冷冻干燥，以生产固体产品。然后固体多聚体成分可以在水溶液中再溶解，然后混合在一起以形成本发明所述的水凝胶。
在一个具体实施方式中，期望的是形成多聚体基质的水溶液的pH值是大约6至8，优选是大约6.5至7.5。这可通过在这两种溶液混合之前，将多聚体成分的各个水溶液的pH调整至该范围而实现。或者，在透析之后，冷冻干燥之前，可以调整单个多聚体成分的水溶液的pH值。pH值能使用任何适当的碱或酸调节。一般来说，使用NaOH调整pH值。
在一个具体实施方式中，水溶液之一或两者都可独立包含一种或多种药学上可接受的辅料。在一个具体实施方式中，水溶液可以独立含有氯化钠。优选地，NaCl浓度是大约0.5至5％w/v。更优选地，NaCl的浓度为大约0.5％至2％w/v，最优选地大约0.9％w/v。
在一个具体实施方式中，水溶液可以独立包含一种或多种缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲液如Na2HPO4、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液。
2.4本发明所述的水凝胶
双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体反应以产生三维交联的多聚体网络。这种多聚体网络与其在其中形成的水溶液形成水凝胶。本发明所述的水凝胶具有这样的特性：使水凝胶适用于药物应用，尤其是，伤口愈合、预防手术粘连并减轻出血(止血)。
不被理论所约束，据信本发明所述水凝胶对伤口表面的应用防止了纤维蛋白和血凝块在该空间的形成，因而防止了后继的粘连形成。
该水凝胶的特性可以通过修饰两种多聚体的衍生和交联而对特定的应用定制。
在本发明所述的多聚体网络中，壳聚糖的D-氨基葡萄糖残基的氨基可以：
(a)与醛衍生的葡聚糖多聚体交联，
(b)与双羧基基团发生酰化，或者
(c)酰化(从最初的壳多糖材料)。
高程度的乙酰化和/或双羧基酰化将使较少的游离氨基与醛衍生的葡聚糖多聚体交联。因此，当混合两种多聚体的水溶液时，发生聚合的量将受双羧基衍生的壳聚糖多聚体的酰化和乙酰化模式的影响。这转而会影响(如果真有的话)水凝胶形成有多快。如果极其少量的聚合发生在多聚体的稀溶液中，那么将形不成水凝胶。
双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液包括大约2％至大约10％w/v的每种成分。
一般来说，将两种多聚体的等浓度的水溶液混合以形成本发明所述的水凝胶。但是，可以使用不同比例的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体，只要这两种多聚体的特性是当混合在一起时它们交联而形成本发明所述的水凝胶。
本领域技术人员可以操作下列参数：
(a)壳聚糖脱乙酰的程度，
(b)壳聚糖双羧基衍生的程度，
(c)醛衍生的葡聚糖氧化的程度，和
(d)在水溶液中的浓度，
以使成分多聚体溶液在混合时迅速交联形成水凝胶。
或者，本领域技术人员可以操作这些参数以确保水凝胶缓慢形成，或在指定时间内形成，如果需要的话。
一些因素，如多聚体的二级衍生、水溶液的性质和生物活性剂或非生物活性剂的添加也应加以考虑。例如，当包含混合的多聚体成分的水溶液的pH值是大约6至8时，本发明所述的水凝胶可以更快形成。
通过操作上面讨论的参数使用本文描述的方法，发明人制成在混合多聚体成分溶液的一秒或两秒内所形成的本发明所述的凝胶。一旦将两种溶液混合，本发明所述的其他水凝胶在数分钟，或甚至是数小时的时间内形成。
双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体溶液可在使用前消毒，以确保其应用到组织不会将微生物引入组织中。或者，冷冻干燥的固体双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体可消毒，然后在消过毒的水溶液中溶解。
溶液可使用本领域已知的任何技术进行消毒。例如，通过使用放射性同位素源(通常是钴-60)的γ射线或电子束或X射线照射进行辐射消毒。
暴露于辐射可能引起影响双羧基衍生的壳聚糖和醛衍生的葡聚糖多聚体的功能的化学变化。例如，如果游离氨基被氧化，将使多聚体成分之间的可用的交联减少，并且凝胶形成的时间更长。辐射还可能降低多聚体成分的分子量。当制备旨在(当在溶液中混合在一起时)在某个时间框架内形成水凝胶的双羧基衍生的壳聚糖和醛衍生的葡聚糖成分时，应考虑这些因素。
本发明所述的水凝胶也可以包含一种或多种生物活性剂，和/或一种或多种非生物活性剂。
在一个具体实施方式中，一种或多种生物活性剂选自血浆蛋白、激素、酶、抗生素、抗菌剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、生长因子、类固醇、细胞悬液、细胞毒素或细胞增殖抑制剂。
纳入水凝胶基质中的生物活性剂在凝胶瓦解时释放。这样，本发明所述的水凝胶可以用于将生物活性剂递送至目标区域。
非生物活性剂也可以纳入水凝胶基质。举例来说，多糖增稠剂如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、黄原胶等，或多聚体增稠剂如聚丙烯酸和共聚物、聚丙烯酰胺和共聚物、醇、顺丁烯二酸酐共聚物等可被加入以产生更结实的水凝胶。
也可将多糖增稠剂添加到多聚体成分的水溶液中，以确保该溶液具有适合于应用的粘度。例如，如果水凝胶要在目标区域如伤口或组织原位形成，多聚体成分的水溶液应有足够的粘性，以至它们不会在交联发生前流走。因此，如果使用的特定的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和/或醛衍生的葡聚糖多聚体形成非常非粘性的水溶液，增稠剂可用于增加粘度。在另一个具体实施方式中，在不添加增稠剂的情况下，多聚体成分的水溶液将有足够的粘性。
类似地，染料如荧光黄(flouroscein)和亚甲基蓝可被纳入水凝胶基质中，以便能够确定所应用的水凝胶的确切位置和数量。
这些额外的制剂可以以本领域已知的任何方法纳入水凝胶。例如，如果制剂是固体物质，它可与干燥的多聚体成分之一混合。然后将混合后的干燥材料溶解在水溶液中，然后与第二种多聚体成分的水溶液混合。
如果纳入的制剂是液体，它可以直接与水质多聚体溶液之一混合，然后冷冻干燥贮存。或者，也可以在混合溶液以形成本发明所述的水凝胶之前，将其直接添加到水质多聚体溶液的混合物中。
也有可能使制剂与多聚体成分之一发生共价反应。如果存在大量制剂，并且制剂与N-琥珀酰壳聚糖的游离氨基发生反应，所生成的水凝胶可能需要更长的时间形成。然而，制剂与多聚体成分之间的共价反应必须防止共价交联而达到不能形成水凝胶的程度。
当水凝胶降解时，制剂将从多聚体上水解。
3、使用本发明所述的水凝胶
在一个方面本发明提供了防止或减少易形成粘连的组织粘连的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理组织。
在一个具体实施方式中，粘附是术后粘连。
在另一个方面本发明提供了减少或停止伤口出血的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理伤口。
在一个方面本发明提供了加速或促进伤口愈合的方法，其包括以本发明所述的水凝胶处理伤口。
对于本发明的上述方法：
在一个具体实施方式中，本发明所述的水凝胶在原位制成。双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液可通过例如，将溶液喷雾、注射或倾倒在目标区域而同时应用。目标区域可是伤口，特别是手术伤口，或组织。
这两种成分在空气中或在伤口或组织的表面相遇并混合，并发生反应而产生交联的多聚体网络。多聚体网络在水溶液中的形成制成了水凝胶。
这些溶液可使用本领域已知的任何手段喷雾、注射或倾倒在目标区域。当喷雾时，水溶液从单独的容器中，以大量分散的液滴被同时排出。这些容器可受到压力。例如，PCT公布WO 00/09199描述了允许喷洒两种可聚合性液体的装置。该装置喷射出存储于单独的隔室中的液体，以使液体仅在突现喷雾时混合。
当注射时，含多聚体的水溶液同时从单独的容器中以液流形式喷出。例如，可使用单独的注射器和点样器将所述水溶液注射至目标区域，这使得当溶液应用于目标区域时溶液在其顶端混合。或者，可以简单地将溶液倾倒至目标区域。
这两种多聚体溶液应同时使用，但不必以完全相同的数量以完全相同的时间达到目标区域，只要发生足够的交联而形成水凝胶。
为了其它粘连或密封系统开发的进行原位凝胶化的各种方法学和装置可被用于应用多聚体的水溶液以形成本发明所述的水凝胶。
在另一具体实施方式中，本发明所述的水凝胶的使用如下：首先混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体，以便在水溶液中形成多聚体网络，然后将形成的水凝胶应用于待治疗的区域。混合多聚体和应用水凝胶之间所需的时间取决于的凝胶形成的速度。本领域已知的任何方法可用于将水凝胶应用至目标区域。例如，可使用大口径的注射器应用水凝胶。
在一个具体实施方式中，所使用的水凝胶的数量应该足以(a)减少或最小化治疗区域内粘连的数目，(b)加快或促进其应用的伤口的愈合，或(c)减少或停止其应用的伤口的出血。
虽然本发明所述的水凝胶能用于减少或最小化由任何粘连-形成事件造成的组织粘连，它们特别用于防止或减轻术后的粘连。
本发明所述的方法可应用于治疗任何生物体。在一个具体实施方式中，这些方法应用于人类。
水凝胶减少出血和粘连的能力，使他们成为有价值的工具，特别是在任何手术程序中。可使用本发明所述的水凝胶的手术程序的例子包括但不仅限于腹部手术(如肠道手术、胸部手术)，神经外科手术(包括颅内(intercranial)和脊柱手术)，神经松解手术(nerve releasing procedure)和脑内侧的手术(procedures on thelining of the brain)，盆腔手术(如卵巢囊肿切除术及子宫切除术)，鼻窦手术，眼科手术，耳科手术，颈部和喉部手术(如声襞和声带手术)，矫形手术(如分离屈肌和伸肌肌腱的粘连以及烧伤手术)。
本发明所述的水凝胶，特别适合用于耳、鼻和喉部手术。在鼻窦内凝胶形成的弱点是粘液纤毛的清除功能将从鼻窦表面慢慢清除凝胶。鼻粘液纤毛清除系统的纤毛摆动的作用是将覆盖鼻上皮细胞的粘液层向鼻咽部运输。这样做时，任何应用于鼻窦表面的物质将类似地被排出。在应用后很快，本发明所述的水凝胶变得很坚实，并因此抵抗了被鼻粘液纤毛清除系统清除。
一旦应用，本发明所述的水凝胶保持了内部组织之间的物理屏障以防止粘连。当组织表面愈合时，水凝胶降解并从该部位清除。
本发明所述的水凝胶也可以应用于皮肤和表皮伤口，直接应用或通过使用纳入水凝胶的伤口敷料而应用。
3.1使用本发明所述的水凝胶递送生物活性剂
本发明所述的水凝胶可以用作生物活性剂的定点的控制性释放载体。因此，一个方面，本发明提供了将一种或多种生物活性剂递送至组织的方法，该方法包括以本发明所述的水凝胶处理组织，其中所述水凝胶含有一种或多种生物活性剂。
生物活性剂的定点递送可减轻与传统的全身性给药相关的副作用，并确保治疗有效量的生物活性剂到达患病区域。例如，本发明所述的多聚体网络可用于治疗慢性静脉功能不全和腿部溃疡。纳入到多聚体网络中的促血管生成(Pro-angiogenic)和上皮生长因子可以有助于愈合溃疡。本发明所述的多聚体网络可以直接以凝胶形式应用于伤口，或者纳入伤口愈合敷料中以应用于伤口。
可以纳入本发明所述的多聚体网络中的生物活性剂包括但不限于血浆蛋白、激素、酶、抗生素、抗菌剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、生长因子、麻醉剂、类固醇、细胞悬液、细胞毒素和细胞增殖抑制剂。
该生物活性剂可与本发明的多聚体结合作用而促进伤口愈合。举例来说，抗生素如四环素，环丙沙星等，生长因子如肝素结合生长因子，包括成纤维细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，胰岛素-结合生长因子-1，胰岛素-结合生长因子-2，表皮生长因子，转化生长因子-α，转化生长因子-β，血小板第4因子和肝素结合因子1和2，都可以纳入到本发明所述的多聚体网络中。
其他可用的生物活性剂包括但不限于抗真菌剂如制霉菌素，氟康唑，酮康唑(ketaconizole)等；抗病毒剂如更昔洛韦，齐多夫定，金刚烷胺，阿糖腺苷，核糖霉素，三氟尿苷，无环鸟苷，双脱氧尿苷(didexoyuridine)等；抗炎剂如α-1抗胰蛋白酶，α-1-抗糜蛋白酶等；细胞毒素或细胞增殖抑制剂如5-氟尿嘧啶，紫杉醇，紫杉特尔，放线菌素D，阿霉素(andriamycin)，阿扎立平，博莱霉素，马利兰，丁酸，卡氮芥，苯丁酸氮芥，顺铂，阿糖胞苷，阿糖胞苷，达卡巴嗪，雌激素，洛莫司汀，美法仑(emlphalan)，巯基嘌呤，甲氨蝶呤，丝裂霉素C，强的松(prednisilone)，泼尼松，丙卡巴肼，链脲佐菌素，硫鸟嘌呤，塞替哌，三丁酸甘油酯，长春碱，长春新碱，庆大霉素，卡铂，环磷酰胺，异环磷酰胺(ifosphamide)，马磷酰胺(maphosphamide)，视黄酸，蓖麻毒素，白喉毒素，毒液等；激素如雌激素，睾酮，胰岛素等；类固醇如倍氯米松，倍他米松，布地奈德，可的松，地塞米松，氟替卡松，氢化可的松，甲泼尼龙，莫米松(memetasone)，泼尼松/强的松龙，曲安西龙等；血浆蛋白如白蛋白；免疫球蛋白，包括免疫球蛋白A，M和G；纤维蛋白原；凝血因子，包括因子II，VII，VIII，IX，X和XIII；纤溶酶原(lasmoinogen)；蛋白C；蛋白S；血浆蛋白酶抑制剂包括抗凝血酶III，α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白和C1酯酶抑制剂；α1-酸性糖蛋白；血浆铜蓝蛋白；结合珠蛋白；转移；通过C91C4b结合蛋白的补体成分C1；interalpha胰蛋白酶抑制剂；载脂蛋白，包括A-1，A-11，B，C和E；纤维连接蛋白和血管他丁。
本发明所述的水凝胶可还包括营养补充物，如多肽、蛋白质、简单碳水化合物、复合碳水化合物、脂类，糖脂、糖蛋白、维生素和矿物质。
生物活性剂纳入水凝胶可以实现制剂的定点递送。释放速率也可通过定制水凝胶的降解率而控制。
生物活性剂可以以本领域已知的任何方式添加到本发明所述的水凝胶中。例如，在将溶液混合在一起之前，将该制剂加至一种多聚体成分的溶液中。纳入方式将取决于生物活性剂的性质。
加入的生物活性剂的浓度将根据制剂的性质、待应用的部位和水凝胶的物理特性而不同。浓度应足以使该生物活性剂以治疗有效量被递送至目标部位。在一个具体实施方式中，生物活性剂的浓度为大约1ng/ml至大约1mg/ml的水凝胶。优选地，生物活性剂的浓度为大约1ug/ml至大约100ug/ml的水凝胶。要加入的适当量的生物活性剂可以由本领域技术人员通过检测含有不同浓度的生物活性剂的水凝胶和选择对于特定目的最有效的水凝胶而计算。
本发明所述的水凝胶的物理特性确保当其被应用时基本上保留在同一个位置并且不会很快被体内的液体冲走或因重力下沉。当被应用时，水凝胶将在组织周围自体成型，确保接触整个组织的表面。
4、试剂盒
在另一个方面本发明提供了本发明所述的方法中使用的试剂盒，其中该试剂盒包括：
(a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，以及
(b)醛衍生的葡聚糖多聚体。
本发明所述的试剂盒方便地提供了在水溶液中交联形成本发明所述的水凝胶的多聚体成分。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒还包括多聚体(a)和(b)在其中可被溶解而交联并形成水凝胶的水溶液。或者，本发明所述的试剂盒可提供预先溶解在水溶液中准备与第二多聚体成分混合的(a)和/或(b)。可以液体或冷冻方式提供水溶液。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒提供了冷冻干燥粉末形式的多聚体成分(a)和(b)。要使用本发明所述的试剂盒，冷冻干燥的多聚体被溶解在适当的水溶液中，然后混合在一起。或者，可以将(a)和(b)都添加到适当的水溶液中并混合直到溶解并交联。在一个具体实施方式中，水溶液选自水、盐水、缓冲液及其混合物。
在一个具体实施方式中，本发明所述的试剂盒也可以包含一种或多种生物活性剂。例如，一种或多种生物活性剂可以被纳入多聚体成分(a)和(b)之一或两者中。或者，一种或多种生物活性剂可出现在溶解(a)和/或(b)的水溶液中。
5、伤口敷料
本发明还提供了当湿润时能释放本发明所述的水凝胶的伤口敷料。该伤口敷料可以是本领域已知的任何合适的敷料。例子包括绷带、条、垫、纱布、膜、长袜和带。
一方面，所述伤口敷料包括双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体。优选地，双羧基衍生的壳聚糖为N-琥珀酰壳聚糖。
为了制备本发明所述的伤口敷料，将干燥的固体双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体混合进入敷料的结构中。或者，所述伤口敷料可在一种多聚体的水溶液中浸湿，然后干燥，引入第二种多聚体作为垫子(matt)。垫子可通过第三种成分(例如，水溶性胶)结合在一起。作为另一种选择，两种多聚体可被干燥并混合，然后放置在两片非常多孔的膜之间，作为伤口愈合敷料的部分结构。
当伤口敷料湿润时，这两种多聚体成分在伤口敷料的水质成分中交联并形成水凝胶。该伤口敷料可通过外部或内部的液体浸湿。例如，当置于伤口上时，伤口敷料可通过与来自伤口的血液或伤口渗出液接触而浸湿。如果伤口不是足够湿润的，伤口敷料可通过与合适的生理上可接受的液体如水或盐溶液接触而浸湿。
通过改变成分多聚体可改变水凝胶形成的速率。伤口敷料的不同用途可需要不同的水凝胶形成速率。
对伤口敷料施压可有助于水凝胶的形成。
伤口敷料可包含额外的制剂，如抗菌剂和其他生物活性剂，如上文所讨论的。这些制剂可使用本领域已知的标准方法纳入敷料材料中，或者可纳入掺入敷料结构中的多聚体溶液中。
现在参照下列实施例对本发明的各个方面以非限制的方式加以说明。
实施例
实施例1
N-琥珀酰壳聚糖多聚体(DMF方法)
A批次：在100ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中将琥珀酸酐(2.15克，0.0215摩尔)添加到壳聚糖(1.5克，0.007摩尔)中。将该混合物在氮气下加热到150℃，加热3小时。
冷却后，从混合物中收集固体，并以甲醇洗涤，然后以丙酮洗涤。将干燥的固体在氢氧化钠(400毫升，2M)中溶解，并将该溶液搅拌过夜。不是所有的固体都溶解。将不溶的固体过滤并使溶液蒸发至大约30-50毫升。
将该溶液在3升烧杯中通过透析袋透析48-60小时，定期换水。然后将该溶液浓缩并冷冻干燥。获得作为棉花样的固体的N-琥珀酰壳聚糖的产物。
B批次：将壳聚糖(来自鱿鱼鞘)(30克)和琥珀酸酐(42克)在DMF(500毫升)中加热到140℃，加热20小时。通过过滤回收由此产生的N-琥珀酰壳聚糖，并以乙醇洗涤，然后以乙醚洗涤并用泵干燥。将该干燥固体加入到氢氧化钠溶液(10克于800毫升水)中并搅拌过夜。将该溶液通过硅藻土过滤，并透析3天，每12小时更换一次水。冷冻干燥产生14克N-琥珀酰壳聚糖(分析的C 39.2％，H 5.9％，N 5.1％)。
C批次：将壳聚糖(30克，实用等级Aldrich，中等分子量)和琥珀酸酐(42克)在DMF(1升)中加热到130℃，加热3小时。壳聚糖膨胀，但没有溶解。在冷却后，将壳聚糖过滤出来，并在滤膜上以甲醇洗涤。然后将壳聚糖加入氢氧化钠溶液(50g于1.5升水)中，并以高速高架搅拌器混合至均匀(通常是30分钟)。偶尔壳聚糖不能全部溶解，在这种情况下通过硅藻土过滤去除任何剩余的凝胶。将溶液加热到50℃，加热14小时并在纤维素管中在蒸馏水中透析3天(换4次，50L)。用一点儿氢氧化钠将pH值调整为8.0。然后在旋转蒸发仪上在减压条件下，将该溶液减少至大约700毫升的体积以产生非常粘稠的溶液，然后冷冻干燥以产生大约35克的产物。
N-琥珀酰壳聚糖(甲醇法)
通过搅拌3小时，将壳聚糖(Aldrich,实用等级)(20克)溶解在乳酸(20毫升)和水(650毫升)中。加入甲醇(650毫升)，并将该混合物加热至35℃。将琥珀酸酐(29克)加入，并将混合物在35℃剧烈搅拌4小时。花几个小时溶解了琥珀酸酐。加入氢氧化钠溶液(35克于300毫升水)并将混合物剧烈搅拌1小时。将由此产生的絮状部分胶化的混合物透析1天以去除甲醇，然后剧烈搅拌以粉碎余下的最终凝胶，并在蒸馏水中再透析3天(每12小时换一次水)并过滤。冷冻干燥产生产物(16.5克)。
实施例2
醛衍生的葡聚糖
A批次：将葡聚糖(1克，MW 60,000-90,000)溶解于20毫升蒸馏水。将高碘酸钠(2克)加入该溶液，室温下搅拌3小时。该溶液在3升烧杯中透析过夜，定期更换水。然后将该溶液浓缩并冷冻干燥以产生白色粉末形式的醛衍生的葡聚糖。
B批次：将葡聚糖(20克，Aldrich，Mn 21,500，MW 142,000)溶解于水(200毫升)，然后加至高碘酸钠的搅拌混合物(40克于200毫升中)中。通过外部冷却，使放热反应的温度保持在摄氏35℃以下，并且该反应在氮气条件下进行。3小时后，将该溶液透析3天(每12小时更换一次水)，过滤和低压冻干以产生白色粉末形式的醛衍生的葡聚糖(14.7克，发现的C 39.8％，H 5.9％)。最终的分子量为Mn 2570，MW4700。
C批次：将葡聚糖(36克，Aldrich食品级，mw 80,000)在水(800毫升)中剧烈搅拌，同时加入固体高碘酸钠(50g)。通过外部冷却控制该放热反应，使温度保持在30℃以下。2小时后，将溶液过滤，并在纤维素管中透析3天(4次更换蒸馏水，每次50升)。用一点儿氢氧化钠将pH值调整为8.0，并在减压条件下使该溶液的体积减少至大约300毫升,并冷冻干燥。产量是大约30克。
实施例3
包括在水溶液中与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络
将来自实施例1的N-琥珀酰壳聚糖(30毫克)溶解在0.6毫升蒸馏水中以产生5％w/v的水溶液(溶液A)。将醛衍生的葡聚糖多聚体(30毫克)溶解在0.6毫升蒸馏水中以产生5％w/v的水溶液(溶液B)。
将溶液A和溶液B混合在一起，直到水凝胶形成(大约2分钟)。水凝胶是包括在水溶液中与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的N-琥珀酰壳聚糖的多聚体网络。
实施例4
碱处理对N-琥珀酰壳聚糖的功能基团水平和水凝胶的成胶时间的影响
根据实施例1(DMF方法-C批次)制备N-琥珀酰壳聚糖，然而将壳聚糖溶液和NaOH加热14小时，加热温度显示于下面表1。表1显示较高温度产生更大的脱酰作用，因此游离氨基的比例较高。游离氨基对于乙酰基和N-琥珀酰基基团的相对性质通过‘H nmr确定。
根据实施例3通过将N-琥珀酰壳聚糖与醛衍生的葡聚糖交联制备的水凝胶可以更快地形成，其中N-琥珀酰壳聚糖具有较高的游离氨的比例。
表1-碱处理对N-琥珀酰壳聚糖的功能基团水平和水凝胶的胶形成时间的影响
实施例5
高碘酸盐的摩尔％对葡聚糖的醛衍生和水凝胶的胶形成时间的影响
根据实施例2制备醛衍生的葡聚糖，但是使用不同摩尔％的高碘酸盐。该反应在室温下进行2小时。表2显示当醛衍生的葡聚糖溶液与N-琥珀酰壳聚糖的溶液混合时，由此产生的醛衍生的葡聚糖的分子量、醛基的摩尔％，和形成水凝胶所花费的时间。
表2
每个壳聚糖残基上存在的醛基的理论最大摩尔％是200，如果每摩尔高碘酸盐与一个壳聚糖残基反应，这将被实现。200的摩尔％代表100％的氧化(或100％的醛衍生)。
实施例6
绵羊内窥镜鼻窦手术后水凝胶对粘连的影响
使用得到确认的内窥镜鼻窦手术伤口愈合规程对20只绵羊(美利奴羊与阉羊杂交)制造标准化的完全厚度粘膜伤口。每只绵羊被给予两次鼻侧壁损伤和每侧一次筛骨损伤。损伤部位随机分成4个处理组，并以下列之一处理：(a)对照(未处理),(b)SprayGelTM，(c)重组组织因子和(d)本发明所述的水凝胶。
对于(b)、(c)和(d)组，使用粘膜喷雾装置将5毫升活性剂喷在伤口表面。SprayGelTM和本发明所述的水凝胶的每种作为两种单独的液体成分被喷洒，其在喷雾中即刻混合形成粘膜粘着性凝胶。
在第28、56、84和112天评估绵羊。在每次回顾时，用肌肉注射4毫克甲苯噻嗪使绵羊适度地镇静。在4次这些每周探访中的每次，对鼻腔进行下列检查：
标注粘连的存在，它们被记录的位置和由独立观察者(动物实验室技术员)根据之前公布的分级方案(表3)分级的每个粘连。
表3-绵羊鼻部粘连的分级方案
1级 小于中鼻甲高度的25％
2级 中鼻甲高度的25-50％
3级 大于中鼻甲大小的50％
在内窥镜视野下在远离活组织检查的位点上使用细胞刷加细胞收集器(Medscand Medical,瑞典)在不进行局部麻醉的情况下从每只绵羊的四个区域收集纤毛细胞的刷毛。为了在未接触的区域抽样，在16星期的时间内，将刷毛的位点仔细地排序，并记录下来。
在鼻侧壁损伤位点的活组织检查之前，对每个鼻腔实施四次联合麻醉剂的喷雾和解充血剂的喷雾(co-phenylcaine-ENT技术)。做切口并且用尖锐的Freer起子将小瓣抬起，并且使用钻取活检钳从每个损伤位点取出两个活检标本。为了在未接触的区域抽样，在十六个星期的时间内，活检每隔每四个星期进行一次，活检位点被仔细地排序，并记录下来，以便在未接触的区域抽样。在最后一次活检之后，通过静脉注射戊巴比妥钠(>100毫克/千克)实施安乐死。
用于光学显微镜的标本在福尔马林中固定4小时，然后置于70％乙醇中并处理。标本包埋在石蜡块中，切成4微米厚度的片，并且对于每个活检标本在两张玻璃载玻片上包埋6至8个切片。然后将它们用苏木精-伊红(H&E)染色。每个标本在光学显微镜下使用图像捕捉软件(Image Master Pro)进行检查。通过测量具有固有层的鼻粘膜表面区域的长度和有上皮覆盖的该表面的长度来计算再上皮化的百分数。对于每个活检标本，测量四个随机的切片。使用这些相同的数字图像还测量了上皮的高度。对于每个活检标本，使用上皮的基底膜和顶端表面作为标记测量了每个切片的上皮的四个随机区域。
为了去除血块、粘膜、碎片和生物被膜，将扫描电子显微镜(SEM)用的标本放置在磷酸缓冲盐水中，然后使用超声波清洗机洗涤20分钟。然后将标本在磷酸缓冲盐水+4％的蔗糖，pH值7.2的4％多聚甲醛/1.25％戊二醛(gluteraldehyde)的溶液中固定，并于4℃贮存，直至处理。处理包括将标本用四氧化锇，接着通过增加乙醇的浓度(70&，90％，95％，100％及100％)逐渐脱水，利用微波技术(PELCO)可以更迅速地处理。在此之后，用二氧化碳临界点干燥器将标本干燥，然后在EM短柱上包埋。最后，将标本覆盖上金和碳。将每个标本用SEM进行检查(Phillips XL30场发射扫描电子显微镜)，且四个表面图像以500×放大倍数获得。将标本根据之前公布的分级标准进行分级。如果需要清晰，标本还可以在更高的放大倍数(2000×和5000×)下进行检查。使用图像分析软件和之前验证的技术，将每个标本的四张图片(于500×放大倍数)用于计算被纤毛覆盖的表面区域的百分数(Macintosh D,Cowin A,Adams D,Wormald P J,Am.J.Rhinol.2005,19(6),557-81)。
将刷毛细胞悬浮在1毫升Dulbecco’s培养基中，并搅拌以释放细胞至培养基中。将其保持在36.5℃直至进行CBF分析。将每个标本中的二十微升放置于加温至36.5℃的显微镜载玻片上并使用相差显微镜。单个分析每个标本的十个细胞，且将它们的均值作为CBF。
参与这项研究的绵羊的健康状态通过有操作绵羊经验的动物房的兽医工作人员进行监测。在给予制剂后，一天监测绵羊四次，共监测两天，监测体温、心率、灵活性和进食。这之后，为该项研究的其余部分，每天监测两次它们的灵活性和进食。
统计分析
进行有邦费罗尼校正后检验(Bonferroni correction post tests)的两因素方差分析(two way ANOVA)以分析上皮高度，再上皮化，再纤毛化，纤毛级别和鼻侧壁粘连百分数和级别。使用威尔柯克森符号秩检验法(Wilcoxon signed ranks test)来分析配对的筛骨粘连率。统计学意义设置在p<0.05。
结果如图1-5所示。
结果
每组中随时间变化有鼻侧壁粘连的绵羊的百分数如图1所示。使用完全厚度损伤方法，对照组有15％的粘连率，组织因子组有25％的粘连率，而SprayGelTM组有10％的粘连率。水凝胶组有10％的粘连率，然而在第56天时这降至5％并在整个研究过程中保持这个水平。在第56、84和112天时，水凝胶组的粘连百分数显著低于组织因子组(5％对25％，p<0.05)。
在SprayGelTM组，粘连的平均分级趋向于较不严重，并且在水凝胶组更不严重，然而，这些区别并不显著(图2).
每组随时间变化的筛骨粘连率如图3所示。用上述方法，在对照组中确立了40％的筛骨粘连率。这在组织因子组增加至50％。SprayGelTM组的粘连率较低，为14％，然而，水凝胶组没有筛骨粘连。尽管该配对研究的数目小，水凝胶组比组织因子组具有显著降低的粘连(0％对50％，p<0.05)，见图4。
当用光学显微镜分析随时间变化的表皮高度时，四组之间未发现显著区别(图5)。
每组有再上皮化的粘膜的百分数如图6所示。在第28天时，与组织因子组相比，水凝胶组有显著高的再上皮化百分数(70％对33％，p<0.001)。此外，在第84天时，与组织因子组相比，SprayGelTM组有显著高的再上皮化百分数(89％对61％，p<0.05)。
图7显示四组中每组随时间变化的再纤毛化的表面区域的百分数(均值±标准偏差)。在第28天时，水凝胶组与对照组(62％对31％，p<0.01)和组织因子组(62％对23％，p<0.001)相比，有显著多的纤毛化，而SprayGelTM组与组织因子组(47％对23％，p<0.05)相比，也有显著增多的纤毛化表面区域。在第56天时，水凝胶组比组织因子组保持了显著多的纤毛化(67％对40％，p<0.05)。总之水凝胶组趋向于改善的再纤毛化，尽管这并不在所有的时间点上都显著。
在每个时间点上每组平均有1-2个标本是不可用的，将这些标本标为5级。下面表4显示绵羊鼻纤毛的扫描电子显微镜(SEM)图像的分级标准。
表4-绵羊鼻纤毛的扫描电子显微镜(SEM)图像的分级标准。
级别 SEM下的外观
I 正常方向的正常纤毛
II 纤毛化上皮，但无方向
III 纤毛残根，再生的纤毛
IV 无可辨认的纤毛
V 不可用的(结痂或凝块覆盖的上皮)
两因素方差分析显示在每个时间点上每组的不可用标本的数目之间无显著性区别，因此这些标本不进行后续分析(数据未显示)。图8显示每个时间点上每组的均值±SD的纤毛级别。在第84天时，SprayGelTM组的平均纤毛级别显著优于组织因子组(1.8对2.6，p<0.05),并且在第112天时，水凝胶组的平均级别显著优于对照组(1.9对2.7，p<0.05)。
随时间变化的四组之中任一组之间的平均CBF无显著性区别(图9)。水凝胶组趋向于在所有时间点上改善纤毛功能，然而，这并不显著。
重要的是，在这个研究中没有一只绵羊经历了有害的事件。在研究期间没有发热、心动过速、不良灵活性或进食不良的报道。
讨论
本发明所述的SprayGelTM和水凝胶均显示出一些防止粘连的性质。与组织因子相比，尤其是水凝胶显示出显著减少的鼻侧壁和前筛骨的粘连。
在伤口愈合的方面上，结果遵循类似的模式：与对照相比，尤其是与组织因子相比，水凝胶和SprayGelTM具有改善的再上皮化率、再纤毛化率和纤毛级别。伤口愈合的最显著的特征是水凝胶组上皮的迅速修复，反映在第28天时，显著增加的再上皮化和发生再纤毛化的表面区域的百分数。在这项研究的早期，所有四组的纤毛级别无显著不同，然而在该研究的后期，水凝胶组与组织因子和对照相比，有显著改善的纤毛级别。
实施例7人类试验
进行一项前瞻性随机受控的先导试验。六名接受全室内窥镜鼻窦手术的患者随机接受20毫升水凝胶，而对侧不接受处理。在对每一侧进行手术结束之时在内窥镜视野下以喷雾形式应用该溶液。使用标准化的电子内镜检查术记录应用后出血，并用2个之前验证的标准每两分钟直至最长10分钟对出血进行分级。
结果
在应用后4、6、8和10分钟，水凝胶在手术区域显示了显著的临床改善(见表5和图10和11)。
表5-使用手术区域出血标准的六名患者的安慰剂相对于活性侧的出血得分
再者，在6例病例中有5例，外科医生认为本发明所述的水凝胶比安慰剂更有效，其中一例被认为无区别。已知影响止血的其它参数如平均动脉压力、心率和终末潮气CO2在安慰剂和活性侧之间无显著区别。
实施例8
水凝胶对绵羊内窥镜鼻窦手术后止血的影响
21只感染了鼻狂蝇Oestrus ovus的绵羊(美利奴与阉羊杂交)参与该研究。鼻狂蝇感染通过鼻腔内窥镜看到证实，并以利什曼染色的鼻棉签证实了嗜酸性鼻窦炎。通过将硫喷妥钠(19毫克/千克体重)注射到颈静脉而诱导全身麻醉。气管插管，然后通过吸入1.5-2.0％的三氟氯溴乙烷维持麻醉。在前筛骨复合体与鼻腔壁之间通过使用微型清创器(Medtronic ENT,Jacksonville,Florida)制造标准化的粘膜损伤之前，切除中鼻甲。两侧的损伤表现的持续时间用秒表计时30秒。粘膜损伤后即刻由独立观察者使用Boezaart手术区域分级标准对基线手术区域级别进行测定(Boezaart AP，Van Der Merne J，Coetzee A，Comparison on sodium nitroprussideand esmolol induced controlled hypertension for functional endoscopic sinus surgery.Can J Anaesh 1995,42,page 373-376)(表6)。
表6-Boezaart手术区域分级标准
每个鼻腔由计算机随机分为不接受治疗(对照)或在基线手术区域级别计算后即刻接受5毫升应用于筛骨区域的本发明所述的水凝胶。将本发明所述的水凝胶用荧光黄染色以帮助可视化。在基线分级后每2分钟对每侧计算手术区域级别，直至出血停止或直至最长的10分钟观察时间。
绵羊拔出插管并返回羊圈中。每日监测三次绵羊，监测变量如食物摄入、鼻腔排出物和体温。受过训练的动物操作人员记录手术后2星期后持续血染的鼻排出物。手术后每天，使所有绵羊镇静并进行电子内镜检查术，记录伤口位点上结痂/凝胶的存在。然后，将其在从0至2的3点刻度尺上进行分级(表7)。在术后14天的时间内持续每日观察。
表7-筛骨复合体结痂/凝胶溶解
级别 评价
0 筛骨表面之间无结痂/凝胶出现
1 被结痂/凝胶覆盖的筛骨复合体的表面区域在50％以下
2 被结痂/凝胶覆盖的筛骨复合体的表面区域在50％以上
结果
使用GraphPad Prism和SPSS 11.0分析手术区域分级标准。由于数据不是正态分布的，使用威尔柯克森符号秩检验法的非参数数据的配对检验用于分析两侧之间的手术级别的区别。对于多重检验的邦费罗尼校正用于所有对手术级别的分析，且统计学意义设置在p<0.05。Student T检验用于比较完全止血的平均时间。
对照相对于本发明所述的水凝胶随时间变化的止血的比较
21只绵羊(美利奴羊与阉羊杂交)参与研究的这个部分。对照和水凝胶之间的基线出血时间上没有显著区别(2.4±0.67对2.4±0.74)。应用后2、4和6分钟，水凝胶侧显著地更多止血。对照相对于水凝胶的平均分级得分和95％置信区间是：2分钟时为1.6(±0.92)对0.9(±0.53)，4分钟时为1.0(±0.66)对0.24(±0.43)，6分钟时为0.4(±0.59)对0.048(±0.21)(p<0.05)(图12)。
完全止血时间
所有水凝胶侧的完全止血时间为6分钟。水凝胶侧的平均止血时间显著好于对照侧，为4.09(±1.61)对6.57(±2.20)(p＝0.049)(图13)。对照侧的持续出血注明为在8分钟时是3侧和在10分钟时是1侧。这是与水凝胶侧6分钟后无进一步出血相比较。
一只绵羊在手术后第5天死亡。死后发现是因为吸入胃内容物。这只绵羊无出血证据。在其余绵羊中，术后第一天无持续的血染鼻腔排出物，且注明无绵羊有过量的需要干预的持续出血。
结痂/水凝胶溶解得分
20只绵羊参与研究的这一部分。手术后第1、3、7和14天，对照侧的平均结痂和水凝胶溶解得分之间无显著性区别。对照相对于水凝胶的平均结痂/水凝胶溶解得分和95％置信区间是：第1天为2.0(±0.00)对1.9(±0.31)，第3天为1.6(±0.60)对1.65(±0.59)，第7天为0.47(±0.61)对0.53(±0.70)，且第14天为0.00(±0.00)对0.05(±0.22)(图14)。
结论
在慢性鼻窦炎绵羊模型中，与对照相比，在粘膜损伤后2、4和6分钟，本发明所述的水凝胶显著地改善止血。当与对照相比其还显示出相似的结痂溶解性质。以其显著的止血效果结合已知的对伤口愈合的正面影响，本发明所述的水凝胶显示出对于接受ESS的患者在ESS后作为手术后伤口敷料的巨大潜力。
工业应用性
本发明提供了水质的生物可降解的水凝胶，其可应用于伤口而有助于伤口愈合并防止粘连。该水凝胶还对止血有正面的影响并可用于绷带和战地敷料以帮助出血性创伤伤口和手术后的止血。
本发明所述的水凝胶适于手术过程中应用。它们的用途可改善接受手术的患者的结果。
本发明所述的水凝胶可由未经过医学训练的人员容易地制备并可用于紧急情况以防止伤者过量失血，直至伤者可被运送至医疗设施。

Claims (53)

1.一种多聚体网络，其包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的。
2.根据权利要求1所述的多聚体网络，其中所述的双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体通过双羧基衍生的壳聚糖多聚体的氨基和醛衍生的葡聚糖多聚体的醛基交联。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在将所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体在水溶液中混合的1秒至5分钟内形成水凝胶。
4.根据权利要求3所述的多聚体网络，其中所述的多聚体网络在将双羧基衍生的壳聚糖多聚体与醛衍生的葡聚糖多聚体在水溶液中混合的1秒至30秒内形成水凝胶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多聚体网络，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
6.一种伤口愈合组合物，其包括水溶液中的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的。
7.根据权利要求6所述的伤口愈合组合物，其中所述组合物包括2％至10％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和2％至10％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
8.根据权利要求6或7所述的伤口愈合组合物，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
9.一种水凝胶，其包括水溶液中的与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的。
10.根据权利要求9所述的水凝胶，其中水凝胶包括2％至10％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和2％至10％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
11.根据权利要求10所述的水凝胶，其中水凝胶包括2％至8％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和2％至8％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
12.根据权利要求10所述的水凝胶，其中水凝胶包括5％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和5％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的水凝胶，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
14.一种制备包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的多聚体网络的方法，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的，其中所述方法包括混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液为2％至10％w/v，且醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液为2％至10％w/v。
16.根据权利要求14所述的方法，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液为5％w/v，且醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液为5％w/v。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述方法包括等体积混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水溶液和醛衍生的葡聚糖多聚体的水溶液。
18.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中每种水溶液的pH值为6至8。
19.根据权利要求18所述的方法，其中每种水溶液的pH值为6.5至7.5。
20.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
21.一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的水凝胶，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的，其中水凝胶包括一种或多种生物活性剂。
22.根据权利要求21所述的水凝胶，其中一种或多种生物活性剂选自血浆蛋白、激素、酶、抗生素、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、生长因子、类固醇、细胞悬液、细胞毒素或细胞增殖抑制剂。
23.根据权利要求9至13中任一项所述的水凝胶在制备用于防止或减轻易形成粘连的组织粘连的药物中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述的粘连是手术后粘连。
25.根据权利要求9至13中任一项所述的水凝胶在制备用于加速或促进伤口愈合的药物中的用途。
26.根据权利要求9至13中任一项所述的水凝胶在制备用于减少或停止伤口出血的药物中的用途。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述的伤口是手术伤口。
28.根据权利要求25所述的用途，其中所述的水凝胶在混合双羧基衍生的壳聚糖多聚体和醛衍生的葡聚糖多聚体的1秒至5分钟内形成。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述的水凝胶在1秒至30秒内形成。
30.根据权利要求25所述的用途，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
31.一种能释放权利要求9至13中任一项所述的水凝胶的伤口敷料。
32.一种试剂盒，其包括：
a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，其是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的，和
b)醛衍生的葡聚糖多聚体。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中a)和b)是冷冻干燥的。
34.根据权利要求32所述的试剂盒，其中a)和b)之一或两者都以单独的水溶液提供。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的试剂盒，其中a)为2％至10％w/v的水溶液，且b)为2％至10％w/v的水溶液。
36.根据权利要求32至34中任一项所述的试剂盒，其中所述水溶液包括0.1％至2％w/v的NaCl。
37.根据权利要求32或33所述的试剂盒，其还包括a)和b)可以溶解在其中而允许交联发生的水溶液。
38.根据权利要求32至34中任一项所述的试剂盒，其中a)是N-琥珀酰壳聚糖。
39.一种包括与醛衍生的葡聚糖多聚体交联的双羧基衍生的壳聚糖多聚体的组合物，所述双羧基衍生的壳聚糖多聚体是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的。
40.根据权利要求39所述的组合物，其进一步包括水溶液。
41.水凝胶形式的根据权利要求39所述的组合物。
42.根据权利要求39或40所述的组合物，其中所述组合物包括2％至10％w/v的双羧基衍生的壳聚糖多聚体和2％至10％w/v的醛衍生的葡聚糖多聚体。
43.根据权利要求39或40所述的组合物，其中双羧基衍生的壳聚糖多聚体是N-琥珀酰壳聚糖。
44.根据权利要求41所述的组合物，其进一步包括一种或多种生物活性剂。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中一种或多种生物活性剂选自血浆蛋白、激素、酶、抗生素、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、生长因子、类固醇、细胞悬液、细胞毒素或细胞增殖抑制剂。
46.根据权利要求41所述的组合物，其用于防止或减轻易形成粘连组织的粘连，用于加速或促进伤口愈合或用于停止伤口出血。
47.用于耳、鼻和喉手术中的根据权利要求41所述的组合物。
48.一种试剂盒，其包括
a)双羧基衍生的壳聚糖多聚体，其是由环酐与壳聚糖多聚体的一些D-氨基葡萄糖残基的氨基反应衍生的，和
b)醛衍生的葡聚糖多聚体。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中a)和b)之一或两者都以单独的水溶液提供。
50.根据权利要求48所述的试剂盒，其进一步包括一种或多种生物活性剂。
51.根据权利要求48所述的试剂盒，其用于耳、鼻和喉的手术。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其用于内窥镜鼻窦手术或鼻旁窦的手术。
53.根据权利要求47所述的组合物，其用于内窥镜鼻窦手术或鼻旁窦的手术。
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