WO2021091040A1 - 버섯 또는 진균 유래 키토산, 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔 및 그 제조방법 - Google Patents

버섯 또는 진균 유래 키토산, 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔 및 그 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • Chitosan is a compound obtained by deacetylating the chitin of the exoskeleton of crustaceans such as crabs and shrimp, and has been known to promote hemostatic and antibacterial action, and to promote wound regeneration by showing deodorization, moisture and exudate absorption effects. It is attracting attention as a material.
  • chitosan is widely used as a wound healing agent, artificial skin, embolic material, blood coagulant, artificial kidney membrane, biodegradable surgical suture, and antibacterial material, and many studies have been conducted to quickly recover wounds as a hemostatic and dressing material. It's going on.
  • Animal-derived materials such as animal chitosan must be tested for inactivation of viruses during the process due to concerns about common virus infections, and potential issues regarding their safety are constantly being raised. It is managed in the necessary 3rd level.
  • the quality of animal chitosan fluctuates according to the time of collection of raw materials, and particularly, the quality fluctuates severely according to the biorhythm of the organism according to the season and spawning season.
  • chitosan Due to the characteristics of chitosan, there is a technology in which chitosan is applied to a gauze-type patch, or an additive such as a crosslinking agent is separately used to use it in the form of a polymer composite.
  • An object of the present invention is to solve the problems of the prior art and technical problems that have been requested from the past.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a hydrogel using chitosan derived from mushrooms or fungi or derivatives thereof in an economical and efficient manner.
  • Another object of the present invention is to provide a hydrogel using mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof that exhibits excellent wound healing effect using mushroom or fungi-derived chitosan, as well as excellent biocompatibility and applicability.
  • Another object of the present invention is to provide a medical dressing containing as an active ingredient a hydrogel using chitosan derived from mushrooms or fungi or derivatives thereof.
  • step (B) after mixing in step (a), adding and mixing a basic aqueous solution so that the pH becomes 6.1 to 6.24;
  • step (C) after mixing in step (b), sterilizing at 0.01 to 0.2 Mpa;
  • Including mushrooms or fungi-derived chitosan or a derivative thereof is crosslinked by self-assemble to provide a method for producing a hydrogel using chitosan derived from mushrooms or fungi, or a derivative thereof, characterized in that the viscosity is 5000 to 55000 cP. to provide.
  • the molecular weight of the mushroom or fungi-derived chitosan may be 3,000 to 30,000 kDa.
  • step (a) 2 to 5 parts by weight of mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof are added to 100 parts by weight of distilled water, followed by stirring, and then an acidic aqueous solution may be added and mixed.
  • the acidic aqueous solution may be mixed by adding 0.5 to 1.0 parts by weight based on 100 parts by weight of distilled water.
  • the acidic aqueous solution is one selected from the group consisting of hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, acetic acid, tartaric acid, salicylic acid, citric acid, hydroxy acetic acid, propionic acid, lactic acid, glyceric acid, ascorbic acid, adipic acid, and malic acid, or a mixed solution thereof.
  • hydrochloric acid nitric acid
  • sulfuric acid acetic acid
  • tartaric acid salicylic acid
  • citric acid hydroxy acetic acid
  • propionic acid lactic acid, glyceric acid, ascorbic acid, adipic acid, and malic acid, or a mixed solution thereof.
  • the basic aqueous solution may be one selected from the group consisting of sodium hydroxide, ammonium hydroxide, potassium hydroxide, and hydroxide phosphate, or a mixed solution thereof.
  • a hydrogel using chitosan derived from mushrooms or fungi or derivatives thereof characterized in that chitosan derived from mushrooms or fungi or derivatives thereof are crosslinked by self-assemble to have a pH of 6.1 to 6.24 and a viscosity of 5000 to 55000 cP. to provide.
  • the mushroom or fungal-derived chitosan derivative is composed of carboxymethyl chitosan, carboxyethyl chitosan, cyanoethyl chitosan, hydroxyethyl chitosan, hydroxypropyl chitosan, glycerylated chitosan, glycol chitosan, succinyl chitosan, carboxymethyl chitosan succinimide. It may be one or a mixture of two or more selected from the group.
  • the hydrogel may be used for hemostasis, sterilization, prevention and suppression of scars, or wound healing and recovery of cuts, abrasions, burns, wounds, bedsores, skin diseases or post-operative wounds.
  • the present invention provides a medical dressing, characterized in that it contains the hydrogel as an active ingredient and has one or more uses selected from the group consisting of hemostasis, wound coating, and adhesion prevention.
  • the present invention provides a hydrogel having excellent biocompatibility and spreadability through a process of crosslinking mushrooms or fungi-derived chitosan or its derivatives by self-assemble, and various additives including conventional crosslinking agents cause It is excellent in terms of safety as it can block the possibility of occurrence of allergenic, irritants, toxic, and endocrine disrupters.
  • the hydrogel using chitosan or its derivatives derived from mushrooms or fungi provides an appropriate moist environment to form a semi-permeable membrane on the wound after drying to maintain proper moisture permeability required for tissue regeneration, and prevents foreign substances such as bacteria and fungi. It blocks the back, so it is excellent for healing and protecting wounds. Moreover, it exhibits excellent antibacterial and anti-inflammatory properties to prevent secondary infections, and to promote damaged tissues, and has excellent deodorizing effects.
  • Hydrogels using chitosan derived from mushrooms or fungi or derivatives thereof according to the present invention are used for acute or chronic wounds, burns, bedsores, diabetic feet or laparoscopy, dentistry of various body tissues such as spine, brain, eyes, ears, nose, cervix, etc. It can be used for cuts, abrasions, burns, wounds, bedsores, bleeding, sterilization, scar prevention and suppression, or wound healing and recovery of skin diseases or post-operative wounds in various surgical areas such as for procedures.
  • Example 1 is a graph evaluating the anti-inflammatory performance of Example 2 in Experimental Example 4.
  • Figures 2 (a) to (d) are photographs of microscopic observation of the anti-inflammatory cells of Example 2 (a, b) and control groups (c, d) in Experimental Example 5.
  • chitosan has been widely used as a conventional medical material.
  • animal chitosan obtained from crustaceans such as crabs and shrimps cannot be free from safety problems such as viral infections and allergens, and the quality is often inconsistent, making them unsuitable for medical use.
  • step (B) after mixing in step (a), adding and mixing a basic aqueous solution so that the pH becomes 6.1 to 6.24;
  • step (C) after mixing in step (b), sterilizing at 0.01 to 0.2 Mpa;
  • Including mushrooms or fungi-derived chitosan or a derivative thereof is crosslinked by self-assemble to provide a method for producing a hydrogel using chitosan derived from mushrooms or fungi, or a derivative thereof, characterized in that the viscosity is 5000 to 55000 cP. to provide.
  • muscle or fungi-derived chitosan is chitosan obtained by physicochemical treatment of mushrooms or fungi, and its obtaining route is known in the art, and thus will be omitted.
  • Mushroom or fungi-derived chitosan can be applied more safely to the human body as it is a second grade that does not require clinical in the CE system due to the nature of the material derived from non-animals. Moreover, since mushrooms are grown under the same conditions in the house, chitosan can be supplied and supplied with the same quality throughout the year. Accordingly, the present invention is excellent in biocompatibility because it can fundamentally block the problems raised by the use of animal chitosan by using chitosan derived from mushrooms or fungi.
  • the mushrooms may be, for example, shiitake mushrooms, wood ear mushrooms, enoki mushrooms, min strand mushrooms, and Agaricus mushrooms, but are not limited thereto.
  • the fungi Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Lentinus edodes, Pleurotus sajo-caju and the yeast Zygosaccharomyces rouxii may be, but are not limited thereto.
  • the present invention uses chitosan derived from mushrooms or fungi having a molecular weight of 3,000 to 30,000 kDa, and exhibits excellent wound healing effect compared to animal chitosan.
  • animal chitosan exhibits a high molecular weight exceeding about 30,000 kDa
  • mushroom or fungi-derived chitosan according to the present invention exhibits a molecular weight of 3,000 to 30,000 kDa.
  • Mushroom or fungi-derived chitosan having such a low molecular weight is easily degraded in vivo, and has high effects such as hemostasis and antibacterial, so that it can exhibit superior wound healing effects compared to the prior art.
  • the mushroom or fungal-derived chitosan derivative is not limited as long as it is a derivative that can be synthesized from the mushroom or fungi-derived chitosan by a general known method.
  • the mushroom or fungal-derived chitosan derivative is carboxymethyl chitosan, carboxyethyl chitosan, cyanoethyl chitosan, hydroxyethyl chitosan, hydroxypropyl chitosan, glycerylated chitosan, glycol chitosan, succinyl chitosan, carboxymethyl chitosan succinate It may be one or a mixture of two or more selected from the group consisting of imides.
  • mushroom or fungi-derived chitosan or its derivatives Due to the high molecular properties of mushroom or fungi-derived chitosan or its derivatives, first, distilled water is added to disperse it evenly, and then an acidic aqueous solution is added to mix it, and cations are introduced into the amino group of mushroom or fungi-derived chitosan or its derivatives, so that it can be effectively dissolved.
  • mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof is added in less than 2 parts by weight based on 100 parts by weight of distilled water, it is difficult to obtain the intended effect of the present invention sufficiently, and when added in excess of 5 parts by weight, mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof Due to its high molecular weight, it is not easy to disperse in distilled water and economical is poor, which is not preferable. Specifically, 2.5 to 4 parts by weight of mushroom or fungal-derived chitosan or a derivative thereof may be added to 100 parts by weight of distilled water.
  • the acidic aqueous solution may be mixed by adding 0.5 to 1.0 parts by weight based on 100 parts by weight of distilled water.
  • the acidic aqueous solution is, for example, one selected from the group consisting of hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, acetic acid, tartaric acid, salicylic acid, citric acid, hydroxy acetic acid, propionic acid, lactic acid, glyceric acid, ascorbic acid, adipic acid, and malic acid, or It may be a mixed solution of these, but is not limited thereto. Specifically, it may be acetic acid.
  • a basic aqueous solution is added so that the pH becomes 6.1 to 6.24, mixed, and then sterilized at 0.01 to 0.2 Mpa to allow mushroom or fungi-derived chitosan or its derivatives to be self-assembled. It can be crosslinked to prepare a hydrogel having a specific viscosity. Specifically, it may be 0.1 to 0.2 Mpa.
  • the inventors of the present invention confirmed that when the pH of chitosan is higher than a certain level, the viscosity of the chitosan increases as the pH increases, indicating a state of a hydrogel having an appropriate viscosity, unlike generally known, even if high-pressure steam sterilization is performed. This is because amines in the chitosan molecular chain receive cations at low pH to show solubility, but when pH increases, cations are taken away and exhibited insolubility, resulting in hydrogelation.
  • the final product When the pH is less than 6.1, the final product exhibits a thin formulation, resulting in runoff, and when the pH exceeds 6.24, agglomeration occurs, and the application properties of the final product may be very poor.
  • the pressure when the pressure is less than 0.01 Mpa, physical cross-linking due to self-assemble of the chitosan molecular chain does not occur sufficiently, and when it exceeds 0.2 Mpa, manufacturing processability is deteriorated, which is not preferable. not. Specifically, it may be 0.1 to 0.2 Mpa.
  • the pH is adjusted according to the concentration and amount of the basic aqueous solution, and the autoclave conditions are adjusted to determine the viscosity within the above range according to the body part and condition to be applied.
  • the molecular chain of chitosan or its derivatives having a specific pH is crosslinked due to self-assemble, and at the same time, impurities such as bacteria are removed, thereby exhibiting excellent human compatibility. If it is out of the locking range, the desired effect cannot be exhibited, which is not preferable.
  • the present invention is a hydrogel using a mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof having a pH of 6.1 to 6.24 and a viscosity of 5000 to 55000 cP by crosslinking mushroom or fungi-derived chitosan or a derivative thereof by self-assemble Provides.
  • the inventors of the present invention confirmed that when the pH of chitosan is higher than a certain level, the viscosity of the chitosan increases as the pH increases, indicating a state of a hydrogel having an appropriate viscosity, unlike generally known, even if high-pressure steam sterilization is performed. This is because amines in the chitosan molecular chain receive cations at low pH to show solubility, but when pH increases, cations are taken away and exhibited insolubility, resulting in hydrogelation.
  • the hydrogel When the pH is less than 6.1, the hydrogel exhibits a dilute formulation and flows down, and when the pH exceeds 6.24, agglomeration occurs, and the application properties of the final product may be very poor.
  • the present invention is excellent in biocompatibility because it can fundamentally block the problems raised by the use of the animal chitosan by using chitosan derived from mushrooms or fungi. Mushroom or fungi-derived chitosan can be applied more safely to the human body as it is a second grade that does not require clinical in the CE system due to the nature of the material derived from non-animals. Moreover, since mushrooms are grown under the same conditions in the house, chitosan can be supplied and supplied with the same quality throughout the year.
  • the mushrooms may be, for example, shiitake mushrooms, wood ear mushrooms, enoki mushrooms, min strand mushrooms, and Agaricus mushrooms, but are not limited thereto.
  • the fungi Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Lentinus edodes, Pleurotus sajo-caju and the yeast Zygosaccharomyces rouxii may be, but are not limited thereto.
  • the present invention uses chitosan derived from mushrooms or fungi having a molecular weight of 3,000 to 30,000 kDa, and exhibits excellent wound healing effect compared to animal chitosan.
  • animal chitosan exhibits a high molecular weight exceeding about 30,000 kDa
  • mushroom or fungi-derived chitosan according to the present invention exhibits a molecular weight of 3,000 to 30,000 kDa.
  • Mushroom or fungi-derived chitosan having such a low molecular weight is easily degraded in vivo, and has high effects such as hemostasis and antibacterial, so that it can exhibit superior wound healing effects compared to the prior art.
  • the mushroom or fungal-derived chitosan derivative is not limited as long as it is a derivative that can be synthesized from the mushroom or fungi-derived chitosan by a general known method.
  • the mushroom or fungal-derived chitosan derivative is carboxymethyl chitosan, carboxyethyl chitosan, cyanoethyl chitosan, hydroxyethyl chitosan, hydroxypropyl chitosan, glycerylated chitosan, glycol chitosan, succinyl chitosan, carboxymethyl chitosan succinate It may be one or a mixture of two or more selected from the group consisting of imides.
  • hydrogel using chitosan or derivatives thereof derived from mushrooms or fungi according to the present invention can be used for various purposes.
  • Chitosan having a molecular weight of 3,000 to 30,000 derived from mushrooms was prepared by Beijing Wisapple Biotech.
  • Chitosan having a molecular weight of 3,000 to 30,000 derived from mushrooms was prepared by Beijing Wisapple Biotech.
  • a hydrogel was prepared under the same conditions as in Example 1, and then about 3 g of hydrogel was applied on the top of the acrylic plate inclined at 45° to observe the flow pattern, and the applied gel was used as a general ointment or cream. The application test was conducted by observing whether the application was evenly applied when applied by hand.
  • the hydrogels according to Examples 1 to 3 exhibit very excellent application properties even after autoclaving.
  • the hydrogel agglomeration phenomenon according to Example 4 occurs slightly, but there is little difference in the feeling of use in terms of actual spreadability, so it can be seen that it is a level that can be applied to a product in general.
  • the hydrogels according to Comparative Examples 1 to 5 are thin and run down as a whole, resulting in lower application properties, which is inconvenient to apply. It can be seen that the hydrogel according to Comparative Examples 6 and 7 has a lumping phenomenon, so that the application property is very poor and the viscosity is very high.
  • the membrane moisture permeability of the hydrogel according to Example 2 was evaluated.
  • thermo-hygrostat maintained at (37 ⁇ 1)°C, RH ⁇ 20%. After 24 hours, take the device out of the thermo-hygrostat and measure the weight (W 2 ).
  • the moisture permeability of the hydrogel according to Example 2 satisfies the moisture permeability of 2000 to 2500, which must be satisfied when the medical device is approved for the corresponding product. This is because the hydrogel according to Example 2 forms a semi-permeable membrane on the wound after drying to maintain an appropriate moisture permeability required for tissue regeneration. Since this semi-permeable membrane blocks foreign substances such as bacteria and fungi, it is excellent for wound recovery and protection.
  • the concentration reduction rate of the bacteria was measured 24 hours after the initial inoculation for 5 kinds of pathogens (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA, Candida) at 37°C, and is shown in Table 3 below.
  • the hydrogel of Example 2 has a bacterial reduction rate of 99.9% against 5 pathogens, and in particular, exhibits excellent antibacterial activity against MRSA (antibiotic-resistant bacteria). This is because the positive charge of chitosan in the gel interacts with anions present in the pathogen cell membrane to inhibit the proliferation of pathogens or destroy the cell membrane to lead to death.
  • silver (Ag + ) or povidone iodine is often used for antimicrobial action, but there is a problem that it is irritating to tissue cells and can cause pain to the patient.
  • the hydrogel according to Example 2 has low cytotoxicity as well as remarkably low biological stimulation, so it does not cause pain and can be preferably used for the human body.
  • a pig animal test was conducted to verify the anti-inflammatory effect by measuring the expression level of inflammatory cytokines. After applying the product to the site causing chronic wound, the skin tissue of the sample application site was collected and the mRNA expression levels of the pro-inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ were measured and the result was measured. It is shown in Figure 1 below.
  • the control group was used as a control group and analyzed by a relative quantification method.
  • RNA is extracted using Chloroform.
  • this RNA is not used and newly extracted and used.
  • RNA concentration (RNA 260nm OD value-blank 260nm OD value) x dilution ratio x RNA constant value
  • cDNA Complementary DNA
  • the synthesized cDNA is stored at -20°C.
  • the hydrogel according to Example 2 when compared to the control group, the hydrogel according to Example 2 showed an expression pattern of 36% of IL-1 ⁇ , 43% of IL-6, and 66% of TNF- ⁇ . Showed the expression pattern of.
  • the hydrogel according to Example 2 when compared with the control group, inhibits the expression of the tested three cytokines, it can be confirmed that it effectively acts on inflammation inhibition.
  • the fabricated slide was observed through Hematoxylin and Eosin (H&E) staining.
  • FIG. 2 it can be observed that in the control group (FIGS. 2(c) and 2(d)), a lot of inflammatory cells are distributed and the recovery of tissues is delayed.
  • the hydrogel according to Example 2 Figs. 2(a) and 2(b)
  • Figs. 2(a) and 2(b) when the hydrogel according to Example 2 is observed in inflammatory cells, only macrophages exist, and cells that are infiltered around blood vessels are observed. It can be confirmed that it is not effective in suppressing inflammation.
  • Example 2 The deodorization performance of normal Gauze was evaluated in Example 2 and as a control group.
  • the gas detection tube method is used.
  • the hydrogel according to Example 2 adsorbs ammonia molecules at a very high value of 99.8% or more.
  • Molecules such as ammonia that cause odor in the human body are adsorbed by interacting with the positive charge of the mushroom-derived chitosan hydrogel according to Example 2, wherein the lone pair of electrons present in the nitrogen contains nitrogen (N).
  • N nitrogen
  • a series of actions caused by ammonia caused by proteolysis of the wound site namely, changes in the acidity (pH) of cells, disruption of cellular energy metabolism (ATP production), and inhibition of neurotransmission production, are largely a factor that interferes with tissue regeneration.
  • By removing ammonia from the wound it can induce tissue regeneration and promote wound healing.

Abstract

본 발명은, (가) 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체에 산성 수용액을 가하여 혼합하는 단계; (나) 상기 단계(가)의 혼합 후, pH가 6.1 내지 6.24가 되도록 염기성 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및 (다) 상기 단계(나)의 혼합 후, 0.01 내지 0.2 Mpa에서 멸균 처리하는 단계; 를 포함하여 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 점도가 5000 내지 55000 cP인 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법 및 이에 의해 생체 적합성 및 발림성이 뛰어나고 항균력, 항염증력, 탈취 효과가 우수한 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 제공한다.

Description

버섯 또는 진균 유래 키토산, 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔 및 그 제조방법
본 발명은 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔 및 그 제조방법에 관한 것으로 상세하게는, 버섯 또는 진균 유래 키토산을 이용하여 우수한 상처 치료 효과를 나타낼 뿐만 아니라 생체 적합성 및 발림성이 뛰어난 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔 및 그 제조방법에 관한 것이다.
키토산은 게, 새우 등의 갑각류의 외골격의 키틴질을 탈아세틸화하여 수득되는 화합물로, 지혈 및 항균 작용을 나타내고, 탈취, 수분 및 삼출물 흡수 효과를 나타내어 상처 재생을 촉진하는 것으로 알려진바 1990 년대부터 의료용 재료로서 주목받고 있다.
현재 키토산을 상처 치유제, 인공피부, 색전성 재료, 혈액 응고제, 인공 신장막, 생분해성 수술용 봉합사, 항균성 재료 등에 다양하게 이용하고 있으며, 지혈 및 드레싱 재료로써 상처를 빠르게 회복시키기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.
그러나, 최근 게, 새우 등 갑각류로부터 수득되는 동물성 키토산에 대한 안전성 문제가 지속적으로 제기되고 있다.
동물성 키토산과 같은 동물에서 유래한 소재는 인수공통의 바이러스 감염 등에 대한 우려 때문에 공정 중 바이러스 불활성화 시험이 필수적으로 이루어져야 하고, 그 안전성에 대한 잠재적인 문제가 끊임없이 제기되고 있는 바 CE 등급체계에서도 임상이 필요한 3등급으로 관리되고 있다.
또한, 동물성 키토산은 원료의 채취시기에 따라 품질의 변동이 발생하며, 특히 계절의 차이와 산란기 등에 따른 생물의 바이오리듬에 따라 품질의 변동이 심하다.
더욱이, 전 세계 인구 중 약 3억 명이 갑각류 알러지가 있는 것으로 보고되는 상황에서 갑각류에서 유래한 키토산에 대한 문제 역시 끊임없이 제기되고 있다. 갑각류 알러지는 갑각류의 특정 단백질에 의해 유발되지만, 동물성 키토산에 의한 잠재적인 알러지 유발 우려가 점차 증가하고 있다.
한편, 키토산을 의료용 재료로써 안전하게 사용하기 위해 그 외에 해결해야 할 많은 과제들이 남아 있으며, 이를 해결하기 위한 일환으로 최종 단계에서 멸균 처리를 진행하기도 한다.
그러나, 키토산은 고압 증기 멸균 시 고분자 사슬이 끊어져 분자량이 감소하게 되므로 최종적으로 점도가 감소하는 것으로 알려졌다(C Jarry, Effects of Steam Sterilization on Thermogelling Chitosan-Based Gels, Journal of Biomedical Materials Research, 58, 1, (2001) p127-162)
이러한 키토산의 특성으로 종래 키토산을 거즈 형태의 패치에 적용하거나, 가교제 등 첨가물을 별도로 사용하여 고분자 복합체 형태로 사용하는 기술이 있다.
그러나, 거즈 형태의 패치의 경우 습윤 유지 및 세균 침입에 취약할 뿐만 아니라 신생 조직 증식 및 세포 기능 활성이 저하되는 단점이 있고, 가교제 등 첨가물을 별도로 사용한 고분자 복합체 형태의 경우 첨가물에 의한 알러지 유발 가능성이 있고 제조 공정의 단순화에 따른 비용 절감 효과가 떨어지는 문제점이 있다.
이에 동물성 키토산이 가지는 문제를 근본적으로 해결하면서도 의료용 재료로써 키토산의 인체 적합성을 증진하여, 키토산이 나타내는 다양한 물성을 안전하고 효과적으로 활용할 수 있는 기술 개발이 필요하다.
<선행기술 문헌>
C Jarry, Effects of Steam Sterilization on Thermogelling Chitosan-Based Gels, Journal of Biomedical Materials Research, 58, 1, (2001) p127-162
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 경제적이고 효율적인 방법으로 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 버섯 또는 진균 유래 키토산을 사용하여 우수한 상처 치료 효과를 나타낼 뿐만 아니라 생체 적합성 및 발림성이 뛰어난 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 유효 성분으로 함유하는 의료용 드레싱을 제공하는 것이다.
본 발명은,
(가) 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체에 산성 수용액을 가하여 혼합하는 단계;
(나) 상기 단계(가)의 혼합 후, pH가 6.1 내지 6.24가 되도록 염기성 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
(다) 상기 단계(나)의 혼합 후, 0.01 내지 0.2 Mpa에서 멸균 처리하는 단계;
를 포함하여 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 점도가 5000 내지 55000 cP인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 버섯 또는 진균 유래 키토산의 분자량은 3,000 내지 30,000 kDa일 수 있다.
상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 단계(가)는 증류수 100 중량부에 대해 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 2 내지 5 중량부 가하여 교반한 후, 산성 수용액을 가하여 혼합할 수 있다.
상기 단계(가)는 상기 산성 수용액은 증류수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 1.0 중량부를 가하여 혼합할 수 있다.
상기 산성 수용액은 염산, 질산, 황산, 아세트산, 주석산, 살리실산, 시트르산, 하이드록시 아세트산, 프로피온산, 젖산, 글리세린산, 아스코르브산, 아디픽산, 및 말산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액일 수 있다.
상기 염기성 수용액은 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 수산화인산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액일 수 있다.
상기 멸균 처리는 100 내지 150℃로 10 내지 20분 동안 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은,
버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 pH가 6.1 내지 6.24이고 점도가 5000 내지 55000 cP인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 제공한다.
상기 버섯 또는 진균 유래 키토산의 분자량은 3,000 내지 30,000 kDa일 수 있다.
상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 하이드로겔은 자상, 찰과상, 화상, 창상, 욕창, 피부 질환 또는 수술 후 상처 부위에 대한 지혈, 살균, 흉터 방지 및 억제, 또는 상처 치유 및 회복의 용도로 이용될 수 있다.
본 발명은, 상기 하이드로겔을 유효 성분으로 함유하여 지혈, 창상 피복 및 유착 방지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용도를 가지는 것을 특징으로 하는 의료용 드레싱을 제공한다.
본 발명은 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교시키는 과정을 통해 생체 적합성 및 발림성이 우수한 하이드로겔을 제공하는 바, 종래 가교제를 포함하는 다양한 첨가물들이 유발하는 하는 알러지(allergenic), 피부자극(irritants), 유독성(toxic), 내분비 교란(endocrine disrupters) 등의 발생 가능성을 차단할 수 있어 안전성 측면에서 우수하다.
본 발명에 따른 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔은 적절한 습윤 환경을 제공하여 건조 후 상처 부위에 반투과성 막을 형성하여 조직재생에 필요한 적절한 투습도를 유지시켜주며 세균 및 진균 등의 외부 이물질을 등을 차단하므로 상처 회복 및 보호에 탁월하다. 더욱이, 우수한 항균력, 항염증력을 나타내어 2차 감염을 예방하고 손상된 조직의 촉진에 유리하게 작용하고, 탈취 효과 또한 뛰어나다
본 발명에 따른 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔은 척추, 뇌, 눈, 귀, 코, 자궁경부 등 각종 신체 조직 부위의 급성 또는 만성 창상, 화상, 욕창, 당뇨발 또는 복강경, 치과 시술용 등 다양한 외과 수술 영역 등에서 자상, 찰과상, 화상, 창상, 욕창, 피부 질환 또는 수술 후 상처 부위에 대한 지혈, 살균, 흉터 방지 및 억제, 또는 상처 치유 및 회복의 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 실험예 4에서 실시예 2의 항염 성능을 평가한 그래프이다; 및
도 2(a) 내지(d)는 실험예 5에서 실시예 2(a, b) 및 대조군(c, d)의 항염증세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
앞서 설명한 바와 같이, 키토산은 종래 의료용 재료로써 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 게, 새우 등 갑각류에서 수득되는 동물성 키토산은 인수공통의 바이러스 감염, 알러지 유발 가능성 등 안전성에 대한 문제에서 자유로울 수 없고 품질이 일정하지 않은 경우가 많아 의료용으로 사용하기에 부적합한 면이 존재했다.
이에, 본 발명은
(가) 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체에 산성 수용액을 가하여 혼합하는 단계;
(나) 상기 단계(가)의 혼합 후, pH가 6.1 내지 6.24가 되도록 염기성 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
(다) 상기 단계(나)의 혼합 후, 0.01 내지 0.2 Mpa에서 멸균 처리하는 단계;
를 포함하여 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 점도가 5000 내지 55000 cP인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 "버섯 또는 진균 유래 키토산"은 버섯 또는 진균을 물리화학적으로 처리하여 수득한 키토산으로 이의 수득 경로는 당업계에 공지되어 있는 바 이하 생략한다.
본 발명에서 "버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체"는 버섯에서 유래한 키토산, 진균에서 유래한 키토산, 버섯에서 유래한 키토산의 유도체, 또는 진균에서 유래한 키토산의 유도체를 의미한다.
버섯 또는 진균 유래 키토산은 비동물에서 유래하는 소재의 특성상 CE 등급체계에서 임상이 불필요한 2등급으로 보다 안전하게 인체에 적용 가능하다. 더욱이, 버섯은 하우스의 동일 조건에서 재배되므로 연중 같은 품질로 키토산 수급이 가능한 장점이 있다. 이에, 본 발명은 버섯 또는 진균에서 유래한 키토산을 사용하여 동물성 키토산 사용으로 인해 제기되는 문제를 원천적으로 차단할 수 있으므로 생체 적합성이 뛰어나다.
상기 버섯은 예를 들어, 표고 버섯, 목이 버섯, 팽이 버섯, 민가닥 버섯, 아가리쿠스 버섯일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진균류인 Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Lentinus edodes, Pleurotus sajo-caju와 효모인 Zygosaccharomyces rouxii일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 분자량이 3,000 내지 30,000 kDa인 버섯 또는 진균 유래 키토산을 사용하여 동물성 키토산 대비 우수한 상처 치료 효과를 나타낸다. 구체적으로, 동물성 키토산의 경우 약 30,000 kDa 초과하는 높은 분자량을 나타내나, 본 발명에 따른 버섯 또는 진균 유래 키토산은 3,000 내지 30,000 kDa 분자량을 나타낸다. 이러한 낮은 분자량을 가지는 버섯 또는 진균 유래 키토산은 생체 내 분해가 쉽게 이루어지며, 지혈, 항균 등의 효과가 높으므로 종래 대비 우수한 상처 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 버섯 또는 진균 유래 키토산의 유도체는 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산에서 일반적인 공지의 방법으로 합성할 수 있는 유도체라면 제한이 없다. 예를 들어, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 단계(가)에서 증류수 100 중량부에 대해 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 2 내지 5 중량부 가하여 교반한 후, 산성 수용액을 가하여 혼합할 수 있다.
버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체의 고분자적 특성으로 먼저, 증류수를 가하여 골고루 분산시킨 후 산성 수용액을 가하여 혼합하는 경우 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체의 아미노기에 양이온을 도입되어 효과적으로 용해될 수 있다.
버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 증류수 100 중량부에 대해 2 중량부 미만으로 첨가될 경우 본 발명이 의도한 효과를 충분히 얻기 어려우며, 5 중량부를 초과하여 첨가될 경우 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체의 고분자적 특성으로 증류수 내 분산이 쉽게 이루어지지 않고 경제성이 떨어지는 바 바람직하지 않다. 상세하게는 증류수 100 중량부에 대해 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 2.5 내지 4 중량부를 가할 수 있다.
상기 산성 수용액은 증류수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 1.0 중량부를 가하여 혼합할 수 있다.
상기 산성 수용액의 양이 증류수 100 중량부를 기준으로 0.5 중량부 미만일 경우 분산되어 있는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체의 용해가 충분히 이루어지기 힘들고 1.0 중량부를 초과할 경우 pH가 필요 이상으로 낮아져 그 이후 단계인 pH 조절을 위해 많은 양의 염기성 수용액이 사용되어야 하는 등의 제조 공정상의 불필요함을 야기한다. 상세하게는, 분산액 100 중량부를 기준으로 산성 수용액을 0.6 내지 0.8 중량부를 가할 수 있다.
상기 산성 수용액은, 예를 들어, 염산, 질산, 황산, 아세트산, 주석산, 살리실산, 시트르산, 하이드록시 아세트산, 프로피온산, 젖산, 글리세린산, 아스코르브산, 아디픽산, 및 말산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상세하게는 아세트산일 수 있다.
상기 단계(나) 및 (다)에서 pH가 6.1 내지 6.24가 되도록 염기성 수용액을 가하고 혼합 후, 0.01 내지 0.2 Mpa에서 멸균 처리하여 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 특정 점도를 가지는 하이드로겔을 제조할 수 있다. 상세하게는 0.1 내지 0.2 Mpa일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 키토산은 고압 증기 멸균시 고분자 사슬이 끊어져 분자량이 감소하게 되므로 최종적으로 점도가 감소하는 것으로 알려져 최종 제품을 제조하는 과정에서 많은 제약이 있었다.
그러나, 본 건의 발명자들은 키토산의 pH가 특정 수준 이상일 경우 고압 증기 멸균 처리를 하더라도 일반적으로 알려진 것과 다르게 pH 상승에 따라 점도가 상승하여 적정 점도를 가진 하이드로겔 상태를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 낮은 pH에서는 키토산 분자 사슬의 아민이 양이온을 받아 용해성을 나타내나, pH가 높아지면 양이온을 뺏겨 불용성을 나타내어 하이드로겔화되기 때문이다.
그러나, pH가 지나치게 높아지면 고압 된 하이드로겔의 뭉침 현상이 발생하여 발림성이 저하될 수 있는 바, 본 건의 발명자들은 심도있는 연구와 실험을 통해 pH가 6.1 내지 6.24가 되는 경우 특정 압력 조건에서 최적의 발림성을 가지는 하이드로겔을 제조할 수 있는 것을 확인하였다.
즉, pH가 6.1 내지 6.24인 키토산 용액을 0.01 내지 0.2 Mpa에서 증기 멸균 처리를 하는 경우, 키토산 분자 사슬의 자가 조립(self-assemble)으로 인한 물리적인 가교(physically cross-linking)가 발생하여 3차원 구조를 형성하고 이에 따라 기계적 물성이 향상되므로 고압 멸균 시에도 점도가 유지될 수 있는 것이다.
상기 pH가 6.1 미만일 경우, 최종 제품이 묽은 제형을 나타내게 되어 흘러내림이 발생하고 pH 6.24를 초과할 경우 뭉쳐지는 현상이 발생하여 최종 제품의 발림성이 매우 좋지 않을 수 있다.
또한, 상기 압력이 0.01 Mpa 미만인 경우, 키토산 분자 사슬의 자가 조립(self-assemble)으로 인한 물리적인 가교(physically cross-linking)가 충분히 일어나지 않으며, 0.2 Mpa를 초과하는 경우 제조 공정성이 저하되어 바람직하지 않다. 상세하게는 0.1 내지 0.2 Mpa일 수 있다.
본 발명은 pH 조절 및 고압 멸균 처리를 통해 키토산의 가교를 유도하여 하이드로겔 상태를 형성하므로, 종래 사용되던 가교제를 포함하는 다양한 첨가물 및 기타 고형화를 위한 인공 화학 물질이 필요하지 않다. 따라서 알러지 유발 가능성, 인체 자극성, 유독성, 내분비 교란이 거의 없고, 잔류 물질로 인한 염증 등의 부작용을 방지할 수 있어 안전성 및 안정성을 확보하면서도 발림성이 우수하다.
본 발명에서는 염기성 수용액의 농도 및 첨가량에 따라 pH를 조절하고, 고압 멸균 처리 조건을 조절하여 적용하는 신체 부위 및 병증에 따라 상기 범위 내에서 점도를 결정할 수 있다.
상기 염기성 수용액은 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 수산화인산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 멸균은 증기 멸균일 수 있으며 100 내지 150℃로 10 내지 20분 동안 이루어질 수 있고, 상세하게는 118 내지 125℃로 10 내지 20분 동안 이루어질 수 있다.
상기 멸균 처리를 통해 특정 pH를 가지는 키토산 또는 그 유도체 분자 사슬이 자가 조립(self-assemble)으로 인한 가교가 발생하며, 동시에, 세균 등 불순물이 제거되어 우수한 인체 적합성을 나타낼 수 있는 바, 상기 온도 및 시건 범위를 벗어날 경우, 원하는 효과를 발휘할 수 없어 바람직하지 않다.
한편, 본 발명은 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 pH가 6.1 내지 6.24이고 점도가 5000 내지 55000 cP인 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 제공한다.
앞서 설명한 바와 같이, 키토산은 고압 증기 멸균 시 고분자 사슬이 끊어져 분자량이 감소하게 되므로 최종적으로 점도가 감소하는 것으로 알려져 최종 제품을 제조하는 과정에서 많은 제약이 있었다.
그러나, 본 건의 발명자들은 키토산의 pH가 특정 수준 이상일 경우 고압 증기 멸균 처리를 하더라도 일반적으로 알려진 것과 다르게 pH 상승에 따라 점도가 상승하여 적정 점도를 가진 하이드로겔 상태를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 낮은 pH에서는 키토산 분자 사슬의 아민이 양이온을 받아 용해성을 나타내나, pH가 높아지면 양이온을 뺏겨 불용성을 나타내어 하이드로겔화되기 때문이다.
그러나, pH가 지나치게 높아지면 고압 증기 멸균 처리된 하이드로겔의 뭉침 현상이 발생하여 발림성이 저하될 수 있는 바, 본 건의 발명자들은 심도있는 연구와 실험을 통해 pH가 6.1 내지 6.24가 되는 경우 점도가 5000 내지 55000 cP인 최적의 발림성을 가지는 하이드로겔을 제조할 수 있는 것을 발견한 것이다.
상기 pH가 6.1 미만일 경우, 하이드로겔이 묽은 제형을 나타내게 되어 흘러내림이 발생하고 pH 6.24를 초과할 경우 뭉쳐지는 현상이 발생하여 최종 제품의 발림성이 매우 좋지 않을 수 있다.
또한, 상기 압력이 0.01 Mpa 미만인 경우, 키토산 분자 사슬의 자가 조립(self-assemble)으로 인한 물리적인 가교(physically cross-linking)가 충분히 일어나지 않으며, 0.2 Mpa를 초과하는 경우 제조 공정성이 저하되어 바람직하지 않다.
본 발명은 버섯 또는 진균에서 유래한 키토산을 사용하여 상기 동물성 키토산 사용으로 인해 제기되는 문제를 원천적으로 차단할 수 있으므로 생체 적합성이 뛰어난다. 버섯 또는 진균 유래 키토산은 비동물에서 유래하는 소재의 특성상 CE 등급체계에서 임상이 불필요한 2등급으로 보다 안전하게 인체에 적용 가능하다. 더욱이, 버섯은 하우스의 동일 조건에서 재배되므로 연중 같은 품질로 키토산 수급이 가능한 장점이 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 하이드로겔은 pH 조절 및 고압 멸균 처리를 통해 키토산 분자 사슬의 자가 조립(self-assemble)으로 인한 물리적인 가교(physically cross-linking)를 통해 3차원 구조를 형성하고 이에 따라 기계적 물성이 향상된 하이드로겔 상태를 유지할 수 있는 것이다. 즉, pH 조절 및 고압 멸균 처리를 통해 키토산의 가교를 유도하여 하이드로겔 상태를 형성하므로, 종래 사용되던 가교제를 포함하는 다양한 첨가물 및 기타 고형화를 위한 인공 화학 물질이 필요하지 않다. 따라서 알러지 유발 가능성, 인체 자극성, 유독성, 내분비 교란이 거의 없고, 잔류 물질로 인한 염증 등의 부작용을 방지할 수 있어 안전성 및 안정성을 확보하면서도 발림성이 우수하다.
또한, 크림, 연고, 파우더 제품 대비 적절한 습윤 환경을 제공하여 상처 치유를 촉진할 뿐만 아니라 상처 부위에 반투과성 막을 형성하여 상처의 적절한 투습도 관리 및 세균 및 진균 등의 외부 이물질을 등을 차단하므로 상처 회복 및 보호에 탁월하다. 더욱이, 키토산의 우수한 항균력 및 항염증력은 2차 감염을 예방하고 손상된 조직의 촉진에 유리하게 작용하고, 또한 암모니아 분자 흡착 효과도 뛰어나다. 따라서, 상처부위의 단백질 가수분해에 의해 발생하는 암모니아에 의한 세포의 산도(pH)를 변화, 세포 에너지 대사(ATP생성)를 방해, 신경 전달물질 생성을 억제, 상처회복을 지연을 억제할 수 있다.
상기 버섯은 예를 들어, 표고 버섯, 목이 버섯, 팽이 버섯, 민가닥 버섯, 아가리쿠스 버섯일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진균류인 Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Lentinus edodes, Pleurotus sajo-caju와 효모인 Zygosaccharomyces rouxii일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 분자량이 3,000 내지 30,000 kDa인 버섯 또는 진균 유래 키토산을 사용하여 동물성 키토산 대비 우수한 상처 치료 효과를 나타낸다.
구체적으로, 동물성 키토산의 경우 약 30,000 kDa을 초과하는 높은 분자량을 나타내나, 본 발명에 따른 버섯 또는 진균 유래 키토산은 3,000 내지 30,000 kDa 분자량을 나타낸다. 이러한 낮은 분자량을 가지는 버섯 또는 진균 유래 키토산은 생체 내 분해가 쉽게 이루어지며, 지혈, 항균 등의 효과가 높으므로 종래 대비 우수한 상처 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 버섯 또는 진균 유래 키토산의 유도체는 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산에서 일반적인 공지의 방법으로 합성할 수 있는 유도체라면 제한이 없다. 예를 들어, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔은 다양한 용도로 사용할 수 있다.
하나의 예로, 척추, 뇌, 눈, 귀, 코, 자궁경부 등 각종 신체 조직 부위의 급성 또는 만성 창상, 화상, 욕창, 당뇨발 또는 복강경, 치과 시술용 등 다양한 외과 수술 영역 등에서 자상, 찰과상, 화상, 창상, 욕창, 피부 질환 또는 수술 후 상처 부위에 대한 지혈, 살균, 흉터 방지 및 억제, 또는 상처 치유 및 회복의 용도로 이용될 수 있다.
본 발명은 상기 하이드로겔을 의료용 드레싱에 직접 적용하여 편리성을 높일 수 있다. 구체적으로, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔을 유효 성분으로 함유하여 지혈, 창상 피복 및 유착 방지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용도를 가지는 의료용 드레싱을 제공하여 더욱 안정적인 습윤 환경을 조성하는 한편, 상처 치유 효과를 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
Beijing Wisapple Biotech사(社)에서 버섯에서 유래한 분자량이 3,000 ~ 30,000인 키토산을 준비하였다.
증류수 100 ml에 버섯 유래 키토산 3 g을 가하고 교반하여 골고루 분산 후, 아세트산 0.75 ml를 가하고 혼합하였다. 이 후, pH가 6.1가 되도록 1N NaOH 수용액 4.65 ml을 가하고 혼합 후 0.15 MPa, 121℃조건에서 15분 동안 고압 멸균하여 버섯 유래 키토산이 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교된 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 2
Beijing Wisapple Biotech사(社)에서 버섯에서 유래한 분자량이 3,000 ~ 30,000인 키토산을 준비하였다.
증류수 100 ml에 버섯 유래 키토산 3 g을 가하고 교반하여 골고루 분산 후, 아세트산 0.75 ml를 가하고 혼합하였다. 이 후, pH가 6.15가 되도록 1N NaOH 수용액 4.75 ml을 가하고 혼합 후 0.15 MPa, 121℃조건에서 15분 동안 고압 멸균하여 버섯 유래 키토산이 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교된 하이드로겔을 제조하였다.
실험예 1
하기에서 정의한 값을 제외하고 실시예 1과 동일한 조건으로 하이드로겔을 제조 후, 45°로 기울인 아크릴판 상부에 약 3 g 하이드로겔을 도포하여 흘러내리는 양상을 관찰하고 도포된 겔을 일반적인 연고나 크림을 바르는 방법으로 손으로 펴 발랐을 때, 고르게 발리는지를 관찰하는 방법으로 발림성 테스트를 하였다.
1N NaOH(ml) pH 고온 고압 멸균 전 물성 고온 고압 멸균 후 물성
점도(cP) 점도 (cP) 발림성
비교예 1 0 5.23 480 240 매우묽음
비교예 2 1 5.35 560 240 매우묽음
비교예 3 2 5.49 800 400 매우묽음
비교예 4 3 5.75 880 480 매우묽음
비교예 5 4 5.90 2480 11280 묽음
실시예 1 4.65 6.1 9780 15623 우수
실시예 2 4.75 6.15 18000 26800 우수
실시예 3 4.85 6.23 27760 41840 우수
실시예 4 4.95 6.24 33520 51200 약간 뭉쳐짐
비교예 6 5.00 6.27 45120 55,000이상 뭉쳐짐
비교예 7 6.00 6.33 56960 55,000이상 심하게뭉쳐짐
상기 표 1를 참조하면, 실시예 1 내지 3에 따른 하이드로겔은 고압 멸균 후에도 매우 우수한 발림성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 실시예 4에 따른 하이드로겔 뭉침 현상이 약간 발생하나 이는 실제 발림성 측면에서 사용감이 거의 차이가 없어, 통상적으로 제품에 적용할 수 있는 수준이라고 볼 수 있다. 비교예 1 내지 5에 따른 하이드로겔은 전체적으로 묽으며 흘러내림이 발생하여 발림성이 저하되므로 바르는 데 불편함이 따른다. 비교예 6 및 7에 따른 하이드로겔은 뭉쳐지는 현상이 발생하여 발림성이 매우 좋지 않으며 점도가 매우 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예 2
실시예 2에 따른 하이드로겔의 막 투습도를 평가하였다.
구체적으로, 하기 조건에서 평가하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
1) 약 30g 정도의 제품을 넓게 펴발라 지름 10cm의 시트형태로 만든 후 건조시켜 시편을 만든다.
2) 투습컵 한쪽 flange에 평평한 판으로 고정시키고 뒤집어 증류수 20mL를 채운다.
3) 위쪽 투습컵 크기에 알맞게 자른 시편을 붙이고 클램핑하여 무게(W1)를 측정한다.
4) (37±1)℃, RH<20%로 유지되는 항온항습기에 넣는다. 24시간 후 항온항습기에서 장치를 꺼내어 무게(W2)를 측정한다.
아래 공식에 의해 투습도를 계산한다.
투습도=(W1-W2)/(m2 24hr) x 103 g (W1 : 투습컵의 초기무게(g), W2: 투습컵의 시험후 무게(g))
시험항목 시험기준 시험결과
1 2 3 4 5 평균
투습도 2,000~2,500 2298.5 2101.1 2143.9 2109.4 2203.6 2171.3
상기 표 2에 따르면 실시예 2에 따른 하이드로겔의 투습도는 해당 제품 의료기기 허가시 필수적으로 만족해야 할 투습도 2000 ~ 2500을 만족하는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2에 따른 하이드로겔은 건조 후 상처 부위에 반투과성 막을 형성하여 조직재생에 필요한 적절한 투습도를 유지시켜주기 때문이다. 이러한 반투과성 막이 세균 및 진균 등의 외부 이물질을 등을 차단하므로 상처 회복 및 보호에 탁월하다.
실험예 3
실시예 2에 따른 하이드로겔의 항균 성능을 평가하였다.
구체적으로, 37℃에서 5종의 병원균(대장균, 녹농균, 황색포도상균, MRSA, 칸디다균)에 대해 초기 접종 후 24시간 후 균의 농도 감소율을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다
Test Items Test Results
Early Conc. (CFU/mL) After 24h Conc.(CFU/mL) Reduction Rate of Bacteria (%)
MRSA(슈퍼 박테리아) BKANK 3.9 x 105 2.3 x 106 -
실시예 2 3.8 x 105 < 10 99.9
Candida albicans(칸디다균) BKANK 3.9 x 105 1.8 x 106 -
실시예 2 3.8 x 105 < 10 99.9
Escherichia coli(대장균) BKANK 3.9 x 105 1.3 x 107 -
실시예 2 3.8 x 105 < 10 99.9
Pseudomonas aeruginosa(녹농균) BKANK 3.9 x 105 4.8 x 106 -
실시예 2 3.8 x 105 < 10 99.9
Staphylococcus aureus(황색포도상균) BKANK 3.9 x 105 3.2 x 106 -
실시예 2 3.8 x 105 < 10 99.9
상기 표 3에 따르면, 실시예 2의 하이드로겔은 5종의 병원균에 대하여 세균감소율이 99.9%에 달하며, 특히, MRSA(항생제 내성균)에 대하여 우수한 항균력을 나타내는 것을 확인할 수 있다 이는 실시예 2의 하이드로겔에서 키토산의 양전하와 병원균 세포막에 존재하는 음이온과 상호작용하여 병원균의 증식을 억제하거나 세포막을 파괴시켜 사멸에 이르게 하기 때문이다.
종래 항균작용을 위해 은(Ag+)이나 포비돈 요오드를 사용하는 경우가 많았으나, 조직세포에 자극적이고 환자에게 고통을 유발시킬 수 있는 문제점이 있다. 실시예 2에 따른 하이드로겔은 세포 독성이 낮을 뿐만 아니라 생체 자극이 현저히 낮으므로 통증을 일으키지 않아 인체에 바람직하게 사용할 수 있다.
실험예 4
실시예 2에 따른 하이드로겔의 항염 성능을 평가하였다.
구체적으로, 염증성 사이토카인 발현량 측정을 통해 항염증 효과를 검증하기 위한 돼지 동물 시험 진행하였다. 만성 창상을 유발한 부위에 제품 적용 후 염증 반응을 보기 위해 시료적용부위의 피부조직을 채취하여 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현량을 측정하여 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. Control 그룹을 대조군으로 하여 상대정량법을 통해 분석하였다.
1) Total RNA 추출
① 피부조직에 RNAiso plus를 첨가하여 균질화함.
② 원심분리 후 Chloroform을 이용하여 RNA를 추출함.
③ 분리된 상층액을 취하여 Isopropanol을 넣고 원심 분리하여 RNA를 침전함.
④ RNA pellet을 75% 알코올을 이용하여 세척함.
⑤ Nanodrop ND-1000 spectrophotometer를 사용하여 Total RNA의 농도와 quality를 확인함.
순도값이 1.7 이하일 때, 이 RNA는 쓰지 않고 새로 추출하여 사용함.
- RNA 순도 및 농도는 아래의 공식에 따라 나타내었다.
- RNA 순도 = 280nm OD 값 / 260nm OD 값
- RNA 농도 = (RNA 260nm OD값 - blank 260nm OD 값) x 희석배율 x RNA 상수값
- Blank 농도 = 0.1% DEPC water
2) cDNA 합성
① complementary DNA (cDNA)는 PrimeScript 1 st strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 합성함.
② 합성한 cDNA는 -20℃에 보관함.
3. Quantitative RT-PCR
① cDNA에 SYBR Premix Ex Taq과 Primer를 첨가하여 Real time PCR 기기를 이용하여 증폭함.
② 유전자 발현량은 Real time PCR의 소프트웨어를 사용하여 정량분석함.
③ 각 실험군의 유전자 발현량은 하우스키핑 유전자인 GAPDH로 보정함
하기 도 1에 따르면, 실시예 2에 따른 하이드로겔은 control 그룹과 비교하였을 때, IL-1β은 36%의 발현 양상 보였고, IL-6은 43%의 발현 양상을 보였으며 TNF-α은 66%의 발현 양상을 보였다.
즉, 실시예 2에 따른 하이드로겔은 control 그룹과 비교하였을 때, 시험한 3 종의 사이토카인 발현이 억제되는 바 염증 억제에 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 5
실시예 2에 따른 하이드로겔의 항염 성능을 평가하였다.
구체적으로, 항염증 효과를 검증하기 위한 돼지 동물 시험 진행하였고, 염증세포의 유무를 현미경을 통해 관찰하였다. 만성 창상을 유발한 부위에 제품 적용 2주 후 채취한 조직으로 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 수행하여 하기 도 2에 나타내었다. 염증 세포를 별도로 처리를 하지 않은 것을 대조군으로 하여 비교하였다.
① 고정 후 피부조직 내에 남아있는 고정액을 수돗물을 이용하여 세척함.
② 수분제거를 위해 알코올을 순차적으로 농도를 높여가며 탈수함.
③ 자일렌을 이용하여 알코올을 제거하고 침투제인 파라핀과 잘 혼합되도록 함.
④ 파라핀을 조직내부에 채워 파라핀 블록을 제작함.
⑤ Microtome을 이용하여 파라핀 블록을 박절하여 조직 슬라이드를 제작함.
⑥ 제작한 슬라이드는 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 통하여 조직을 관찰함.
하기 도 2에 따르면 대조군(도 2(c), 2(d))에서는 염증 세포가 많이 분포하고 있으며 조직의 회복이 늦어지는 것을 관찰할 수 있다. 그러나, 실시예 2에 따른 하이드로겔(도 2(a), 2(b))을 염증 세포에 관찰하는 경우 대식세포(Macrophage)만 존재하며, 혈관 주위에 인필트레이션(infilteration)되는 세포가 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있는 바, 염증 억제에 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6
실시예 2와 대조군으로 normal Gauze의 탈취 성능을 평가하였다
구체적으로, 가스 검지관 법을 사용한다.
즉, 인체에서 악취를 유발하는 암모니아 가스를 채운 비닐 백 내에 시료 투입하고 2시간 후 비닐 백 내의 잔존 암모니아 또는 트리메틸아민 수치 측정하여 아래의 수식을 이용해 탈취율을 산출하여 하기 표 4에 나타내었다.
탈취율(%)=((Cb-Cs)/Cb)*100
(Cb: BLANK, 2시간 경과 후 시험 가스백 안에 남아있는 시험 가스의 농도, Cs: 시료, 2시간 경과 후 시험 가스백 안에 남아 있는 시험 가스의 농도)
탈취율 (%)
소재균류 실시예 2 Normal Gauze
암모니아 >99.8 33.1
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에 따른 하이드로겔은 99.8% 이상의 매우 높은 수치로 암모니아 분자를 흡착하는 것을 확인할 수 있다. 인체에서 악취를 유발하는 암모니아와 같은 분자들은 질소(N)를 포함하여, 상기 질소에 존재하는 비공유 전자쌍이 실시예 2에 따른 버섯 유래 키토산 하이드로겔 양전하와 상호작용하여 흡착된다. 상처 부위의 단백질 가수 분해로 발생하는 암모니아로 인한 일련의 작용들, 즉, 세포의 산도(pH) 변화, 세포 에너지 대사(ATP 생성) 방해, 신경 전달 생성을 억제는 등 조직 재생에 방해요인으로 크게 작용한다. 상처부위에서 암모니아를 제거해줌으로써 조직 재생을 유도하여 상처 회복을 촉진할 수 있다.

Claims (13)

  1. (가) 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체에 산성 수용액을 가하여 혼합하는 단계;
    (나) 상기 단계(가)의 혼합 후, pH가 6.1 내지 6.24가 되도록 염기성 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
    (다) 상기 단계(나)의 혼합 후, 0.01 내지 0.2 Mpa에서 멸균 처리하는 단계;
    를 포함하여 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 점도가 5000 내지 55000 cP인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산의 분자량은 3,000 내지 30,000 kDa인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계(가)는 증류수 100 중량부에 대해 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 2 내지 5 중량부 가하여 교반한 후, 산성 수용액을 가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단계(가)는 상기 산성 수용액을 증류수 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 1.0 중량부를 가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 산성 수용액은 염산, 질산, 황산, 아세트산, 주석산, 살리실산, 시트르산, 하이드록시 아세트산, 프로피온산, 젖산, 글리세린산, 아스코르브산, 아디픽산, 및 말산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 염기성 수용액은 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 수산화인산염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 멸균 처리는 100 내지 150℃로 10 내지 20분 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔의 제조방법.
  9. 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체가 자가 조립(self-assemble)에 의해 가교되어 pH가 6.1 내지 6.24이고 점도가 5000 내지 55000 cP인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산의 분자량은 3,000 내지 30,000 kDa인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 버섯 또는 진균 유래 키토산 유도체는 카르복시메틸키토산, 카르복시에틸키토산, 시아노에틸키토산, 히드록시에틸키토산, 히드록시프로필키토산, 글리세릴화키토산, 글리콜키토산, 숙시닐키토산, 카르복시메틸키토산숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔.
  12. 제 9 항에 따른 하이드로겔은 자상, 찰과상, 화상, 창상, 욕창, 피부 질환 또는 수술 후 상처 부위에 대한 지혈, 살균, 흉터 방지 및 억제, 또는 상처 치유 및 회복의 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는 버섯 또는 진균 유래 키토산 또는 그 유도체를 이용한 하이드로겔.
  13. 제 9 항에 따른 하이드로겔을 유효 성분으로 함유하여 지혈, 창상 피복 및 유착 방지로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용도를 가지는 것을 특징으로 하는 의료용 드레싱.
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