CN104870451A

CN104870451A - 二氢-吡啶并噁嗪衍生物的固体形式

Info

Publication number: CN104870451A
Application number: CN201380061193.5A
Authority: CN
Inventors: K·胡尔特; C·卡利斯; K·卡梅尔托恩斯; N·索德尔曼; F·泽克里
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: KR102184069B1; AU2013368997B2; DK2928896T3; MX366342B; PE20150946A1; PT2928896T; CY1119702T1; TN2015000128A1; EP2928896B1; CA2891521A1; AU2013368997B8; PH12015501052A1; NZ706865A; TW201422625A; HK1209419A1; IL238889A0; PL2928896T3; ZA201502350B; CL2015001409A1; AU2013368997A8

Abstract

本发明涉及(1,1-二氧代-六氢-1λ＊6＊-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式；包含这些结晶形式的药物组合物和组合产品，还涉及使用这些结晶形式的方法，包括使用药物组合物和组合产品治疗疾病的方法。

Description

二氢-吡啶并噁嗪衍生物的固体形式

发明领域

本发明涉及二氢-吡啶并噁嗪衍生物的新的固体形式，其制备方法及其在药物组合物中的用途。

发明背景

国际专利申请PCT/IB2012/057554(以WO2013/093849公布)公开了适用于治疗由PI3K酶活性介导的障碍或疾病的二氢-苯并-噁嗪和二氢-吡啶并-噁嗪衍生物。PCT/IB2012/057554公开了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮，以及该化合物的制备方法。

这些化合物单独或者与一种或多种其它药理学活性化合物组合用于治疗PI3K相关疾病，包括但不限于自身免疫疾病、炎性疾病、变态反应性疾病、气道疾病(例如哮喘和COPD)、移植排斥、癌症(例如造血源(hematopoietic origin)的癌症或实体瘤)。

这些化合物还单独或者与一种或多种其它药理学活性化合物组合用于治疗病症、疾病或障碍，例如自身免疫疾病、炎性疾病、变态反应性疾病、气道疾病(例如哮喘或COPD)、移植排斥；异常或不期望的抗体产生、抗原呈递、细胞因子产生或淋巴样器官发生，包括风湿性关节炎、寻常天疱疮、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、舍格伦综合征、自身免疫性溶血性贫血、ANCA-相关的血管炎症、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、慢性自身免疫性荨麻疹、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性鼻炎)、肺出血肾炎综合征、AMR(抗体介导的移植排斥)、B细胞介导的超急性、急性和慢性移植排斥和造血源癌症，包括但不限于多发性骨髓瘤；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓样白血病；非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓化生；以及瓦尔登斯特伦病；更适当地选自风湿性关节炎(RA)、寻常天疱疮(PV)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、获得性血友病A型(AHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、舍格伦综合征(SS)，ANCA相关的血管炎、冷球蛋白血症、慢性自身免疫性荨麻疹(CAU)、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性鼻炎)、肺出血肾炎综合征、移植排斥和造血源癌症，以及与疾病或感染(例如严重的脑型疟疾、锥虫病、利什曼病、弓形体病和神经系统囊虫病)相关的免疫病理学。

发明简述

本发明涉及(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式；包含该晶型的药物组合物及组合产品。本发明还涉及使用该晶型的方法，包括用于治疗由PI3K酶的活性(优选PI3Kδ亚型的活性)所介导疾病的其药物组合物和组合产品。

众所周知，特定药物中活性药物成分(API)的结晶形式通常是药物易于制备、吸湿性、稳定性、溶解度、储存稳定性、易于配制、在胃肠液中的溶出率以及体内生物利用度的重要决定因素。当相同组成的物质以不同的晶格排列结晶时晶体形式出现，导致具体晶型具有特定的不同的热力学性质和稳定性。晶体形式还包括相同化合物的不同水合物或溶剂合物。为了确定优选的晶型，对所述晶型的许多性质进行比较，并依据许多物理性质变量选择优选的晶型。完全有可能在一些情况下某些方面例如易于制备、稳定性等是优选的某种晶型被认为是关键性的。在其它情况下，可能优选不同的晶型以获得更大的溶出率和/或优良的生物利用度。还不可能预计具体化合物是否会形成多晶型物，是否任何此类多晶型物都适用于在治疗性组合物中的商业用途，或者哪种多晶型物将表现出这些期望的特性。

附图简述

图1是实施例F1(结晶无水形式)的X-射线粉末衍射图谱。

图2是实施例F1(结晶无水形式)的差示扫描量热分析图。

发明详述

在一项实施方案中，本发明涉及(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水晶体形式。

在另一项实施方案中，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水晶体形式是通过X-射线粉末衍射图谱来表征，包括以下以2θ角+/-0.2度给出的峰：9.1、10.2、11.9、13.0、17.1、17.7、18.7、20.3、20.8、26.0、26.7、23.2、24.1、24.8、29.3、27.4和21.4。

在另一项实施方案中，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式具有与图1中所示X-射线粉末衍射图谱基本上相同的X-射线粉末衍射图谱。

在另一项实施方案中，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式具有与图2中所示基本上相同的差示扫描量热分析图。

除非另外指明，否则术语“本发明的晶型”是指(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式。

除非另外指明，在上下文中所用的一般术语优选地在本公开物内容中具有以下含义：

通过以下描述可以更加充分地理解本发明，包括以下术语的词汇表和最后的实施例。如本文所用的，术语“包含”、“包括”和“含有”以其开放、非限定形式使用。

如本文所用的术语“可药用载体”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的那样(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，MackPrinting Company,1990,第1289-1329页)。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖了其在治疗组合物或药物组合物中的用途。

术语本发明化合物的“治疗有效量”指将引起个体的生物学或医学响应、例如降低或抑制酶或蛋白质活性或者改善症状、减轻病症、减慢或延缓疾病发展或者预防疾病等的本发明化合物的量。在一项非限制性的实施方案中，术语“治疗有效量”指如下定义的本发明化合物的量：当施用于个体时，可有效地：(1)至少部分地减轻、抑制、阻止和/或改善病症、障碍或疾病，所述的病症、障碍或疾病(i)受PI3K所介导或(ii)与PI3K活性相关或(iii)以PI3K活性(正常或异常)为特征；或者(2)降低或抑制PI3K的活性；或者(3)降低或抑制PI3K的表达。在另一项非限制性的实施方案中，术语“治疗有效量”指如下定义的本发明化合物的量：当施用于细胞或组织或非细胞生物材料或介质时，可有效地至少部分地降低或抑制PI3K的活性；或者至少部分地降低或抑制PI3K的表达。如以上PI3K的实施方案中所阐述的术语“治疗有效量”的含义还以相同的方式应用于任意其它相关的蛋白质/肽/酶。

如本文所用的术语“个体”指动物。通常，动物是哺乳动物。个体还指例如灵长类动物(例如人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在一些实施方案中，个体是灵长类动物。在另一项实施方案中，个体是人。

如本文所用的术语“抑制”指减轻或抑制所指定的病症、症状或者障碍或疾病，或者生物活性或过程的基线活性显著下降。

在一项实施方案中，如本文所用的术语任意疾病或障碍的“治疗”涉及改善疾病或障碍(即，减缓或停止或减轻疾病或其临床症状中的至少一种的发展)。在另一项实施方案中，“治疗”指缓解或改善至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在另一项实施方案中,“治疗”指调节身体方面(例如稳定可辨别的症状)或生理方面(例如稳定身体参数)或此两个方面的疾病或障碍。在另一项实施方案中，“治疗”指阻止或延缓疾病或障碍的发作或发展或进展。

如本文所用，如果个体在生物学上、医学上或生活质量上将得益于该治疗，则该个体“需要”该治疗。

如本文所用的那样，本发明的上下文，尤其是权利要求的上下文中所用的术语“一个”、“一种”和类似术语被视为覆盖单数和复数，本文另有指示或上下文清楚地矛盾除外。

本文所述的所有方法可以以任意适宜的次序进行，本文另有指示或上下文清楚地矛盾除外。本文提供的任意和所有实例或示例性语言，如“例如”的使用仅仅是为了更好地解释本发明，并且不对别处所要求的本发明的范围施加限制。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的晶型和可药用载体的药物组合物。药物组合物可以被配制用于特定的施用途径，例如口服施用、胃肠道外施用和直肠施用等。此外，本发明的药物组合物还可以被制备成固体形式(包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、粉末或栓剂)或者液体形式(包括但不限于溶液剂、混悬剂或乳剂)。药物组合物可以接受常规的药物操作如灭菌和/或可以含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂以及佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。

通常，药物组合物是片剂或明胶胶囊剂，其包含活性成分以及：

a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；

b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有

c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还有

d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或者泡腾合剂；和/或

e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。

可以按照本领域已知的方法对片剂进行薄膜包衣或肠溶包衣。

适于口服施用的组合物包括有效量的本发明的晶型，其以如下形式：片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊剂或者糖浆剂或酏剂。用于口服使用的组合物可按照本领域已知用于制备药物组合物的任意方法来制备，这类组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的物质以提供药学上美观和可口的制剂。片剂可以含有活性成分以及适于制备片剂的无毒的可药用赋形剂。这些赋形剂例如有：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂是未被包衣的或者通过已知技术被包衣以延缓在胃肠道中的崩解和吸收并由此提供历经更长时间的持续作用。例如，可以采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服使用的制剂可以作为其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或白陶土混合的硬明胶胶囊剂来呈现，或者作为其中活性成分与水或油介质如花生油、液状石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊剂来呈现。

一些可注射的组合物是水性等张溶液或混悬液，栓剂可有利地由脂肪乳剂或混悬剂来制备。所述组合物可以被灭菌和/或含有佐剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别按照常规的混合、制粒或包衣方法制得，含有约0.1-75％或含有约1-50％的活性成分。

适于透皮应用的组合物包括有效量的本发明的晶型和载体。适于透皮递送的载体包括可吸收的药理学上可接受的溶剂以帮助穿过宿主的皮肤。例如，透皮装置是绷带剂的形式，包含背衬膜、含有化合物和任选的载体的贮库、任选的速率控制屏障(历经延长的时间以受控和预定的速率递送化合物至宿主皮肤)和确保该装置在皮肤上的手段。

适于局部应用、例如应用于皮肤和眼的组合物包括水性溶液、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂等进行递送。这类局部递送系统可特别适于皮肤应用，例如用于治疗皮肤癌症、例如预防性地用于防晒霜、乳剂、洗液、喷雾等。因此，它们特别适用于本领域众所周知的局部制剂、包括美容化妆制剂。这类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

如本文所用的局部应用还可以涉及吸入或经鼻应用。它们可以方便地以干粉的形式(单独或作为混合物、例如与乳糖的干混合物或混合的组分颗粒、例如与磷脂混合)由干粉吸入器递送或以气雾喷雾形式由加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷散器在使用或不使用适宜抛射剂的情况下递送。

本发明还提供了包含本发明的晶型作为活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进某些化合物的降解。

本发明的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低含水量的成分以及低含水量或低湿度的条件来制备。可以制备无水药物组合物并储存以便保持其无水性质。因此，使用已知阻止与水接触的材料来包装无水组合物，以便它们可以被包括在适宜的配方药盒中。适宜包装的实例包括但不限于密封箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和窄条包装。

本发明还提供了包含一种或多种使作为活性成分的本发明化合物的降解速率降低的物质的药物组合物和剂型。这类物质在本文中称为“稳定剂”，其包括但不限于抗氧化剂如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。

本发明的晶型可用于治疗包括疾病或感染相关的免疫病理学情况在内的其中B细胞功能如抗体生成、抗原呈递、细胞因子生成或淋巴器官发生中的一种或多种是异常的或是不希望的病症、疾病或障碍，包括风湿性关节炎、寻常性天疱疮及相关疾病、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、舍格伦综合征、自身免疫性溶血性贫血、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、慢性自身免疫性荨麻疹、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、AMR(抗体介导的移植排斥)、B细胞介导的超急性、急性和慢性移植排斥以及造血源癌症，所述造血源癌症包括但不限于多发性骨髓瘤；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓样白血病；非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓外化生；和瓦尔登斯特伦病。

本发明包括治疗其中嗜中性粒细胞功能如超氧化物释放、受激的胞吐作用或化学诱导性迁移中的一种或多种是异常的或是不希望的病症、疾病或障碍的方法，所述病症、疾病或障碍包括风湿性关节炎、脓毒病、肺或呼吸系统障碍如哮喘、炎性皮肤病如银屑病，以及疾病或感染相关的免疫病理学情况等。

本发明包括治疗其中嗜碱性粒细胞和肥大细胞功能如化学诱导性迁移或变应原-IgE-介导的脱粒中的一种或多种是异常的或是不希望的病症、疾病或障碍的方法，所述病症、疾病或障碍包括变应性疾病(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)以及其它障碍如COPD、哮喘或肺气肿。

本发明包括治疗其中T细胞功能如细胞因子生成或细胞介导的细胞毒性中的一种或多种是异常的或是不希望的病症、疾病或障碍的方法，所述病症、疾病或障碍包括风湿性关节炎、多发性硬化、急性或慢性细胞组织或器官移植物排斥或者造血源癌症，以及疾病或感染相关的免疫病理学情况。

而且，本发明包括治疗神经变性疾病、心血管疾病和血小板聚集的方法。

而且，本发明包括治疗皮肤疾病如迟发性皮肤卟啉症、多形性日光疹、皮肌炎、日光性荨麻疹、口腔扁平苔癣、脂膜炎、硬皮病、荨麻疹性血管炎的方法。

而且，本发明包括治疗慢性炎性疾病如结节病、环状肉芽肿的方法。

在其它实施方案中，所述病症或障碍(例如PI3K-介导的)选自：真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化伴骨髓外化生、哮喘、COPD、ARDS、勒夫勒综合征、嗜酸粒细胞性肺炎、寄生虫(特别是后生动物)侵扰(包括热带嗜酸粒细胞增多症)、支气管肺曲霉菌病、结节性多动脉炎(包括丘-斯综合征)、嗜酸性肉芽肿、由药物反应引起的影响气道的嗜酸粒细胞相关病症、银屑病、接触性皮炎、特应性皮炎、斑秃、多形性红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白斑、变应性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、自身免疫性血液系统障碍(例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、斯-约综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎)、内分泌眼病、格雷夫斯病、结节病、肺泡炎、慢性过敏性肺炎、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)、肺间质纤维化、银屑病关节炎、肾小球肾炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深静脉血栓形成、中风、心肌梗死、不稳定型心绞痛、血栓栓塞、肺栓塞、血栓溶解疾病、急性动脉缺血、外周血栓性阻塞和冠状动脉疾病、再灌注损伤、视网膜病如糖尿病视网膜病或高压氧诱发的视网膜病和特征为眼内压或眼房水分泌升高的病患如青光眼。

在另一项实施方案中，本发明的晶型可用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病和炎性病症、特别是病因学包括自身免疫性组分的炎性病症如关节炎(例如风湿性关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)和变形性关节炎)和风湿性疾病、包括涉及骨丢失的炎性病症和风湿性疾病，炎性疼痛、脊椎关节病、包括强直性脊柱炎、赖特综合征、反应性关节炎、银屑病关节炎和肠病性关节炎(enterophathics arthritis)、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应)和变态反应。可使用本发明的晶型的具体的自身免疫性疾病包括自身免疫性血液学病症(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、获得性血友病A、冷凝集素病、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、炎性肌肉障碍、多软骨炎、硬皮病(sclerodoma)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关的血管炎、IgM介导的神经病、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、斯-约综合征、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、节段性回肠炎和肠易激综合征)、内分泌眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、视神经脊髓炎、原发性胆汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎和后葡萄膜炎以及全葡萄膜炎)、干燥性角膜结膜炎和春季角结膜炎、肺间质纤维化、银屑病关节炎和肾小球肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)、肿瘤、皮肤和角膜炎性疾病、肌炎、骨植入物松弛、代谢病症如动脉粥样硬化、糖尿病和血脂异常症。

在另一项实施方案中，本发明的晶型可用于治疗选自如下的病症或障碍：原发性皮肤B细胞淋巴瘤、免疫性大疱疾病(immunobullous disease)、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、巴西天疱疮的地方性形式(Fogo selvagem)、副肿瘤性天疱疮、大疱性类天疱疮、粘膜类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、慢性移植物抗宿主病、皮肌炎、系统性红斑狼疮、血管炎、小血管炎、低补体性荨麻疹性血管炎(hypocomplementemic urticarial vasculitis)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关的血管炎、冷球蛋白血症、Schnitzler综合征、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、血管性水肿、白斑、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、冷凝集素病、自身免疫性溶血性贫血、抗嗜中性粒细胞胞质抗体相关的血管炎、移植物抗宿主病、冷球蛋白血症和血栓性血小板减少症。

因此，作为另外的实施方案，本发明提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式在治疗法中的用途。在另外的实施方案中，所述治疗法选自可通过抑制PI3K而治疗的疾病。在另一项实施方案中，所述疾病选自上述清单，适宜地选自自身免疫性疾病、炎性疾病、变应性疾病、气道疾病如哮喘和COPD、移植排斥；抗体生成、抗原呈递、细胞因子生成或淋巴器官发生是异常的或不希望的疾病，包括风湿性关节炎、寻常性天疱疮、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、舍格伦综合征、自身免疫性溶血性贫血、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、慢性自身免疫性荨麻疹、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、AMR(抗体介导的移植排斥)、B细胞介导的超急性、急性和慢性移植排斥以及造血源癌症，所述造血源癌症包括但不限于多发性骨髓瘤；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓样白血病；非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓外化生；和瓦尔登斯特伦病；更适宜地选自风湿性关节炎(RA)、寻常性天疱疮(PV)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、获得性A型血友病(AHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、舍格伦综合征(SS)、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、慢性自身免疫性荨麻疹(CAU)、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、移植排斥和造血源癌症，以及疾病或感染相关的免疫病理学情况如严重和脑型疟疾、锥虫病、利什曼病、弓形体病和神经型囊尾蚴病。

在另一项实施方案中，本发明提供了治疗通过抑制PI3K来治疗的疾病的方法，该方法包括施用治疗可接受量的(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式。在另外的实施方案中，所述疾病选自上述清单，适宜地选自自身免疫性疾病、炎性疾病、变应性疾病、气道疾病如哮喘和COPD、移植排斥；抗体生成、抗原呈递、细胞因子生成或淋巴器官发生是异常的或不希望的疾病，包括风湿性关节炎、寻常性天疱疮、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、舍格伦综合征、自身免疫性溶血性贫血、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、慢性自身免疫性荨麻疹、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、AMR(抗体介导的移植排斥)、B细胞介导的超急性、急性和慢性移植排斥以及造血源癌症，所述造血源癌症包括但不限于多发性骨髓瘤；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓样白血病；非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓外化生；和瓦尔登斯特伦病；更适宜地选自风湿性关节炎(RA)、寻常性天疱疮(PV)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、获得性A型血友病(AHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、舍格伦综合征(SS)、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、慢性自身免疫性荨麻疹(CAU)、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、移植排斥和造血源癌症以及疾病或感染相关的免疫病理学情况，如严重和脑型疟疾、锥虫病、利什曼病、弓形体病和神经型囊尾蚴病。

因此，作为另外的实施方案，本发明提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式在制备药物中的用途。在另外的实施方案中，所述药物用于治疗可通过抑制PI3K来治疗的疾病。在另一项实施方案中，所述疾病选自上述清单，适宜地选自自身免疫性疾病、炎性疾病、变应性疾病、气道疾病如哮喘和COPD、移植排斥；抗体生成、抗原呈递、细胞因子生成或淋巴器官发生是异常的或不希望的疾病，包括风湿性关节炎、寻常性天疱疮、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、舍格伦综合征、自身免疫性溶血性贫血、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、慢性自身免疫性荨麻疹、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、AMR(抗体介导的移植排斥)、B细胞介导的超急性、急性和慢性移植排斥以及造血源癌症，所述造血源癌症包括但不限于多发性骨髓瘤；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓性白血病；非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓外化生；和瓦尔登斯特伦病；更适宜地选自风湿性关节炎(RA)、寻常性天疱疮(PV)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、获得性A型血友病(AHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、舍格伦综合征(SS)、ANCA相关性血管炎、冷球蛋白血症、慢性自身免疫性荨麻疹(CAU)、变态反应(特应性皮炎、接触性皮炎、变应性鼻炎)、古德帕斯丘综合征、移植排斥和造血源癌症以及疾病或感染相关的免疫病理学情况，例如严重和脑型疟疾、锥虫病、利什曼病、弓形体病和神经型囊尾蚴病。

对于约50-70kg的个体，本发明的药物组合物或组合产品可以是约1-1000mg活性成分或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg活性成分的单位剂量。化合物或其药物组合物或组合产品的治疗有效剂量取决于个体的种属、体重、年龄和个体状况、待治疗病症或疾病或其严重性。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可容易地确定每种活性成分预防、治疗或抑制所述病症或疾病进程所需的有效量。

上文引用的剂量性质可以有利地采用哺乳动物如小鼠、大鼠、狗、猴或其离析器官、组织和制品经体外和体内试验得以证明。本发明的晶型可以以溶液如水溶液的形式进行体外应用，并且可以经肠道内、胃肠道外或有利地经静脉内、例如作为混悬液或水溶液进行体内应用。体外剂量可以是约10^-3摩尔至10^-9摩尔浓度。体内治疗有效量根据施用途径可以是约0.1-500mg/kg或约1-100mg/kg。

本发明的晶型可以与一种或多种其它治疗剂同时、在其之前或在其之后进行施用。本发明的晶型可以通过相同或不同施用途径单独施用或者与其它治疗剂在同一药物组合物中一起施用。

在一项实施方案中，本发明提供了包含(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和至少一种其它治疗剂的产品，作为组合制剂用于在治疗中同时、分别或依次使用。在一项实施方案中，治疗是由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的治疗。作为组合制剂提供的产品包括包含一起处于相同药物组合物中的(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和其它治疗剂的组合物，或者包含单独形式的(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和其它治疗剂的产品，例如以药盒形式。

在一项实施方案中，本发明提供了包含(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和其它治疗剂的药物组合物。任选地，所述药物组合物可以包含可药用载体，如上文所述。

在一项实施方案中，本发明提供了包含两种或更多种单独药物组合物的药盒，其中至少有一种所述药物组合物中含有(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式。在一项实施方案中，药盒包含用于单独容纳所述组合物的装置，例如容器、分隔瓶或分隔箔袋。这类药盒的实例例如通常用来包装片剂、胶囊剂等的泡罩包装。

本发明的药盒可用于施用不同的剂型如口服或胃肠外、用于以不同的剂量间隔施用单独组合物、或者用于相对于另一种组合物逐渐增加的单独组合物。为了帮助顺从性，本发明的药盒通常包含施用指导。

在本发明的组合治疗中，本发明的晶型和所述其它治疗剂可以通过相同或不同生产商来制备和/或配制。而且，本发明的晶型和所述其它治疗剂可以如下被一起带入组合治疗中：(i)在将组合产品发送给医生之前(例如在包含本发明的晶型和所述其它治疗剂的药盒情况下)；(ii)在临施用前由医生自己(或在医生的指导下)；(iii)由患者自己、例如在依次施用本发明的晶型和所述其它治疗剂期间。

本发明还提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式用作药物的用途。

因此，本发明提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式用于治疗疾病的用途。本发明还提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的用途，其中药物被制备用于与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了其它治疗剂用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的用途，其中药物被用于与(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式一起施用。

本发明还提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式，其用于治疗方法中。本发明还提供了在用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的方法中使用的(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式，其中(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式被制备用于与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了在用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的方法中使用的其它治疗剂，其中所述其它治疗剂被制备用于与(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式一起施用。本发明还提供了在用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的方法中使用的(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式，其中(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式与其它治疗剂一起施用。本发明还提供了在用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的方法中使用的其它治疗剂，其中所述其它治疗剂与(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式一起施用。

本发明还提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式用于治疗疾病的用途。本发明还提供了(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的用途，其中患者以前(例如24小时内)已经用其它治疗剂进行了治疗。本发明还提供了其它治疗剂用于治疗由PI3K酶的活性介导的疾病或障碍的用途，其中患者以前(例如24小时内)已经用(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式进行了治疗。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式可以作为唯一的活性成分或者与其它药物联合、例如作为其佐剂进行施用，所述其它药物例如有免疫抑制或免疫调节剂或者其它抗炎剂、例如用于治疗或预防同种异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥或者炎性疾病或自身免疫性疾病或者化疗剂，例如恶性细胞抗增殖剂。例如，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式可用于与以下物质组合使用：钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢素A或FK 506；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573、TAFA-93、biolimus-7或biolimus-9；具有免疫抑制性质的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特；咪唑立宾；麦考酚酸或其盐；麦考酚酸吗乙酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；PKC抑制剂，例如WO 02/38561或WO 03/82859中公开的那些，例如实施例56或70的化合物；JAK3激酶抑制剂，例如N-苄基-3,4-二羟基-亚苄基-氰基乙酰胺α-氰基-(3,4-二羟基)-]N-苄基肉桂酰胺(Tyrphostin AG 490)、灵菌红素25-C(PNU156804)、[4-(4'-羟基苯基)-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉](WHI-P131)、[4-(3'-溴-4'-羟基苯基)-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉](WHI-P154)、[4-(3',5'-二溴-4'-羟基苯基)-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉]WHI-P97、KRX-211、3-{(3R,4R)-4-甲基-3-[甲基-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-氨基]-哌啶-1-基}-3-氧代-丙腈，为游离形式或可药用盐形式，例如单柠檬酸盐(还称为CP-690,550)，或者WO 04/052359或WO 05/066156中公开的化合物；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、CD80、CD86或它们的配体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体的胞外域的至少一部分、例如与非CTLA4蛋白序列连接的CTLA4或其突变体的至少胞外部分、例如CTLA4lg(例如称为ATCC 68629)或其突变体、例如LEA29Y的重组结合分子；粘附分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或抗组胺剂；或镇咳药或支气管扩张剂；或血管紧张素受体阻滞剂；或抗感染剂。

当(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式与其它免疫抑制剂/免疫调节剂、抗炎剂、化疗剂或抗感染剂治疗组合施用时，共施用的免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、化疗剂或抗感染剂化合物的剂量当然将根据所用的共用药物的类型(例如其是类固醇还是钙调磷酸酶抑制剂)、所用的具体药物、待治疗的病症等而变化。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式还可以用于有利地与其它治疗剂、尤其是其它抗增殖剂组合使用。这类抗增殖剂包括但不限于芳香酶抑制剂；抗雌激素药；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；诱导细胞分化过程的化合物；环加氧酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；抗肿瘤抗代谢物；铂化合物；靶向于/降低蛋白激酶或脂质激酶活性的化合物和其它抗血管生成化合物；靶向于、降低或抑制蛋白磷酸酶或脂质磷酸酶活性的化合物；促性激素释放素激动剂；抗雄激素药；甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；双膦酸药物；生物应答调节剂；抗增殖性抗体；类肝素酶(heparanase)抑制剂；Ras致癌同工型抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗恶性血液疾病的物质；靶向于、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制剂；替莫唑胺和甲酰四氢叶酸。

如本文所用的术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制雌激素生成(即，将雄甾烯二酮和睾酮底物分别转化为雌酮和雌二醇)的化合物。该术语包括但不限于类固醇物质，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，和特别是非类固醇物质，尤其是氨鲁米特、罗谷亚胺、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦可以以例如其市售形式、例如以商标AROMASIN市售的形式施用。福美坦可以以例如其市售形式、例如以商标LENTARON市售的形式施用。法倔唑可以以例如其市售形式、例如以商标AFEMA市售的形式施用。阿那曲唑可以以例如其市售形式、例如以商标ARIMIDEX市售的形式施用。来曲唑可以以例如其市售形式、例如以商标FEMARA或FEMAR市售的形式施用。氨鲁米特可以以例如其市售形式、例如以商标ORIMETEN市售的形式施用。包含为芳香酶抑制剂的化疗剂的本发明的组合产品特别可用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳房肿瘤。

如本文所用的术语“抗雌激素药”涉及在雌激素受体水平上拮抗雌激素效应的化合物。该术语包括但不限于他莫昔芬、氟维司群、雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。他莫昔芬可以以例如其市售形式、例如以商标NOLVADEX市售的形式施用。盐酸雷洛昔芬可以以例如其市售形式、例如以商标EVISTA市售的形式施用。氟维司群可以如美国专利4,659,516中所公开的那样进行配制或者可以以例如其市售形式、例如以商标FASLODEX市售的形式施用。包含为抗雌激素药的化疗剂的本发明的组合产品特别可用于治疗雌激素受体阳性肿瘤，例如乳房肿瘤。

如本文所用的术语“抗雄激素药”涉及任何能抑制雄性激素生物效应的物质，包括但不限于比卡鲁胺(CASODEX)，其可以例如如美国专利4,636,505中所公开的那样进行配制。

如本文所用的术语“促性激素释放素激动剂”包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和乙酸戈舍瑞林。戈舍瑞林公开在美国专利4,100,274中，可以以例如其市售形式、例如以商标ZOLADEX市售的形式施用。阿巴瑞克可以例如如美国专利5,843,901中所公开的那样进行配制。

如本文所用的术语“拓扑异构体I抑制剂”包括但不限于拓扑替康、吉马替康(gimatecan)、伊立替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。伊立替康可以以例如其市售形式、例如以商标CAMPTOSAR市售的形式施用。拓扑替康可以以例如其市售形式、例如以商标HYCAMTIN市售的形式施用。

如本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类物质，如多柔比星，包括脂质体制剂，例如CAELYX；柔红霉素；表阿霉素；伊达比星；奈莫柔比星；蒽醌类米托蒽醌和洛索蒽醌；以及鬼臼毒素类依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以以例如其市售形式、例如以商标ETOPOPHOS市售的形式施用。替尼泊苷可以以例如其市售形式、例如以商标VM 26-BRISTOL市售的形式施用。多柔比星可以以例如其市售形式、例如以商标ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN市售的形式施用。表阿霉素可以以例如其市售形式、例如以商标FARMORUBICIN市售的形式施用。伊达比星可以以例如其市售形式、例如以商标ZAVEDOS市售的形式施用。米托蒽醌可以以例如其市售形式、例如以商标NOVANTRON市售的形式施用。

术语“微管活性剂”涉及微管稳定化合物、微管去稳定化合物和微管蛋白聚合抑制剂，包括但不限于紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇和多西他赛；长春花生物碱，例如长春花碱、尤其是硫酸长春花碱，长春新碱、尤其硫酸长春新碱和长春瑞滨；淅皮海绵内酯(discodermolides)；秋水仙碱；和埃坡霉素及其衍生物，例如埃坡霉素B或D或其衍生物。紫杉醇可以以例如其市售形式、例如以TAXOL市售的形式施用。多西他赛可以以例如其市售形式、例如以商标TAXOTERE市售的形式施用。硫酸长春花碱可以以例如其市售形式、例如以商标VINBLASTIN R.P.市售的形式施用。硫酸长春新碱可以以例如其市售形式、例如以商标FARMISTIN市售的形式施用。淅皮海绵内酯可以例如如美国专利5,010,099中所公开的那样得到。还包括WO 98/10121、美国专利6,194,181、WO 98/25929、WO 98/08849、WO99/43653、WO 98/22461和WO 00/31247中所公开的埃坡霉素衍生物。尤其优选的是埃坡霉素A和/或B。

如本文所用的术语“烷化剂”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。环磷酰胺可以以例如其市售形式、例如以商标CYCLOSTIN市售的形式施用。异环磷酰胺可以以例如其市售形式、例如以商标HOLOXAN市售的形式施用。

术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”涉及抑制组蛋白脱乙酰酶并且具有抗增殖活性的化合物。这包括WO 02/22577中所公开的化合物，尤其是N-羟基-3-[4-[[(2-羟基乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可药用盐。还尤其包括辛二酰苯胺(suberoylanilide)异羟肟酸(SAHA)。

术语“抗肿瘤抗代谢物”包括但不限于5-氟尿嘧啶或5-FU；卡培他滨；吉西他滨；DNA去甲基化化合物如5-氮杂胞苷和地西他滨；甲氨蝶呤和依达曲沙；以及叶酸拮抗剂如培美曲塞。卡培他滨可以以例如其市售形式、例如以商标XELODA市售的形式施用。吉西他滨可以以例如其市售形式、例如以商标GEMZAR市售的形式施用。还包括单克隆抗体曲妥单抗，其可以以例如其市售形式、例如以商标HERCEPTIN市售的形式施用。

如本文所用的术语“铂化合物”包括但不限于卡铂、顺-铂、顺铂和奥沙利铂。卡铂可以以例如其市售形式、例如以商标CARBOPLAT市售的形式施用。奥沙利铂可以以例如其市售形式、例如以商标ELOXATIN市售的形式施用。

如本文所用的术语“靶向于/降低蛋白激酶或脂质激酶活性的化合物”、“靶向于、降低或抑制蛋白磷酸酶或脂质磷酸酶活性的化合物”或者“其它抗血管生成化合物”包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或者脂质激酶抑制剂，例如：

a)靶向于、降低或抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制PDGFR活性的化合物，尤其是抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼、SU101、SU6668和GFB-111；

b)靶向于、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGFR)活性的化合物；

c)靶向于、降低或抑制胰岛素样生长因子受体I(IGF-IR)活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制IGF-IR活性的化合物，尤其是抑制IGF-IR受体的化合物，例如WO 02/092599中公所开的那些化合物；

d)靶向于、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

e)靶向于、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

f)靶向于、降低或抑制c-Met受体活性的化合物；

g)靶向于、降低或抑制Kit/SCFR受体酪氨酸激酶活性的化合物；

h)靶向于、降低或抑制C-kit受体酪氨酸激酶(PDGFR家族的一部分)活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族活性的化合物，尤其是抑制c-Kit受体的化合物，例如伊马替尼；

i)靶向于、降低或抑制c-Abl家族成员和它们的基因融合产物(例如BCR-Abl激酶)活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制c-Abl家族成员和它们的基因融合产物活性的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼、PD180970、AG957、NSC 680410或来自派德公司(ParkeDavis)的PD173955；

j)靶向于、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸激酶Raf家族成员以及MEK、SRC、JAK、FAK、PDK和Ras/MAPK家族成员或PI(3)激酶家族或PI(3)激酶相关激酶家族和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员活性的化合物，尤其是美国专利5,093,330中所公开的那些星孢素衍生物，例如米哚妥林；其它化合物的实例例如包括UCN-01；沙芬戈；BAY 43-9006；苔藓抑素1；哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；LY333531/LY379196；异喹啉化合物，例如WO 00/09495中所公开的那些；FTIs；PD184352或QAN697(P13K抑制剂)；

k)靶向于、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶抑制剂活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶抑制剂活性的化合物，包括甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)或Tyrphostin。Tyrphostin优选是低分子量(Mr<1500)化合物，或其可药用盐，尤其是选自亚苄基丙二腈类或者S-芳基苯丙二腈或双底物喹啉类化合物的化合物，更尤其是选自下组的任意化合物：Tyrphostin A23/RG-50810、AG 99、Tyrphostin AG 213、Tyrphostin AG1748、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin B44、Tyrphostin B44(+)对映异构体、Tyrphostin AG 555、AG 494、Tyrphostin AG 556、AG957和Adaphostin(4-{[(2,5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯、NSC 680410、Adaphostin；

l)靶向于、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4，为均或杂二聚物)活性的化合物，例如靶向于、降低或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物，尤其是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族成员如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4或者与EGF或EGF相关性配体结合的化合物、蛋白质或抗体，特别是在下列文献中一般性地和具体地公开的那些化合物、蛋白质或单克隆抗体：WO 97/02266，例如实施例39的化合物，或者EP 0564409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0566226、EP 0787722、EP 0837063、美国专利5,747,498、WO98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983和尤其是WO96/30347(例如称为CP 358774的化合物)、WO 96/33980(例如化合物ZD1839)和WO 95/03283(例如化合物ZM105180)；例如曲妥珠单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗、易瑞沙、特罗凯、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3和WO 03/013541中所公开的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物。

其它抗血管生成化合物包括具有其它活性机理的化合物，例如与蛋白激酶或脂质激酶抑制无关的机理，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。

靶向于、降低或抑制蛋白磷酸酶或脂质磷酸酶活性的化合物有例如磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制剂，例如冈田酸(okadaic acid)或其衍生物。

诱导细胞分化过程的化合物有例如视黄酸、α-、γ-或δ-生育酚或者α-、γ-或δ-生育三烯酚。

如本文所用的术语“环加氧酶抑制剂”包括但不限于例如COX-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸与衍生物，例如塞来考昔(CELEBREX)、罗非考昔(VIOXX)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸(例如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯氨基)苯基乙酸)或芦米考昔。

如本文所用的术语“双膦酸药物”包括但不限于依替膦酸(etridonicacid)、氯膦酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。“依替膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标DIDRONEL市售的形式施用。“氯膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标BONEFOS市售的形式施用。“替鲁膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标SKELID市售的形式施用。“帕米膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标AREDIA^TM市售的形式施用。“阿仑膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标FOSAMAX市售的形式施用。“伊班膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标BONDRANAT市售的形式施用。“利塞膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标ACTONEL市售的形式施用。“唑来膦酸”可以以例如其市售形式、例如以商标ZOMETA市售的形式施用。

术语“mTOR抑制剂”涉及抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)并且具有抗增殖活性的化合物，例如西罗莫司依维莫司(Certican^TM)、CCI-779和ABT578。

如本文所用的术语“类肝素酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括但不限于PI-88。

如本文所用的术语“生物应答调节剂”指淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ。

如本文所用的术语“Ras致癌同工型抑制剂”(如H-Ras、K-Ras或N-Ras)指靶向于、降低或抑制Ras的致癌活性的化合物，例如“法尼基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或R115777(Zarnestra)。

如本文所用的术语“端粒酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制端粒酶活性的化合物。靶向于、降低或抑制端粒酶活性的化合物尤其是抑制端粒酶受体的化合物，例如telomestatin(替莫美他汀)。

如本文所用的术语“甲硫氨酸氨肽酶抑制剂”指靶向于、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物。靶向于、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物有例如bengamide(比格麦德)或其衍生物。

如本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”指靶向于、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向于、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括例如PS-341和MLN 341。

如本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或“MMP抑制剂”包括但不限于胶原拟肽和非拟肽抑制剂、四环素衍生物，例如异羟肟酸拟肽抑制剂巴马司他及其口服可生物利用的类似物马立马司他(BB-2516)、普啉司他(AG3340)、metastat(马他司他)(NSC 683551)BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211、MMI270B或AAJ996。

如本文所用的术语“用于治疗血液学恶性疾病的药物”包括但不限于FMS-样酪氨酸激酶抑制剂，例如靶向于、降低或抑制FMS-样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物；干扰素、1-b-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(ara-c)和白消安(bisulfan)；和ALK抑制剂，例如靶向于、降低或抑制间变性淋巴瘤激酶的化合物。

靶向于、降低或抑制FMS-样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物尤其是抑制Flt-3R受体激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如PKC412、米哚妥林、星孢素衍生物、SU11248和MLN518。

如本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括但不限于靶向于、降低或抑制HSP90的内在的腺苷三磷酸酶活性的化合物；经由泛素蛋白酶体途径降解、靶向于、降低或抑制HSP90客户蛋白的化合物。靶向于、降低或抑制HSP90的内在腺苷三磷酸酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的腺苷三磷酸酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如17-烯丙基氨基,17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)—一种格尔德霉素衍生物；其它与格尔德霉素相关的化合物；根赤壳菌素和HDAC抑制剂。

如本文所用的术语“抗增殖抗体”包括但不限于曲妥珠单抗(Herceptin^TM)、曲妥珠单抗-DM1、厄洛替尼(Tarceva^TM)、贝伐珠单抗(Avastin^TM)、利妥昔单抗PRO64553(抗-CD40)和2C4抗体。抗体意指例如完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体、和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。

对于急性髓样白血病(AML)的治疗而言，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式可以与标准白血病疗法组合使用，尤其是与用于治疗AML的疗法组合使用。具体而言，(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式可以与例如法尼基转移酶抑制剂和/或其它可用于治疗AML的药物组合施用，例如柔红霉素、阿霉素、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊达比星、卡铂和PKC412。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式还可用于有利地与其它治疗剂、尤其是其它抗疟疾药组合使用。这类抗疟疾药包括但不限于氯胍、氯丙胍、甲氧苄啶、氯喹、甲氟喹、本芴醇、阿托伐醌、乙胺嘧啶-磺胺多辛、乙胺嘧啶-氨苯砜、卤泛群、奎宁、奎尼丁、阿莫地喹、阿莫吡喹、磺胺药物、青蒿素、阿替夫林、蒿甲醚、青蒿琥酯、伯氨喹、吸入性NO、L-精氨酸、二丙烯三胺NO-亲核复合体(NO供体)、罗格列酮(PPARγ激动剂)、活性炭、红细胞生成素、左旋咪唑和咯萘啶。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式还可用于有利地与其它治疗剂、例如用于治疗利什曼病、锥虫病、弓形体病和神经型囊尾蚴病的治疗剂组合使用。这类治疗剂包括但不限于硫酸氯喹、阿托伐醌-氯胍、蒿甲醚-本芴醇、硫酸奎宁、青蒿琥酯、奎宁、多西环素、克林霉素、葡甲胺锑酸盐、葡萄糖酸锑钠、米替福新、酮康唑、喷他脒、两性霉素B(AmB)、脂质体-AmB、巴龙霉素、依洛尼塞、硝呋替莫、苏拉明、美拉胂醇、泼尼松龙、苄硝唑、磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、克林霉素、甲氧苄啶(trimetropim)、磺胺甲噁唑、阿奇霉素、阿托伐醌、地塞米松、吡喹酮、阿苯达唑、β-内酰胺、氟喹诺酮、大环内酯、氨基糖苷、磺胺嘧啶和乙胺嘧啶。

由代码号、通用名或商品名确定的活性成分的结构可以从标准汇编“默克索引”的现行版本或者从数据库例如Patents International(例如IMSWorld Publications)获得。

上述可以与(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式组合使用的化合物可以如现有技术、例如上文所引用的文献中所描述的那样进行制备和施用。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式也可以有利地与已知治疗方法、例如激素或尤其是放射的施用组合。

(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式可以特别用作放射增敏剂，尤其是用于治疗对放射疗法敏感性差的肿瘤。

“组合产品”意指一种剂量单位形式的固定组合产品，或者用于组合施用的成套药盒，其中(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和组合伴侣可以在同一时间被独立地施用或者在一定的时间间隔内分别施用，所述时间间隔尤其允许各组合伴侣显示出合作作用，例如协同作用或其任意组合。如本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等意指包括向需要其的单个个体(例如患者)施用所选择的组合伴侣，并且意欲包括其中活性剂不一定通过相同施用途径或不一定同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合”指将多于一种活性成分混合或合并所得的产品，包括活性成分的固定和非固定组合产品。术语“固定组合”指活性成分、例如(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和组合伴侣以单一实体或剂型同时施用于患者。术语“非固定组合”指活性成分、例如(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式和组合伴侣以分开的实体同时、共同或无特定时间限制地依次施用于患者，其中这种施用为患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或3种以上的活性成分。

实施例

实验细节：

以下实施例意欲说明本发明，并且不对其构成任何限定。温度以摄氏度给出。若无另外提及，则所有蒸发均在减压下进行，通常在约15mmHg至100mmHg(＝20-133mbar)之间进行。终产物、中间体和原料的结构通过标准分析方法确证，例如微量分析和光谱特征，例如MS、IR、NMR。所用缩略语是本领域常规的那些。

用于合成本发明的晶型的所有原料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂可以自商业途径获得，或者可以通过本领域技术人员己知的有机合成方法制备(Houben-Weyl第4版.1952，Methods of OrganicSynthesis,Thieme,第21卷)。另外，本发明的晶型可以通过以下实施例中所示的本领域技术人员已知的有机合成方法制备。

缩略语

ACN 乙腈

AcOH 乙酸

aq. 水性的，含水的

Boc 叔丁氧羰基

Boc₂O 二碳酸二叔丁酯

tBu 叔丁基

tBuOH 叔丁醇

BrettPhos 2-(二环己基膦基)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'-三异丙基-1,1'-

联苯

br s 宽单峰

COMU (1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-

吗啉代-碳鎓六氟磷酸盐

conc. 浓的

d 天

d 二重峰

dd 双二重峰

dba 二亚苄基丙酮

DCM 二氯甲烷

DEA 二乙胺

DEAD 偶氮二甲酸二乙酯

DEAP 二乙基氨基吡啶

DIPEA 二异丙基乙胺

DMF 二甲基甲酰胺

DMME 二甲氧基甲烷

DMSO 二甲基亚砜

DPPA 二苯基磷酰基叠氮化物

DPPF 1,1’-双(二苯膦基)二茂铁

EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

eq. 当量

ESI 电喷雾离子化

Et₃N 三乙胺

Et₂O 乙醚

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

h 小时

HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟

磷酸盐

HBTU O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸

盐

HMDS 六甲基二硅胺烷

HOBT 1-羟基-苯并三唑

HPLC 高效液相色谱法

IPA 异丙醇

LCMS 液相色谱-质谱联用

mCPBA 间氯过苯酸

MeOH 甲醇

m 多重峰

min 分钟

MS 质谱

mw 微波

NMR 核磁共振波谱法

NaOtBu 叔丁醇钠

NP 正相

OBD 最佳床密度

Pd₂(dba)₃ 三(二亚苄基丙酮)二钯

PL-HCO₃ MP SPE 用于除去酸的以聚合物为载体的碳酸氢盐柱

prep. 制备型

PPh₃ 三苯膦

q 四重峰

Rac-BINAP 外消旋的2,2′-双(二-对甲苯基膦基)-1,1′-联萘

RP 反相

Rt 保留时间

rt 室温

RuPhos 2-二环己基膦基-2',6'-二-异丙氧基-1,1'-联苯

sat. 饱和的

SCX-2 以聚合物为载体的磺酸大孔聚苯乙烯

soln. 溶液

t 三重峰

TBME 叔丁基甲基醚

TBAF 四丁基氟化铵

TBDMSCl 叔丁基二甲基甲硅烷基氯

四甲基-叔丁基-XPhos 2-二-叔丁基膦基-3,4,5,6-四甲基-2’,4’,6’-三异丙基联苯

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱法

UPLC 超高效液相色谱法

XPhos 2-二环己基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯

Pd[RuPhos] (2-二环己基膦基-2',6'-二异丙基-1,1'-联苯)(2-(2-氨基乙

基)苯基)钯(II)

所用的微波设备是Biotage

所有化合物均采用Autonom命名。

通用色谱信息

LCMS方法M1(Rt _M1 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 50mm

HPLC-柱类型：Acquity UPLC HSS T3,1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积-％甲酸+3.75mM乙酸铵

B)ACN+0.04体积-％甲酸

HPLC-梯度：1.4min 2-98％B，0.45min 98％B，流速＝1.2ml/min

HPLC-柱温：50℃

LCMS方法M2(Rt _M2 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18,2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积-％甲酸+3.75mM乙酸铵

B)ACN+0.04体积-％甲酸

HPLC-梯度：1.4min 2-98％B，0.75min 98％B，流速＝1.2ml/min

HPLC-柱温：50℃

LCMS方法M3(Rt _M3 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18,2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积-％甲酸+3.75mM乙酸铵

B)ACN+0.04体积-％甲酸

HPLC-梯度：8.5min 2-98％B，1min 98％B，流速＝1.2ml/min

HPLC-柱温：50℃

LCMS方法M4(Rt _M4 )

HPLC-柱尺寸：4.6 x 50mm

HPLC-柱类型：SunFire C18,5μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.1体积-％TFA,B)ACN+0.1体积-％TFA

HPLC-梯度：8.0min 5-100％B，B，流速＝2ml/min

HPLC-柱温：40℃

LCMS方法M5(Rt _M5 )

HPLC-柱尺寸：0.46x25cm

HPLC-柱类型：Chiralcel OJ-H(1189)

HPLC-洗脱剂：EtOH/MeOH 60:40

HPLC-梯度：等浓度，流速＝0.5ml/min

检测器：UV 220nm

LCMS方法M6(Rt _M6 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18,2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％TFA,B)ACN+0.04％TFA

HPLC-梯度：1.4min 2-98％B，0.75min 98％B，流速＝1.2ml/min

HPLC-柱温：50℃

LCMS方法M7(Rt _M7 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18,2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％TFA,B)ACN+0.04％TFA

HPLC-梯度：3.0min 10-95％B，1min 95％B，流速＝1.2ml/min

HPLC-柱温：50℃

LCMS方法M8(Rt _M8 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18 2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,

B)乙腈+0.04％甲酸

HPLC-梯度：10-95％B，3.0min，流速＝1.2ml/min

LCMS方法M9(Rt _M9 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18 2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,

B)乙腈+0.04％甲酸

HPLC-梯度：从0.0至0.5min 10％B，然后从0.5min至3.0min梯度10-95％B，流速＝1.2ml/min

LCMS方法M10(Rt _M10 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 50mm

HPLC-柱类型：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.1体积-％甲酸，B)乙腈

HPLC-梯度：1.00min 20-25％B，然后3.20min 25-95％B，然后0.10min95-100％B，然后0.20min 100％，流速＝0.7ml/min

LCMS方法M11(Rt _M11 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 50mm

HPLC-柱类型：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.1体积-％甲酸，B)乙腈

HPLC-梯度：1.00min 5-10％B，然后3.00min 10-90％B，然后0.10min90-100％B，然后0.40min 100％，流速＝0.7ml/min

LCMS方法M12(Rt _M12 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18 2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.1体积-％TFA,B)乙腈

HPLC-梯度：历经1.7min 10-95％B，1.2mL/min作为溶剂流，然后历经0.7min 95％B，流速＝1.4mL/min。

LCMS方法M13(Rt _M13 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18 2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,

B)乙腈+0.04％甲酸

HPLC-梯度：10-95％B，3.7min，流速＝1.2ml/min

LCMS方法M14(Rt _M14 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 30mm

HPLC-柱类型：Ascentis Express C18,2.7μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,

B)乙腈+0.04％甲酸

HPLC-梯度：1.5min 10-95％B，1min 95％B，流速＝1.2ml/min

LCMS方法M15(Rt _M15 )

HPLC-柱尺寸：0.46x25cm

HPLC-柱类型：Chiralcel OD-H(1194)

HPLC-洗脱剂：己烷/EtOH 50:50+0.05％DEA

HPLC-梯度：等浓度，流速＝0.5ml/min

检测器：UV 220nm

LCMS方法M16(Rt _M16 )

HPLC-柱尺寸：2.1 x 50mm

HPLC-柱类型：Acquity UPLC HSS T3,1.8μm

HPLC-洗脱剂：A)水+0.05体积-％甲酸+3.75mM乙酸铵

B)ACN+0.04体积-％甲酸

HPLC-梯度：1.4min 5-98％B，0.4min 98％B，流速＝1.0ml/min

HPLC-柱温：60℃

X-射线粉末衍射

设备:

方法X1

熔点测定：

通过差示扫描量热法(DSC)确定熔点。在TA Instruments DSC Q2000上采用10℃/min加热速率记录DSC。在标准铝盘(盘+盖，TA 900786.901，900779.901)中量取0.6mg样品。该仪器采用Thermal Advantage Q-Series软件V.2.6.0.367和Thermal Advantage软件V4.6.9进行操作。热事件采用Universal Analysis V4.3A Build 4.3.0.6进行表征。将样品在没有针孔的样品盘进行测定。将样品根据以下方案进行处理：

步骤1:于0℃平衡

步骤2:以10℃/min逐步升至300℃

实施例F1:(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮

a)7-氯-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪

将7-氯-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-2-酮(CAS登记号928118-43-8)(3.70g,20mmol)在THF(63ml)中的溶液用BH₃*THF(1M在THF中，47ml,47mmol)处理。将反应混合物在75℃搅拌1h，然后冷却至室温，用甲醇(24ml,600mmol)淬灭。将反应混合物减压浓缩，将残余物用EtOAc溶解，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。将有机层经MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到标题产物，为浅黄色固体(3.3g,96％产率)。

UPLC Rt_M1＝0.47min；ESIMS:171[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.53(s,1H),7.11(br s,1H),6.47(s,1H),4.09(t,2H),3.17-3.38(m,2H)。

b)2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-醇

将7-氯-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪(1.08g,6.33mmol)、KOH水溶液(1.07g,19mmol KOH,在5.4mL水中)、2-二-叔丁基膦基-3,4,5,6-四甲基-2’,4’,6-三-异丙基联苯98％(0.30g,0.63mmol)和Pd₂(dba)₃(0.29g,0.32mmol)在二噁烷(32.5ml)中的混合物用氮气脱气三次，将管密封，将反应混合物在100℃搅拌5小时。冷却至室温后，将反应混合物经hyflo过滤，用EtOAc和甲醇冲洗。将滤液浓缩，经硅胶快速色谱法纯化(DCM/MeOH，98:2至75:25)后，得到标题化合物，为橙色残余物(660mg,69％产率)

UPLC Rt_M1＝0.34min；ESIMS:153[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.33(br s,1H),7.03(br s,1H),6.71(s,1H),5.15(s,1H),3.95(t,2H),3.25(m,2H)。

c)(S)-3-(2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基)-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

将2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-醇(0.66g,4.34mmol)和(R)-3-甲磺酰基氧基-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(CAS登记号127423-61-4)(1.73g,6.51mmol)在DMF(40ml)中的无水溶液用氢化钠(60％，在矿物油中，0.21g,8.68mmol)处理，将反应混合物在80℃搅拌18小时。冷却至室温后，将反应混合物用TBME稀释，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。将有机层经MgSO₄干燥，过滤，浓缩，经硅胶快速色谱法纯化(环己烷/EtOAc,95:5至30:70)后，得到标题化合物，为黄色油状物(1.035g,75％纯度，56％产率)。

UPLC Rt_M1＝0.65min；ESIMS:322[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.54(s,1H),5.86(s,1H),5.42(br s,1H),4.25-4.41(m,1H),4.19(t,2H),3.38-3.66(m,6H),2.00-2.18(m,2H),1.46(d,9H)。

d)(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

将(S)-3-(2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基)-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(254mg,0.79mmol)、5-溴-2-甲氧基-3-甲基吡啶(CAS登记号760207-87-2)(208mg,1.03mmol)、XPhos(30mg,0.06mmol)和NaOtBu(167mg,1.74mmol)在二噁烷(6ml)中的混合物用氩气脱气5min，然后加入Pd₂(dba)₃(29mg,0.03mmol)。将管填充氩气，密封，将反应混合物在100℃搅拌2小时。冷却至室温后，将反应混合物经hyflo过滤，用EtOAc冲洗，将滤液用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。将水层用EtOAc重萃取两次，将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，经硅胶快速色谱法纯化(庚烷/EtOAc，100:0至50:50)后，得到标题化合物，为清澈的胶(274mg,78％产率)。UPLC Rt_M1＝1.20min；ESIMS:443[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.93(d,1H),7.61(br s,1H),7.30-7.35(m,1H),5.71(s,1H),5.34-5.46(m,1H),4.31(br s,2H),3.99(s,3H),3.68(t,2H),3.34-3.62(m,4H),2.23(s,3H),2.01-2.09(m,2H),1.44(s,9H)。

e)1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-7-((S)-吡咯烷-3-基氧基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪

将(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(364mg,0.82mmol)在DCM(6ml)中的溶液用TFA(0.63ml,8.23mmol)处理，将反应混合物于室温搅拌18h，然后用饱和NaHCO₃水溶液淬灭，用DCM萃取。将有机层经MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到标题产物，为红色油状物，将其未经进一步纯化用于下一步骤(313mg,90％纯度，定量产率)。

UPLC Rt_M1＝0.65min；ESIMS:343[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.93(d,1H),7.62(s,1H),7.32(d,1H),5.70(s,1H),5.26-5.36(m,1H),4.31(t,2H),3.99(s,3H),3.67(t,2H),2.95-3.15(m,3H),2.81-2.92(m,1H),2.22(s,3H),1.98-2.10(m,1H),1.79-1.90(m,1H)。

f)(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮

将1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-甲酸(CAS登记号64096-87-3)(106mg,0.59mmol)在DMF(4ml)中的溶液用HBTU(225mg,0.59mmol)和DIPEA(0.24ml,1.37mmol)处理。将所得橙色溶液于室温搅拌5min，然后加入1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-7-((S)-吡咯烷-3-基氧基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪(156mg,0.46mmol)在DMF(2ml)中的溶液。将反应混合物于室温搅拌1h，然后减压浓缩，将残余物用DCM溶解，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。通过使其通过相分离柱将有机层干燥，浓缩，经SFC色谱(柱DEAP(250mm x 30mm，60A，5μm)Princeton，梯度11-16％的在超临界CO₂中的甲醇，6min)后，得到标题化合物，为略带颜色的固体(112mg,49％产率)。

UPLC Rt_M1＝0.81min；ESIMS:503[(M+H)⁺]。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.01(s,1H),7.61(m,1H),7.52(d,1H),5.52(d,1H),5.24-5.43(m,1H),4.26(br s,2H),3.89(s,3H),3.59-3.79(m,3H),3.41-3.56(m,2H),3.21-3.39(m,1H),2.98-3.21(m,4H),2.67-2.83(m,1H),1.84-2.20(m,9H)。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆):δ8.01(s,1H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.51(m,1H),5.55-5.51(m,1H),5.43-5.24(m,1H),4.29-4.22(m,2H),3.90(s,3H),3.80-3.60(m,2H),3.56-3.37(m,3H),3.28-2.99(m,5H),2.89-2.66(m,1H),2.19-2.09(m,4H),2.08-1.98(m,2H),1.98-1.86(m,3H)。

通过在异丙醇/乙醚中加热和冷却进行实施例F1的结晶

将474mg无定形的实施例F1混悬于1.4mL异丙醇中。将混合物加热至70℃，在70℃搅拌以完全溶解实施例F1。将溶液冷却至室温，形成胶状残余物。加入2mL乙醚，将浆体搅拌48小时。形成白色混悬液。将混悬液过滤，将固体在40℃、15mbar干燥。得到细的白色粉末。该物质只包含略微残余的溶剂(<0.5％)。得到具有148.77℃的起始熔点的实施例F1的无水结晶形式。

实施例F1的无水结晶形式(方法M1)的X-射线粉末衍射图(允许误差±0.5)的最显著的2θ峰的列表(信息包括了低/弱峰)。注意:峰列表不是穷举的，而仅仅是“尤其明显的”。

2θ(度)	强度
		9.1	低
10.2	中等
		11.9	中等
13.0	低
		17.1	强
17.7	中等，未解析
		18.7	中等
20.3	中等，未解析
		20.8	中等，未解析
26.0	中等/低
		26.7	中等
23.2	中等/低
		24.1	中等/低
24.8	中等/低
		29.3	中等/低
27.4	中等/低
		21.4	中等/低

生物学评价

化合物的活性可以通过以下体外或体内方法评估。

生物学测定

1 酶PI3Kα和PI3Kδ同工型抑制的测定

1.1 脂质激酶活性试验

化合物作为PI3激酶抑制剂的效能可以如下证明：

在半面积的COSTAR 96孔板以50μl/孔的终体积进行激酶反应。在该测定中，ATP和磷脂酰肌醇的终浓度分别为5μM和6μg/mL。加入PI3激酶如PI3激酶δ引发反应。

p110δ：每孔如下加入试验组分：

·第2-1列，每孔10μL测试化合物在5％DMSO中的溶液。

·在第1列的前4个孔和第12列的后4个孔中加入10μL 5％体积/体积DMSO来测定总活性。

·在第1列的后4个孔和第12列的前4个孔中加入10μM对照化合物来测定背景。

·对每块板而言制备2mL“试验混合物”：

1.912mL HEPES试验缓冲液

8.33μl 3mM ATP储备液，得到终浓度为5μM/孔

1μl处于活性期的[³³P]ATP，得到0.05μCi/孔

30μl 1mg/mL PI储备液，得到终浓度为6μg/mL/孔

5μl 1M MgCl₂储备液，得到终浓度为1mM/孔

·每孔加入20μl试验混合物。

·对每块板而言制备2mL“酶混合物”(在2mL激酶缓冲液中含有x^*μlPI3激酶p110β)。在加入试验板期间将“酶混合物”置于冰上。

·每孔加入20μl“酶混合物”以引发反应。

·然后将板于室温温育90分钟。

·向每孔加入50μL WGA-SPA珠(麦胚凝集素包被的闪烁亲近测定珠)的混悬液终止反应。

·采用TopSeal-S(聚苯乙烯微量板的热密封条，PerkinElmer LAS[Deutschland]GmbH,Rodgau,德国)密封试验板，于室温温育至少60分钟。

·然后采用Jouan台式离心机(Jouan Inc.,Nantes,法国)将试验板于1500rpm离心2分钟。

·采用Packard TopCount对试验板计数，每孔计数20秒。

*酶体积取决于所用批次的酶活性。

在更优选的试验中，在低体积非结合的CORNING 384孔黑色板(目录号#3676)中以每孔10μl的终体积进行激酶反应。该试验中ATP和磷脂酰肌醇(PI)的终浓度分别为1μM和10μg/mL。通过加入ATP引发反应。

每孔如下加入试验组分：

第1-20列，每孔50nl测试化合物在90％DMSO中的溶液，8个浓度(1/3和1/3.33系列稀释步骤)，单份。

·低对照：第23-24列的一半孔加入50nl 90％DMSO(终浓度0.45％)。

·高对照：第23-24列的另一半孔加入50nl参照化合物(例如WO2006/122806的实施例7的化合物)(终浓度2.5μM)。

·标准：第21-22列，50nl如试验化合物刚提及的那样稀释的参照化合物。

·对每份试验而言制备20mL“缓冲液”：

200μl 1M TRIS HCl pH7.5(终浓度为10mM)

60μl 1M MgCl₂(终浓度为3mM)

500μl 2M NaCl(终浓度为50mM)

100μl 10％CHAPS(终浓度为0.05％)

200μl 100mM DTT(终浓度为1mM)

18.94mL超纯水

·对每份试验而言制备10mL“PI”：

200μl 1mg/mL l-α-磷脂酰肌醇(Liver Bovine,Avanti Polar Lipids目录号840042C MW＝909.12)，在3％辛基葡糖苷中制备(终浓度为10μg/mL)

9.8mL“缓冲液”

·对每份试验而言制备10mL“ATP”：

6.7μl 3mM ATP储备液，得到终浓度为1μM/孔

10mL“缓冲液”

·对每份试验而言在具有如下终浓度的“PI”中制备2.5mL各PI3K构建体：

10nM PI3KαEMV B1075

25nMβEMV BV949

10nMδEMV BV1060

150nMγEMV BV950

·每孔加入5μl“PI/PI3K”。

·每孔加入5μl“ATP”以引发反应。

·然后将板于室温温育60分钟(α、β、δ)或120分钟(γ)。

·通过加入10μl激酶-Glo(Promega Cat.No.#6714)终止反应。

·10分钟后，在积分时间为100毫秒且灵敏度设置为191的Synergy 2读数器(BioTek,Vermont USA)中对试验板进行读数。

·输出：高对照为约60’000计数，低对照为30’000或更低。

·该发光试验给出在0.4至0.7之间的有用的Z’比率。

Z’值是试验的稳定性的通用量度。Z’在0.5至1.0之间被认为是优异的试验。

对于此试验，如下制备所提及的PI3K构建体：

1.2基因构建体的产生

使用两个不同构建体BV 1052和BV 1075以产生用于化合物筛选的PI3激酶α蛋白。

PI3KαBV-1052 p85(iSH2)-Gly接头-p110a(D20aa)-C-端His标签

p85亚基的内部SH2结构域(iSH2)和p110-a亚基(前20个氨基酸缺失)的PCR产物通过重叠PCR产生并融合。

iSH2PCR产物由第一链cDNA产生，最初使用引物gwG130-p01(5’-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO:1)和gwG130-p02(5’-TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’)(SEQ ID NO:2)。

随后，在第二PCR反应中，使用引物gwG130-p03(5’-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO:3)和gwG152-p04(5’-TACCATAATTCCACCACCACCACCGGAAATTCCCCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’)(SEQ ID NO:4)分别在p85iSH2片段的5’端和3’端添加Gateway(Invitrogen AG,瑞士巴塞尔)重组AttB1位点和接头序列。

p110-a片段也由第一链cDNA产生,最初使用引物gwG152-p01(5’-CTAGTGGAATGTTTACTACCAAATGG-3’)(SEQ ID NO:5)和gwG152-p02(5’-GTTCAATGCATGCTGTTTAATTGTGT-3’)(SEQ IDNO:6)。

在随后的PCR反应中，使用引物gw152-p03(5’-GGGGGAATTTCCGGTGGTGGTGGTGGAATTATGGTAC-TAGTGGAATGTTTACTACCAAATGGA-3’)(SEQ ID NO:7)和gwG152-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCGTTCAATG-CATGCTGTTTAATTGTGT-3’)(SEQ ID NO:8)分别在p110-a片段的5’端和3’端添加接头序列和组氨酸标签。

p85-iSH2/p110-a融合蛋白在第三PCR反应中、通过在iSH2片段3’端和p110-a片段5’端的重叠接头、使用上述gwG130-p03引物和含有重叠组氨酸标签和AttB2重组序列(5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCTCC-3’)(SEQID NO:9)的引物进行装配。

将该终产物在(Invitrogen)OR反应中重组至供体载体pDONR201中以产生ORF318进入克隆。该克隆通过测序验证，用于Gateway LR反应中以转移插入片段至Gateway适配的pBlueBac4.5(Invitrogen)载体中用于生成杆状病毒表达载体LR410。

PI3KαBV-1075 p85(iSH2)-12 XGly接头-p110a(D20aa)-C-端His标签

杆状病毒BV-1075的构建体通过三部分连接生成，包括p85片段和p110-a片段被克隆至载体pBlueBac4.5中。p85片段衍生自用Nhe/Spe消化的质粒p1661-2。p110-a片段衍生自LR410(参见上文)，作为SpeI/HindIII片段。克隆载体pBlueBac4.5(Invitrogen)用Nhe/HindIII消化。这导致构建体PED 153.8。

p85组分(iSH2)通过PCR、使用ORF 318(上文所述)作为模板和一个正向引物KAC1028(5’-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAATATACC)(SEQ ID NO:10)和两个反向引物KAC1029(5’-GCCTCCACCACCTCCGCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ ID NO:11)和KAC1039(5’-TACTAGTCCGCCTCCACCACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID NO:12)产生。

两个反向引物重叠并掺入12x Gly接头和p110a基因的N-末端序列于SpeI位点。12x Gly接头替换BV1052构建体中的接头。将PCR片段克隆至pCR2.1TOPO(Invitrogen)中。在所得克隆中，确定p1661-2是正确的。该质粒用Nhe和SpeI消化，将所得片段凝胶分离并纯化用于亚克隆。

p110-a克隆片段通过克隆LR410(参见上文)被SpeI和HindIII酶消化而产生。SpeI位点位于p110a基因的编码区。将所得片段凝胶分离并纯化用于亚克隆。

克隆载体pBlueBac4.5(Invitrogen)通过用Nhe和HindIII进行酶消化而制备。切开的载体用Qiagen(Quiagen N.V,Venlo,荷兰)柱纯化，然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)(New England BioLabs,Ipswich,MA)脱磷酸化。CIP反应完成后，再次将切开的载体进行柱纯化以产生最终的载体。使用Roche Rapid连接酶和供应商说明书进行三部分连接反应。

PI3KβBV-949 p85(iSH2)-Gly接头-p110b(全长)-C-端His标签

p85亚基的内部SH2结构域(iSH2)和全长p110-b亚基的PCR产物通过重叠PCR产生并融合。

随后，在第二PCR反应中，Gateway(Invitrogen)重组AttB1位点和接头序列被分别添加至p85iSH2片段的5’端和3’端，使用引物gwG130-p03(5’-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO:3)和gwG130-p05(5’-ACTGAAGCATCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID NO:13)。

p110-b片段也由第一链cDNA产生，最初使用引物gwG130-p04(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTTCAGTTTCATAATGCC-TCCTGCT-3’)(SEQ ID NO:4)(其含有接头序列和p110-b的5’端)和gwG130-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATCTGTAGTCTTT-CCGAACTGTGTG-3’)(SEQ ID NO:14)(其含有融合了组氨酸标签的p110-b的3’端序列)。

p85-iSH2/p110-b融合蛋白通过重叠PCR、iSH2片段3’端和p110-b片段5’端的接头的反应、使用以上提及的gwG130-p03引物和含有重叠组氨酸标签和AttB2重组序列的引物(5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTT-AAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’)(SEQ ID NO:15)进行装配。

将该终产物在Gateway(Invitrogen)OR反应中重组至供体载体pDONR201中以产生ORF253进入克隆。该克隆通过测序验证，用于Gateway LR反应以转移插入片段至Gateway适配的pBlueBac4.5(Invitrogen)载体中，用于产生杆状病毒表达载体LR280。

PI3KδBV-1060 p85(iSH2)-Gly接头-p110d(全长)-C-端His标签

p85亚基的内部SH2结构域(iSH2)和全长p110-d亚基的PCR产物通过重叠PCR产生并进行融合。

iSH2 PCR产物由第一链cDNA产生，最初应用引物gwG130-p01(5’-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO:1)和gwG130-p02(5’-TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’)(SEQ ID NO:2)。随后在第二PCR反应中，应用引物gwG130-p03(5’-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACAT-ATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO:3)和gwG154-p04(5’-TCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID NO:16)分别在p85iSH2片段的5’端和3’端加上Gateway(Invitrogen)重组AttB1位点和接头序列。

p110-a片段也由第一链cDNA产生，最初应用引物gwG154-p01(5’-ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’)(SEQ ID NO:17)和gwG154-p02(5’-CTACTG-CCTGTTGTCTTTGGACACGT-3’)(SEQ IDNO:18)。

在随后的PCR反应中，应用引物gw154-p03(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’)(SEQ ID NO:19)和gwG154-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGAT-GGTGATGTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’)(SEQ ID NO:20)分别在p110-d片段的5’端和3’端加上接头序列和组氨酸标签。

p85-iSH2/p110-d融合蛋白是在第三PCR反应中，通过iSH2片段3’端和p110-d片段5’端的重叠接头、使用上述gwG 130-p03引物和包含重叠组氨酸标签和Gateway(Invitrogen)AttB2重组序列的引物(5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’)(SEQ ID NO:21)而组装。

将该终产物在Gateway(Invitrogen)OR反应中重组到供体载体pDONR201中以产生ORF319进入克隆。该克隆经测序确证，用于在Gateway LR反应中将插入片段转移至Gateway适配的pBlueBac4.5(Invitrogen)载体中，以产生杆状病毒表达载体LR415。

PI3KγBV-950 p110g(D144aa)-C-端His标签

该构建体获自Roger Williams实验室,MRC Laboratory of MolecularBiology,剑桥,UK(2003年11月)。构建体的描述参见Pacold M.E.等人(2000)Cell 103,931-943。

1.3 蛋白质表达和纯化

产生PI3K同种型重组杆状病毒和蛋白质的方法：将含有不同PI3激酶基因的pBlue-Bac4.5(对于a、b和d同种型)或pVL1393(对于g)质粒用BaculoGold WT基因组DNA(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)共转染，使用供应商推荐的方法。随后，将转染得到的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞上噬斑纯化，以生成若干表达重组蛋白的分离物。通过抗-HIS或抗同种型抗体的蛋白质印迹分析选择阳性克隆。对于PI3Kα和δ同种型，对PI3K的首次克隆病毒储备物进行二次噬斑纯化。以低感染复数(moi)进行所有杆状病毒分离物的扩增，以生成高滴度、低传代储备物用于蛋白生成。杆状病毒命名为BV1052(α)和BV1075(α)、BV949(β)、BV1060(δ)和BV950(γ)。

蛋白质生产包括在2L玻璃Erlenmyer烧瓶(110rpm)或摇式生物反应器(wave-bioreactor)(22-25rpm)中以moi 2-10感染(3代或更低)在无蛋白培养基中悬浮的Tn5(Trichoplusia ni)或TiniPro(Expression Systems,LLC,Woodland,CA,USA)细胞达39-48小时。最初，将10L工作体积的摇式生物反应器以3e5细胞/ml的密度以半容量(5L)接种。将反应器以15rpm在细胞生长期摇晃72小时，添加5％氧与空气混合物(每分钟0.2L)。在感染前，立即分析摇式反应器的密度、存活力，并稀释至约1.5e6细胞/ml。再培养2-4小时后，加入100-500ml高滴度、低传代的病毒。对于39-48小时的感染期，增加氧至35％，摇晃平台的rpm增至25。在感染期间，通过Vicell存活力分析仪(Beckman Coulter,Inc,Fullerton,CA,USA)生物过程监测细胞的存活力、直径和密度。每12-18小时直至收集，读取各种参数和代谢物(pH、O₂饱和度、葡萄糖等)的Nova Bioanalyzer(NOVABiomedical Corp.,Waltham,MA,USA)读数。感染后48小时内收集摇式生物反应器的细胞。离心收集细胞(4℃/1500rpm)，随后在汇集沉淀期间保持在冰上用于裂解和纯化。用少量冷的未添加的Grace培养基(无蛋白酶抑制剂)制备沉淀汇集物。

用于HTS的PI3Kα纯化方案(BV1052)

PI3Kα以三个色谱步骤纯化：使用Ni琼脂糖树脂的固定化金属亲和色谱(GE Healthcare,属于General Electric Company,Fairfield,CT,USA)、使用Superdex 200 26/60柱(GE Healthcare)的凝胶过滤，和最后在SP-XL柱(GE Healthcare)上的阳离子交换步骤。所有缓冲液冷却至4℃，裂解在冰上冷却进行。柱分离于室温迅速进行。

通常，将冷冻的昆虫细胞在高渗裂解缓冲液中裂解，并施加至准备好的IMAC柱上。将树脂用3-5个柱体积的裂解缓冲液洗涤，继而用3-5个柱体积的含有45mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，然后用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析各级分，汇集含有目标蛋白的级分，施加至准备好的GFC柱。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自GFC柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将来自GFC柱的汇集物用低盐缓冲液稀释，施加至准备好的SP-XL柱。将柱用低盐缓冲液洗涤，直至得到稳定的A280基线吸收，使用0mM NaCl至500mM NaCl的20个柱体积梯度洗脱。同样，通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自SP-XL柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将最终的汇集物透析至含有50％甘油的储备缓冲液中，储存于-20℃。在磷酸肌醇激酶试验中分析最终汇集物的活性。

用于HTS的PI3Kβ纯化方案(BV949)

PI3Kβ以两个色谱步骤纯化：使用Ni琼脂糖树脂(GE Healthcare)的固定化金属亲和色谱(IMAC)和使用Superdex 200 26/60柱(GE Healthcare)的凝胶过滤(GFC)。所有缓冲液冷却至4℃，裂解在冰上冷却进行。柱分离于室温迅速进行。

通常，将冷冻的昆虫细胞在高渗裂解缓冲液中裂解，并施加至准备好的IMAC柱上。将树脂用3-5个柱体积的裂解缓冲液洗涤，继而用3-5个柱体积的含有45mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，然后用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析各级分，汇集含有目标蛋白的级分，施加至准备好的GFC柱。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自GFC柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将最终的汇集物透析至含有50％甘油的储备缓冲液中，储存于-20℃。在磷酸肌醇激酶试验中分析最终汇集物的活性。

用于HTS的PI3Kγ纯化方案(BV950)

PI3Kγ以两个色谱步骤纯化：使用Ni琼脂糖树脂(GE Healthcare)的固定化金属亲和色谱(IMAC)和使用Superdex 200 26/60柱(GE Healthcare)的凝胶过滤(GFC)。所有缓冲液冷却至4℃，裂解在冰上冷却进行。柱分离于室温迅速进行。通常，将冷冻的昆虫细胞在高渗裂解缓冲液中裂解，并施加至准备好的IMAC柱上。将树脂用3-5个柱体积的裂解缓冲液洗涤，继而用3-5个柱体积的含有45mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，然后用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析各级分，汇集含有目标蛋白的级分，施加至准备好的GFC柱。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自GFC柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将最终的汇集物透析至含有50％甘油的储备缓冲液中，储存于-20℃。在磷酸肌醇激酶试验中分析最终汇集物的活性。

用于HTS的PI3Kδ纯化方案(BV1060)

PI3Kδ以三个色谱步骤纯化：使用Ni琼脂糖树脂(GE Healthcare)的固定化金属亲和色谱、使用Superdex 200 26/60柱(GE Healthcare)的凝胶过滤，和最后在Q-HP柱(GE Healthcare)上的阴离子交换步骤。所有缓冲液冷却至4℃，裂解在冰上冷却进行。柱分离于室温迅速进行。通常，将冷冻的昆虫细胞在高渗裂解缓冲液中裂解，并施加至准备好的IMAC柱上。将树脂用3-5个柱体积的裂解缓冲液洗涤，继而用3-5个柱体积的含有45mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，然后用含有250mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析各级分，汇集含有目标蛋白的级分，施加至准备好的GFC柱。通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自GFC柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将来自GFC柱的汇集物用低盐缓冲液稀释，施加至准备好的Q-HP柱。将柱用低盐缓冲液洗涤，直至得到稳定的A280基线吸收，使用0mM NaCl至500mM NaCl的20个柱体积梯度洗脱。同样，通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析来自Q-HP柱的级分，汇集含有目标蛋白的级分。将最终的汇集物透析至含有50％甘油的储备缓冲液中，储存于-20℃。在磷酸肌醇激酶试验中分析最终汇集物的活性。

通过“excel fit”附带的四参数曲线拟合程序确定IC₅₀。使用四参数逻辑方程计算每一化合物8个浓度(通常10、3.0、1.0、0.3、0.1、0.030、0.010和0.003μM)百分抑制率的IC₅₀值(IDBS XLfit)。或者，使用idbsXLfit模型204——一种四参数逻辑模型计算IC₅₀值。

或者，对于ATP耗竭试验，将待测试的化合物溶于DMSO，以0.5μL每孔直接分配至白色384-孔板。为开始反应，向每孔添加10μL 10nM PI3激酶和5μg/mL 1-α-磷脂酰肌醇(PI)，继而添加10μL 2μM ATP。进行反应，直至约50％的ATP被耗竭，然后添加20μL激酶-Glo溶液(Promega Corp.,Madison,WI,USA)终止反应。将终止的反应物温育5分钟，然后经由发光检测剩余的ATP。然后确定IC50值。

在本发明的一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在酶PI3Kδ试验中为1nM至500nM。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在酶PI3Kδ试验中为1nM至100nM。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在酶PI3Kδ试验中为0.5nM至10nM。

在本发明的一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在细胞PI3Kδ试验中为1nM至1000nM。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在细胞PI3Kδ试验中为1nM至500nM。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于一种或多种其它同工型而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少10倍。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于一种或多种其它同工型而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少20倍。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于不同的旁系同源体PI3Kα和β而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少10倍。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于不同的旁系同源体PI3Kα和β而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少20倍。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在细胞PI3Kδ试验中为1nM至500nM，且其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于不同的旁系同源体PI3Kα和β而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少10倍。

在本发明的另一项实施方案中，PI3K抑制剂，其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中表示为IC₅₀的活性范围在细胞PI3Kδ试验中为1nM至500nM，且其中所述抑制剂对PI3K同工型δ具有抑制作用，其中所述抑制剂显示出相对于不同的旁系同源体PI3Kα和β而言对PI3K同工型δ的选择性，其中该选择性为至少20倍。

2.细胞试验

2.1 Rat-1细胞中磷酸肌醇-3激酶(PI3K)介导的Akt 1/2(S473)磷酸化

将稳定过表达人磷酸肌醇-3激酶(PI3K)α、β或δ的催化亚基的肉豆蔻酰化形式的Rat-1细胞以7500(PI3Kα)、6200(PI3Kβ)或4000(PI3Kδ)细胞的密度接种于384-孔板中的30ul完全生长培养基(达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM高葡萄糖)，所述培养基补充有10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)MEM非必需氨基酸、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、10μg/mL嘌罗霉素和1％(v/v)青霉素/链霉素)，在37℃/5％CO₂/95％湿度孵育24h。将化合物在384-孔化合物板中稀释以获得40个测试化合物在90％DMSO中的8-点系列稀释液以及4个参考化合物加上16个高对照和16个低(抑制)对照。使用Hummingwell纳升分配器将250nl化合物溶液分配吸取到384-孔聚丙烯板中而制得预稀释板。通过加入49.75ul完全生长培养基来预稀释化合物。使用384-孔移液器将10ul预稀释化合物溶液转移至细胞板，产生DMSO终浓度为0.11％。将细胞在37℃/5％CO₂/95％湿度孵育1h。移去上清液，将细胞裂解于20ul裂解缓冲液中，用于检测。

对于p-Akt(Ser473)的检测，使用p-Akt 1/2(Ser473)测定试剂盒(PerkinElmer，美国)。使用384-孔移液器将5ul细胞裂解液转移至384-孔低体积Proxiplates以用于检测。根据厂家方案加入试剂。首先，加入5ul反应缓冲液加含有受体珠的活化缓冲液混合物，将板密封，并在板振荡仪上于室温温育2小时。其次，加入2ul含有供体珠的稀释缓冲液，并将板在上述振荡仪上再温育2小时。使用标准设置在兼容板读数器上对板进行读数。

2.2 鼠B细胞活化的测定

已经确认，当细胞通过B细胞受体(BCR)受刺激时，PI3Kδ可调节B细胞功能(Okkenhaug等人,Science 297:1031(2002)。对于评估化合物对B细胞活化的抑制性质，在用抗-IgM刺激后测量了源自小鼠脾抗体的鼠B细胞上的活化标记物CD86和CD69的上调。CD69是B和T细胞的熟知的活化标记物(Sancho等人,Trends Immunol.26:136(2005)。CD86(也称为B7-2)主要在抗原呈递细胞、包括B细胞上表达。静息B细胞以低水平表达CD86，但是在例如BCR或IL-4受体受刺激后上调CD86。B细胞上的CD86与T细胞上的CD28相互作用。这种相互作用对于最佳T细胞活化和产生最佳IgG1响应而言是需要的(Carreno等人,Annu Rev Immunol.20:29(2002))。

收集来自Balb/c小鼠的脾，分离脾细胞并用含有10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES、100个单位/mL青霉素/链霉素的RPMI洗涤两次。以这种方式补充的RPMI此后称为培养基。将细胞在培养基中调节至2.5X 10⁶个细胞/mL，将200μl细胞混悬液(5x10⁶个细胞)加至96孔板的适当孔中。

然后通过加入培养基中的50μl抗-IgM mAb(终浓度：30μg/mL)刺激细胞。在37℃孵育24小时后，将细胞用下列抗体合剂染色：用于评估B细胞的抗-小鼠CD86-FITC、抗-小鼠CD69-PerCP-Cy5.5、抗-小鼠CD19-PerCP以及用于评估T细胞的抗-小鼠CD3-FITC、抗-小鼠CD69-PE(每种抗体2μl/孔)。于室温(RT)在暗处1小时后，将细胞转移至96深孔板中。将细胞用1mL含有2％FBS的PBS洗涤1次，在重新混悬于200μl中后，将样品在FACS Calibur流式细胞仪上进行分析。在FSC/SSC斑点印迹中根据大小和粒度对淋巴细胞进行门控并进一步用于分析CD19、CD3和活化标记物(CD86、CD69)的表达。使用BD CellQest软件，将来自斑点印迹的数据计算成CD19+或CD3+群体内对活化标记物阳性染色的细胞的百分比。

对于评估化合物的抑制性质，首先将化合物溶解并稀释于DMSO中，然后在培养基中以1:50稀释。将来自Balb/c小鼠的脾细胞分离，重新混悬，并转移至96孔板(200μl/孔)，如上所述。将经稀释的化合物或溶剂加至板(25μl)中并在37℃孵育1小时。然后在37℃将培养物用25μl抗-IgM mAb/孔(终浓度30μg/mL)刺激24小时，用抗-小鼠CD86-FITC和抗-小鼠CD19-PerCP(每种抗体2μl/孔)染色。如上所述通过流式细胞仪对CD19阳性B细胞上的CD86表达进行定量。

2.3 大鼠B细胞活化的测定

已经确认，当细胞通过B细胞受体(BCR)受刺激时，PI3Kδ可调节B细胞功能(Okkenhaug等人,Science 297:1031(2002)。对于评估化合物对B细胞活化的抑制性质，在用抗-IgM和重组IL-4刺激后测量了源自全血的大鼠B细胞上的活化标记物CD86的上调。CD86分子(也称为B7-2)主要在抗原呈递细胞、包括B细胞上表达。静息B细胞以低水平表达CD86，但是在例如BCR或IL-4受体受刺激后上调CD86。B细胞上的CD86与T细胞上的CD28相互作用。这种相互作用对于最佳T细胞活化和产生最佳IgG1响应而言是需要的(Carreno等人,Annu Rev Immunol.20:29(2002))。

大鼠血液的收集

通过采用具有预涂覆肝素钠的皮下注射针的10ml注射器从成年雄性Lewis鼠(LEW/HanHsd)腹主动脉收集全血。将血液转移至50ml Falcon管中，将抗凝剂浓度调节至100U/ml。

刺激大鼠B细胞和用特定抑制剂处理

对于评价免疫抑制药物的体外作用，用培养基将肝素化血预稀释至50％。将补充有100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺,50mg/ml右旋糖酐40和5％胎牛血清(FCS,Fetaclone I,Gibco#10270-106)的DMEM高葡萄糖(Animed cat#1-26F01-I)作为培养基。然后，在96孔U-底微孔板(Nunc)中向190μl预稀释血加入10μl预稀释测试化合物，得到3-倍系列稀释，浓度范围为20至0.0003μM。将对照孔用DMSO预处理，得到0.5％DMSO的终浓度。培养物一式两份进行设置，通过在板振荡器(Heidolph Titramax 101；30秒，速度900)上振荡进行充分混合，上下抽吸，在板振荡器上再次振荡。将培养物在37℃、5％CO₂温育1小时。然后，加入20μl多克隆山羊抗大鼠IgM Ab(Serotec,cat#302001)和10μl稀释的重组rIL-4(Immunotools#340085)，分别得到30μg/ml和5ng/ml的最终浓度。通过在如上的板振荡器上振荡将各板混合，在37℃、5％CO₂温育24小时。

通过流式细胞仪测定B细胞活化

温育后，将15μl 25mM EDTA溶液加入各孔中，振荡15min以使粘附细胞脱粘附。然后，对于分析表面活化标记物，将样品用PE-Cy5-标记的抗大鼠CD45RA(BD cat#557015)染色以允许在FACS分析中在B细胞上设门控。另外，将样品用PE-标记的抗大鼠CD86(BD cat#551396)染色。所有染色操作于室温在暗处进行30min。温育后，将样品转移至含2ml/孔的BD裂解溶液(BD#349202)的96-深孔V-底微孔板(Corning#396096)。红细胞裂解后，将样品用2ml CellWASH(BD#349524)洗涤。在LSRII或FACScalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上分别使用Cellquest Plus或DIVA(6.1.1版)软件采集数据。在FSC/SSC斑点印迹中根据大小和粒度对淋巴细胞进行门控，进一步分析CD45RA和活化标记物的表达。将来自斑点印迹或直方图的数据计算成CD45RA+群体内对活化标记物阳性染色的细胞的百分比。

统计学评价

通过下式计算在暴露于药物后B细胞活化的抑制百分比：

使用ORIGIN 7软件(OriginLab Corporation,Northampton,MA)进行非线性回归曲线拟合。通过Hill方程对抑制数据进行拟合，得到导致50％抑制的药物浓度(IC₅₀)。

2.4 在小鼠脾细胞中TLR9诱导的IL-6的测定

从小鼠脾制备单细胞混悬液

在C57BL/6小鼠安乐死后立即摘除脾。从脾除去多余的脂肪，随后使用来自5ml注射器的注射器柱塞经由0.4μM细胞渗滤器将脾破碎。制备单细胞混悬液，并使用冷PBS在50ml Falcon管中将体积调节至15ml。在4℃将细胞以1500rpm离心5分钟，随后除去上清液，再混悬于5ml红细胞裂解缓冲液中(每个脾)，于室温温育5分钟。将冰冷PBS(30ml)加入细胞中，随后在4℃以1500rpm离心5分钟。除去上清液，并将细胞用40ml鼠脾细胞培养基(MSCM)洗涤两次。MSCM由补充有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI、1x非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、0.05mMβ-巯基乙醇和10％热灭活的胎牛血清(FBS)组成。将细胞再混悬于10-20mlMSCM中，并使用Countess细胞计数器计数。从单个C57BL/6小鼠脾脏得到约60x10⁶脾细胞。

刺激鼠脾细胞和用特定抑制剂处理

将脾细胞以2x10⁵细胞/孔的最终密度、以100μl体积铺于96孔平底板中，并在加湿的37℃培养箱中温育2-4小时。然后，使用自动液体处理设备将待测试化合物使用之前制备的化合物储备板进行分配。储备板包含使用2-或3-倍稀释以8-10个点排列的化合物(在90％/10％DMSO/ddH₂0中)。所述液体处理设备将1μl的各稀释物从之前制备的化合物源板分配至96-孔板中的适合的目标孔中。细胞培养物中的化合物的最终的起始浓度为10μM。细胞培养物中DMSO的最终浓度为0.5％。将细胞与化合物一起温育1小时，随后加入TLR配体。然后，以20μl的体积(对于200μl的最终培养物体积)加入10x EC₈₀浓度的CpG1826，然后将培养物在加湿的37℃培养箱中温育过夜。

通过ELISA测定白介素-6

培养过夜后，将板于室温以2000rpm离心5分钟。随后将150μl各培养物转移至96-孔V-底板中，用商购可得的小鼠IL-6夹心ELISA试剂盒测量IL-6水平。简言之，将板用捕获抗体包被过夜，随后用PBS/0.1％BSA封闭1小时。以50μl体积加入样品和标准品，将板于室温温育2小时。除去标准品/样品后，将板使用PBS/0.05％Tween洗涤，随后加入50μl生物素化的检测抗体，然后将板于室温在振荡下温育2小时。将板再次洗涤，随后每孔加入50μl链霉抗生物素-辣根过氧化物酶达20分钟。在再次洗涤板之后，将50μl TMB底物加入各孔中，将板温育20分钟，随后加入25μl/孔终止溶液。使用SpectraMax 190板读数器(450nm)测量IL-6水平，使用SoftMax Pro和GraphPad Prism软件进行分析。

2.5 人外周血单核细胞(PBMC)中的TLR9诱导的IFNα的测定

来自新鲜人血的PBMC的制备

在含肝素的10个S-Monovette管(S-Monovette 7.5mL NH肝素16IU/mL血液；Starstedt)中收集人血(约75ml)。通过每管加入15ml淋巴细胞分离液LSM1077^TM(#J15-004；PAA Laboratories)制备Leucosep^TM管(30mL#227290；Greiner Bio-one)，将其以1000g离心30秒。将一些的25ml血转移至Leucosep^TM管，随后用等份PBS(无Ca²⁺/Mg²⁺；#14190-094)稀释。使用无制动Eppendorf 5810R离心机将样品在22℃以800g离心20min。从血浆:分离液界面小心除去PBMC层，转移至清洁的50ml管中。通过加入PBS(最多45ml)将细胞洗涤一次，使用有制动(设置在速度9)Eppendorf5810R离心(1400rpm，10min，在22℃)。将离心沉淀的细胞小心地再混悬于介质(RPMI 1640+GlutaMAX-I、0.05mM 2-巯基乙醇、10mM HEPES和5％v/v FCS)中，汇集样品。从Gibco得到介质组分2-巯基乙醇(#31350-010；50mM)、Hepes(#15630-056,1M)和RPMI 1640(1x)+GlutaMAX-I(#61870-010)。从Amimed得到FCS(#2-01F36-1)。使用自动细胞计数器对PBMC计数(将样品在介质中以1:10预-稀释，随后加入等体积(10μl)的锥虫蓝)。将细胞稀释至4 x 10⁶细胞/ml，并接种于384-孔板(#353962；Becton Dickinson AG)，得到25μl最终体积(即1 x 10⁵细胞/孔)。

刺激PBMC和用特定抑制剂处理

将化合物在100％v/v DMSO(#41640-100mL；Sigma-Aldrich)中预稀释，随后转移至介质中(以达到0.25％的最终DMSO浓度)。将细胞用适当的化合物稀释物(5μl)或溶媒对照(5μl)处理，在37℃在加湿培养箱中、在含5％(v/v)CO₂的空气中温育30min。用CpG2216(0.3μM；#tlrl-hodna；Invivogen)或溶媒对照(10μl/孔)刺激细胞，温育20h。将板短暂离心(200 xg，2min，在22℃)，移出上清液样品(30μl)用于对IFNα水平进行定量。

使用αLisa技术对IFNα进行定量

对于IFNα的定量，使用来自PerkinElmer的人干扰素AlphaLISA试剂盒(#AL264F)。新鲜制备含抗-IFNα受体小珠(最终5μg/ml)和生物素化抗体抗-IFNα(最终0.5nM)的抗体混合物，分配(5μl)至384-孔Optiplates^TM(#6007299；PerkinElmer)中。制备已知的IFNα标准品(人IFNαB(2b))的稀释物，与细胞上清液(5μl)一起加入以上的板中。将板短暂离心(在200g脉冲)，用粘性封口膜掩盖，涡旋，于室温在暗处温育1h。制备涂覆链霉抗生物素的供体小珠(最终20μg/ml)，在暗光区域加入各孔中(5μl)(光敏感混合物)。将板于室温温育30min(板不能离心或覆盖)。温育后，将板用装备ALPHA选项的EnVision^TM多板读数器、使用仪器自身的“AlphaScreen标准设置”(例如总测量时间:550ms，激光680nm激发时间:180ms,镜:D640as，发射光滤光片:M570w，中心波长570nm，带宽100nm,透光度75％)读取。收集数据用于IFNα水平的分离和定量。

数据评价和分析

使用带有XLfit加载项(IDBS；4.3.2版)的Excel XL fit 4.0(微软)分析数据。根据使用人IFNαB(2b)的标准曲线外推测定具体的IFNα浓度。将曲线拟合到实验数据后通过非线性回归确定化合物的各自的IC₅₀值。

3.绵羊红细胞(SRBC)的抗体生成的测定

简言之，在第0天对OFA大鼠静脉内注射绵羊红细胞，用所研究的化合物口服治疗连续四天(第0天至第3天)。在第4天制备脾细胞混悬液，将淋巴细胞放置在存在指示细胞(SRBC)和补体的软琼脂上。指示细胞由于SRBC-特异性抗体(主要是IgM亚类)的分泌和补体的存在而裂解，导致产生噬斑。对每块板的噬斑数计数并表示为每个脾的噬斑数。

免疫：在第0天用2x10⁸/ml SRBC(获自Laboratory Animal ServicesLAS,Novartis Pharma AG)以0.5ml/大鼠的体积静脉内注射，使各组(五只雌性OFA大鼠/组)免疫。

化合物治疗：从免疫当天开始，用混悬于0.5％CMC、0.5％Tween 80中的化合物对动物治疗连续4天(第0、1、2和3天)。以5ml/kg体重的施用体积，每天两次、剂量之间间隔12小时口服施用化合物。

脾细胞混悬液的制备：

在第4天，用CO₂对动物实施安乐死。除去脾，称重，对于每只大鼠的脾，放置于含有10ml冷(4℃)汉克平衡盐溶液(HBSS；Gibco,pH 7.3,含1mg酚红/100ml)的塑料管中。用玻璃棒将脾匀浆化，置于冰上5分钟，取1ml上清液转移至新管。将细胞在4ml HBSS中洗涤1次，然后弃去上清液，将沉淀重新混悬于1ml HBSS中。通过自动化细胞计数器测定每个脾的淋巴细胞数，将脾细胞混悬液调节至30x10⁶/ml的细胞浓度。

噬斑形成试验

用在HBSS中的0.7％琼脂糖(SERVA)溶液制备软琼脂培养皿。另外，在塑料管中制备1ml 0.7％琼脂糖，在水浴中保持在48℃。加入一些50μl30x10⁶/ml脾细胞混悬液和50μl SRBC(40 x 10⁸/ml)，快速混合(涡旋)，倒在所制备的琼脂糖培养皿上。将培养皿略微倾斜以达到细胞混合物在琼脂糖层上的均匀分布。将培养皿置于室温15分钟，接着在37℃孵育60分钟。然后，加入1.4ml豚鼠补体(Harlan；10％)并在37℃再继续孵育60分钟。由析出的B细胞释放的SRBC-特异性抗体与其附近的抗原(SRBC)结合。这些抗原-抗体复合物活化补体并导致SRBC裂解，在红细胞层内留下亮点(噬斑)。用显微镜对噬斑进行计数。

使用以下方程式测定对噬斑形成的抑制：抑制％＝C*100/V-100，其中V＝媒介物组的每脾平均噬斑数；C＝化合物治疗组的每脾平均噬斑数。

参考文献

N.K.Jerne&A.A.Nordin(1963)在琼脂中通过单个生成抗体的细胞形成噬斑(Plaque formation in agar by single antibody-producing cells)，Science 140:405.

N.K.Jerne,A.A.Nordin&C.Henry(1963)用于识别生成抗体的细胞的琼脂噬斑技术(The agar plaque technique for recognizingantibody-producing cells)，见于：“Cell Bound Antibodies”，B.Amos&H.Koprowski编辑,Wistar Inst.Press,费城,第109-125页。

生物学数据

酶法试验

实施例	PI3Kα(uM)	PI3Kδ(uM)
			F1	0.109	0.003

细胞试验

实施例	细胞PI3Kδ/IC₅₀[umol l-1]	RWB/IC₅₀CD86[nmol l-1]
			F1	0.011	7

Claims

1.(1,1-二氧代-六氢-1λ*6*-噻喃-4-基)-{(S)-3-[1-(6-甲氧基-5-甲基-吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噁嗪-7-基氧基]-吡咯烷-1-基}-甲酮的无水结晶形式。

2.如权利要求1中所述的无水结晶形式，其特征在于包括以下以2θ角+/-0.2度给出的峰的X-射线粉末衍射图谱：9.1、10.2、11.9、13.0、17.1、17.7、18.7、20.3、20.8、26.0、26.7、23.2、24.1、24.8、29.3、27.4和21.4。

3.如权利要求1中所述的无水结晶形式，其具有与图1中所示X-射线粉末衍射图谱基本上相同的X-射线衍射图谱。

4.如权利要求1中所述的无水结晶形式，其具有与图2中所示基本上相同的差示扫描量热分析图。

5.如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式，其用作药物。

6.组合产品，其包含治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式和一种或多种治疗活性药物。

7.如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式在制备用于治疗由PI3K酶的活性、优选PI3Kδ亚型的活性所介导的疾病或障碍的药物中的用途。

8.如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式，其用于治疗由PI3K酶的活性、优选PI3Kδ亚型的活性所介导的疾病或障碍。

9.药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式和一种或多种可药用载体。

10.在个体中调节PI3K酶的活性、优选PI3Kδ亚型的活性的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求1至4中任一项所述的结晶形式的步骤。

11.如权利要求1-4中任一项所述的结晶形式用于在个体中治疗由PI3K酶的活性、优选PI3Kδ亚型的活性所介导的障碍或疾病的用途。