CN103848926B - 一种羧化壳聚糖的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羧化壳聚糖的制备方法和用途。密闭反应器中加入戊二酸酐的二甲亚砜溶液，加热，放入壳聚糖反应后再置于氢氧化钠溶液中反应，取出即获得羧化壳聚糖。羧化壳聚糖溶于固体酸溶液中，再溶入氯化钙，经喷雾干燥得到羧化壳聚糖止血颗粒。羧化壳聚糖溶于固体酸的溶液中，再溶入氯化钙，经冷冻干燥得到羧化壳聚糖止血海绵。羧化壳聚糖溶于酸溶液中，将该溶液注于模具中，在其上密闭覆盖单向渗透膜，再将模具浸泡碱性介质中制得壳聚糖凝胶，然后去离子水洗至中性；再将其浸入氯化钙溶液中，交联，取出，洗涤干净；再将凝胶浸泡在丙三醇溶液中，取出后沥干；然后置于无水乙醇环境中单面熏蒸，干燥即得羧化壳聚糖止血膜。

Description

一种羧化壳聚糖的制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种羧化壳聚糖的制备方法和用途。

背景技术

止血一直是困扰医院手术的一大难题，伤口出血是外科手术中最棘手的问题之一，一台手术往往超过一半的时间都是用于止血，尽管医生可以用止血钳止血，烧灼伤口，甚至使用收缩血管的药物，但每年在手术台上仍然有数百万单位的血液白白流失，甚至会出现因为不能有效止血而失去生命的现象。如果能够迅速止血，既减少了伤亡、又使得输血量将大大减少，于此同时，病人因失血而承担的二次损伤也将减少。另外，在战场上、自然灾害中及各种日常突发性事故中，不可控制的出血是导致伤员死亡的主要原因。尽早的控制出血成为降低伤亡的最佳策略。

目前，为寻找理想的止血材料，国内外进行了大量的研究。国内外众多研究已经证实，壳聚糖具有一定的止血功能，加上它们固有的特性——无毒、无抗原性，并具有生物相容性、抑菌活性、促进伤口愈合等，赋予其作为止血材料的潜能。现有技术已经有多种基于单纯的壳聚糖的止血剂，比如壳聚糖海绵，壳聚糖凝胶，壳聚糖干粉，壳聚糖止血绷带等，并且有一些也获得了应用，但是单纯的壳聚糖止血产品，其作用机理主要通过促进形成血凝块形成作用实现的，由于促进血凝块的作用过程通常都需要几分钟，而且较大出血的部位血压力较大，常会将尚未完全形成牢固血凝块的出血点冲开，所以对于较大出血效果不理想。由于其作用有限，止血时间长，对于较大出血效果不理想，限制了临床上的推广使用。

如何发挥壳聚糖的优势，克服其止血主要弱的缺点，一直是研究的焦点所在，现有技术中描述了两种方法，一种方法是壳聚糖和其他有止血作用的成分复合，如凝血因子、氯化钙等。如中国专利（申请号为02111437.4）公开了一种壳聚糖、胶原和海藻酸钙复合海绵生物敷料；中国专利（申请号为200310121182.X）公开了一种壳聚糖、明胶和聚乙烯醇生物止血敷料，其在兔肝、脾和兔耳的动物出血模型实验中，止血时间均为60秒左右；中国专利（申请号为200480023481.2）公开了一种壳聚糖作为基质复合物止血性微孔多糖微球的止血剂；另一种方法是将壳聚糖改性制成它的衍生物，例如水溶性羧甲基壳聚糖止血纱布等，水溶性的壳聚糖初始接触血液溶解后，有物理粘附作用，但粘附作用不强，随着水溶性的壳聚糖接触血液完全溶解后，血液会穿透水溶性的壳聚糖渗出，导致止血效果减弱。现有技术中描述的几种方法使壳聚糖止血性能有些提高，但是止血作用仍然有限，止血时间长，对于较大的出血效果还是不理想，并且凝血因子大多数来源于血液，成本较高，同时还存在血液传染病的危险。所以，从发现壳聚糖的止血作用至今，仍然未找到一种理想的壳聚糖止血产品。

本发明利用戊二酸酐对壳聚糖进行羧化，得到一种羧化壳聚糖，该羧化壳聚糖与现有技术中的壳聚糖止血材料对比大大缩短了凝血时间，显示了卓越的止血性能，同时抗菌作用和与组织的粘附性都大大增强。同时利用该羧化壳聚糖制备获得的羧化壳聚糖止血海绵、止血颗粒和止血膜各自具备优良的应用特性。

发明内容

发明内容（一）

本发明提供一种新型羧化壳聚糖的制作方法，目的是为了解决如下技术问题：1、现有壳聚糖敷料凝血时间长，2、吸水性差，对创面的粘附性能差，3、抗菌作用有一些，但是不强。

为达到上述目的，本发明采用技术方案是：

1、在密闭反应容器中加入质量体积浓度为7.5%的戊二酸酐的二甲亚砜溶液，加热至60℃；

2、将2倍于戊二酸酐质量的、脱乙酰度为55%~99%、分子量为20,000~500,000的壳聚糖放入密闭容器中，反应30分钟，对壳聚糖进行羧化，使壳聚糖凝胶的羧化度达到1%~20%；

3、反应后取出壳聚糖，再将其放入25℃的0.1mol/LNaOH溶液反应1小时，然后用乙醇洗涤6次。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，脱乙酰度的计算方式如：《分析化学研究简报》2002年第7期第846~848页，贾之慎、李秀玲所撰写的《酸碱电导滴定法测定壳聚糖脱乙酰度》。

2、上述方案中，所述模具可以是培养皿等类似具有敞口，其它部位密封的器皿。

3、上述方案中，羧化度的定义：每100g壳聚糖羧化之后，羧化基团总质量占产物总质量的比例。

羧化基团的测定方式如《北京化工大学学报》第31卷第2期第14~17页，刘长霞等撰写的《N,O-羧甲基壳聚糖羧化度计算式的修正》。

本发明中，凝胶体系下，壳聚糖的羟基、氨基不可能完全羧化，但羧化度的计算仍以反应完全之后，羧化基团质量占产物总质量的百分比计算。

由于上述方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和技术效果：

1、本发明对壳聚糖进行羧化改性，并使得羧化之后的壳聚糖的止血性能大大提升，止血时间大大缩短；

2、本发明对壳聚糖进行羧化改性，并使得羧化度达到1%~20%，提高吸水性，从而使其创面粘附性能好；

3、本发明对壳聚糖进行羧化改性，获得的羧化壳聚糖具有较强的抗菌作用，比现有壳聚糖材料的抗菌作用更强。

总的来说，通过本发明方法制备的羧化壳聚糖具有止血快、抗菌强、粘附性强和促进愈合的特点，同时也保留了一般壳聚糖止血辅料可生物降解与吸收、以及吸收之后不成栓的特点。

发明内容（二）

本发明还提供了一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血颗粒的制备方法，目的是进一步缩短羧化壳聚糖的凝血时间；用该方法制备获得的羧化壳聚糖颗粒也大大提高了对创面的粘附性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：将羧化壳聚糖溶解到柠檬酸的溶液当中，再溶入适量氯化钙，然后经过喷雾干燥得到羧化壳聚糖止血颗粒。

由于用该方法获得的羧化壳聚糖止血颗粒当中含有固体酸柠檬酸，因此在使用中颗粒遇到创面的水之后，酸将会溶出，这样就在局部营造了一个好的弱酸性环境，能够促进羧化壳聚糖的溶解，进而大大提高了吸水性，使得创面粘附性增强；另外，由于颗粒中存在适量的氯化钙，在止血过程中可以提供一定量的钙离子，因此可以增强凝血作用。

总的来说，通过本发明方法制备的羧化壳聚糖止血颗粒具有止血快、抗菌强、粘附性强和促进愈合的的特点，同时也保留了一般壳聚糖止血辅料可生物降解与吸收、以及吸收之后不成栓的特点。

发明内容（三）

本发明还提供了一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血海绵的制备方法，目的是进一步缩短羧化壳聚糖的凝血时间；用该方法制备获得的羧化壳聚糖止血海绵也大大提高了创面粘附性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：将羧化壳聚糖溶解到柠檬酸的溶液当中，再溶入适量氯化钙，经过冷冻干燥得到羧化壳聚糖止血海绵。

由于用该方法获得的羧化壳聚糖止血海绵当中含有固体酸柠檬酸，因此在使用中颗粒遇到创面的水之后，酸将会溶出，这样就在局部营造了一个好的弱酸性环境，能够促进羧化壳聚糖的溶解，进而大大提高了吸水性，使得创面粘附性增强；由于通过冻干的方法获得了海绵状的止血材料，海绵状也进一步赋予了材料好的吸湿和溶胀性，再加上海绵是一个面，这样对创口的粘附性进一步增强，也能够促进创口的愈合；另外，由于海绵中存在适量的氯化钙，在止血过程中可以提供一定量的钙离子，因此可以增强凝血作用。

总的来说，通过本发明方法制备的羧化壳聚糖止血海绵具有止血快、抗菌强、粘附性强、吸湿性强和促进愈合的特点，同时也保留了一般壳聚糖止血辅料可生物降解与吸收、以及吸收之后不成栓的特点。

发明内容（四）

本发明还提供了一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血膜的制备方法，目的是进一步缩短羧化壳聚糖的凝血时间；用该方法制备获得的羧化壳聚糖止血膜也大大提高了创面粘附性；用该方法制备获得的羧化壳聚糖止血膜也解决了由于对创面的粘附性所引起的周围组织粘连的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

第一步：制备羧化壳聚糖凝胶

将羧化壳聚糖溶解到2%的醋酸溶液当中获得3%（m/v）的羧化壳聚糖溶液，将羧化壳聚糖溶液注入敞口的模具，然后将该模具的敞口用单向渗透膜封闭，再将所述模具浸入沉析液中至壳聚糖完全沉析得到壳聚糖凝胶；其中，所述沉析液是质量浓度为2%的氢氧化钠溶液；所述单向渗透膜为滤纸或者聚丙烯多孔膜；

第二步：交联反应

将第一步制得的羧化壳聚糖凝胶用去离子水洗涤凝胶至中性；再加入到质量浓度为1%的氯化钙中进行交联反应30分钟，然后用去离子水洗涤；

第三步：增塑反应

将第二步制得的交联的羧化壳聚糖凝胶加入到质量体积浓度为5%的丙三醇溶液中进行增塑反应；

第四步：单面乙醇熏蒸

将第三步制得的增塑的羧化壳聚糖凝胶的一面用密封不能通透乙醇分子的模具保护起来，然后将其置于盛有无水乙醇的密闭容器中，但是不接触乙醇液体，熏蒸2小时，取出羧化壳聚糖凝胶，50℃干燥后即得到一面具有自粘贴功能、另外一面无粘结性的羧化壳聚糖止血膜。

由于用该方法获得的羧化壳聚糖止血膜当中交联有适量的氯化钙，在止血过程中可以提供一定量的钙离子，因此可以增强凝血作用；该羧化壳聚糖止血膜经过塑化和单面乙醇熏蒸之后，使得羧化壳聚糖止血膜的一面具有较强的创面粘附性能，而另外一面（乙醇熏蒸面）经过乙醇熏蒸处理之后无粘结性，与周围组织起到隔离作用。

总的来说，通过本发明方法制备的羧化壳聚糖止血膜具有止血快、抗菌强、止血面粘附性强、材料强度高、吸湿性强和促进愈合的特点，同时还具有无粘结性的面，解决了一般材料易引起组织粘连的问题，同时也保留了一般壳聚糖止血辅料可生物降解与吸收、以及吸收之后不成栓的特点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

一种新型羧化壳聚糖的制备方法

（1）在250ml的密闭烧瓶中加入戊二酸酐的二甲亚砜溶液（3g戊二酸酐溶于40ml二甲亚砜），加热至60℃；

（2）将6g的脱乙酰度为55%、分子量为20,000的壳聚糖放入密闭烧瓶中，转子搅拌反应30分钟，对壳聚糖进行羧化；

（3）反应后取出壳聚糖，再将其放入25℃的0.1mol/LNaOH溶液反应1小时，然后用乙醇洗涤6次。

本实施方式所述的羧化壳聚糖止血时间短、可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的贴合度好，其用于兔子耳背动脉出血模型的止血时间为23±6s，应用于兔子腘动脉出血模型的出血时间为81±17s，并且每克羧化壳聚糖吸血量为4.3±0.9g，使其在临床手术的止血和促进创面愈合。

实施例2

一种新型羧化壳聚糖的制备方法

（1）在250ml的密闭烧瓶中加入戊二酸酐的二甲亚砜溶液（3g戊二酸酐溶于40ml二甲亚砜），加热至60℃；

（2）将6g的脱乙酰度为99%、分子量为500,000的壳聚糖放入密闭烧瓶中，转子搅拌反应30分钟，对壳聚糖进行羧化；

（3）反应后取出壳聚糖，再将其放入25℃的0.1mol/LNaOH溶液反应1小时，然后用乙醇洗涤6次。

本实施方式所述的羧化壳聚糖止血时间短、可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的贴合度好，其用于兔子耳背动脉出血模型的止血时间为22±5s，应用于兔子腘动脉出血模型的出血时间为79±12s，并且每克羧化壳聚糖吸血量为4.1±0.7g，使其在临床手术的止血和促进创面愈合。

实施例3

一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血颗粒的制备方法

将1g的羧化壳聚糖溶解到100ml的1%（m/v）柠檬酸的溶液当中，再溶入0.2g的氯化钙，然后常规喷雾干燥机喷雾干燥得到羧化壳聚糖止血颗粒。

本实施方式所述的羧化壳聚糖止血颗粒止血时间短、可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的贴合度好，其用于兔子耳背动脉出血模型的止血时间为21±7s，应用于兔子腘动脉出血模型的出血时间为63±11s，并且每克羧化壳聚糖止血颗粒吸血量为5.1±1.1g，使其在临床手术的止血和促进创面愈合。

实施例4

一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血海绵的制备方法

将1g的羧化壳聚糖溶解到100ml的1%（m/v）柠檬酸的溶液当中，再溶入0.2g的氯化钙，然后常规冷冻干燥机冷冻干燥得到羧化壳聚糖止血海绵。

本实施方式所述的羧化壳聚糖止血海绵的材料抗折性能好，可以多次对折，止血时间短、可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的贴合度好，其用于兔子耳背动脉出血模型的止血时间为17±4s，应用于兔子腘动脉出血模型的出血时间为57±12s，并且每克羧化壳聚糖止血海绵吸血量为6.3±1.3g，使其在临床手术的止血和促进创面愈合。

实施例5

一种利用羧化壳聚糖制备羧化壳聚糖止血膜的制备方法

（1）制备羧化壳聚糖凝胶

将3g羧化壳聚糖溶解到100ml的2%的醋酸溶液当中获得3%（m/v）的羧化壳聚糖溶液，将羧化壳聚糖溶液注入敞口的培模具，然后将该培养皿的敞口用聚丙烯多孔膜封闭，再将所述整个培养皿浸入2%的氢氧化钠溶液沉析液中至壳聚糖完全沉析得到壳聚糖凝胶。

（2）交联反应

将（1）制得的羧化壳聚糖凝胶用去离子水洗涤凝胶至中性，再将其加入到质量浓度为1%的氯化钙当中进行交联反应30分钟，然后用去离子水洗涤。

（3）增塑反应

将（2）制得的交联的羧化壳聚糖凝胶加入到质量体积浓度为5%的丙三醇溶液中进行增塑反应。

（4）单面乙醇熏蒸

将（3）制得的增塑的羧化壳聚糖凝胶的一面用密封不能通透乙醇分子的培养皿密封保护起来，然后将其置于盛有无水乙醇的密闭容器中，但是不接触乙醇液体，熏蒸2小时，取出羧化壳聚糖凝胶，50℃真空或者常压干燥后即得到一面具有自粘贴功能、另外一面无粘结性的羧化壳聚糖止血膜。

本实施方式所述的羧化壳聚糖止血膜的材料抗折性能好，可以多次对折，止血时间短、可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的贴合度好，其用于兔子耳背动脉出血模型的止血时间为22±5s，应用于兔子腘动脉出血模型的出血时间为62±14s，并且每克羧化壳聚糖止血膜吸血量为5.5±1.0g，使其在临床手术的止血和促进创面愈合。

采用下述试验来验证本发明止血材料的有益效果

一、止血材料的吸血量测试：

称取1g实施例1制备的止血材料，将其浸泡在新鲜兔子血液10min后取出，再称总重量，用该总重量减去1，即得到每克止血材料的吸血量。每克止血材料的吸血量为4.3±0.9g。

称取1g实施例2制备的止血材料，将其浸泡在新鲜兔子血液10min后取出，再称总重量，用该总重量减去1，即得到每克止血材料的吸血量。每克止血材料的吸血量为4.1±0.7g。

称取1g实施例3制备的止血颗粒，将其浸泡在新鲜兔子血液10min后取出，再称总重量，用该总重量减去1，即得到每克止血颗粒的吸血量。每克止血颗粒的吸血量为5.1±1.1g。

称取1g实施例4所制备的止血海绵，将其浸泡在新鲜兔子血液10min后取出，再称总重量，用该总重量减去1，即得到每克止血海绵的吸血量。每克止血海绵的吸血量为6.3±1.3g。

称取1g实施例5所制备的止血膜，将其浸泡在新鲜兔子血液10min后取出，再称总重量，用该总重量减去1，即得到每克止血膜的吸血量。每克止血膜的吸血量为5.5±1.0g。

二、动物创伤止血试验：

材料：实施例1-5制备的止血材料、纱布、新西兰大兔子、手术刀片、消毒剪刀、秒表。

实验方法1（兔子耳背动脉止血实验）

（1）取2.5kg左右的新西兰大兔子，随机分组，对兔子耳部脱毛后，实施腹腔注射10%水合氯醛麻醉；

（2）用手术刀片在耳背平面做动脉截断伤口；

（3）将实施例1-5制备的止血材料中的一种0.1g覆盖于伤口上并按压；直至放松无伤口再次出血为止成功，记录止血时间；

（4）实验过程中注意观察兔子的异常表现及其术后恢复情况。

实验方法2（兔子股腘动脉止血实验）

（1）对兔子后腿去毛后将其麻醉，实施腹腔注射10%水合氯醛麻醉；

（2）用手术刀将兔股剖开皮，分离肌肉并将其腘动脉剪断，将实施例1-5制备的止血材料中的一种0.2g填塞到动脉断口处并按压；直至松开无伤口再次出血为止成功，记录止血时间；

（3）实验过程中注意观察兔子的异常表现及其术后恢复情况。

实验方法3（对比实验）

将实验方法1和实验方法2中的止血材料替换为纱布，观察止血效果。采用止血时间、存活率及伤口恢复等评价不同止血材料的止血性能，其结果见表1和表2。

表1不同止血材料对兔耳背动脉的止血性能

止血材料	止血时间（s）	存活率	伤口恢复
				实施例1止血材料	23±6	100%	很好
实施例2止血材料	22±5	100%	很好
				实施例3止血材料	21±7	100%	很好
实施例4止血材料	17±4	100%	很好
				实施例5止血材料	22±5	100%	很好
纱布	97±28	100%	一般

表2不同止血材料对兔腘动脉的止血性能

止血材料	止血时间（s）	存活率	伤口恢复
				实施例1止血材料	81±17	100%	很好
实施例2止血材料	79±12	100%	很好
				实施例3止血材料	63±11	100%	很好
实施例4止血材料	57±12	100%	很好
				实施例5止血材料	62±14	100%	很好
纱布	无法止血	0%	死亡

从表1的结果中可以看出对于兔子耳背动脉出血模型，本发明制备的5种止血材料均表现出优良的止血效果及促进伤口恢复的作用。从表2的结果中可以看出对于兔子腘动脉止血模型，本发明制备的5种止血材料可在1分半钟内止血，保证生物体在止血后存活，而纱布材料无法止血；而且止血海绵更是在1分钟内实现快速止血。

三、止血材料的抑菌作用

（1）抗细菌作用

抗菌活性实验是采用浓度稀释的方法，每次测定重复三次，测试病原菌有大肠杆菌、荧光假单孢菌、金黄色葡萄球、变形杆菌，菌液浓度为10⁵个/mL。分别将实施例1-5制得的止血材料溶于2%（m/v）的醋酸溶液当中，止血材料起始浓度为50.0μg/mL，2倍梯度稀释至0.098μg/mL，等量体积的菌液和测试样品混合培养在96孔板中，细菌培养温度为37℃，培养时间24h后观察，若发现没有菌落形成时为样品最低抗菌浓度，即MIC值。该实验阳性对照为硫酸阿米卡星，2%（m/v）的醋酸溶液作为溶剂对照，止血材料抗菌结果见表3。

表3止血材料的抗菌MIC值（μg/mL）

化合物	大肠杆菌	荧光假单孢菌	金黄色葡萄球	变形杆菌
					实施例1止血材料	6.25	6.25	0.78	3.13
实施例2止血材料	3.13	3.13	6.25	3.13
					实施例3止血材料	3.13	3.13	0.78	6.25
实施例4止血材料	3.13	3.13	3.13	3.13
					实施例5止血材料	6.25	3.13	6.25	6.25
溶剂对照	>50	>50	>50	>50
					硫酸阿米卡星	0.39	0.39	0.78	0.78

结论：实施例1-5的止血材料具有较强的抗细菌活性。

（2）抗真菌活性

抗人体真菌活性实验是采用浓度稀释的方法，每次测定重复三次，测试病原菌有红色毛藓菌、羊毛状小孢子菌和断发藓菌，菌液浓度为10⁵个/mL。分别将实施例1-5制得的止血材料溶于2%（m/v）的醋酸溶液当中，止血材料起始浓度为50.0μg/mL（2％的醋酸溶液），2倍梯度稀释至0.098μg/mL，等量体积的菌液和测试样品混合培养在96孔板中，人体真菌培养温度分别为28℃，培养时间24h后观察，若发现没有菌落形成时为样品最低抗人体真菌浓度，即MIC值。该实验阳性对照为酮康唑，止血材料抗人体真菌结果见表4。

表4止血材料的抗人体真菌MIC值（μg/mL）

化合物	红色毛藓菌	羊毛状小孢子菌	断发藓菌球
				实施例1止血材料	12. 5	12. 5	12. 5
实施例2止血材料	6.25	12. 5	12. 5
				实施例3止血材料	12. 5	12. 5	12. 5
实施例4止血材料	6.25	12. 5	6.25
				实施例5止血材料	6.25	6.25	12. 5
溶剂对照	>50	>50	>50
				酮康唑	3.13	3.13	3.13

结论：实施例1-5的止血材料具有较强的抗真菌活性。

Claims (3)

1.一种羧化壳聚糖止血膜的制备方法，其特征在于：由下列步骤组成：

第一步：制备羧化壳聚糖凝胶

在密闭反应容器中加入质量体积浓度为7.5%g/ml的戊二酸酐的二甲亚砜溶液，加热至60℃，将2倍于戊二酸酐质量的、脱乙酰度为55%~99%、分子量为20,000~500,000的壳聚糖放入密闭容器中反应30分钟后取出，再将其放入25℃的0.1mol/LNaOH溶液反应1小时，将其取出即获得羧化壳聚糖；

将羧化壳聚糖溶解到2%的醋酸溶液当中，将羧化壳聚糖溶液注入敞口的模具，然后将该模具的敞口用单向渗透膜封闭，再将所述模具浸入沉析液中至壳聚糖完全沉析得到壳聚糖凝胶；其中，所述沉析液是质量浓度为2%的氢氧化钠溶液；所述单向渗透膜为滤纸或者聚丙烯多孔膜；

第二步：交联反应

将第一步制得的羧化壳聚糖凝胶用去离子水洗涤凝胶至中性；再加入到质量浓度为1%的氯化钙中进行交联反应30分钟，然后用去离子水洗涤；

第三步：增塑反应

将第二步制得的交联的羧化壳聚糖凝胶加入到质量体积浓度为5%的丙三醇溶液中进行增塑反应；

第四步：单面乙醇熏蒸

将第三步制得的增塑的羧化壳聚糖凝胶的一面用密封不能通透乙醇分子的模具保护起来，然后将其置于盛有无水乙醇的密闭容器中，但是不接触乙醇液体，熏蒸2小时，取出羧化壳聚糖凝胶，50℃干燥后即得到一面具有自粘贴功能、另外一面无粘结性的羧化壳聚糖止血膜。

2.根据权利要求1所述的一种羧化壳聚糖止血膜的制备方法，其特征在于：所述羧化壳聚糖溶液的质量体积浓度为3%g/ml。

3.根据权利要求1所述的一种羧化壳聚糖止血膜的制备方法，其特征在于：所述第四步的干燥是在真空或者常压条件下进行。