KR102184069B1

KR102184069B1 - 디히드로-피리도-옥사진 유도체의 고체 형태

Info

Publication number: KR102184069B1
Application number: KR1020157013235A
Authority: KR
Inventors: 콘스탄체 후르트; 크리스토프 칼리스; 카렌 캄머투앙; 니콜라 솔더만; 프레데릭 제크리
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2012-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2020-11-30
Also published as: ZA201502350B; HK1209419A1; GT201500124A; CA2891521A1; MX2015006650A; CL2015001409A1; AU2013368997A1; PE20150946A1; IL238889B; EP2928896B1; EP2928896A1; CY1119702T1; PL2928896T3; PT2928896T; AU2013368997B2; WO2014102630A1; DK2928896T3; IL238889A0; AU2013368997B8; CN104870451B

Abstract

본 발명은 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태; 상기 형태를 포함하는 제약 조성물 및 조합물 뿐만 아니라 질환의 치료를 위해 상기 형태, 예컨대 그의 제약 조성물 및 조합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

디히드로-피리도-옥사진 유도체의 고체 형태 {SOLID FORM OF DIHYDRO-PYRIDO-OXAZINE DERIVATIVE}

본 발명은 디히드로-피리도-옥사진 유도체의 신규 고체 형태, 그의 제조 방법 및 제약 조성물에서의 그의 용도에 관한 것이다.

WO2013/093849로서 공개된 국제 특허 출원 PCT/IB2012/057554에는 PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 장애 또는 질환의 치료에 적합한 디히드로-벤조-옥사진 및 디히드로-피리도-옥사진 유도체가 개시되어 있다. PCT/IB2012/057554에는 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논, 및 상기 화합물의 제조 방법이 개시되어 있다.

이들 화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약리학적 활성 화합물과 조합으로, 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 예컨대 천식 및 COPD, 이식 거부, 암, 예를 들어 조혈 기원의 암 또는 고형 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 PI3K-관련 질환의 치료에 유용하다.

이들 화합물은 또한 단독으로 또는 하나 이상의 다른 약리학적 활성 화합물과 조합으로, 상태, 질환 또는 장애, 예를 들어 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 예컨대 천식 및 COPD, 이식 거부; 항체 생산, 항원 제시, 시토카인 생산 또는 림프성 기관발생이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 것, 예컨대 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 특발성 혈소판감소증 자반증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 만성 자가면역 두드러기, 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, AMR (항체-매개 이식 거부), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 예컨대 비제한적으로 다발성 골수종; 백혈병; 급성 골수 백혈병; 만성 골수 백혈병; 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 비-호지킨 림프종; 림프종; 진성 다혈구혈증; 본태성 혈소판혈증; 골수 화생을 동반한 골수섬유증; 및 발덴스트룀병; 보다 적합하게는 류마티스 관절염 (RA), 심상성 천포창 (PV), 특발성 혈소판감소증 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 후천성 A형 혈우병 (AHA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 (MG), 쇼그렌 증후군 (SS), ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 만성 자가면역 두드러기 (CAU), 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, 이식 거부, 및 조혈 기원의 암 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염, 예를 들어 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증 및 신경낭미충증의 치료에 유용하다.

본 발명은 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태; 상기 형태를 포함하는 제약 조성물 및 조합물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 PI3K 효소의 활성에 의해, 바람직하게는 PI3Kδ 이소형의 활성에 의해 매개되는 질환의 치료를 위해 상기 형태, 예컨대 그의 제약 조성물 및 조합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

특정한 약물의 활성 제약 성분 (API)의 결정질 형태가 종종 약물의 제조 용이성, 흡습성, 안정성, 용해도, 저장 안정성, 제제화의 용이성, 위장액 중의 용해 속도 및 생체내 생체이용률의 중요한 결정인자인 것으로 널리 공지되어 있다. 결정질 형태는 동일한 조성의 물질이 상이한 격자 배열로 결정화하여 특정한 결정질 형태에 대해 특이적인 상이한 열역학적 특성 및 안정성을 생성하는 경우에 발생한다. 결정질 형태는 또한 동일한 화합물의 상이한 수화물 또는 용매화물을 포함할 수 있다. 어떠한 형태가 바람직한지를 결정하는데 있어서, 형태의 수많은 특성이 비교되고, 바람직한 형태는 다수의 물리적 특성 변수에 근거하여 선택된다. 특정 측면, 예컨대 제조의 용이성, 안정성 등이 중대하게 여겨지는 일부 상황에서 한 형태가 바람직할 수 있다는 것은 전적으로 가능하다. 다른 상황에서, 상이한 형태가 보다 큰 용해 속도 및/또는 보다 우수한 생체이용률에 바람직할 수 있다. 특정한 화합물이 다형체를 형성할 것인지의 여부, 임의의 이러한 다형체가 치료 조성물에서 상업적인 용도에 적합할 것인지의 여부, 또는 어떠한 다형체가 이러한 바람직한 특성을 나타낼 것인지를 예측하는 것은 아직 가능하지 않다.

도 1은 결정질 무수 형태인 실시예 F1의 X선 분말 회절 패턴이다.
도 2는 결정질 무수 형태인 실시예 F1의 시차 주사 열량측정 그래프이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 도 2-세타 +/- 0.2 도에서 주어진 하기 피크: 9.1, 10.2, 11.9, 13.0, 17.1, 17.7, 18.7, 20.3, 20.8, 26.0, 26.7, 23.2, 24.1, 24.8, 29.3, 27.4, 및 21.4를 포함하는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 도 1에 제시된 X선 분말 회절 스펙트럼과 실질적으로 동일한 X선 회절 스펙트럼을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 도 2에 제시된 그래프와 실질적으로 동일한 시차 주사 열량측정 그래프를 갖는다.

달리 명시되지 않는 한, 용어 "본 발명의 형태"는 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태를 지칭한다.

본원의 상기 및 하기에 사용된 일반적 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 바람직하게는 본 개시내용의 문맥 내에서 하기 의미를 갖는다:

본 발명은 하기 용어 해설 및 종결부 실시예를 비롯한 하기 설명을 참조로 보다 완전하게 인지될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비롯한", "함유하는" 및 "포함하는"은 본원에서 그들의 개방적, 비제한적 의미로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료 등 및 그의 조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329] 참조). 임의의 통상의 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 또는 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.

본 발명의 화합물의 용어 "치료 유효량"은 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어 효소 또는 단백질 활성의 감소 또는 억제, 또는 증상의 개선, 상태의 완화, 질환 진행의 둔화 또는 지연, 또는 질환의 예방 등을 도출할 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다. 한 비제한적 실시양태에서, 용어 "치료 유효량"은 대상체에 투여되는 경우에, (1) (i) PI3K에 의해 매개되거나, 또는 (ii) PI3K 활성과 연관되거나, 또는 (iii) PI3K의 활성 (정상적 또는 비정상적)을 특징으로 하는 상태, 또는 장애 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화, 억제, 예방 및/또는 개선시키는데 유효하거나 또는 (2) PI3K의 활성을 감소 또는 억제하는데 유효하거나 또는 (3) PI3K의 발현을 감소 또는 억제하는데 유효한 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다. 또 다른 비제한적 실시양태에서, 용어 "치료 유효량"은 세포, 또는 조직, 또는 비-세포 생물학적 물질, 또는 배지에 투여되는 경우에, PI3K의 활성을 적어도 부분적으로 감소 또는 억제하는데 유효하거나; 또는 PI3K의 발현을 적어도 부분적으로 감소 또는 억제하는데 유효한 본 발명의 화합물의 양을 지칭한다. PI3K에 대한 상기 실시양태에서 예시된 바와 같은 용어 "치료 유효량"의 의미는 또한 임의의 다른 관련 단백질/펩티드/효소에 동일한 의미로 적용된다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 동물을 지칭한다. 전형적으로 동물은 포유동물이다. 대상체는 또한, 예를 들어 영장류 (예를 들어, 인간, 남성 또는 여성), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "억제하다", "억제" 또는 "억제하는"은 주어진 상태, 증상 또는 장애 또는 질환의 감소 또는 저해, 또는 생물학적 활성 또는 과정의 기저 활성에서의 유의한 감소를 지칭한다.

본원에 사용된 임의의 질환 또는 장애에 대한 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 한 실시양태에서 질환 또는 장애의 개선 (즉, 질환 또는 그의 임상 증상 중 적어도 하나의 발생의 둔화 또는 정지 또는 감소)을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별가능하지 않을 수 있는 것들을 비롯한 적어도 하나의 물리적 파라미터의 완화 또는 개선을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 물리적 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화) 또는 둘 다의 조절을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 또는 발달 또는 진행의 예방 또는 지연을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상체가 치료로부터 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 있어 유익할 경우에, 이러한 대상체는 이러한 치료를 "필요로 한다".

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 문맥에서, 특히 특허청구범위의 문맥에서 사용된 단수 용어 및 유사한 용어들은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석될 것이다.

본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적인 언어, 예를 들어 "예컨대"의 사용은 본 발명을 단지 보다 잘 설명하기 위한 의도이고, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 형태 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 특정한 투여 경로, 예컨대 경구 투여, 비경구 투여 및 직장 투여 등을 위해 제제화될 수 있다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 고체 형태 (제한 없이 캡슐, 정제, 환제, 과립, 산제 또는 좌제 포함) 또는 액체 형태 (제한 없이 용액, 현탁액 또는 에멀젼 포함)로 제조될 수 있다. 제약 조성물은 통상의 제약 작업, 예컨대 멸균에 적용될 수 있고/거나, 통상의 불활성 희석제, 윤활제 또는 완충제, 뿐만 아니라 아주반트, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제 및 완충제 등을 함유할 수 있다.

전형적으로, 제약 조성물은 활성 성분을

a) 희석제, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신;

b) 윤활제, 예를 들어 실리카, 활석, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜; 정제의 경우에 또한

c) 결합제, 예를 들어 규산알루미늄마그네슘, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 원하는 경우에

d) 붕해제, 예를 들어 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; 및/또는

e) 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제

와 함께 포함하는 정제 또는 젤라틴 캡슐이다.

정제는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 필름 코팅 또는 장용 코팅될 수 있다.

경구 투여에 적합한 조성물은 유효량의 본 발명의 형태를 정제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르의 형태로 포함한다. 경구 사용을 위한 조성물은 제약 조성물의 제조에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조되고, 이러한 조성물은 제약상 우아하고 맛우수한 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제는 활성 성분을, 정제의 제조에 적합한 비독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합하여 함유할 수 있다. 이들 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석이다. 정제는 코팅되지 않거나 또는 공지된 기술에 의해 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시킴으로써 보다 장기간에 걸쳐 지속되는 작용을 제공한다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다. 경구 사용을 위한 제제는, 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.

특정의 주사가능한 조성물은 수성 등장성 용액 또는 현탁액이고, 좌제는 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 유리하게 제조된다. 상기 조성물은 멸균될 수 있고/거나, 아주반트, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 다른 치료상 유익한 물질을 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 각각 제조되고, 약 0.1-75%의 활성 성분을 함유하거나, 또는 약 1-50%의 활성 성분을 함유한다.

경피 적용에 적합한 조성물은 유효량의 본 발명의 형태를 적합한 담체와 함께 포함한다. 경피 전달에 적합한 담체는 흡수가능한 약리학상 허용되는 용매를 포함하여 숙주의 피부를 통한 통과를 보조한다. 예를 들어, 경피 장치는 백킹 부재, 화합물을 임의로 담체와 함께 함유하는 저장소, 임의로 장기간에 걸쳐 제어되고 미리 결정된 속도로 숙주의 피부에 화합물을 전달하기 위한 속도 제어 장벽, 및 장치가 피부에 부착되도록 하는 수단을 포함하는 붕대 형태이다.

예를 들어, 피부 및 눈에 대한 국소 적용에 적합한 조성물은 수용액, 현탁액, 연고, 크림, 겔, 또는 예를 들어 에어로졸 등에 의한 전달을 위한 분무가능한 제제를 포함한다. 이러한 국소 전달 시스템은, 예를 들어 피부암의 치료를 위해, 예를 들어 예방적 사용을 위해 선 크림, 로션, 스프레이 등으로 피부 적용하기에 특히 적절할 것이다. 이들은 따라서 관련 기술분야에 널리 공지된 국소 (화장품 포함) 제제에 사용하기에 특히 적합하다. 이들은 가용화제, 안정화제, 장성 증진제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.

본원에 사용된 국소 적용은 또한 흡입 또는 비강내 적용에 관한 것일 수 있다. 이는 편리하게는 적합한 추진제를 사용하거나 또는 사용하지 않고, 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말의 형태로 (단독으로, 혼합물로서, 예를 들어 락토스와의 건조 블렌드로서, 또는 예를 들어 인지질과의 혼합 성분 입자로서), 또는 가압 용기, 펌프, 스프레이, 아토마이저 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제제 형태로 전달될 수 있다.

본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 형태를 포함하는 무수 제약 조성물 및 투여 형태를 추가로 제공하며, 이는 물이 특정 화합물의 분해를 용이하게 할 수 있기 때문이다.

본 발명의 무수 제약 조성물 및 투여 형태는 무수 또는 저수분 함유 성분, 및 저수분 또는 저습 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 무수 제약 조성물은 그의 무수 특성이 유지되도록 제조 및 저장될 수 있다. 따라서, 무수 조성물은 그것이 적합한 규정 키트에 포함될 수 있도록, 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 공지된 물질을 사용하여 포장된다. 적합한 포장의 예는 기밀 호일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들어, 바이알), 블리스터 팩 및 스트립 팩을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 활성 성분으로서의 본 발명의 화합물이 분해되는 속도를 감소시키는 하나 이상의 작용제를 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태를 추가로 제공한다. 본원에 "안정화제"로서 지칭된 이러한 작용제는 항산화제, 예컨대 아스코르브산, pH 완충제 또는 염 완충제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 형태는 B 세포의 기능, 예컨대 항체 생산, 항원 제시, 시토카인 생산 또는 림프성 기관발생 중 하나 이상이 비정상적이거나 바람직하지 않은 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염을 비롯한 상태, 질환 또는 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 심상성 천포창 및 관련 질환, 특발성 혈소판감소증 자반증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 만성 자가면역 두드러기, 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, AMR (항체-매개 이식 거부), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 예컨대 비제한적으로 다발성 골수종; 급성 골수 백혈병; 만성 골수 백혈병; 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 비-호지킨 림프종; 림프종; 진성 다혈구혈증; 본태성 혈소판혈증; 골수 화생을 동반한 골수섬유증; 및 발덴스트룀병의 치료에 유용할 수 있다.

본 발명은 호중구의 기능, 예컨대 슈퍼옥시드 방출, 자극된 세포외유출 또는 화학주성 이동 중 하나 이상이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 상태, 질환 또는 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 패혈증, 폐 또는 호흡기 장애, 예컨대 천식, 염증성 피부병, 예컨대 건선, 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염 등을 치료하는 방법을 포함한다.

본 발명은 호염기구 및 비만 세포의 기능, 예컨대 화학주성 이동 또는 알레르겐-IgE-매개 탈과립화 중 하나 이상이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 상태, 질환 또는 장애, 예컨대 알레르기성 질환 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 뿐만 아니라 다른 장애, 예컨대 COPD, 천식 또는 기종을 치료하는 방법을 포함한다.

본 발명은 T 세포의 기능, 예컨대 시토카인 생산 또는 세포-매개 세포독성 중 하나 이상이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 상태, 질환 또는 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 세포 조직 또는 기관 이식편의 급성 또는 만성 거부, 또는 조혈 기원의 암, 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염을 치료하는 방법을 포함한다.

추가로, 본 발명은 신경변성 질환, 심혈관 질환 및 혈소판 응집을 치료하는 방법을 포함한다.

추가로, 본 발명은 피부 질환, 예컨대 만발성 피부 포르피린증, 다형 광 발진, 피부근염, 일광 두드러기, 구강 평편 태선, 지방층염, 경피증, 두드러기성 혈관염을 치료하는 방법을 포함한다.

추가로, 본 발명은 만성 염증성 질환, 예컨대 사르코이드증, 환상 육아종을 치료하는 방법을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상태 또는 장애 (예를 들어 PI3K-매개)는 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 천식, COPD, ARDS, 뢰플러 증후군, 호산구성 폐렴, 기생충 (특히, 후생동물) 침입 (열대성 호산구증가증 포함), 기관지폐 아스페르길루스증, 결절성 다발동맥염 (처그-스트라우스 증후군 포함), 호산구성 육아종, 약물-반응에 의해 발생하여 기도에 영향을 미치는 호산구-관련 장애, 건선, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 원형 탈모증, 다형성 홍반, 포진성 피부염, 경피증, 백반증, 과민성 혈관염, 두드러기, 수포성 유천포창, 홍반성 루푸스, 천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 자가면역 혈액 장애 (예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 결장염 및 크론병), 내분비 안병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 폐포염, 만성 과민성 폐장염, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변증, 포도막염 (전방 및 후방), 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염, 사구체신염, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 고혈압, 심부 정맥 혈전증, 졸중, 심근경색, 불안정형 협심증, 혈전색전증, 폐 색전증, 혈전용해 질환, 급성 동맥 허혈, 말초 혈전성 폐쇄, 및 관상 동맥 질환, 재관류 손상, 망막병증, 예컨대 당뇨병성 망막병증 또는 고압 산소-유발 망막병증, 및 상승된 안내압 또는 안구 방수의 분비를 특징으로 하는 상태, 예컨대 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 형태는 자가면역 질환 및 염증성 상태, 특히 자가면역 요인을 비롯한 병인을 갖는 염증성 상태, 예컨대 관절염 (예를 들어 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형성 관절염), 및 류마티스성 질환, 예컨대 염증성 상태, 및 골 손실을 포함하는 류마티스성 질환, 염증성 통증, 척추관절병증, 예컨대 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 및 장병증성 관절염, 과민증 (기도 과민증 및 피부 과민증 둘 다 포함) 및 알레르기의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 본 발명의 형태가 사용될 수 있는 특정한 자가면역 질환은 자가면역 혈액 장애 (예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증 포함), 후천성 A형 혈우병, 한랭 응집소 질환, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발연골염, 경피증, 항-호중구 세포질 항체-연관 혈관염, IgM-매개 신경병증, 안진전 근간대성경련 증후군, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 결장염, 크론병 및 과민성 장 증후군 포함), 내분비 안병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 시신경척수염, 원발성 담즙성 간경변증, 소아 당뇨병 (제I형 당뇨병), 포도막염 (전방, 중간 및 후방 뿐만 아니라 범포도막염), 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염 (예를 들어 특발성 신증후군 또는 미세 변화 신병증을 비롯한 신증후군을 동반하거나 또는 동반하지 않음), 종양, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 이식물의 이완, 대사 장애, 예컨대 아테롬성동맥경화증, 당뇨병 및 이상지혈증을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 형태는 원발성 피부 B-세포 림프종, 면역수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 브라질 천포창 (포고 셀바젬병)의 풍토병성 형태, 부신생물성 천포창, 수포성 유천포창, 점막 유천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 만성 이식편 대 숙주 질환, 피부근염, 전신 홍반성 루푸스, 혈관염, 소혈관 혈관염, 저보체혈증성 두드러기성 혈관염, 항호중구 세포질 항체-혈관염, 한랭글로불린혈증, 슈니츨러 증후군, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 혈관부종, 백반증, 전신 홍반성 루푸스, 특발성 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 한랭 응집소 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 항호중구 세포질 항체-연관 혈관염, 이식편 대 숙주 질환, 한랭글로불린혈증 및 혈전성 혈소판감소증으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태 또는 장애의 치료에 유용하다.

따라서, 추가 실시양태로서, 본 발명은 요법에서의 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 요법은 PI3K의 억제에 의해 치료될 수 있는 질환으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 상기 언급한 목록으로부터, 적합하게는 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 예컨대 천식 및 COPD, 이식 거부; 항체 생산, 항원 제시, 시토카인 생산 또는 림프성 기관발생이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 것, 예컨대 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 특발성 혈소판감소증 자반증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 만성 자가면역 두드러기, 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, AMR (항체-매개 이식 거부), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 예컨대 비제한적으로 다발성 골수종; 백혈병; 급성 골수 백혈병; 만성 골수 백혈병; 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 비-호지킨 림프종; 림프종; 진성 다혈구혈증; 본태성 혈소판혈증; 골수 화생을 동반한 골수섬유증; 및 발덴스트룀병으로부터; 보다 적합하게는 류마티스 관절염 (RA), 심상성 천포창 (PV), 특발성 혈소판감소증 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 후천성 혈우병 유형 A (AHA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 (MG), 쇼그렌 증후군 (SS), ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 만성 자가면역 두드러기 (CAU), 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염, 예를 들어 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증 및 신경낭미충증으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료상 허용되는 양의 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 투여를 포함하는 PI3K의 억제에 의해 치료되는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 질환은 상기 언급한 목록으로부터, 적합하게는 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 예컨대 천식 및 COPD, 이식 거부; 항체 생산, 항원 제시, 시토카인 생산 또는 림프성 기관발생이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 것, 예컨대 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 특발성 혈소판감소증 자반증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 만성 자가면역 두드러기, 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, AMR (항체-매개 이식 거부), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 예컨대 비제한적으로 다발성 골수종; 백혈병; 급성 골수 백혈병; 만성 골수 백혈병; 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 비-호지킨 림프종; 림프종; 진성 다혈구혈증; 본태성 혈소판혈증; 골수 화생을 동반한 골수섬유증; 및 발덴스트룀병으로부터; 보다 적합하게는 류마티스 관절염 (RA), 심상성 천포창 (PV), 특발성 혈소판감소증 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 후천성 혈우병 유형 A (AHA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 (MG), 쇼그렌 증후군 (SS), ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 만성 자가면역 두드러기 (CAU), 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염, 예를 들어 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증 및 신경낭미충증으로부터 선택된다.

따라서, 추가 실시양태로서, 본 발명은 의약의 제조를 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 추가 실시양태에서, 의약은 PI3K의 억제에 의해 치료될 수 있는 질환의 치료를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 상기 언급된 목록으로부터, 적합하게는 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 예컨대 천식 및 COPD, 이식 거부; 항체 생산, 항원 제시, 시토카인 생산 또는 림프성 기관발생이 비정상적이거나 또는 바람직하지 않은 것, 예컨대 류마티스 관절염, 심상성 천포창, 특발성 혈소판감소증 자반증, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 만성 자가면역 두드러기, 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, AMR (항체-매개 이식 거부), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 예컨대 비제한적으로 다발성 골수종; 백혈병; 급성 골수 백혈병; 만성 골수 백혈병; 림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 비-호지킨 림프종; 림프종; 진성 다혈구혈증; 본태성 혈소판혈증; 골수 화생을 동반한 골수섬유증; 및 발덴스트룀병으로부터; 보다 적합하게는 류마티스 관절염 (RA), 심상성 천포창 (PV), 특발성 혈소판감소증 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 후천성 혈우병 유형 A (AHA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증 (MG), 쇼그렌 증후군 (SS), ANCA-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 만성 자가면역 두드러기 (CAU), 알레르기 (아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염), 굿패스쳐 증후군, 이식 거부, 및 조혈 기원의 암, 뿐만 아니라 면역병리상태와 연관된 질환 또는 감염, 예를 들어 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증 및 신경낭미충증으로부터 선택된다.

본 발명의 제약 조성물 또는 조합물은 약 50-70 kg의 대상체에 대해 약 1-1000 mg의 활성 성분(들), 또는 약 1-500 mg, 또는 약 1-250 mg, 또는 약 1-150 mg, 또는 약 0.5-100 mg, 또는 약 1-50 mg의 활성 성분의 단위 투여량으로 존재할 수 있다. 화합물, 그의 제약 조성물 또는 조합물의 치료 유효 투여량은 대상체의 종, 체중, 연령 및 개별 상태, 치료할 장애 또는 질환 또는 그의 중증도에 따라 달라진다. 통상의 의사, 임상의 또는 수의사는 장애 또는 질환의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는데 필요한 각각의 활성 성분의 유효량을 용이하게 결정할 수 있다.

상기 언급된 투여량 특성은 유리하게는 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 개, 원숭이, 또는 그의 단리된 기관, 조직 및 제제를 사용하는 시험관내 및 생체내 시험에서 입증가능하다. 본 발명의 형태는 용액, 예를 들어 수용액의 형태로 시험관내 적용될 수 있고, 경장으로, 비경구로, 유리하게는 정맥내로, 예를 들어 현탁액 또는 수용액으로서 생체내 적용될 수 있다. 시험관내 투여량은 약 10^-3 몰 내지 10^-9 몰 농도의 범위일 수 있다. 생체내 치료 유효량은 투여 경로에 따라 약 0.1-500 mg/kg 또는 약 1-100 mg/kg의 범위일 수 있다.

본 발명의 형태는 하나 이상의 다른 치료제와 동시에, 또는 그 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 형태는 동일하거나 또는 상이한 투여 경로에 의해 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 작용제와 동일한 제약 조성물 내에서 함께 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 요법에서의 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 적어도 하나의 다른 치료제를 포함하는 생성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 요법은 PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태의 치료이다. 조합 제제로서 제공되는 생성물은, 동일한 제약 조성물 내에 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 다른 치료제(들)를 함께 포함하는 조성물, 또는 개별 형태로, 예를 들어 키트의 형태로 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 다른 치료제(들)를 포함하는 조성물을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 또 다른 치료제(들)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의로, 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 2종 이상의 개별 제약 조성물을 포함하며, 이들 중 적어도 1종이 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태를 함유하는 것인 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 상기 조성물을 개별적으로 보유하기 위한 수단, 예컨대 용기, 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷을 포함한다. 이러한 키트의 예는 정제, 캡슐 등의 포장에 전형적으로 사용되는 바와 같은 블리스터 팩이다.

본 발명의 키트는 상이한 투여 형태, 예를 들어 경구 및 비경구로 투여하기 위해, 개별 조성물을 상이한 투여 간격으로 투여하기 위해, 또는 개별 조성물을 서로에 대해 적정하기 위해 사용될 수 있다. 순응도를 보조하기 위해, 본 발명의 키트는 전형적으로 투여 지침서를 포함한다.

본 발명의 조합 요법에서, 본 발명의 형태 및 다른 치료제는 동일하거나 또는 상이한 제조업체에 의해 제조되고/거나 제제화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 형태 및 다른 치료제는 (i) 의사에게 조합 제품으로 배포되기 전에 (예를 들어 본 발명의 형태 및 다른 치료제를 포함하는 키트의 경우); (ii) 투여 직전에 의사 자신에 의해 (또는 의사의 지시 하에); (iii) 예를 들어 본 발명의 형태 및 다른 치료제의 순차적 투여 동안에 환자 자신에서, 조합 요법으로 합해질 수 있다.

본 발명은 또한 제약으로서 사용하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 의약이 또 다른 치료제와 함께 투여하기 위해 제조되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 의약이 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태와 함께 투여되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 또 다른 치료제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 치료 방법에 사용하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태를 제공한다. 본 발명은 또한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태가 또 다른 치료제와 함께 투여하기 위해 제조되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태를 제공한다. 본 발명은 또한 다른 치료제가 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태와 함께 투여하기 위해 제조되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 또 다른 치료제를 제공한다. 본 발명은 또한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태가 또 다른 치료제와 함께 투여되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태를 제공한다. 본 발명은 또한 다른 치료제가 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태와 함께 투여되는 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 또 다른 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 질환을 치료하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 환자가 이전에 (예를 들어 24시간 내에) 또 다른 치료제로 치료되었던 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 환자가 이전에 (예를 들어 24시간 내에) (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태로 치료되었던 것인, PI3K 효소의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 또 다른 치료제의 용도를 제공한다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 단독 활성 성분으로 투여되거나, 또는 예를 들어 아주반트로서의 다른 약물, 예를 들어 면역억제제 또는 면역조절제 또는 다른 항염증제 (예를 들어 동종이식편 또는 이종이식편 급성 또는 만성 거부 또는 염증성 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방을 위함), 또는 화학요법제, 예를 들어 악성 세포 항증식제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506; mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573, TAFA-93, 비올리무스-7 또는 비올리무스-9; 면역억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들어 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 미코페놀산 또는 염; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 그의 면역억제 동족체, 유사체 또는 유도체; 예를 들어 WO 02/38561 또는 WO 03/82859에 개시된 바와 같은 PKC 억제제, 예를 들어 실시예 56 또는 70의 화합물; JAK3 키나제 억제제, 예를 들어 N-벤질-3,4-디히드록시-벤질리덴-시아노아세트아미드 α-시아노-(3,4-디히드록시)-]N-벤질신남아미드 (티르포스틴 AG 490), 프로디지오신 25-C (PNU156804), [4-(4'-히드록시페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린] (WHI-P131), [4-(3'-브로모-4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린] (WHI-P154), [4-(3',5'-디브로모-4'-히드록실페닐)-아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린] WHI-P97, KRX-211, 3-{(3R,4R)-4-메틸-3-[메틸-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-아미노]-피페리딘-1-일}-3-옥소-프로피오니트릴의 유리 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태, 예를 들어 모노-시트레이트 (CP-690,550으로도 지칭됨), 또는 WO 04/052359 또는 WO 05/066156에 개시된 바와 같은 화합물; 면역억제 모노클로날 항체, 예를 들어 백혈구 수용체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86 또는 그의 리간드에 대한 모노클로날 항체; 다른 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 그의 돌연변이체를 갖는 재조합 결합 분자, 예를 들어 비-CTLA4 단백질 서열에 결합된 CTLA4의 적어도 세포외 부분 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 CTLA4Ig (예를 들어 ATCC 68629로 지정됨) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 LEA29Y; 부착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 항히스타민제; 또는 진해제, 또는 기관지확장제; 또는 안지오텐신 수용체 차단제; 또는 항감염제와 조합되어 사용될 수 있다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태가 다른 면역억제/면역조절 요법, 항염증 요법, 화학요법 또는 항감염 요법과 함께 투여되는 경우에, 공-투여되는 면역억제, 면역조절, 항염증, 화학요법 또는 항감염 화합물의 투여량은 물론 사용되는 공동-약물의 유형 (예를 들어 이것이 스테로이드인지 또는 칼시뉴린 억제제인지의 여부), 사용되는 구체적 약물, 치료할 상태 등에 따라 달라질 것이다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 또한 다른 치료제, 특히 다른 항증식제와 조합되어 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 항증식제는 아로마타제 억제제; 항에스트로겐; 토포이소머라제 I 억제제; 토포이소머라제 II 억제제; 미세관 활성제; 알킬화제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 세포 분화 과정을 유도하는 화합물; 시클로옥시게나제 억제제; MMP 억제제; mTOR 억제제; 항신생물성 항대사물; 플라틴 화합물; 단백질 또는 지질 키나제 활성을 표적화하는/감소시키는 화합물 및 추가의 항혈관신생 화합물; 단백질 또는 지질 포스파타제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물; 고나도렐린 효능제; 항안드로겐; 메티오닌 아미노펩티다제 억제제; 비스포스포네이트; 생물학적 반응 조절제; 항증식성 항체; 헤파라나제 억제제; Ras 종양원성 이소형의 억제제; 텔로머라제 억제제; 프로테아솜 억제제; 혈액 악성종양의 치료에 사용되는 작용제; Flt-3의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물; Hsp90 억제제; 테모졸로미드 (테모달(TEMODAL)®); 및 류코보린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "아로마타제 억제제"는 에스트로겐 생산, 즉 기질 안드로스텐디온 및 테스토스테론의 각각 에스트론 및 에스트라디올로의 전환을 억제하는 화합물에 관한 것이다. 상기 용어는 스테로이드, 특별히 아타메스탄, 엑세메스탄 및 포르메스탄; 및 특히 비-스테로이드, 특별히 아미노글루테티미드, 로글레티미드, 피리도글루테티미드, 트릴로스탄, 테스토락톤, 케토코나졸, 보로졸, 파드로졸, 아나스트로졸 및 레트로졸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 엑세메스탄은, 예를 들어 상표 아로마신(AROMASIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 포르메스탄은, 예를 들어 상표 렌타론(LENTARON) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 파드로졸은, 예를 들어 상표 아페마(AFEMA) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 아나스트로졸은, 예를 들어 상표 아리미덱스(ARIMIDEX) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 레트로졸은, 예를 들어 상표 페마라(FEMARA) 또는 페마르(FEMAR) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 아미노글루테티미드는, 예를 들어 상표 오리메텐(ORIMETEN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 아로마타제 억제제인 화학요법제를 포함하는 본 발명의 조합물은 호르몬 수용체 양성 종양, 예를 들어 유방 종양의 치료에 특히 유용하다.

본원에 사용된 용어 "항에스트로겐"은 에스트로겐 수용체 수준에서 에스트로겐의 효과를 길항하는 화합물에 관한 것이다. 상기 용어는 타목시펜, 풀베스트란트, 랄록시펜 및 랄록시펜 히드로클로라이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 타목시펜은, 예를 들어 상표 놀바덱스(NOLVADEX) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 랄록시펜 히드로클로라이드는, 예를 들어 상표 에비스타(EVISTA) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 풀베스트란트는 미국 특허 번호 4,659,516에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있거나, 또는 예를 들어 상표 파슬로덱스(FASLODEX) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 항에스트로겐인 화학요법제를 포함하는 본 발명의 조합물은 에스트로겐 수용체 양성 종양, 예를 들어 유방 종양의 치료에 특히 유용하다.

본원에 사용된 용어 "항안드로겐"은 안드로겐 호르몬의 생물학적 효과를 억제할 수 있는 임의의 물질에 관한 것이고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,636,505에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있는 비칼루타미드 (카소덱스(CASODEX))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "고나도렐린 효능제"는 아바렐릭스, 고세렐린 및 고세렐린 아세테이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 고세렐린은 미국 특허 번호 4,100,274에 개시되어 있고, 예를 들어 상표 졸라덱스(ZOLADEX) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 아바렐릭스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,843,901에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "토포이소머라제 I 억제제"는 토포테칸, 기마테칸, 이리노테칸, 캄프토테신 및 그의 유사체, 9-니트로캄프토테신 및 거대분자 캄프토테신 접합체 PNU-166148 (WO 99/17804의 화합물 A1)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이리노테칸은, 예를 들어 상표 캄프토사르(CAMPTOSAR) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 토포테칸은, 예를 들어 상표 하이캄틴(HYCAMTIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "토포이소머라제 II 억제제"는 안트라시클린, 예컨대 리포솜 제제를 비롯한 독소루비신, 예를 들어 케릭스(CAELYX); 다우노루비신; 에피루비신; 이다루비신; 네모루비신; 안트라퀴논 미톡산트론 및 로속산트론; 및 포도필로톡신 에토포시드 및 테니포시드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에토포시드는, 예를 들어 상표 에토포포스(ETOPOPHOS) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 테니포시드는, 예를 들어 상표 VM 26-브리스톨(VM 26-BRISTOL) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 독소루비신은, 예를 들어 상표 아드리블라스틴(ADRIBLASTIN) 또는 아드리아마이신(ADRIAMYCIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 에피루비신은, 예를 들어 상표 파르모루비신(FARMORUBICIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 이다루비신은, 예를 들어 상표 자베도스(ZAVEDOS) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 미톡산트론은, 예를 들어 상표 노반트론(NOVANTRON) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다.

용어 "미세관 활성제"는 미세관 안정화제, 미세관 탈안정화제 및 마이크로튜불린 중합 억제제, 예컨대 비제한적으로 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 특히 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴, 특히 빈크리스틴 술페이트 및 비노렐빈; 디스코데르몰리드; 콜키신; 및 에포틸론 및 그의 유도체, 예를 들어 에포틸론 B 또는 D 또는 그의 유도체에 관한 것이다. 파클리탁셀은, 예를 들어 탁솔(TAXOL) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 도세탁셀은, 예를 들어 상표 탁소테레(TAXOTERE) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 빈블라스틴 술페이트는, 예를 들어 상표 빈블라스틴 R.P.(VINBLASTIN R.P.) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 빈크리스틴 술페이트는, 예를 들어 상표 파르미스틴(FARMISTIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 디스코데르몰리드는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,010,099에 개시된 바와 같이 수득될 수 있다. 또한, WO 98/10121, 미국 특허 번호 6,194,181, WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 및 WO 00/31247에 개시된 에포틸론 유도체가 포함된다. 에포틸론 A 및/또는 B가 특히 바람직하다.

본원에 사용된 용어 "알킬화제"는 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 또는 니트로소우레아 (BCNU 또는 글리아델(Gliadel))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로포스파미드는, 예를 들어 상표 시클로스틴(CYCLOSTIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 이포스파미드는, 예를 들어 상표 홀록산(HOLOXAN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다.

용어 "히스톤 데아세틸라제 억제제" 또는 "HDAC 억제제"는 히스톤 데아세틸라제를 억제하고 항증식 활성을 보유하는 화합물에 관한 것이다. 이는 WO 02/22577에 개시된 화합물, 특히 N-히드록시-3-[4-[[(2-히드록시에틸)[2-(1H-인돌-3-일)에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로펜아미드, N-히드록시-3-[4-[[[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로펜아미드 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 이는 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA)을 추가로 특히 포함한다.

용어 "항신생물성 항대사물"은 5-플루오로우라실 또는 5-FU; 카페시타빈; 겜시타빈; DNA 탈메틸화제, 예컨대 5-아자시티딘 및 데시타빈; 메토트렉세이트 및 에다트렉세이트; 및 폴산 길항제, 예컨대 페메트렉세드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 카페시타빈은, 예를 들어 상표 젤로다(XELODA) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 겜시타빈은, 예를 들어 상표 겜자르(GEMZAR) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 또한, 예를 들어 상표 헤르셉틴(HERCEPTIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있는 모노클로날 항체 트라스투주맙이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "플라틴 화합물"은 카르보플라틴, 시스-플라틴, 시스플라티눔 및 옥살리플라틴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 카르보플라틴은, 예를 들어 상표 카르보플라트(CARBOPLAT) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. 옥살리플라틴은, 예를 들어 상표 엘록사틴(ELOXATIN) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질 또는 지질 키나제 활성; 또는 단백질 또는 지질 포스파타제 활성을 표적화하는/감소시키는 화합물; 또는 추가의 항혈관신생 화합물"은 단백질 티로신 키나제 및/또는 세린 및/또는 트레오닌 키나제 억제제 또는 지질 키나제 억제제, 예를 들어 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:

a) 혈소판-유래 성장 인자-수용체 (PDGFR)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 PDGFR의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 특히 PDGF 수용체를 억제하는 화합물, 예를 들어 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체, 예를 들어 이마티닙, SU101, SU6668 및 GFB-111;

b) 섬유모세포 성장 인자-수용체 (FGFR)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물;

c) 인슐린-유사 성장 인자 수용체 I (IGF-IR)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 IGF-IR의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 특히 IGF-IR 수용체를 억제하는 화합물, 예컨대 WO 02/092599에 개시된 이들 화합물;

d) Trk 수용체 티로신 키나제 패밀리의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물;

e) Axl 수용체 티로신 키나제 패밀리의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물;

f) c-Met 수용체의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물;

g) Kit/SCFR 수용체 티로신 키나제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물;

h) C-kit 수용체 티로신 키나제 - (PDGFR 패밀리의 일부)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 c-Kit 수용체 티로신 키나제 패밀리의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 특히 c-Kit 수용체를 억제하는 화합물, 예를 들어 이마티닙;

i) c-Abl 패밀리의 구성원 및 그의 유전자-융합 생성물, 예를 들어 BCR-Abl 키나제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 c-Abl 패밀리 구성원 및 그의 유전자 융합 생성물의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예를 들어 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체, 예를 들어 이마티닙, PD180970, AG957, NSC 680410 또는 PD173955 (파크데이비스(ParkeDavis)로부터의 것);

j) 단백질 키나제 C (PKC), 및 세린/트레오닌 키나제의 Raf 패밀리의 구성원, MEK, SRC, JAK, FAK, PDK 및 Ras/MAPK 패밀리 구성원, 또는 PI(3) 키나제 패밀리, 또는 PI(3)-키나제-관련 키나제 패밀리의 구성원, 및/또는 시클린-의존성 키나제 패밀리 (CDK)의 구성원의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 특히 미국 특허 번호 5,093,330에 개시된 스타우로스포린 유도체, 예를 들어 미도스타우린; 추가 화합물의 예는, 예를 들어 UCN-01; 사핀골; BAY 43-9006; 브리오스타틴 1; 페리포신; 일모포신; RO 318220 및 RO 320432; GO 6976; Isis 3521; LY333531/LY379196; 이소키놀린 화합물, 예컨대 WO 00/09495에 개시된 것들; FTI; PD184352; 또는 QAN697 (P13K 억제제)을 포함함;

k) 단백질-티로신 키나제 억제제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)) 또는 티르포스틴을 포함하는 단백질-티로신 키나제 억제제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물. 티르포스틴은 바람직하게는 저분자량 (Mr < 1500) 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 특히 벤질리덴말로니트릴 부류 또는 S-아릴벤젠말로니트릴 또는 이중기질 퀴놀린 부류의 화합물로부터 선택된 화합물, 보다 특히 티르포스틴 A23/RG-50810, AG 99, 티르포스틴 AG 213, 티르포스틴 AG 1748, 티르포스틴 AG 490, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B44 (+) 거울상이성질체, 티르포스틴 AG 555, AG 494, 티르포스틴 AG 556, AG957 및 아다포스틴 (4-{[(2,5-디히드록시페닐)메틸]아미노}-벤조산 아다만틸 에스테르, NSC 680410, 아다포스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 화합물임; 및

l) 수용체 티로신 키나제의 표피 성장 인자 패밀리 (동종이량체 또는 이종이량체로서의 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예컨대 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은 특히 EGF 수용체 티로신 키나제 패밀리의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4를 억제하거나 또는 EGF 또는 EGF 관련 리간드와 결합하는 화합물, 단백질 또는 항체이고, 특히 WO 97/02266 (예를 들어 실시예 39의 화합물) 또는 EP 0 564 409; WO 99/03854; EP 0520722; EP 0 566 226; EP 0 787 722; EP 0 837 063; 미국 특허 번호 5,747,498; WO 98/10767; WO 97/30034; WO 97/49688; WO 97/38983, 특히 WO 96/30347 (예를 들어 CP 358774로 공지된 화합물); WO 96/33980 (예를 들어 화합물 ZD 1839) 및 WO 95/03283 (예를 들어 화합물 ZM105180)에 일반적으로 및 구체적으로 개시된 화합물, 단백질 또는 모노클로날 항체, 예를 들어 트라스투주맙 (헤르셉틴), 세툭시맙, 이레사(Iressa), 타르세바(Tarceva), OSI-774, CI-1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 또는 E7.6.3; 및 WO 03/013541에 개시된 7H-피롤로-[2,3-d]피리미딘 유도체임.

추가의 항혈관신생 화합물은 그의 활성에 대해 또 다른 메카니즘을 갖는 화합물, 예를 들어 단백질 또는 지질 키나제 억제와 관련이 없는 화합물, 예를 들어 탈리도미드 (탈로미드(THALOMID)) 및 TNP-470을 포함한다.

단백질 또는 지질 포스파타제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 예를 들어 포스파타제 1, 포스파타제 2A, PTEN 또는 CDC25의 억제제, 예를 들어 오카다산 또는 그의 유도체이다.

세포 분화 과정을 유도하는 화합물은, 예를 들어 레티노산, α-, γ- 또는 δ-토코페롤, 또는 α-, γ- 또는 δ-토코트리엔올이다.

본원에 사용된 용어 시클로옥시게나제 억제제는, 예를 들어 Cox-2 억제제, 5-알킬 치환된 2-아릴아미노페닐아세트산 및 유도체, 예컨대 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)), 로페콕시브 (비옥스(VIOXX)), 에토리콕시브, 발데콕시브 또는 5-알킬-2-아릴아미노페닐아세트산, 예를 들어 5-메틸-2-(2'-클로로-6'-플루오로아닐리노)페닐 아세트산 또는 루미라콕시브를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "비스포스포네이트"는 에트리돈산, 클로드론산, 틸루드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 이반드론산, 리세드론산 및 졸레드론산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "에트리돈산"은, 예를 들어 상표 디드로넬(DIDRONEL) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "클로드론산"은, 예를 들어 상표 보네포스(BONEFOS) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "틸루드론산"은, 예를 들어 상표 스켈리드(SKELID) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "파미드론산"은, 예를 들어 상표 아레디아(AREDIA)™ 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "알렌드론산"은, 예를 들어 상표 포사맥스(FOSAMAX) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "이반드론산"은, 예를 들어 상표 본드라나트(BONDRANAT) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "리세드론산"은, 예를 들어 상표 악토넬(ACTONEL) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다. "졸레드론산"은, 예를 들어 상표 조메타(ZOMETA) 하에, 예를 들어 시판되는 것과 같은 형태로 투여될 수 있다.

용어 "mTOR 억제제"는 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)을 억제하고 항증식 활성을 보유하는 화합물, 예컨대 시롤리무스 (라파뮨(Rapamune)®), 에베롤리무스 (세르티칸(Certican)™), CCI-779 및 ABT578에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "헤파라나제 억제제"는 헤파린 술페이트 분해를 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 PI-88을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "생물학적 반응 조절제"는 림포카인 또는 인터페론, 예를 들어 인터페론 γ를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Ras 종양원성 이소형, 예를 들어 H-Ras, K-Ras 또는 N-Ras의 억제제"는 Ras의 종양원성 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물, 예를 들어 "파르네실 트랜스퍼라제 억제제", 예를 들어 L-744832, DK8G557 또는 R115777 (자르네스트라(Zarnestra))을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "텔로머라제 억제제"는 텔로머라제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 텔로머라제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 특히 텔로머라제 수용체를 억제하는 화합물, 예를 들어 텔로메스타틴이다.

본원에 사용된 용어 "메티오닌 아미노펩티다제 억제제"는 메티오닌 아미노펩티다제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 메티오닌 아미노펩티다제의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 예를 들어 벤가미드 또는 그의 유도체이다.

본원에 사용된 용어 "프로테아솜 억제제"는 프로테아솜의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 지칭한다. 프로테아솜의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 예를 들어 PS-341 및 MLN 341을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제" 또는 "MMP 억제제"는 콜라겐 펩티드모방체 및 비-펩티드모방체 억제제, 테트라시클린 유도체, 예를 들어 히드록사메이트 펩티드모방체 억제제 바티마스타트 및 그의 경구로 생체이용가능한 유사체 마리마스타트 (BB-2516), 프리노마스타트 (AG3340), 메타스타트 (NSC 683551) BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211, MMI270B 또는 AAJ996을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "혈액 악성종양의 치료에 사용되는 작용제"는 FMS-유사 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 FMS-유사 티로신 키나제 수용체 (Flt-3R)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물; 인터페론, 1-b-D-아라비노푸란실시토신 (ara-c) 및 비술판; 및 ALK 억제제, 예를 들어 역형성 림프종 키나제를 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

FMS-유사 티로신 키나제 수용체 (Flt-3R)의 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 특히 Flt-3R 수용체 키나제 패밀리의 구성원을 억제하는 화합물, 단백질 또는 항체, 예를 들어 PKC412, 미도스타우린, 스타우로스포린 유도체, SU11248 및 MLN518이다.

본원에 사용된 용어 "HSP90 억제제"는 HSP90의 내인성 ATPase 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물; 유비퀴틴 프로테아솜 경로를 통해 HSP90 클라이언트 단백질을 분해, 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. HSP90의 내인성 ATPase 활성을 표적화, 감소 또는 억제하는 화합물은, 특히 HSP90의 ATPase 활성을 억제하는 화합물, 단백질 또는 항체, 예를 들어 17-알릴아미노, 17-데메톡시겔다나마이신 (17AAG), 겔다나마이신 유도체, 다른 겔다나마이신 관련 화합물, 라디시콜 및 HDAC 억제제이다.

본원에 사용된 용어 "항증식성 항체"는 트라스투주맙 (헤르셉틴™), 트라스투주맙-DM1, 에를로티닙 (타르세바™), 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)™), 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®), PRO64553 (항-CD40) 및 2C4 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체는, 예를 들어 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2종의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 의미한다.

급성 골수성 백혈병 (AML)의 치료를 위해, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 표준 백혈병 요법과 조합되어, 특히 AML의 치료에 사용되는 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 특히, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는, 예를 들어 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 및/또는 AML의 치료에 유용한 다른 약물, 예컨대 다우노루비신, 아드리아마이신, Ara-C, VP-16, 테니포시드, 미톡산트론, 이다루비신, 카르보플라티눔 및 PKC412와 조합되어 투여될 수 있다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 또한 다른 치료제, 특히 다른 항-말라리아제와 조합되어 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 항-말라리아제는 프로구아닐, 클로르프로구아닐, 트리메토프림, 클로로퀸, 메플로퀸, 루메판트린, 아토바쿠온, 피리메타민-술파독신, 피리메타민-답손, 할로판트린, 퀴닌, 퀴니딘, 아모디아퀸, 아모피로퀸, 술폰아미드, 아르테미시닌, 아르테플렌, 아르테메터, 아르테수네이트, 프리마퀸, 흡입용 NO, L-아르기닌, 디프로필렌트리-아민 NONOate (NO 공여자), 로시글리타존 (PPARγ 효능제), 활성탄, 에리트로포이에틴, 레바미솔 및 피로나리딘을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 또한 다른 치료제, 예컨대 리슈마니아증, 트리파노소마증, 톡소플라스마증 및 신경낭미충증의 치료에 사용되는 것과 조합되어 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 클로로퀸 술페이트, 아토바쿠온-프로구아닐, 아르테메터-루메판트린, 퀴닌-술페이트, 아르테수네이트, 퀴닌, 독시시클린, 클린다마이신, 메글루민 안티모니에이트, 소듐 스티보글루코네이트, 밀테포신, 케토코나졸, 펜타미딘, 암포테리신 B (AmB), 리포솜-AmB, 파로모마이신, 에플로르니틴, 니푸르티목스, 수라민, 멜라르소프롤, 프레드니솔론, 벤즈니다졸, 술파디아진, 피리메타민, 클린다마이신, 트리메트로핌, 술파메톡사졸, 아지트로마이신, 아토바쿠온, 덱사메타손, 프라지콴텔, 알벤다졸, 베타-락탐, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 아미노글리코시드, 술파디아진 및 피리메타민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

코드 번호, 일반명 또는 상표명에 의해 확인되는 활성제의 구조는 표준 일람 ["The Merck Index"] 현행판 또는 데이터베이스, 예를 들어 페이턴츠 인터내셔널(Patents International), 예를 들어 IMS 월드 퍼블리케이션즈(IMS World Publications)로부터 얻을 수 있다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태와 조합되어 사용될 수 있는 상기 언급된 화합물은 관련 기술분야, 예컨대 상기 인용된 문헌에 기재된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 또한 공지된 치료 방법, 예를 들어 호르몬의 투여 또는 특히 방사선과 조합되어 유리하게 사용될 수 있다.

(1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태는 특히 방사선증감제로서, 특히 방사선요법에 불량한 감수성을 나타내는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.

"조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 조합 파트너가 독립적으로 동시에 투여되거나 또는 특히 조합 파트너가 협력 효과, 예를 들어 상승작용 효과 또는 그의 임의의 조합을 나타내도록 하는 시간 간격을 두고 별개로 투여될 수 있는 것인 조합 투여를 위한 부분들의 키트를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "공-투여" 또는 "조합 투여" 등은 선택된 조합 파트너를 그를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어 환자)에 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되지는 않는 것인 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "제약 조합물"은, 하나 초과의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미하고, 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태 및 조합 파트너가 둘 다 단일 개체 또는 투여량의 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논)의 무수 결정질 형태 및 조합 파트너가 둘 다 별개의 개체로서 동시에, 공동으로, 또는 구체적 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체 내에 2종의 화합물의 치료상 유효한 수준을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에 적용된다.

실시예

실험 상세사항:

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 의도되고, 그에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 온도는 섭씨 온도로 주어진다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 증발은 감압 하에, 전형적으로는 약 15 mm Hg 내지 100 mm Hg (= 20-133 mbar)에서 수행한다. 최종 생성물, 중간체 및 출발 물질의 구조는 표준 분석 방법, 예를 들어 미량분석 및 분광학적 특성, 예를 들어 MS, IR, NMR에 의해 확인한다. 사용된 약어는 관련 기술분야에 통상적인 것들이다.

본 발명의 형태를 합성하는데 이용되는 모든 출발 물질, 빌딩 블록, 시약, 산, 염기, 탈수제, 용매 및 촉매는 상업적으로 입수가능하거나, 또는 통상의 기술자에게 공지된 유기 합성 방법 (Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21)에 의해 제조할 수 있다. 추가로, 본 발명의 형태는 하기 실시예에 나타낸 바와 같은 통상의 기술자에게 공지된 유기 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.

약어

ACN 아세토니트릴

AcOH 아세트산

aq. 수성

Boc tert-부톡시카르보닐

Boc₂O 디-tert-부틸 디카르보네이트

tBu tert-부틸

tBuOH tert-부탄올

BrettPhos 2-(디시클로헥실포스피노)-3,6-디메톡시-2'-4'-6'-트리이소프로필-1,1'-비페닐

br s 넓은 단일선

COMU (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트

conc. 진한

d 일

d 이중선

dd 이중선의 이중선

dba 디벤질리덴아세톤

DCM 디클로로메탄

DEA 디에틸아민

DEAD 디에틸 아조디카르복실레이트

DEAP 디에틸아미노피리딘

DIPEA 디이소프로필에틸아민

DMF 디메틸포름아미드

DMME 디메톡시메탄

DMSO 디메틸술폭시드

DPPA 디페닐포스포릴 아지드

DPPF 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센

EDC 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드

eq. 당량

ESI 전기분무 이온화

Et₃N 트리에틸아민

Et₂O 디에틸에테르

EtOAc 에틸 아세테이트

EtOH 에탄올

h 시간

HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HBTU O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HMDS 헥사메틸디실라잔

HOBT 1-히드록시-벤즈트리아졸

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

IPA 이소프로판올

LCMS 액체 크로마토그래피 동반 질량 분광측정법

mCPBA 메타-클로로퍼옥시벤조산

MeOH 메탄올

m 다중선

min 분

MS 질량 분광측정법

mw 마이크로웨이브

NMR 핵 자기 공명 분광측정법

NaOtBu 소듐 tert-부톡시드

NP 정상상

OBD 최적 베드 밀도

Pd₂(dba)₃ 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐

PL-HCO₃ MP SPE 산 제거를 위한 중합체-지지된 비카르보네이트 카트리지

prep. 정제용

PPh₃ 트리페닐포스핀

q 사중선

Rac-BINAP 라세미 2,2'-비스(디-p-톨릴포스피노)-1,1'-비나프틸

RP 역상

Rt 체류 시간

rt 실온

RuPhos 2-디시클로헥실포스피노-2',6'-디-이소프로폭시-1,1'-비페닐

sat. 포화

SCX-2 중합체 지지된 술폰산 거대다공성 폴리스티렌

soln. 용액

t 삼중선

TBME tert-부틸 메틸 에테르

TBAF 테트라부틸암모늄 플루오라이드

TBDMSCl tert-부틸디메틸실릴클로라이드

테트라메틸-t-부틸-XPhos 2-디-t-부틸포스피노-3,4,5,6-테트라메틸-2',4',6'-트리이소프로필비페닐

TFA 트리플루오로아세트산

THF 테트라히드로푸란

TLC 박층 크로마토그래피

UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피

XPhos 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐

Pd[RuPhos] (2-디시클로헥실포스피노-2' 6'-디이소프로필-1 1'-비페닐)(2-(2-아미노에틸)페닐)팔라듐(II)

사용된 마이크로웨이브 장비는 바이오타지 이니시에이터(Biotage Initiator)®였다.

모든 화합물은 오토놈(AutoNom)을 사용하여 명명하였다.

일반적 크로마토그래피 정보

LCMS 방법 M1 (Rt_M1)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 50 mm

HPLC-칼럼 유형: 액퀴티(Acquity) UPLC HSS T3, 1.8 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.05 부피% 포름산 + 3.75 mM 아세트산암모늄 B) ACN + 0.04 부피% 포름산

HPLC-구배: 1.4분 내 2 - 98% B, 0.45분 98% B, 유량 = 1.2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 50℃

LCMS 방법 M2 (Rt_M2)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스(Ascentis Express) C18, 2.7 μm

HPLC-구배: 1.4분 내 2 - 98% B, 0.75분 98% B, 유량 = 1.2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 50℃

LCMS 방법 M3 (Rt_M3)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18, 2.7 μm

HPLC-구배: 8.5분 내 2 - 98% B, 1분 98% B, 유량 = 1.2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 50℃

LCMS 방법 M4 (Rt_M4)

HPLC-칼럼 치수: 4.6 x 50 mm

HPLC-칼럼 유형: 선파이어(SunFire) C18, 5 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.1 부피% TFA, B) ACN + 0.1 부피% TFA

HPLC-구배: 8.0분 내 5 - 100% B, B 유량 = 2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 40℃

LCMS 방법 M5 (Rt_M5)

HPLC-칼럼 치수: 0.46x25 cm

HPLC-칼럼 유형: 키랄셀(Chiralcel) OJ-H (1189)

HPLC-용리액: EtOH/MeOH 60:40

HPLC-구배: 등용매, 유량 = 0.5 ml/분

검출기: UV 220 nm

LCMS 방법 M6 (Rt_M6)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18, 2.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.05% TFA, B) ACN + 0.04% TFA

HPLC-구배: 1.4분 내 2 - 98% B, 0.75분 98% B, 유량 = 1.2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 50℃

LCMS 방법 M7 (Rt_M7)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18, 2.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.05% TFA, B) ACN + 0.04% TFA

HPLC-구배: 3.0분 내 10 - 95% B, 1분 95% B, 유량 = 1.2 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 50℃

LCMS 방법 M8 (Rt_M8)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18 2.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.05% 포름산 + 3.75 mM 아세트산암모늄, B) 아세토니트릴 + 0.04% 포름산

HPLC-구배: 3.0분 내 10 - 95% B, 유량 = 1.2 ml/분

LCMS 방법 M9 (Rt_M9)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18 2.7 μm

HPLC-구배: 0.0에서 0.5분 10% B, 이어서 0.5분에서 3.0분 구배 10 - 95% B, 유량 = 1.2 ml/분

LCMS 방법 M10 (Rt_M10)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 50 mm

HPLC-칼럼 유형: 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.1 부피% 포름산, B) 아세토니트릴

HPLC-구배: 1.00분 내 20 - 25%, 이어서 3.20분 내 25 - 95% B, 이어서 0.10분 내 95 - 100% B, 이어서 0.20분 동안 100%, 유량 = 0.7 ml/분

LCMS 방법 M11 (Rt_M11)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 50 mm

HPLC-칼럼 유형: 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.1 부피% 포름산, B) 아세토니트릴

HPLC-구배: 1.00분 내 5 - 10% B, 이어서 3.00분 내 10 - 90% B, 이어서 0.10분 내 90 - 100% B, 이어서 0.40분 동안 100%, 유량 0.7 ml/분

LCMS 방법 M12 (Rt_M12)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18 2.7 μm

HPLC-용리액: A) 물 + 0.1 부피% TFA, B) 아세토니트릴

HPLC-구배: 1.7분에 걸쳐 10 -95% B 및 용매 유량으로서 1.2 mL/분, 이어서 0.7분에 걸쳐 95 5 B, 유량 = 1.4 mL/분.

LCMS 방법 M13 (Rt_M13)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18 2.7 μm

HPLC-구배: 3.7분 내 10 - 95% B, 유량 = 1.2 ml/분

LCMS 방법 M14 (Rt_M14)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 30 mm

HPLC-칼럼 유형: 아센티스 익스프레스 C18, 2.7 μm

HPLC-구배: 1.5분 내 10 - 95% B, 1분 95% B, 유량 = 1.2 ml/분

LCMS 방법 M15 (Rt_M15)

HPLC-칼럼 치수: 0.46x25 cm

HPLC-칼럼 유형: 키랄셀 OD-H (1194)

HPLC-용리액: 헥산/EtOH 50:50 + 0.05% DEA

HPLC-구배: 등용매, 유량=0.5 ml/분

검출기: UV 220 nm

LCMS 방법 M16 (Rt_M16)

HPLC-칼럼 치수: 2.1 x 50 mm

HPLC-칼럼 유형: 액퀴티 UPLC HSS T3, 1.8 μm

HPLC-구배: 1.4분 내 5 - 98% B, 0.4분 98% B, 유량 = 1.0 ml/분

HPLC-칼럼 온도: 60℃

X선 분말 회절

기기분석:

방법 X1

기기 브루커(Bruker) D8 GADDS 디스커버(Discover)

조사 CuKα (40 kV, 40 mA)

검출기 HI-STAR 영역 검출기

스캔 범위 6°-39° (2 세타 값)

융점 결정:

융점은 시차 주사 열량측정 (DSC)에 의해 결정하였다. DSC는 10℃/분의 가열 속도를 사용하는 TA 인스트루먼츠(TA Instruments) DSC Q2000 상에 기록된 바와 같았다. 0.6 mg 샘플을 표준 알루미늄 팬 (팬 + 덮개, TA 900786.901, 900779.901) 내로 칭량하였다. 써멀 어드밴티지 Q-시리즈(Thermal Advantage Q-Series) 소프트웨어 V.2.6.0.367 및 써멀 어드밴티지 소프트웨어 V4.6.9를 사용하여 기기를 작동시켰다. 유니버셜 어낼러시스(Universal Analysis) V4.3A 빌드 4.3.0.6을 사용하여 열 사건을 특성화하였다. 샘플을 핀 홀이 없는 샘플 팬에 대해 측정하였다. 샘플을 하기 프로토콜에 따라 처리하였다:

단계 1: 0℃에서 평형화

단계 2: 300℃까지 10℃/분으로 램핑.

실시예 F1: (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논

a) 7-클로로-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진

THF (63 ml) 중 7-클로로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-2-온 (CAS 등록번호 928118-43-8) (3.70 g, 20 mmol)의 용액을 BH₃*THF (THF 중 1M, 47 ml, 47 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시키고, 메탄올 (24 ml, 600 mmol)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc로 녹이고, 포화 수성 NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 생성물을 연황색 고체 (3.3 g, 96% 수율)로서 수득하였다.

b) 2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-올

디옥산 (32.5 ml) 중 7-클로로-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진 (1.08 g, 6.33 mmol), 수성 KOH 용액 (5.4 ml 물 중 1.07 g, 19 mmol KOH), 2-디-t-부틸포스피노-3,4,5,6-테트라메틸-2',4',6-트리-i-프로필비페닐 98% (0.30 g, 0.63 mmol) 및 Pd₂(dba)₃ (0.29 g, 0.32 mmol)의 혼합물을 질소로 3회 탈기하고, 튜브를 밀봉하고, 반응 혼합물을 100℃에서 5시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 하이플로를 통해 여과하고, EtOAc 및 메탄올로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피 (DCM / MeOH, 98:2에서 75:25)를 한 후, 표제 화합물을 오렌지색 잔류물 (660 mg, 69% 수율)로서 수득하였다.

c) (S)-3-(2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시)-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르

DMF (40 ml) 중 2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-올 (0.66 g, 4.34 mmol) 및 (R)-3-메탄술포닐옥시-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (CAS 등록번호 127423-61-4) (1.73 g, 6.51 mmol)의 건조 용액을 수소화나트륨 (광유 중 60%, 0.21 g, 8.68 mmol)으로 처리하고, 반응 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 TBME로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피 (시클로헥산 / EtOAc, 95:5에서 30:70)를 한 후, 표제 화합물을 황색 오일 (1.035 g, 75% 순도, 56% 수율)로서 수득하였다.

d) (S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르

디옥산 (6 ml) 중 (S)-3-(2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시)-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (254 mg, 0.79 mmol), 5-브로모-2-메톡시-3-메틸피리딘 (CAS 등록번호 760207-87-2) (208 mg, 1.03 mmol), XPhos (30 mg, 0.06 mmol), 및 NaOtBu (167 mg, 1.74 mmol)의 혼합물을 아르곤으로 5분 동안 탈기한 다음, Pd₂(dba)₃ (29 mg, 0.03 mmol)을 첨가하였다. 튜브를 아르곤으로 채우고, 밀봉하고, 반응 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 하이플로를 통해 여과하고, EtOAc로 헹구고, 여과물을 포화 수성 NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc로 2회 재추출하고, 합한 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피 (헵탄 / EtOAc, 100:0에서 50:50)를 한 후, 표제 화합물을 투명한 검 (274 mg, 78% 수율)으로서 수득하였다.

e) 1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-7-((S)-피롤리딘-3-일옥시)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진

DCM (6 ml) 중 (S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (364 mg, 0.82 mmol)의 용액을 TFA (0.63 ml, 8.23 mmol)로 처리하고, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 포화 수성 NaHCO₃ 용액으로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 생성물을 적색 오일로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다 (313mg, 90% 순도, 정량적 수율).

f) (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논

DMF (4 ml) 중 1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-카르복실산 (CAS 등록번호 64096-87-3) (106 mg, 0.59 mmol)의 용액을 HBTU (225 mg, 0.59 mmol) 및 DIPEA (0.24 ml, 1.37 mmol)로 처리하였다. 생성된 오렌지색 용액을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DMF (2 ml) 중 1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-7-((S)-피롤리딘-3-일옥시)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진 (156 mg, 0.46 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 DCM으로 녹이고, 포화 수성 NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 유기 층을 상 분리 카트리지에 통과시킴으로써 건조시키고, 농축시키고, SFC 크로마토그래피 (칼럼 DEAP (250mm x 30mm, 60A, 5μm) 프린스턴(Princeton), 6분 내 초임계 CO₂ 중 메탄올의 구배 11 - 16%)를 한 후, 표제 화합물을 연한색 고체 (112 mg, 49% 수율)로서 수득하였다.

이소프로판올 / 디에틸 에테르 중에서의 가열 및 냉각에 의한 실시예 F1의 결정화

무정형 실시예 F1 474mg을 이소프로판올 1.4mL 중에 현탁시켰다. 혼합물을 70℃로 가열하고, 70℃에서 교반하여 실시예 F1이 완전히 용해되도록 하였다. 용액을 실온으로 냉각시켰고, 접착성 잔류물이 형성되었다. 디에틸 에테르 2mL를 첨가하고, 슬러리를 48시간 동안 교반하였다. 백색 현탁액이 형성되었다. 현탁액을 여과하고, 고체를 40℃, 15mbar에서 건조시켰다. 미세한 백색 분말을 수득하였다. 이 물질은 약간의 잔류 용매 (<0.5%)만을 함유하였다. 148.77℃의 용융 개시점을 갖는 실시예 F1의 결정질 무수 형태를 수득하였다.

실시예 F1 무수 형태 (방법 M1)의 허용오차 ±0.5를 갖는 X선 분말 회절 패턴으로부터의 가장 유의한 2-세타 피크 목록 (정보에 대한 낮은/약한 피크 포함). 주: 하기 피크 목록은 배타적인 것이 아니며, 단지 "특히"일 뿐이다.

생물학적 평가

화합물의 활성은 하기 시험관내 & 생체내 방법에 의해 평가할 수 있다.

생물학적 검정

1 효소적 PI3K 알파 및 PI3K 델타 이소형 억제의 결정

1.1 지질 키나제 활성의 시험

PI3 키나제 억제제로서의 화합물의 효능은 하기와 같이 입증할 수 있다:

절반 면적 코스타(COSTAR) 96 웰 플레이트의 웰당 50 μl의 최종 부피로 키나제 반응을 수행하였다. 검정에서 ATP 및 포스파티딜 이노시톨의 최종 농도는 각각 5 μM 및 6 μg/mL였다. PI3 키나제, 예를 들어 PI3 키나제 δ를 첨가함으로써 반응을 개시하였다.

p110δ. 검정의 성분을 웰마다 하기와 같이 첨가하였다:

ㆍ 칼럼 2-1에 웰당 5% DMSO 중 10 μl 시험 화합물.

ㆍ 칼럼 1의 처음 4개 웰 및 칼럼 12의 마지막 4개 웰에 5% vol/vol DMSO 10 μl를 첨가함으로써 총 활성을 결정하였다.

ㆍ 칼럼 1의 마지막 4개 웰 및 칼럼 12의 처음 4개 웰에 10 μM 대조군 화합물을 첨가함으로써 배경값을 결정하였다.

ㆍ 플레이트당 2 mL '검정 믹스'를 제조하였다:

HEPES 검정 완충제 1.912 mL

웰당 5 μM의 최종 농도를 제공하는 ATP의 3 mM 원액 8.33 μl

활성일에 웰당 0.05 μCi를 제공하는 [³³P]ATP 1 μl

웰당 6 μg/mL의 최종 농도를 제공하는 1 mg/mL PI 원액 30 μl

웰당 1 mM의 최종 농도를 제공하는 MgCl₂의 1 M 원액 5 μl

ㆍ 웰당 검정 믹스 20 μl를 첨가하였다.

ㆍ 플레이트당 2 mL '효소 믹스'를 제조하였다 (키나제 완충제 2 mL 중 x^* μl PI3 키나제 p110β). '효소 믹스'는 검정 플레이트에 첨가하는 동안 얼음 상에 유지하였다.

ㆍ 웰당 20 μl '효소 믹스'를 첨가하여 반응을 개시하였다.

ㆍ 이어서, 플레이트를 90분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

ㆍ 웰당 50 μl WGA-SPA 비드 (밀 배아 응집소-코팅된 섬광 근접 검정 비드) 현탁액을 첨가함으로써 반응을 종결하였다.

ㆍ 탑실-S(TopSeal-S) (폴리스티렌 마이크로플레이트를 위한 가열 밀봉, 퍼킨엘머 LAS [도이칠란트] 게엠베하(PerkinElmer LAS [Deutschland] GmbH), 독일 로트가우)를 사용하여 검정 플레이트를 밀봉하고, 적어도 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

ㆍ 이어서, 주앙(Jouan) 벤치 탑 원심분리기 (주앙 인크.(Jouan Inc.), 프랑스 낭트)를 사용하여 검정 플레이트를 2분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다.

ㆍ 팩커드 탑카운트(Packard TopCount)를 사용하여 검정 플레이트를 계수하였다 (각 웰을 20초 동안 계수함).

* 효소의 부피는 사용된 배치의 효소적 활성에 따라 달라진다.

보다 바람직한 검정에서는, 저 부피 비-결합 코닝(CORNING) 384 웰 흑색 플레이트 (카탈로그 번호 #3676)의 웰당 10 μl의 최종 부피로 키나제 반응을 수행하였다. 검정에서 ATP 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)의 최종 농도는 각각 1 μM 및 10 μg/mL였다. ATP를 첨가함으로써 반응을 개시하였다.

검정의 성분을 웰마다 하기와 같이 첨가하였다:

칼럼 1-20에 웰당 90% DMSO 중 50 nl 시험 화합물, 단일로 8가지 농도 (1/3 및 1/3.33 연속 희석 단계).

ㆍ 저 대조군: 칼럼 23-24의 웰 절반에 90% DMSO 50 nl (최종 0.45%).

ㆍ 고 대조군: 칼럼 23-24의 다른 절반에 참조 화합물 (예를 들어 WO 2006/122806에서의 실시예 7의 화합물) 50 nl (최종 2.5 μM).

ㆍ 표준물: 칼럼 21-22에 시험 화합물로서 희석된 직전에 언급된 바와 같은 참조 화합물 50 nl.

ㆍ 검정당 20 mL '완충제'를 제조하였다:

1M 트리스 HCl pH7.5 200 μl (최종 10 mM)

1M MgCl₂ 60 μl (최종 3 mM)

2M NaCl 500 μl (최종 50 mM)

10% CHAPS 100 μl (최종 0.05%)

100mM DTT 200 μl (최종 1mM)

나노순수 물 18.94 mL

ㆍ 검정당 10 mL 'PI'를 제조하였다:

3% 옥틸글루코시드 중에 제조된 1 mg/mL l-알파-포스파티딜이노시톨 (소의 간, 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids) 카탈로그 번호 840042C MW=909.12) 200 μl (최종 10 μg/mL)

'완충제' 9.8 mL

ㆍ 검정당 10 mL 'ATP'를 제조하였다:

웰당 1 μM의 최종 농도를 제공하는 ATP의 3 mM 원액 6.7 μl

'완충제' 10 mL

ㆍ 검정당 각각의 PI3K 구축물 2.5 mL를 'PI' 중에 하기 최종 농도로 제조하였다:

10 nM PI3K 알파 EMV B1075

25 nM 베타 EMV BV949

10 nM 델타 EMV BV1060

150 nM 감마 EMV BV950

ㆍ 웰당 'PI/PI3K' 5 μl를 첨가하였다.

ㆍ 웰당 5 μl 'ATP'를 첨가하여 반응을 개시하였다.

ㆍ 이어서, 플레이트를 60분 (알파, 베타, 델타) 또는 120분 (감마) 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

ㆍ 10 μl 키나제-글로(Kinase-Glo) (프로메가(Promega) 카탈로그 번호 #6714)를 첨가하여 반응을 종결하였다.

ㆍ 10분 후에 시너지 2(Synergy 2) 판독기 (바이오텍(BioTek), 미국 버몬트)에서 100 밀리초의 통합 시간 및 191로 설정된 감도로 검정 플레이트를 판독하였다.

ㆍ 출력값: 고 대조군은 약 60,000 카운트였고, 저 대조군은 30,000 이하였다.

ㆍ 본 발광 검정은 0.4 내지 0.7의 유용한 Z' 비를 제공하였다.

Z' 값은 검정 견실성의 보편적인 척도이다. 0.5 내지 1.0의 Z'가 탁월한 검정으로 간주된다.

본 검정을 위해, 언급된 PI3K 구축물을 하기와 같이 제조하였다:

1.2 유전자 구축물의 생성

2개의 상이한 구축물 BV 1052 및 BV 1075를 사용하여 화합물 스크리닝을 위한 PI3 키나제 α 단백질을 생성하였다.

PI3Kα BV-1052 p85(iSH2)-Gly 링커-p110a(D20aa)-C-말단 His 태그

p85 서브유닛의 중간 SH2 도메인 (iSH2) 및 p110-a 서브유닛 (처음 20개 아미노산 결실)에 대한 PCR 생성물을 생성하고, 중복 PCR에 의해 융합시켰다.

먼저 프라이머

를 사용하여 제1 가닥 cDNA로부터 iSH2 PCR 생성물을 생성하였다.

후속적으로, 2차 PCR 반응에서 게이트웨이(Gateway) (인비트로젠 아게(Invitrogen AG), 스위스 바젤) 재조합 AttB1 부위 및 링커 서열을, 프라이머

를 사용하여 p85 iSH2 단편의 5'말단 및 3'말단에 각각 부가하였다.

또한, 먼저 프라이머

를 사용하여 제1 가닥 cDNA로부터 p110-a 단편을 생성하였다.

후속적 PCR 반응에서, 링커 서열 및 히스티딘 태그를, 프라이머

를 사용하여 p110-a 단편의 5'말단 및 3'말단에 각각 부가하였다.

상기 언급된 gwG130-p03 프라이머, 및 중복 히스티딘 태그 및 AttB2 재조합 서열을 함유하는 프라이머

를 사용하여, iSH2 단편의 3'말단 및 p110-a 단편의 5'말단에서 중복 링커에 의한 제3 PCR 반응으로 p85-iSH2/p110-a 융합 단백질을 조립하였다.

상기 최종 생성물을 (인비트로젠) OR 반응에서 공여자 벡터 pDONR201 내로 재조합시켜 ORF318 진입 클론을 생성하였다. 상기 클론을 서열분석에 의해 검증하고, 게이트웨이 LR 반응에서 삽입물을 바큘로바이러스 발현 벡터 LR410의 생성을 위한 게이트웨이 적합화 pBlueBac4.5 (인비트로젠) 벡터 내로 전달하는데 사용하였다.

PI3Kα BV-1075 p85(iSH2)-12 XGly 링커-p110a(D20aa)-C-말단 His 태그

벡터 pBlueBac4.5 내로 클로닝된 p85 단편 및 p110-a 단편으로 구성된 3-부분 라이게이션에 의해 바큘로바이러스 BV-1075에 대한 구축물을 생성하였다. Nhe/Spe로 소화시킨 플라스미드 p1661-2로부터 p85 단편을 유도하였다. SpeI/HindIII 단편으로서 LR410 (상기 참조)으로부터 p110-a 단편을 유도하였다. 클로닝 벡터 pBlueBac4.5 (인비트로젠)를 Nhe/HindIII으로 소화시켰다. 이로써 구축물 PED 153.8을 생성하였다.

주형으로서의 ORF 318 (상기 기재된 것), 및 1개의 정방향 프라이머

및 2개의 역방향 프라이머

를 사용하여 PCR에 의해 p85 성분 (iSH2)을 생성하였다.

2개의 역방향 프라이머는 중복되고, 12x Gly 링커 및 p110a 유전자의 N-말단 서열을 SpeI 부위로 혼입시켰다. 12x Gly 링커는 BV1052 구축물에서의 링커를 대체하였다. PCR 단편을 pCR2.1 TOPO (인비트로젠) 내로 클로닝하였다. 생성된 클론 중 p1661-2가 정확한 것으로 결정되었다. 상기 플라스미드를 Nhe 및 SpeI로 소화시키고, 생성된 단편을 서브클로닝을 위해 겔-단리하고 정제하였다.

클론 LR410 (상기 참조)을 SpeI 및 HindIII으로 효소 소화시켜 p110-a 클로닝 단편을 생성하였다. SpeI 부위는 p110a 유전자의 코딩 영역에 존재하였다. 생성된 단편을 서브클로닝을 위해 겔-단리하고 정제하였다.

Nhe 및 HindIII으로 효소 소화시킴으로써 클로닝 벡터 pBlueBac4.5 (인비트로젠)를 제조하였다. 절단 벡터를 퀴아젠(Qiagen) (퀴아젠 엔.브이(Quiagen N.V), 네덜란드 벤로) 칼럼으로 정제한 다음, 소 장 알칼리성 포스파타제 (CIP) (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 매사추세츠주 입스위치)로 탈인산화하였다. CIP 반응의 완결 후, 절단 벡터를 다시 칼럼 정제하여 최종 벡터를 생성하였다. 로슈 래피드(Roche Rapid) 리가제 및 판매업체 설명서를 사용하여 3-부분 라이게이션을 수행하였다.

PI3Kβ BV-949 p85(iSH2)-Gly 링커-p110b(전장)-C-말단 His 태그

p85 서브유닛의 중간 SH2 도메인 (iSH2) 및 전장 p110-b 서브유닛에 대한 PCR 생성물을 생성하고, 중복 PCR에 의해 융합시켰다.

먼저 프라이머

후속적으로, 2차 PCR 반응에서 게이트웨이 (인비트로젠) 재조합 AttB1 부위 및 링커 서열을, 프라이머

또한, 먼저 링커 서열 및 p110-b의 5'말단을 함유하는

및 히스티딘 태그에 융합된 p110-b의 3'말단의 서열을 함유하는

프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA로부터 p110-b 단편을 생성하였다.

를 사용하여, iSH2 단편의 3'말단 및 p110-b 단편의 5'말단에서 링커의 중복 PCR 반응에 의해 p85-iSH2/p110-b 융합 단백질을 조립하였다.

상기 최종 생성물을 게이트웨이 (인비트로젠) OR 반응에서 공여자 벡터 pDONR201 내로 재조합시켜 ORF253 진입 클론을 생성하였다. 상기 클론을 서열분석에 의해 검증하고, 게이트웨이 LR 반응에서 삽입물을 바큘로바이러스 발현 벡터 LR280의 생성을 위한 게이트웨이 적합화 pBlueBac4.5 (인비트로젠) 벡터 내로 전달하는데 사용하였다.

PI3Kδ BV-1060 p85(iSH2)-Gly 링커-p110d(전장)-C-말단 His 태그

p85 서브유닛의 중간 SH2 도메인 (iSH2) 및 전장 p110-d 서브유닛에 대한 PCR 생성물을 생성하고, 중복 PCR에 의해 융합시켰다.

먼저 프라이머

또한, 먼저 프라이머

를 사용하여 제1 가닥 cDNA로부터 p110-a 단편을 생성하였다.

를 사용하여 p110-d 단편의 5'말단 및 3'말단에 각각 부가하였다.

상기 언급된 gwG130-p03 프라이머, 및 중복 히스티딘 태그 및 게이트웨이 (인비트로젠) AttB2 재조합 서열을 함유하는 프라이머

를 사용하여, iSH2 단편의 3'말단 및 p110-d 단편의 5'말단에서 중복 링커에 의한 제3 PCR 반응으로 p85-iSH2/p110-d 융합 단백질을 조립하였다.

상기 최종 생성물을 게이트웨이 (인비트로젠) OR 반응에서 공여자 벡터 pDONR201 내로 재조합시켜 ORF319 진입 클론을 생성하였다. 상기 클론을 서열분석에 의해 검증하고, 게이트웨이 LR 반응에서 삽입물을 바큘로바이러스 발현 벡터 LR415의 생성을 위한 게이트웨이 적합화 pBlueBac4.5 (인비트로젠) 벡터 내로 전달하는데 사용하였다.

PI3Kγ BV-950 p110g(D144aa)-C-말단 His 태그

상기 구축물은 로저 윌리암스(Roger Williams) 실험실 (MRC 분자 생물학 실험실, 영국 캠브리지)로부터 입수하였다 (2003년 11월). 구축물은 문헌 [Pacold M. E. et al. (2000) Cell 103, 931-943]에 기재되어 있다.

1.3 단백질 발현 및 정제

PI3K 이소형에 대한 재조합 바큘로바이러스 및 단백질의 생성 방법:

다양한 PI3 키나제 유전자를 함유하는 pBlue-Bac4.5 (a, b 및 d 이소형의 경우) 또는 pVL1393 (g의 경우) 플라스미드를, 판매자가 권장한 방법을 사용하여 바큘로골드(BaculoGold) WT 게놈 DNA (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)로 공-형질감염시켰다. 후속적으로, 형질감염으로부터 수득한 재조합 바큘로바이러스를 Sf9 곤충 세포 상에서 플라크-정제하여 재조합 단백질을 발현하는 몇몇 단리물을 수득하였다. 항-HIS 또는 항-이소형 항체 웨스턴에 의해 양성 클론을 선택하였다. PI3K 알파 및 델타 이소형의 경우에는, PI3K의 제1 클론 바이러스 원액에 대해 제2 플라크-정제를 수행하였다. 전체 바큘로바이러스 단리물의 증폭을 낮은 감염 다중도 (moi)로 수행하여 단백질 생산을 위한 고-역가, 저 계대 원액을 생성하였다. 바큘로바이러스를 BV1052 (α) 및 BV1075 (α), BV949 (β), BV1060 (δ) 및 BV950 (γ)으로 지정하였다.

단백질 생산은 2 l 유리 에를렌마이어(Erlenmyer) 플라스크 (110 rpm) 또는 웨이브-생물반응기 (22-25 rpm)에서 단백질-무함유 배지 중에 현탁된 Tn5 (트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)) 또는 TiniPro (익스프레션 시스템즈, 엘엘씨(Expression Systems, LLC), 미국 캘리포니아주 우드랜드) 세포를 2-10의 moi로 39-48시간 동안 감염시키는 것 (계대 3 이하)을 포함하였다. 먼저, 10 l 작업 부피 웨이브-생물반응기의 절반 용적 (5L)을 3e5개 세포/mL의 밀도로 시딩하였다. 반응기를 72시간의 세포 성장 단계 동안 15 rpm으로 요동시키고, 공기와 혼합한 5% 산소로 보충하였다 (분당 0.2 l). 감염 직전에, 웨이브-반응기 배양물을 밀도, 생존율에 대해 분석하고, 대략 1.5e6개 세포/mL로 희석하였다. 100-500 mL의 고 역가, 저 계대 바이러스를 첨가한 후, 2-4시간 추가 배양하였다. 39-48시간의 감염 기간 동안 산소를 35%로 증가시키고, 요동 플랫폼 rpm을 25로 증가시켰다. 감염 동안에, 세포를 생존율, 직경 및 밀도에 대해 바이셀(Vicell) 생존율 분석기 (베크만 쿨터, 인크(Beckman Coulter, Inc), 미국 캘리포니아주 풀러톤) 생물공정에 의해 모니터링하였다. 다양한 파라미터 및 대사물 (pH, O₂ 포화도, 글루코스 등)의 노바(Nova) 생물분석기 (노바 바이오메디칼 코포레이션(NOVA Biomedical Corp.), 미국 매사추세츠주 월섬) 판독값을, 수확할 때까지 매 12-18시간마다 취하였다. 웨이브-생물반응기 세포를 감염 후 40시간 내에 수집하였다. 원심분리 (1500 rpm에서 4℃)에 의해 세포를 수집하고, 후속적으로 용해 및 정제를 위해 펠릿을 풀링하는 동안 얼음 상에 유지하였다. 펠릿 풀을 소량의 저온의 비-보충된 그레이스(Grace) 배지 (프로테아제 억제제 무함유)를 사용하여 제조하였다.

HTS (BV1052)에 대한 PI3K 알파 정제 프로토콜

PI3K 알파를 3개의 크로마토그래피 단계로 정제하였다: Ni 세파로스(Ni Sepharose) 수지 (제너럴 일렉트릭 캄파니(General Electric Company) 소속의 지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 코네티컷주 페어필드) 상의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 슈퍼덱스(Superdex) 200 26/60 칼럼 (지이 헬스케어)을 이용한 겔 여과, 및 최종적인 SP-XL 칼럼 (지이 헬스케어) 상의 양이온 교환 단계. 모든 완충제를 4℃로 냉각시키고, 얼음 상에서 냉각된 상태로 용해를 수행하였다. 칼럼 분획화를 실온에서 급속하게 수행하였다.

전형적으로, 동결된 곤충 세포를 고장성 용해 완충제 중에 용해시키고, 정제용 IMAC 칼럼에 적용하였다. 수지를 3-5 칼럼 부피의 용해 완충제에 이어서 45 mM 이미다졸을 함유하는 3-5 칼럼 부피의 세척 완충제로 세척하고, 이어서 표적 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리시켰다. 분획을 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 정제용 GFC 칼럼에 적용하였다. GFC 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. GFC 칼럼으로부터의 풀을 저염 완충제 중에 희석하고, 정제용 SP-XL 칼럼에 적용하였다. 안정한 A280 기준선 흡광도가 달성될 때까지 칼럼을 저염 완충제로 세척하고, 0 mM NaCl에서 500 mM NaCl로의 20 칼럼 부피 구배를 사용하여 용리시켰다. 다시, SP-XL 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. 최종 풀을 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충제 중에 투석하고, -20℃에서 저장하였다. 최종 풀을 포스포이노시톨 키나제 검정에서 활성에 대해 검정하였다.

HTS (BV949)에 대한 PI3K 베타 정제 프로토콜

PI3K 베타를 2개의 크로마토그래피 단계로 정제하였다: Ni 세파로스 수지 (지이 헬스케어) 상의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 및 슈퍼덱스 200 26/60 칼럼 (지이 헬스케어)을 이용한 겔 여과 (GFC). 모든 완충제를 4℃로 냉각시키고, 얼음 상에서 냉각된 상태로 용해를 수행하였다. 칼럼 분획화를 실온에서 신속하게 수행하였다.

전형적으로, 동결된 곤충 세포를 고장성 용해 완충제 중에 용해시키고, 정제용 IMAC 칼럼에 적용하였다. 수지를 3-5 칼럼 부피의 용해 완충제에 이어서 45 mM 이미다졸을 함유하는 3-5 칼럼 부피의 세척 완충제로 세척하고, 이어서 표적 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리시켰다. 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 정제용 GFC 칼럼에 적용하였다. GFC 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. 최종 풀을 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충제 중에 투석하고, -20℃에서 저장하였다. 최종 풀을 포스포이노시톨 키나제 검정에서 활성에 대해 검정하였다.

HTS (BV950)에 대한 PI3K 감마 정제 프로토콜

PI3K 감마를 2개의 크로마토그래피 단계로 정제하였다: Ni 세파로스 수지 (지이 헬스케어) 상의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 및 슈퍼덱스 200 26/60 칼럼 (지이 헬스케어)을 이용한 겔 여과 (GFC). 모든 완충제를 4℃로 냉각시키고, 얼음 상에서 냉각된 상태로 용해를 수행하였다. 칼럼 분획화를 실온에서 신속하게 수행하였다. 전형적으로, 동결된 곤충 세포를 고장성 용해 완충제 중에 용해시키고, 정제용 IMAC 칼럼에 적용하였다. 수지를 3-5 칼럼 부피의 용해 완충제에 이어서 45 mM 이미다졸을 함유하는 3-5 칼럼 부피의 세척 완충제로 세척하고, 이어서 표적 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리시켰다. 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 정제용 GFC 칼럼에 적용하였다. GFC 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. 최종 풀을 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충제 중에 투석하고, -20℃에서 저장하였다. 최종 풀을 포스포이노시톨 키나제 검정에서 활성에 대해 검정하였다.

HTS (BV1060)에 대한 PI3K 델타 정제 프로토콜

PI3K 델타를 3개의 크로마토그래피 단계로 정제하였다: Ni 세파로스 수지 (지이 헬스케어) 상의 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 슈퍼덱스 200 26/60 칼럼 (지이 헬스케어)을 이용한 겔 여과, 및 최종적인 Q-HP 칼럼 (지이 헬스케어) 상의 음이온 교환 단계. 모든 완충제를 4℃로 냉각시키고, 얼음 상에서 냉각된 상태로 용해를 수행하였다. 칼럼 분획화를 실온에서 신속하게 수행하였다. 전형적으로, 동결된 곤충 세포를 고장성 용해 완충제 중에 용해시키고, 정제용 IMAC 칼럼에 적용하였다. 수지를 3-5 칼럼 부피의 용해 완충제에 이어서 45 mM 이미다졸을 함유하는 3-5 칼럼 부피의 세척 완충제로 세척하고, 이어서 표적 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용리시켰다. 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 정제용 GFC 칼럼에 적용하였다. GFC 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. GFC 칼럼으로부터의 풀을 저염 완충제 중에 희석하고, 정제용 Q-HP 칼럼에 적용하였다. 안정한 A280 기준선 흡광도가 달성될 때까지 칼럼을 저염 완충제로 세척하고, 0 mM NaCl에서 500 mM NaCl로의 20 칼럼 부피 구배를 사용하여 용리시켰다. 다시, Q-HP 칼럼으로부터의 분획을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, 표적 단백질을 함유하는 분획을 풀링하였다. 최종 풀을 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충제 중에 투석하고, -20℃에서 저장하였다. 최종 풀을 포스포이노시톨 키나제 검정에서 활성에 대해 검정하였다.

IC₅₀은 "엑셀 피트(excel fit)"와 함께 4 파라미터 곡선 피팅 루틴에 의해 결정하였다. 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 8가지 농도 (통상적으로, 10, 3.0, 1.0, 0.3, 0.1, 0.030, 0.010 및 0.003 μM)에서의 각 화합물의 억제 백분율의 IC₅₀ 값 (IDBS XLfit)을 계산하였다. 대안적으로는, 4 파라미터 로지스틱 모델인 idbsXLfit 모델 204를 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

대안적으로, ATP 고갈 검정의 경우에는, 시험되는 화합물을 DMSO 중에 용해시키고, 웰당 0.5 μl로 백색 384-웰 플레이트에 직접 분배하였다. 반응을 개시하기 위해, 10 nM PI3 키나제 10 μl 및 5 μg/mL 1-알파-포스파티딜이노시톨 (PI)에 이어서 2 μM ATP 10 μl를 각 웰에 첨가하였다. 대략 50%의 ATP가 고갈될 때까지 반응을 수행하고, 이어서 20 μl의 키나제-글로 용액 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.), 미국 위스콘신주 매디슨)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 정지된 반응물을 5분 동안 인큐베이션하고, 이어서 남아있는 ATP를 발광을 통해 검출하였다. 이어서, IC₅₀ 값을 결정하였다.

본 발명의 한 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 효소적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 500 nM이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 효소적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 100 nM이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 효소적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 0.5nM 내지 10 nM이다.

본 발명의 한 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 세포적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 1000 nM이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 세포적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 500 nM이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 이소형 중 하나 이상에 비해 적어도 10배의 선택성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 이소형 중 하나 이상에 비해 적어도 20배의 선택성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 파라로그 PI3K α 및 β에 비해 적어도 10배의 선택성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 파라로그 PI3K α 및 β에 비해 적어도 20배의 선택성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 세포적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 500 nM이고, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 상기 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 파라로그 PI3K α 및 β에 비해 적어도 10배의 선택성을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 PI3K 억제제는 세포적 PI3K 델타 검정에서 IC₅₀으로 표현되는 활성의 범위가 1 nM 내지 500 nM이고, PI3K 이소형 델타에 대한 억제 작용을 갖는 상기 억제제는 PI3K 이소형 델타에 대해, 다른 파라로그 PI3K α 및 β에 비해 적어도 20배의 선택성을 나타낸다.

2. 세포 검정

2.1 Rat-1 세포에서의 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K)-매개 Akt 1/2 (S473) 인산화

인간 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K) 알파, 베타 또는 델타의 촉매 서브유닛의 미리스토일화 형태를 안정하게 과다발현하는 Rat-1 세포를, 30ul 완전 성장 배지 (10% (v/v) 태아 소 혈청, 1% (v/v) MEM 비 필수 아미노산, 10mM HEPES, 2mM L-글루타민, 10 μg/mL 퓨로마이신 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM 고 글루코스)) 중 7500개 (PI3K 알파), 6200개 (PI3K 베타) 또는 4000개 (PI3K 델타) 세포의 밀도로 384-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃ / 5%CO₂ / 95% 습도에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 화합물을 384-웰 화합물 플레이트에서 희석하여 90% DMSO 중 40종의 시험 화합물에 대한 8-지점 연속 희석물, 뿐만 아니라 4종의 참조 화합물 + 16종의 고 대조군 및 16종의 저 (억제) 대조군을 수득하였다. 허밍웰(Hummingwell) 나노리터 디스펜서를 사용하여 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 내로 화합물 용액 250 nl를 피펫팅하여 분배함으로써 예비희석 플레이트를 제조하였다. 49.75 ul 완전 성장 배지를 첨가함으로써 화합물을 예비희석하였다. 예비희석된 화합물 용액 10ul를 384-웰 피펫터를 사용하여 세포 플레이트로 옮김으로써, 0.11%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 세포를 37℃ / 5%CO₂ / 95% 습도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 알파스크린(AlphaScreen)® 슈어파이어(SureFire)® 검출용 용해 완충제 20ul 중에 용해시켰다.

p-AKT(Ser473)의 검출을 위해, 슈어파이어® p-Akt 1/2 (Ser473) 검정 키트 (퍼킨엘머, 미국)를 사용하였다. 세포 용해물 5ul를 384-웰 피펫터를 사용하여 검출을 위한 384-웰 저 부피 프록시플레이트(Proxiplate)로 옮겼다. 알파스크린® 슈어파이어® 시약의 첨가를 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 첫째로, 알파스크린® 수용자 비드를 함유하는 반응 완충제 + 활성화 완충제 믹스 5ul를 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 둘째로, 알파스크린® 공여자 비드를 함유하는 희석 완충제 2ul를 첨가하고, 플레이트를 추가로 2시간 동안 상기와 같이 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 표준 알파스크린® 설정을 사용하여, 알파스크린® 호환 플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다.

2.2 뮤린 B 세포 활성화의 결정

PI3Kδ는 세포가 B 세포 수용체 (BCR)를 통해 자극될 때 B 세포 기능을 조절하는 것으로 인식되어 있다 (Okkenhaug et al. Science 297:1031 (2002)). B 세포 활성화에 대한 화합물의 억제 특성을 평가하기 위해, 마우스 비장 항체로부터 유도된 뮤린 B 세포 상의 활성화 마커 CD86 및 CD69의 상향조절을 항-IgM으로의 자극 후에 측정하였다. CD69는 B 및 T 세포에 대한 널리 공지된 활성화 마커이다 (Sancho et al. Trends Immunol. 26:136 (2005)). CD86 (B7-2로도 공지되어 있음)은 B 세포를 비롯한 항원-제시 세포 상에서 주로 발현된다. 휴지기의 B 세포는 CD86을 낮은 수준으로 발현하지만, 예를 들어 BCR 또는 IL-4 수용체의 자극 후에는 이를 상향조절한다. B 세포 상의 CD86은 T 세포 상의 CD28과 상호작용한다. 이 상호작용은 최적 T 세포 활성화 및 최적 IgG1 반응의 생성을 위해 필요하다 (Carreno et al. Annu Rev Immunol. 20:29 (2002)).

Balb/c 마우스로부터 비장을 수집하고, 비장세포를 단리하여 10% 태아 소 혈청 (FBS), 10 mM HEPES, 100 유닛/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI로 2회 세척하였다. 상기 방식으로 보충된 RPMI는 이하에서 배지로 지칭된다. 세포를 배지 중에서 2.5 X 10⁶개 세포/mL로 조정하고, 200 μl 세포 현탁액 (5 x10⁶개 세포)을 96 웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다.

이어서, 배지 중 항-IgM mAb 50 μl (최종 농도: 30 μg/mL)를 첨가함으로써 세포를 자극하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 하기 항체 칵테일로 염색하였다: B 세포의 평가를 위한 항-마우스 CD86-FITC, 항-마우스 CD69-PerCP-Cy5.5, 항-마우스 CD19-PerCP, 및 T 세포의 평가를 위한 항-마우스 CD3-FITC, 항-마우스 CD69-PE (각 항체 2 μl/웰). 암실에서 실온 (rt) 하에 1시간 후, 세포를 96 딥웰(Deepwell) 플레이트로 옮겼다. 세포를 2% FBS를 함유하는 1 mL PBS로 1회 세척하고, 200 μl 중에 재현탁시킨 후, 샘플을 FACS 칼리버(Calibur) 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 림프구를 크기 및 입도에 따라 FSC/SSC 도트 플롯에서 게이팅하고, CD19, CD3 및 활성화 마커 (CD86, CD69)의 발현에 대해 추가로 분석하였다. BD 셀퀘스트(BD CellQest) 소프트웨어를 사용하여, 도트 블롯으로부터 CD19+ 또는 CD3+ 집단 내에서 활성화 마커에 대해 양성적으로 염색된 세포의 백분율로서 데이터를 계산하였다.

화합물의 억제 특성을 평가하기 위해, 화합물을 먼저 DMSO 중에 용해시키고 희석한 다음, 배지 중에 1:50으로 희석하였다. Balb/c 마우스로부터 비장세포를 단리하고, 재현탁시키고, 상기 기재된 바와 같은 96 웰 플레이트로 옮겼다 (200 μl/웰). 희석된 화합물 또는 용매를 플레이트에 첨가하고 (25 μl), 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 배양물을 25 μl 항-IgM mAb/웰 (최종 농도 30 μg/mL)로 37℃에서 24시간 동안 자극하고, 항-마우스 CD86-FITC 및 항-마우스 CD19-PerCP로 염색하였다 (각 항체 2 μl/웰). CD19 양성 B 세포 상의 CD86 발현을 상기 기재된 바와 같은 유동 세포측정법에 의해 정량화하였다.

2.3 래트 B 세포 활성화의 결정

PI3Kδ는 세포가 B 세포 수용체 (BCR)를 통해 자극될 때 B 세포 기능을 조절하는 것으로 인식되어 있다 (Okkenhaug et al. Science 297:1031 (2002)). B 세포 활성화에 대한 화합물의 억제 특성을 평가하기 위해, 전혈로부터 유도된 래트 B 세포 상의 활성화 마커 CD86의 상향조절을 항-IgM 및 재조합 IL-4로의 자극 후에 측정하였다. CD86 분자 (B7-2로도 공지되어 있음)는 B 세포를 비롯한 항원-제시 세포 상에서 주로 발현된다. 휴지기의 B 세포는 CD86을 낮은 수준으로 발현하지만, 예를 들어 BCR 또는 IL-4 수용체의 자극 후에는 이를 상향조절한다. B 세포 상의 CD86은 T 세포 상의 CD28과 상호작용한다. 이 상호작용은 최적 T 세포 활성화 및 최적 IgG1 반응의 생성을 위해 필요하다 (Carreno et al. Annu Rev Immunol. 20:29 (2002)).

래트 혈액의 수집

헤파린나트륨으로 예비코팅된 피하 바늘을 갖는 10 ml 시린지를 사용하여 비만 성체 수컷 루이스(Lewis) 래트 (LEW/HanHsd) 복부 대동맥으로부터 전혈을 수집하였다. 혈액을 50 ml 팔콘(Falcon) 튜브 내로 옮기고, 항응고제 농도를 100 U/ml로 조정하였다.

래트 B 세포의 자극 및 특이적 억제제로의 처리

면역억제 약물의 시험관내 효과의 평가를 위해, 헤파린첨가 혈액을 배지를 사용하여 50%로 예비희석하였다. 배지로서, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 50 mg/ml 덱스트란 40 및 5% 소 태아 혈청 (FCS, 페타클론(Fetaclone) I, 깁코(Gibco) #10270-106)으로 보충된 DMEM 고 글루코스 (아니메드(Animed) 카탈로그# 1-26F01-I)를 제공하였다. 이어서, 190 μl 예비희석된 혈액을 96 웰 U-바닥 마이크로타이터 플레이트 (눈크(Nunc))에서 예비희석된 시험 화합물 10 μl로 스파이킹하여 20 내지 0.0003 μM의 농도 범위를 갖는 3배 연속 희석물을 생성시켰다. 대조군 웰은 DMSO로 예비처리하여 0.5% DMSO의 최종 농도를 얻었다. 배양물을 2벌로 세팅하고, 플레이트 진탕기 (하이돌프 티트라맥스(Heidolph Titramax) 101; 30초, 속도 900) 상에서 교반에 의해 잘 혼합하고, 상하로 피펫팅하고, 다시 플레이트 진탕기 상에서 교반하였다. 배양물을 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 폴리클로날 염소 항-래트 IgM Ab (세로텍(Serotec), 카탈로그# 302001) 20 μl 및 희석된 재조합 rIL-4 (이뮤노툴즈(Immunotools) # 340085) 10 μl를 첨가하여 각각 30 μg/ml 및 5 ng/ml의 최종 농도를 얻었다. 플레이트를 상기와 같이 플레이트 진탕기 상에서 교반에 의해 혼합하고, 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

유동 세포측정법에 의한 B 세포 활성화의 결정

인큐베이션 후에, 웰당 25 mM EDTA 용액 15 μl를 첨가하고, 15분 동안 진탕하여 부착 세포를 분리하였다. 표면 활성화 마커의 분석을 위해, 샘플을 이어서 PE-Cy5-표지된 항-래트CD45RA (BD 카탈로그# 557015)로 염색하여 FACS 분석에서 B 세포 상에 게이팅되도록 하였다. 추가로, 샘플을 PE-표지된 항-래트 CD86 (BD 카탈로그# 551396)으로 염색하였다. 모든 염색 절차는 암실에서 30분 동안 실온에서 수행하였다. 인큐베이션 후에, 샘플을 BD 용해 용액 (BD # 349202) 2 ml/웰을 함유하는 96-딥 웰 V-바닥 마이크로타이터 플레이트 (코닝 # 396096)로 옮겼다. 적혈구의 용해 후에, 샘플을 셀워시(CellWASH) (BD # 349524) 2 ml로 세척하였다. 셀퀘스트 플러스(Cellquest Plus) 또는 디바(DIVA) (버전 6.1.1) 소프트웨어를 각각 사용하여 LSRII 또는 FACS칼리버 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 데이터를 획득하였다. 림프구를 크기 및 입도에 따라 FSC/SSC 도트 블롯에서 게이팅하고, CD45RA 및 활성화 마커의 발현에 대해 추가로 분석하였다. 도트 블롯 또는 히스토그램으로부터 CD45RA+ 집단 내에서 활성화 마커에 대해 양성적으로 염색된 세포의 백분율로서 데이터를 계산하였다.

통계적 평가

약물에 대한 노출 후 B 세포 활성화의 억제 백분율을 하기 공식에 의해 계산하였다:

오리진(ORIGIN) 7 소프트웨어 (오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation), 마이애미주 노샘프턴)를 비-선형 회귀 곡선 피팅에 대해 사용하였다. 힐(Hill) 방정식을 억제 데이터에 피팅하여 50% 억제를 생성하는 약물 농도 (IC₅₀)를 얻었다.

2.4 마우스 비장세포에서의 TLR9-유도된 IL-6의 결정

마우스 비장으로부터의 단세포 현탁액의 제조

비장을 안락사 직후에 C57BL/6 마우스로부터 절제하였다. 과도한 지방을 비장으로부터 다듬은 후에, 5 ml 시린지로부터의 플런저를 사용하여 0.4 μM 세포 여과기를 통해 비장을 으깼다. 단세포 현탁액을 제조하고, 저온의 PBS를 사용하여 50 ml 팔콘 튜브에서 부피를 15 ml로 조정하였다. 세포를 1500 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후에, 상청액을 제거하고, 비장당 적혈구 용해 완충제 5 ml 중에 재현탁시키고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 빙냉 PBS (30 ml)를 세포에 첨가한 후에, 1500 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 뮤린 비장세포 배양 배지 (MSCM) 40 ml로 2회 세척하였다. MSCM은 100 유닛/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신, 1 x 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 0.05 mM β-메르캅토에탄올 및 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충된 RPMI로 이루어졌다. 세포를 MSCM 10-20 ml 중에 재현탁시키고, 카운테스(Countess) 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 대략 60x10⁶개 비장세포를 단일 C57BL/6 마우스 비장으로부터 수득하였다.

뮤린 비장세포의 자극 및 특이적 억제제로의 처리

비장세포를 96 웰 편평 바닥 플레이트에 100 μl 부피 중 2x10⁵개 세포/웰의 최종 밀도로 플레이팅하고, 37℃ 가습 인큐베이터 내에서 2-4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 이전에 제조한 화합물 원액 플레이트를 사용하여 시험되는 화합물을 자동화 액체 취급 기계를 사용하여 분배하였다. 원액 플레이트는 2 또는 3배 희석물을 사용하여 8-10 지점에 배열된 화합물 (90%/10% DMSO/ddH₂O 중)로 이루어졌다. 액체 취급 기계로 이전에 제조한 화합물 공급원 플레이트로부터의 각 희석물 1 μl를 96-웰 플레이트 내의 적절한 목적 웰에 분배하였다. 세포 배양물 중 화합물의 최종 출발 농도는 10 μM이었다. 세포 배양물 중 DMSO의 최종 농도는 0.5%였다. 세포를 1시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 후, TLR 리간드를 첨가하였다. 이어서, 10x EC₈₀ 농도의 CpG1826을 (200 μl의 최종 배양물 부피를 위해) 20 μl 부피로 첨가하고, 그 후 배양물을 37℃ 가습 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션하였다.

ELISA에 의한 인터류킨-6의 결정

밤새 배양한 후에, 플레이트를 2000 rpm으로 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 후속적으로, 각 배양물 150 μl를 96-웰 V-바닥 플레이트에 옮기고, 상업적으로 입수가능한 마우스 IL-6 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 IL-6 수준을 측정하였다. 간략하게, 플레이트를 포획 항체로 밤새 코팅한 후, PBS/0.1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 샘플 및 표준물을 50 μl 부피로 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표준물/샘플의 제거 후에, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈(Tween)을 사용하여 세척한 후, 비오티닐화 검출 항체 50 μl를 첨가하고, 그 후 플레이트를 2시간 동안 실온에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척한 후, 웰당 50 μl 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제를 20분 동안 첨가하였다. 추가의 플레이트 세척 후에, 50 μl TMB 기질을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 20분 동안 인큐베이션한 후, 25 μl/웰 정지 용액을 첨가하였다. IL-6 수준을 스펙트라맥스(SpectraMax) 190 플레이트 판독기 (450 nm)를 사용하여 측정하고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

2.5 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 TLR9-유도된 IFN알파의 결정

신선 인간 혈액으로부터의 PBMC의 제조

인간 혈액 (약 75 ml)을 헤파린을 함유하는 10개의 S-모노벳(S-Monovette) 튜브 (S-모노벳 7.5 mL NH 헤파린 16 IU/mL 혈액; 슈타르슈테트(Starstedt))에 수집하였다. 류코셉(Leucosep)™ 튜브 (30 mL #227290; 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-one))를 튜브당 15 ml 림프구 분리 배지 LSM1077™ (#J15-004; PAA 래보러토리즈(PAA Laboratories))의 첨가 및 30초 동안 1000g로의 원심분리에 의해 제조하였다. 일부 25 ml 혈액을 류코셉™ 튜브로 옮긴 후, 동등한 부의 PBS (Ca2+/Mg2+ 무함유; #14190-094)로 희석하였다. 샘플을 에펜도르프(Eppendorf) 5810R 원심분리기를 사용하여 브레이크 없이 800g로 20분 동안 22℃에서 원심분리하였다. PBMC 층을 조심스럽게 혈장:분리 배지 계면으로부터 제거하고, 깨끗한 50 ml 튜브 내로 옮겼다. 세포를 PBS의 첨가 (45 ml 이하)에 의해 1회 세척하고, 에펜도르프 5810R을 사용하여 브레이크 (속도 9로 설정)를 포함하여 원심분리하였다 (1400rpm, 22℃에서 10분). 펠릿화된 세포를 조심스럽게 배지 (RPMI 1640+글루타맥스-I (GlutaMAX-I), 0.05 mM 2-메르캅토에탄올, 10 mM HEPES 및 5% v/v FCS) 중에 재현탁시키고, 샘플을 풀링하였다. 배지 성분 2-메르캅토에탄올 (#31350-010; 50 mM), Hepes (#15630-056, 1M) 및 RPMI 1640 (1x) + 글루타맥스-I (#61870-010)는 깁코로부터 입수하였다. FCS (#2-01F36-1)는 아미메드(Amimed)로부터 입수하였다. PBMC를 카운테스® 자동화 세포 계수기를 사용하여 계수하였다 (샘플을 배지 중에 1:10으로 예비희석한 후, 트리판 블루(Trypan Blue) 동등 부피 (10 μl)를 첨가하였음). 세포를 4 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 384-웰 플레이트 (#353962; 벡톤 디킨슨 아게(Becton Dickinson AG))에 시딩하여 최종부피 25 μl (즉, 1 x 10⁵개 세포/웰)를 제공하였다.

PBMC의 자극 및 특이적 억제제로의 처리

화합물을 100% v/v DMSO (#41640-100 mL; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 중에 예비희석하고, 이어서 배지로 옮겼다 (0.25%의 최종 DMSO 농도가 달성됨). 세포를 적절한 화합물 희석물 (5 μl) 또는 비히클 대조군 (5 μl)으로 처리하고, 가습 인큐베이터 내의 5% (v/v) CO₂를 포함하는 공기 중에서 37℃로 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 CpG2216 (0.3 μM; #tlrl-hodna; 인비보젠(Invivogen)) 또는 비히클 대조군 (10 μl/웰)으로 자극하고, 20시간 동안 인큐베이션하였다. IFNα 수준의 정량화를 위해 플레이트를 간략하게 원심분리하고 (2분 동안 22℃에서 200 x g), 상청액 샘플 (30 μl)을 제거하였다.

알파리사(AlphaLisa) 기술을 사용한 IFNα의 정량화

IFN알파의 정량화를 위해, 퍼킨엘머로부터의 인간 인터페론 알파리사 키트 (#AL264F)를 사용하였다. 항-IFNα 수용자 비드 (최종 5 μg/ml) 및 비오티닐화 항체 항-IFNα (최종 0.5 nM)를 함유하는 항체 믹스를 새로이 제조하고, 384-웰 옵티플레이츠(Optiplates)™ (#6007299; 퍼킨엘머) 내로 분배하였다 (5 μl). 공지된 IFNα 표준물 (인간 IFNα B (2b))의 희석물을 제조하고, 세포 상청액 (5 μl)과 함께 상기 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 간략하게 원심분리하고 (200g에서 펄스), 접착성 밀봉 필름으로 덮고, 와동시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드 (최종 20 μg/ml)를 제조하고, 어두운 조명의 구역에서 (광 민감성 믹스) 각 웰 (5 μl)에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 인큐베이션하였다 (플레이트는 원심분리되거나 또는 덮이지 않아야 함). 인큐베이션 후에, 알파 옵션이 구비된 엔비전(EnVision)™ 다중플레이트 판독기를 기기 자체의 "알파스크린 표준 설정" (예를 들어 총 측정 시간: 550 ms, 레이저 680 nm 여기 시간: 180 ms, 거울: D640 as, 방출 필터: M570w, 중심 파장 570 nm, 대역폭 100 nm, 투과율 75%)으로 사용하여 플레이트를 판독하였다. IFNα 수준의 분석 및 정량화를 위해 데이터를 수집하였다.

데이터 평가 및 분석

XLfit 애드-인 (IDBS; 버전 4.3.2)을 포함하는 엑셀 XL fit 4.0 (마이크로소프트(Microsoft))을 사용하여 데이터를 분석하였다. 인간 IFNα B (2b)를 사용한 표준 곡선에 대한 외삽에 따라 특정한 IFNα 농도를 결정하였다. 실험 데이터에 대한 곡선의 피팅 후 비선형 회귀에 의해 화합물의 개별 IC₅₀ 값을 결정하였다.

3 양 적혈구 (SRBC)에 대한 항체 생산의 결정.

간략하게, OFA 래트에 제0일에 양 적혈구를 정맥내 주사하고, 조사 하의 화합물로 연속 4일 동안 (제0일 내지 제3일) 경구로 처리하였다. 비장 세포 현탁액을 제4일에 제조하고, 림프구를 지표 세포 (SRBC) 및 보체의 존재 하에 연질 한천 상에 플레이팅하였다. SRBC-특이적 항체 (대부분 IgM 하위부류)의 분비 및 보체의 존재로 인한 지표 세포의 용해는 플라크를 생성하였다. 플레이트당 플라크의 개수를 계수하고, 비장당 플라크의 개수로서 표현하였다.

면역화: 5마리의 암컷 OFA 래트의 군을 제0일에 정맥내 주사에 의해 래트당 0.5 ml의 부피로 2x10⁸개/ml SRBC (래보러토리 애니멀 서비시즈 LAS(Laboratory Animal Services LAS), 노파르티스 파르마 아게로부터 입수함)로 면역화시켰다.

화합물 처리: 동물을 면역화 당일에 시작하여 연속 4일 동안 (제0, 1, 2 및 3일) 0.5% CMC, 0.5%트윈80 중에 현탁시킨 화합물로 처리하였다. 화합물을 5 ml/kg 체중의 적용 부피로 투여 사이에 12시간 간격을 두고 매일 2회 경구 투여하였다.

비장 세포 현탁액의 제조:

제4일에, 동물을 CO₂로 안락사시켰다. 비장을 제거하고, 칭량하고, 각각의 래트 비장에 대해 저온의 (4℃) 행크 평형 염 용액 (HBSS; 깁코, pH 7.3, 1 mg 페놀레드(Phenolred)/100 ml 함유) 10 ml를 함유하는 플라스틱 튜브에 넣었다. 비장을 유리 포터로 균질화시키고, 5분 동안 얼음 상에 정치시키고, 1 ml 상청액을 새로운 튜브 내로 옮겼다. 세포를 4 ml HBSS로 1회 세척한 다음, 상청액을 버리고, 펠릿을 HBSS 1 ml 중에 재현탁시켰다. 비장당 림프구 개수를 자동화 세포 계수기에 의해 결정하고, 비장 세포 현탁액을 30x10⁶개/ml의 세포 농도로 조정하였다.

플라크 형성 검정:

연질 한천 페트리 디쉬를 HBSS 중 0.7% 아가로스 (SERVA)를 사용하여 제조하였다.

추가로, 0.7% 아가로스 1 ml를 플라스틱 튜브에서 제조하고, 수조에서 48℃로 유지시켰다. 30x10⁶개/ml 비장 세포 현탁액 중의 일부 50 μl 및 40 x 10⁸개/ml의 SRBC 50 μl을 첨가하고, 급속하게 혼합하고 (볼텍스(Vortex)), 제조된 아가로스 디쉬 상에 부었다. 페트리 디쉬를 약간 기울여, 아가로스 층 상에서 세포 혼합물의 균일한 분포를 달성하였다. 디쉬를 실온에서 15분 동안 정치시킨 다음, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1.4 ml 기니 피그 보체 (하를란(Harlan); 10%)를 첨가하고, 추가로 60분 동안 37℃에서 인큐베이션을 계속하였다. SRBC-특이적 항체가 항원 (SRBC)에 결합된 플레이팅된 B 세포에 의해 그의 부근에 방출되었다. 이들 항원-항체 복합체는 보체를 활성화시켜, 적색 적혈구 층 내에 밝은 반점 (플라크)을 남기는 SRBC의 용해를 유발하였다. 플라크를 현미경으로 계수하였다.

플라크 형성의 억제의 결정을 위해 하기 공식을 사용하였다: %억제 = C*100/V-100

상기 공식에서, V= 비히클 군에 대한 평균 플라크 개수/비장; C= 화합물 처리군에 대한 평균 플라크 개수/비장

참고문헌:

N.K. Jerne & A.A. Nordin (1963) Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 140:405.

N.K. Jerne, A.A. Nordin & C. Henry (1963) The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells. In: "Cell Bound Antibodies", B. Amos & H. Koprowski, Eds., Wistar Inst. Press, Philadelphia pp.109-125.

생물학적 데이터

효소적 검정

세포적 검정

SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Solid Form of Dihydro-Pyrido-Oxazine Derivative <130> PAT055990A <160> 21 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 1 cgagaatatg atagattata tgaagaat 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 tggtttaatg ctgttcatac gtttgtcaat 30 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctac gaaggagata tacatatgcg agaatatgat 60 agattatatg aagaat 76 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 taccataatt ccaccaccac caccggaaat tccccctggt ttaatgctgt tcatacgttt 60 gtcaat 66 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ctagtggaat gtttactacc aaatgg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 gttcaatgca tgctgtttaa ttgtgt 26 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 gggggaattt ccggtggtgg tggtggaatt atggtactag tggaatgttt actaccaaat 60 gga 63 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 agctccgtga tggtgatggt gatgtgctcc gttcaatgca tgctgtttaa ttgtgt 56 <210> 9 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 gggaccactt tgtacaagaa agctgggttt aagctccgtg atggtgatgg tgatgtgctc 60 c 61 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 gctagcatgc gagaatatga tagattatat gaagaatata cc 42 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 gcctccacca cctccgcctg gtttaatgct gttcatacgt ttgtc 45 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 tactagtccg cctccaccac ctccgcctcc accacctccg cc 42 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 actgaagcat cctcctcctc ctcctcctgg tttaatgctg ttcatacgtt tgtc 54 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 agctccgtga tggtgatggt gatgtgctcc agatctgtag tctttccgaa ctgtgtg 57 <210> 15 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 gggaccactt tgtacaagaa agctgggttt aagctccgtg atggtgatgg tgatgtgctc 60 c 61 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 tcctcctcct cctcctcctg gtttaatgct gttcatacgt ttgtc 45 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 atgccccctg gggtggactg ccccat 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 ctactgcctg ttgtctttgg acacgt 26 <210> 19 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 19 attaaaccag gaggaggagg aggaggaccc cctggggtgg actgccccat gga 53 <210> 20 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 20 agctccgtga tggtgatggt gatgtgctcc ctgcctgttg tctttggaca cgttgt 56 <210> 21 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 21 gggaccactt tgtacaagaa agctgggttt aagctccgtg atggtgatgg tgatgtgctc 60 c 61

Claims

도 2-세타 +/- 0.2 도에서 주어진 하기 피크: 9.1, 10.2, 11.9, 13.0, 17.1, 17.7, 18.7, 20.3, 20.8, 26.0, 26.7, 23.2, 24.1, 24.8, 29.3, 27.4, 및 21.4를 포함하는 X선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, (1,1-디옥소-헥사히드로-1람다*6*-티오피란-4-일)-{(S)-3-[1-(6-메톡시-5-메틸-피리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-피리도[3,4-b][1,4]옥사진-7-일옥시]-피롤리딘-1-일}-메타논의 무수 결정질 형태.
제1항에 있어서, 하기에 제시된 X선 분말 회절 스펙트럼을 갖는 무수 결정질 형태.
제1항에 있어서, 하기에 제시된 시차 주사 열량측정 그래프를 갖는 무수 결정질 형태.
치료 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 형태 및 하나 이상의 치료 활성제를 포함하는, 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 이식 거부, 류마티스 관절염(RA), 심상성 천포창(PV), 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 쇼그렌 증후군(SS), 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 항-호중구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 만성 자가면역 두드러기(CAU), 알레르기, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 굿패스쳐 증후군, 항체-매개 이식 거부(AMR), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 조혈 기원의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 림프종, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 발덴스트룀병, 후천성 A형 혈우병(AHA), 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증, 및 신경낭미충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 조합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 형태를 포함하는, PI3K 효소의 활성에 의해 또는 PI3Kδ 이소형의 활성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 제약 조성물로서, 상기 질환 또는 장애가 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 이식 거부, 류마티스 관절염(RA), 심상성 천포창(PV), 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 쇼그렌 증후군(SS), 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 항-호중구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 만성 자가면역 두드러기(CAU), 알레르기, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 굿패스쳐 증후군, 항체-매개 이식 거부(AMR), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 조혈 기원의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 림프종, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 발덴스트룀병, 후천성 A형 혈우병(AHA), 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증, 및 신경낭미충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
치료 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 형태 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 이식 거부, 류마티스 관절염(RA), 심상성 천포창(PV), 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 쇼그렌 증후군(SS), 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 항-호중구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 만성 자가면역 두드러기(CAU), 알레르기, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 굿패스쳐 증후군, 항체-매개 이식 거부(AMR), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 조혈 기원의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 림프종, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 발덴스트룀병, 후천성 A형 혈우병(AHA), 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증, 및 신경낭미충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 제약 조성물.
치료 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 형태를 포함하는, 대상체에서 PI3K 효소의 활성 또는 PI3Kδ 이소형의 활성을 조절하기 위한 제약 조성물로서, 이러한 조절이 자가면역 장애, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 기도 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 이식 거부, 류마티스 관절염(RA), 심상성 천포창(PV), 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증(MG), 쇼그렌 증후군(SS), 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 항-호중구 세포질 항체(ANCA)-연관 혈관염, 한랭글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 만성 자가면역 두드러기(CAU), 알레르기, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 굿패스쳐 증후군, 항체-매개 이식 거부(AMR), B 세포-매개 초급성, 급성 및 만성 이식 거부, 조혈 기원의 암, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 림프종, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 발덴스트룀병, 후천성 A형 혈우병(AHA), 중증 뇌 말라리아, 트리파노소마증, 리슈마니아증, 톡소플라스마증, 및 신경낭미충증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하는 것인 제약 조성물.
제4항에 있어서, 질환 또는 장애가 쇼그렌 증후군인 조합물.
제5항에 있어서, 질환 또는 장애가 쇼그렌 증후군인 제약 조성물.
제6항에 있어서, 질환 또는 장애가 쇼그렌 증후군인 제약 조성물.
제7항에 있어서, 질환 또는 장애가 쇼그렌 증후군인 제약 조성물.