CN104857337A - 一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂及其制备方法，涉及一种中药微生物制剂；其制备方法为，对米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母进行活化和扩大培养；取黄芪，党参，白术，熟地，当归，白芍，羊红膻，杜仲，淫羊藿，菟丝子，女贞子，枸杞子，陈皮，谷芽等，粉碎，得到中药粉；取豆粕粉，玉米芯颗粒，麸皮等制备固体发酵培养基；然后将固体发酵培养基装入发酵罐中，分别接入米曲霉种子液，产朊假丝酵母种子液，枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液，进行好氧发酵，发酵36h-48h后，进行厌氧发酵，得到草亲鱼用发酵中药微生物制剂。所得微生物制剂，可用于一年多次产卵的草亲鱼产前强化培育、产后迅速恢复体质、提高亲鱼抗病力和产卵量。

Description

一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂及其制备方法

技术领域

    本发明涉及一种中药微生物制剂，具体的说是一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂及其制备方法。

背景技术

草鱼是我国的主要淡水养殖经济鱼类，是我国“四大家鱼”之一，肉质鲜美，生长快，饵料要求低，深受消费者喜爱。草鱼性成熟年龄在4-7龄，性成熟期长，优质的草亲鱼是苗种生产单位的宝贵资源，草亲鱼在产卵过程中，机械损伤和亲鱼繁殖过程中体力的过分消耗引起的生理性的体质虚弱，是造成草亲鱼产后抗病力降低、死亡率高的主要原因。我国大部分鱼苗繁殖场采用草鱼一年一次的繁殖方式，产卵量较低，草鱼为一年多次产卵类型，可以在一年中进行两次甚至三次产卵，利用一年多次催产技术，可以使草鱼的产卵量提高2-3倍，经济效益非常明显。但是，草亲鱼一年多次产卵，二次或三次催产时，正值高温季节，草亲鱼第一次产卵后，营养物质消耗殆尽，不仅需要和正常的一次产卵亲鱼一样恢复体质，而且需要经历营养积累和性腺再次成熟的过程，且均需在较短的时间内来完成，若营养补充不能满足需要或草亲鱼带病催产，再次催产后亲鱼产后由于体质虚弱，伤病等原因造成的死亡率更高，以及由此间接造成的产卵量、受精率及孵化率降低等问题，随着催产次数的增多也更加明显，这些都给草亲鱼产前强化培育和产后恢复技术提出了更高的要求。

目前主要采用产后注射抗生素，入塘后施用漂白粉或投喂药饵等化学杀菌剂来预防和治疗产后草亲鱼死亡问题，具有一定的疗效，但耐药性随着亲鱼使用年限的增长日益突出，并且由此间接造成的受精卵质量低劣、鱼苗畸形等问题也不容忽视。采用草亲鱼产后注射葡萄糖，入塘后增加嫩草投喂量和补充豆饼、麦芽等精料的方法，对于草亲鱼产后体质恢复，具有一定的作用，但恢复期长至20天以上，对于需达到二次催产要求的，恢复和强化培育期往往长至50-70天以上，影响、缩短了二次孵化鱼苗的生长期，鱼苗越冬的规格偏小，直接影响成活率和经济效益，在我国北方草鱼生长期相对较短，使草鱼多次产卵技术由于二次催产日期过晚，变得实际不具有经济价值。

芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等微生物对于改善水质，提高饲料报酬、促进鱼类生长、增强鱼类抗病力方面具有显著的效果，但也存在益生菌数量不稳定、活性低、肠道定植力弱等缺点。我国传统中草药在预防和治疗鱼类疾病，促进动物性腺发育，产后恢复等方面有广泛应用，具有安全、毒副作用小，绿色天然，无药物残留等优点，但也存在用药量大，发苦口感差，使用麻烦、提取成本高等缺点。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂及其制备方法，所制得的发酵中药微生物制剂活菌总数≥10⁸个/g，水分≤10%在饲料中用量为饲料质量的0.5-1%。该微生物制剂适用于草亲鱼，是一年多次产卵的草亲鱼产前强化培育、产后迅速恢复体质、提高亲鱼抗病力和产卵量的发酵中药微生物制剂。

一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、微生物的活化和培养：分别将米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母进行活化培养和扩大培养后，得到米曲霉种子液、枯草芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液和产朊假丝酵母种子液，备用；微生物的活化和培养方法分别为：

（1）、所述米曲霉的活化培养和扩大培养方法为：

a、活化培养：将米曲霉接入试管固体斜面察氏培养基中，在30℃下培养4-6天，待斜面长满黄绿色孢子为止，得到活化培养后米曲霉；

所述察氏培养基，每升培养基中包括硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g和琼脂20g，余量为水；

b、扩大培养：将米曲霉三角瓶种子扩大培养基混合均匀，粉碎，过4mm筛，加入蒸馏水，使培养基含水量的质量百分比为80-90%，然后取20g含水量的质量百分比为80-90%的米曲霉三角瓶种子扩大培养基装入250mL三角瓶中，灭菌后接入2-3环活化培养后米曲霉，置于30-32℃培养4-5天，制得孢子数在40-80亿/g的米曲霉干曲，倒入经事先灭菌过地装有1%葡萄糖溶液的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，即为米曲霉种子液；

所述米曲霉三角瓶种子扩大培养基中各成分的质量百分比为：麸皮80%，面粉10%，豆饼10%。

    （2）、所述枯草芽孢杆菌的活化培养和扩大培养方法为：

a、活化培养：将保存的枯草芽孢杆菌菌种取出，放入37℃培养箱中4-6小时，接入装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后摇床转速200rpm，37℃培养24小时，得到活化培养后枯草芽孢杆菌；

所述牛肉膏蛋白胨培养基，每升培养基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，余量为水，pH值7.2-7.5；

b、扩大培养：取活化培养后枯草芽孢杆菌，按照活化培养后枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌扩大培养基的质量比为1:100的比例，接入装有50mL枯草芽孢杆菌扩大培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200rpm，37℃培养24小时，所得培养物中枯草芽孢杆菌数为10⁹个/mL；添加枯草芽孢杆菌扩大培养基调整活菌数使枯草芽孢杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即得到枯草芽孢杆菌种子液；

所述枯草芽孢杆菌扩大培养基，每升培养基中含有玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，碳酸钙5g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，水合硫酸锰0.2g，余量为水， pH值7.0-7.5。

（3）、所述植物乳杆菌的活化和扩大培养方法为：

a、活化培养：将保存的植物乳杆菌取出，放入37℃培养箱中4-6小时后，接入MRS培养基中， 接种量为1-3接种环，置于5℃静止培养18-24小时；

所述MRS培养基，每升培养基中含有蛋白陈10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵  2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，余量为水；

b、扩大培养：将活化培养的植物乳杆菌，按照活化培养的植物乳杆菌和植物乳杆菌扩大培养基的质量比为1:50的比例，接种于植物乳杆菌扩大培养基中，34-37℃静止培养24h，添加植物乳杆菌扩大培养基调整活菌数使植物乳杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即为植物乳杆菌种子液；

所述植物乳杆菌扩大培养基中各成分的质量百分比为，豆芽汁5%，番茄汁10%，马铃薯5%，蔗糖2%，食盐4%，水74%。

（4）、所述产朊假丝酵母的活化和扩大培养方法为：

a、活化培养：将产朊假丝酵母取出放入30℃培养箱中4-6小时，接入事先灭菌的装有50mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后置于30℃，摇床转速160 rpm /min，培养18-24小时，得到活化后产朊假丝酵母菌液；

所述YPD液体培养基，每升培养基中含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，余量为水；

b、扩大培养：将活化培养的产朊假丝酵母菌液接种到事先灭菌的装有50mL 产朊假丝酵母扩大液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为产朊假丝酵母扩大液体培养基体积的2%；然后置于摇床转速160 rpm /min,温度30℃条件下培养18-24h后，添加产朊假丝酵母扩大液体培养基，调整浓度使产朊假丝酵母菌数3-8×10⁸个/mL，得到产朊假丝酵母种子液；

所述产朊假丝酵母扩大液体培养基：每升培养基中包括葡萄糖100g，硫酸铵20g，尿素10g，酵母膏2g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.2g，余量为水，调整PH值至5.5；

所述米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母的活化培养和扩大培养方法也可以为，将米曲霉菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉或产朊假丝酵母菌粉，倒入装有质量分数为1%葡萄糖水溶液和8-10粒玻璃珠的三角瓶中，在摇床上震荡，充分打散菌粉，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌数3-8×10⁸个/mL，即为米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌种子液。

步骤二、按照重量份数取中药，黄芪50-90份，党参20-40份，白术15-25份，熟地30-50份，当归20-40份，白芍10-30份，羊红膻20-40份，杜仲10-30份，淫羊藿10-30份，菟丝子10-20份，女贞子20-40份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽10-30份，茯苓10-20份，香附10-30份，益母草10-30份和川芎5-15份，除去中药中的杂质，晾晒，粉碎过40目筛，混合均匀，得到中药粉，备用；

所取中药重量份数，优选为黄芪70-80份，党参30-35份，白术15-25份，熟地40-45份，当归30-35份，白芍20-25份，羊红膻30-35份，杜仲20-25份，淫羊藿20-25份，菟丝子15-18份，女贞子30-32份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽20-25份，茯苓15-18份，香附10-30份，益母草20-25份和川芎10-12份。

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉64-80份，玉米芯颗粒60-80份，麸皮130-160份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉450-490份，加入340-400份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

所述矿物盐溶液的组成成分，按照重量份数包括磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份，硫酸镁0.06-0.07份和100份水；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液12-15份，产朊假丝酵母种子液12-15份，混合均匀，控制温度为30-34℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入24-30份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液36-45份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵36h-48h；

步骤五、厌氧发酵：停止通入灭菌空气或氧气，控制温度为34-37℃，继续发酵32-40h，发酵结束有甜香味、酒味，低温干燥后，既得草亲鱼用发酵中药微生物制剂。

所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份和硫酸镁0.06-0.07份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

所述玉米芯颗粒的制备方法为，选择洁净、干燥、无霉菌污染的玉米芯，在粉碎机中粉碎成直径约5-10mm的小块，即得到玉米芯颗粒。

本发明中所采用的中药药理: 草亲鱼产前需更多的营养精微物质，产后多气虚，血虚，血淤，选择不同药理作用的中草药，根据传统中兽医学理论，按照君臣佐使的机理组成复方，可以药效互补，提高疗效，相比单方制剂，复方制剂更具有优势。全方以中药补气血名方八珍汤、归芪益母汤为基础，根据微生物和中药相互关系，鱼类生长特点和养殖需求，药物加减变化而来，分别选取具有补气，补血，健脾，益肝、肾，去湿，清热解毒，活血化瘀等功效的中药配制而成，补气、补血为主，兼顾健脾、补肝肾，活血化瘀、通经为辅，具有旺盛脾胃功能，促进消化吸收和性腺发育，防治疾病的功效。

其中配方中黄芪、熟地益气养血共为君药；党参补中益气，白术、茯苓健脾渗湿，助黄芪补气，当归，白芍养血和营，助熟地滋养心肝共为臣药；淫羊藿，羊红膻，菟丝子温肾助阳，活血化瘀，杜仲补肝肾，强筋骨，安胎 ，枸杞子，女贞子补肝，益肾阴，谷芽消食和中，健脾开胃，陈皮、香附疏肝理气，使补气、血药补而不滞，共为佐药；益母草活血通经，川穹活血化瘀共为佐使药。以下为各中药成分的药理和作用：

黄芪：甘，微温，归脾、肺经，补气升阳，益卫固表，利水消肿，托疮生肌。

党参：甘，平，归脾、肺经，补中益气，养血。

白术：苦，甘，温，归脾、胃经，补气健脾，燥湿利水，安胎。

熟地：甘，微温，归肝、肾经，补血滋阴，益精填髓。

当归：甘、辛，温，归肝、心、脾经，补血，活血，调经，止痛，润肠。

白芍：苦，酸，甘，微寒，归肝、脾经，养血调经，平肝止痛。

羊红膻：甘，辛，温，归心、肾、肺、脾经，温中散寒，温肾助阳，活血化瘀，健脾益气。

杜仲：甘，温，归肝、肾经，补肝肾、强筋骨，安胎。

淫羊藿：辛，甘，温，归肝肾经，温肾壮阳，强筋骨。

菟丝子：甘，温，归肝肾经，补肾固精，安胎。

陈皮：辛，苦，温，归脾、肺经，理气健脾，燥湿化痰。

香附：辛，微苦，归肝，三焦经，疏肝理气，调经止痛。

谷芽：甘，平，归脾、胃经，消食键胃。

女贞子：甘，苦，归肝、肾经，补益肝肾。

枸杞子：味甘，平，归肝肾肺经，养肝，润肺，滋肾，补气强精，抗衰老。

茯苓：甘，淡平，归心、脾、胃经，利水渗湿，健脾安神。

益母草：苦、辛、微寒，归肝、心、膀胱经，活血化瘀，利水消肿，清热解毒。

川芎：辛，温，归肝胆心包经，活血行气，祛风止痛。

有益效果是：

1、本发明运用生物技术将微生物与中草药有效的结合起来，扬长避短，加强草亲鱼的产前、产后培育。发酵中药微生物制剂是现代微生物技术与中药研究的完美结合，本发明在微生物和中药双向筛选的基础上，得到能和鱼类益生菌共发酵的中草药，并根据中兽医理论和鱼类生理特点配制成复方制剂，具有促进鱼类增重、降低饵料系数、提高鱼类免疫力，防止疾病、增加产卵量，加快产后恢复速度的作用。

2、本发明采用微生物技术减少中草药用量，提高疗效。中草药中的绝大部分成分均包含于植物细胞中，植物细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶等组成，细胞壁的物理障碍阻止了中草药中有效成分被鱼类利用，草鱼具有部分降解纤维素、半纤维素的能力，但往往活力不足，发酵菌种中枯草芽孢杆菌和米曲霉，在中药基质上生长能够分泌纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等多种酶系，具有明显的破壁作用，再用产朊假丝酵母和植物乳杆菌酶解，使蛋白质、多糖等营养性大分子物质转化为易吸收的小分子，使存在于中药细胞中的营养成分和有益成分极易被鱼类利用，促进中药有效成分在鱼体内的吸收、运输和代谢，提高中药药效，避免部分成分经过高温熬制后失去活性或大量损耗，且具有对中草药活性成分进行转化、修饰以及产生新的活性物质的巨大潜力。

3、本发明所制备的草亲鱼用发酵中药微生物制剂可促进益生菌在肠道内的定植。中草药中的营养非活性成分（如淀粉、营养蛋白等）可以给益生菌提供繁殖条件，复方中黄芪、白术、当归、陈皮、党参等中药对草鱼肠道粘膜具有保护和损伤修复作用，对肠道病原菌具有抑制、杀灭作用，而对于枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌的生长具有促进作用，使微生物的活性得以提高，更易于在草鱼肠道中定植。

4、本发明所制备的草亲鱼用发酵中药微生物制剂可促进性腺发育，提高产卵量。益母草、当归对子宫具有兴奋作用，香附内含挥发油具有轻度雌激素样作用，淫羊藿能提高垂体对黄体生成释放激素的反应性而明显增加正常大鼠垂体前叶、卵巢、子宫重量，菟丝子的水煎剂能明显增加黑腹果蝇交配次数，提高阳虚小白鼠的体重、肾重、胸腺重、红细胞数、血红蛋白含量，使小白鼠持续游泳时间明显延长，女贞子中含有的女贞子苷，杜仲含有的木脂素，枸杞中含有的果酱红素等均有促进水产动物性性腺发育，提高动物繁殖力的作用，发酵产物中含有的酵母活性肽，氨基酸，B族维生素，核苷酸等物质，同样具有促进亲鱼性腺发育，增加亲鱼产卵量，提高草鱼繁殖能力的作用，使用后产卵量提高15-40%，受精率提高12%-33%，孵化率提高12%-110%，可进行一年二次甚至三次产卵，繁殖效率提高2至3倍。

5、本发明所制备的草亲鱼用发酵中药微生物制剂可加强产前强化培育，缩短产后恢复期。中草药中黄芪、党参、熟地、当归等具有补气、补血，增强脾胃功能，增加食欲，促进消化和营养成分吸收、转化的作用，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌可以调节草鱼肠道菌群微生态系统，提高草鱼饲料转化率，促进草鱼生长，有利于产后草亲鱼补充营养，迅速恢复体质，增加蛋白质等营养物质的积累。使用发酵中药微生物制剂后产后恢复期从50-70天缩短至30-49天。

6、本发明所制备的草亲鱼用发酵中药微生物制剂可增加免疫力和抗病力。中药经发酵后，更多的活性物质得以释放，被鱼类利用，组方中黄芪、党参、白术等含有的苷类、多糖、类脂物质有促进抗体生成及免疫调节的作用，枯草芽孢杆菌具有生物夺氧作用，植物乳杆菌分泌乳酸，改善肠道微生物环境，抑制多种病原菌的繁殖，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌均有免疫刺激作用，中草药和微生物两者共同作用，提高草亲鱼抗细菌、抗病毒、抗真菌的能力，降低产后草鱼死亡率，死亡率从原来的10%-15%降至2%以内。

7、本发明所制备的草亲鱼用发酵中药微生物制剂可，经发酵后，中药口味得以改善，部分有毒物质被分解，对草鱼具有诱食作用，增加草亲鱼的摄食量，提高饵料利用率。绿色天然，环保。本发明使用的中草药均为市场上常见的中草药品种，绿色天然，价廉易得，发酵所用微生物均为鱼类饲料中的常见益生菌，均可在中国典型培养物保藏中心或中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买到，添加到饲料中，无富集，无残留，不污染水体，具有较高的经济和社会效益。

附图说明

图1为微生物对中药细胞壁的破壁效应图。

具体实施方式

一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、微生物的活化和培养：分别将米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母进行活化培养和扩大培养后，分别得到米曲霉种子液、枯草芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液和产朊假丝酵母种子液，备用；微生物的活化和培养方法分别为：

（2）、所述米曲霉的活化培养和扩大培养方法为：

a、活化培养：将米曲霉接入试管固体斜面察氏培养基中，在30℃下培养4-6天，待斜面长满黄绿色孢子为止，得到活化培养后米曲霉；

所述察氏培养基，每升培养基中包括硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，余量为水，加热溶解，分装后121℃灭菌20min；

b、扩大培养：将米曲霉三角瓶种子扩大培养基混合均匀，粉碎，过4mm筛，加入蒸馏水，使培养基含水量的质量百分比为80-90%，然后取20g含水量的质量百分比为80-90%的米曲霉三角瓶种子扩大培养基装入250mL三角瓶中，灭菌后接入2-3环活化培养后米曲霉，置于30-32℃培养4-5天，制得孢子数在40-80亿/g的米曲霉干曲，倒入经事先灭菌过地装有1%葡萄糖溶液的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，即为米曲霉种子液；

所述米曲霉三角瓶种子扩大培养基中各成分的质量百分比为，麸皮80%，面粉10%，豆饼10%。

（2）、所述枯草芽孢杆菌的活化培养和扩大培养方法为：

a、活化培养：将保存的枯草芽孢杆菌菌种取出，放入37℃培养箱中4-6小时，接入装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后摇床转速200rpm，37℃培养24小时，得到活化培养后枯草芽孢杆菌；

所述牛肉膏蛋白胨培养基，每升培养基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，余量为水，pH值7.2-7.5；

b、扩大培养：取活化培养后枯草芽孢杆菌，按照活化培养后枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌扩大培养基的质量比为1:100的比例，接入装有50mL枯草芽孢杆菌扩大培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200rpm，37℃培养24小时，所得培养物中枯草芽孢杆菌数为10⁹个/mL；添加枯草芽孢杆菌扩大培养基调整活菌数使枯草芽孢杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即得到枯草芽孢杆菌种子液；

所述枯草芽孢杆菌扩大培养基，每升培养基中含有玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，碳酸钙5g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，水合硫酸锰0.2g，余量为水， pH值7.0-7.5。

（3）、所述植物乳杆菌的活化和扩大培养方法为：

a、活化培养：将保存的植物乳杆菌取出，放入37℃培养箱中4-6小时后，接入MRS培养基中， 接种量为1-3接种环，置于5℃静止培养18-24小时；

所述MRS培养基，每升培养基中含有蛋白陈10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵  2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，余量为水；

b、扩大培养：将活化培养的植物乳杆菌，按照活化培养的植物乳杆菌和植物乳杆菌扩大培养基的质量比为1:50的比例，接种于植物乳杆菌扩大培养基中，34-37℃静止培养24h，添加植物乳杆菌扩大培养基调整活菌数使植物乳杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即为植物乳杆菌种子液；

所述植物乳杆菌扩大培养基中各成分的质量百分比为，豆芽汁5%，番茄汁10%，马铃薯5%，蔗糖2%，食盐4%，水74%。

（4）、所述产朊假丝酵母的活化和扩大培养方法为：

a、活化培养：将产朊假丝酵母取出放入30℃培养箱中4-6小时，接入事先灭菌的装有50mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后置于30℃，摇床转速160 rpm /min，培养18-24小时，得到活化后产朊假丝酵母菌液；

所述YPD液体培养基，每升培养基中含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，余量为水；

b、扩大培养：将活化培养的产朊假丝酵母菌液接种到事先灭菌的装有50mL 产朊假丝酵母扩大液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为产朊假丝酵母扩大液体培养基体积的2%；然后置于摇床转速160 rpm /min,温度30℃条件下培养18-24h后，添加产朊假丝酵母扩大液体培养基，调整浓度使产朊假丝酵母菌数3-8×10⁸个/mL，得到产朊假丝酵母种子液；

所述产朊假丝酵母扩大液体培养基：每升培养基中包括葡萄糖100g，硫酸铵20g，尿素10g，酵母膏2g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.2g，余量为水，调整PH值至5.5；

所述米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母的活化培养和扩大培养方法也可以为，将米曲霉菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉或产朊假丝酵母菌粉，倒入装有质量分数为1%葡萄糖水溶液和8-10粒玻璃珠的三角瓶中，在摇床上震荡，充分打散菌粉，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌数为3-8×10⁸个/mL，即为米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌种子液。

步骤二、按照重量份数取黄芪50-90份，党参20-40份，白术15-25份，熟地30-50份，当归20-40份，白芍10-30份，羊红膻20-40份，杜仲10-30份，淫羊藿10-30份，菟丝子10-20份，女贞子20-40份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽10-30份，茯苓10-20份，香附10-30份，益母草10-30份和川芎5-15份，除去中药中的杂质，晾晒，粉碎过40目筛，混合均匀，得到中药粉，备用；

所取中药重量份数，优选为黄芪70-80份，党参30-35份，白术15-25份，熟地40-45份，当归30-35份，白芍20-25份，羊红膻30-35份，杜仲20-25份，淫羊藿20-25份，菟丝子15-18份，女贞子30-32份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽20-25份，茯苓15-18份，香附10-30份，益母草20-25份和川芎10-12份。

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉64-80份，玉米芯颗粒60-80份，麸皮130-160份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉450-490份，加入340-400份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

所述矿物盐溶液的组成成分，按照重量份数包括磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份，硫酸镁0.06-0.07份和100份水；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液12-15份，产朊假丝酵母种子液12-15份，混合均匀，控制温度为30-34℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入24-30份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液36-45份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵36h-48h；

步骤五、厌氧发酵：停止通入灭菌空气或氧气，控制温度为34-37℃，继续发酵32-40h，发酵结束有甜香味、酒味，低温干燥后，既得草亲鱼用发酵中药微生物制剂。

所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份和硫酸镁0.06-0.07份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

所述玉米芯颗粒的制备方法为，选择洁净、干燥、无霉菌污染的玉米芯，在粉碎机中粉碎成直径约5-10mm的小块，即得到玉米芯颗粒。

实施例1

一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、微生物的活化和培养：分别将米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母进行活化培养和扩大培养后，分别得到米曲霉种子液、枯草芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液和产朊假丝酵母种子液，备用；

所述米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母的活化培养和扩大培养方法为，将米曲霉菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉或产朊假丝酵母菌粉，倒入装有质量分数为1%葡萄糖水溶液和8-10粒玻璃珠的三角瓶中，在摇床上震荡，充分打散菌粉，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母数3-8×10⁸个/mL，即为米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌种子液。

步骤二、按照重量份数取黄芪90份，党参40份，白术25份，熟地50份，当归40份，白芍30份，羊红膻40份，杜仲30份，淫羊藿30份，菟丝子10-20份，女贞子40份，枸杞子40份，陈皮40份，谷芽30份，茯苓20份，香附30份，益母草30份和川芎15份，除去中药中的杂质，晾晒，粉碎过40目筛，混合均匀，得到中药粉，备用；

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉70份，玉米芯颗粒70份，麸皮150份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉480份，加入360份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液14份，产朊假丝酵母种子液14份，混合均匀，控制温度为32℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入26份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液38份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵40h；

步骤五、厌氧发酵：停止通入灭菌空气或氧气，控制温度为34-37℃，继续发酵32-40h，发酵结束有甜香味、酒味，低温干燥后，既得草亲鱼用发酵中药微生物制剂。

所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.35份，磷酸氢二钾0.65份，氯化钠0.47份和硫酸镁0.065份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

所述玉米芯颗粒的制备方法为，选择洁净、干燥、无霉菌污染的玉米芯，在粉碎机中粉碎成直径约8mm的小块，即得到玉米芯颗粒。

实施例2

如实施例1所述，在其它条件与实施例1相同的情况下，步骤二中所取的中药的重量份数为黄芪50份，党参20份，白术15份，熟地300份，当归20份，白芍10份，羊红膻20份，杜仲10份，淫羊藿10-30份，菟丝子10份，女贞子20份，枸杞子20份，陈皮20份，谷芽10份，茯苓10份，香附10-30份，益母草10份和川芎5份；

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉80份，玉米芯颗粒80份，麸皮160份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉490份，加入400份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液15份，产朊假丝酵母种子液15份，混合均匀，控制温度为34℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入24-30份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液45份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵48h；

所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.4份，磷酸氢二钾0.7份，氯化钠0.5份和硫酸镁0.07份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

实施例3

如实施例1所述，在其它条件与实施例1相同的情况下，步骤二中所取的中药的重量份数为黄芪70份，党参30份，白术20份，熟地40份，当归30份，白芍28份，羊红膻26份，杜仲22份，淫羊藿16份，菟丝子18份，女贞子26份，枸杞子42份，陈皮36份，谷芽26份，茯苓18份，香附10-30份，益母草22份和川芎12份；

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉64份，玉米芯颗粒60份，麸皮130份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉450份，加入340份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液12份，产朊假丝酵母种子液12份，混合均匀，控制温度为30℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入24份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液36份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵36h；

所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.3份，磷酸氢二钾0.6份，氯化钠0.4份和硫酸镁0.06份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

实施例4

如实施例1所述，在其它条件与实施例1相同的情况下，步骤二中所取的中药的重量份数为70份，党参30份，白术15份，熟地40份，当归30份，白芍20份，羊红膻30份，杜仲20份，淫羊藿20份，菟丝子15份，女贞子30份，枸杞子20份，陈皮20份，谷芽20份，茯苓15份，香附10份，益母草20份和川芎10份。

实施例5

如实施例1所述，在其它条件与实施例1相同的情况下，步骤二中所取的中药的重量份数为80份，党参35份，白术25份，熟地45份，当归35份，白芍25份，羊红膻35份，杜仲25份，淫羊藿25份，菟丝子18份，女贞子30-32份，枸杞子40份，陈皮40份，谷芽25份，茯苓18份，香附30份，益母草25份和川芎12份。

相关实验

实验一：本发明草亲鱼用发酵中药微生物制剂对于草亲鱼产卵和抗病力的影响实验：

一、实验方法

1、材料与方法：

池塘：面积1-2亩的长方形池塘5口，水深1.2-1.8米，池塘淤泥少，注排水方便，每个池塘配备3kw增氧机一台。孵化场所：产卵池圆形，直径4米，高1.8米，有进排水管道，配有3个孵化池和2个暂养池。试验用鱼：年龄7-10龄，体重7-13kg/尾，体质健壮无伤，每个池塘放养8组，雌雄比1:1.5，共约150-170kg，并搭配适量鲢、鳙成鱼。青饲料：饲喂草鱼的青饲料，包括黑麦草、苏丹草等人工种植的牧草和部分陆生蔬菜。

2、草亲鱼培育

（1）、水质调控：秋季和早春每半月冲水一次，中春每周冲水一次，每次水位升高约10-15cm左右，晚春产卵前，每天冲水一次，每次1h，保持水质清新，促进性腺发育。每15天以生石灰15kg/亩全池泼洒消毒，每30-40天换水一次，每次换池塘水的三分之一。

（2）、产后培育：

一次催产后培育：指第一次产卵后至第二次产卵这段时间，对于轻程度的皮肤损伤及鳞片脱落，用青霉素药膏涂抹，放入养殖池，第二天用二氧化氯制剂消毒，用量0.3g/m³水体，连用2天。草鱼产卵入糖后5-10天以精饲料为主，青饲料为辅，精饲料投喂量占亲鱼体重的3%-4%，青饲料占体重的10%-15%；中间10-15天青饲料投喂量占体重的20%-30%，精饲料为辅占体重的2%-3%；最后至二次产卵，青饲料占体重的30%-40%，精饲料占1%-2%，总体上，青饲料或精饲料均以当天吃完或略有剩余为准。

二次催产后培育：消毒措施同一次产后培育，草鱼入糖15天内，亲鱼摄食量低，仅投喂精饲料，15天后以青饲料为主，精饲料为辅投喂，每天精饲料投喂量为鱼体重的1%-2%，青饲料投喂量为鱼体重的30%-40%，均以当天吃完略有剩余为标准，每天上午9-10点投喂青饲料，每天下午2点投喂精饲料。

（3）、冬季培育：十月初至第二年3月，逐渐减少青饲料投喂量，增加精饲料投喂量，至11月，投喂一个月的小麦芽，12月至第二年3月，每隔2-3天投喂一次精饲料，投喂量以下次投喂前略有剩余为宜。

（4）、春季培育：第二年3月开始至产前，随着水温逐渐回升，亲鱼摄食强度又逐渐恢复，加强这一阶段的培育，会促进性腺的发育。以青饲料为主，占鱼体重的30%-40%，精饲料为辅，占鱼体重的1%-2%，产前10天，精饲料全部投喂麦芽，以当天吃完，略有剩余为宜。

3、实验分组：

A组（低质饵料对照组）：精饲料由煮熟的玉米和小麦组成，配比为玉米、小麦1:1的比例，除2中精饲料特别指出投喂麦芽之外，均采用此配方比例投喂，催产结束后草亲鱼每尾注射10万国际单位青霉素。

B组（低质中药发酵实验组）：精饲料配比为玉米、小麦，发酵中药微生物制剂10:9:1的比例（加上青饲料用量，中药用量约为总饲料用量的0.5%），不注射抗菌药物。除2中特别指出的投喂麦芽之外，均采用此配方比例投喂。

C组（高质量饵料对照组）：投喂黄豆、花生饼、小麦、谷芽组成的精饲料，黄豆饼，花生饼，小麦，谷芽的比例为2:1:1:1，催产结束后草亲鱼每尾注射10万国际单位青霉素, 除2中特别指出的投喂麦芽之外，均采用此配方比例投喂。

D组（高质中药实验组）：按照黄豆饼，花生饼，小麦，谷芽，中药8:3:4:4:1的比例，配比中的中药未经过益生菌发酵过程，其它成分相同，不注射青霉素，除2中特别指出的投喂麦芽之外，均采用此配方比例投喂。

E组（高质中药发酵实验组）：以本发明草亲鱼用发酵中药微生物制剂代替高质中药实验组中的中药，其它不变。

4、 产卵检查方法

挖卵检查法结合外观选择法。

6、亲鱼催产

催产时间从5月10日至8月初，催产期间水温18℃-30℃，催产药物使用促黄体生成素释放激素类似物（LRH-A），用量20微克/kg，按照雌雄比1:2的比例，注射催产药物后放入产卵池催产，自然受精，收集卵移入孵化环道孵化。

7、实验结果统计

产卵量计算方法：采用间接计数法，统计从产卵池转移到孵化池的总桶数，用500mL烧杯取卵计数，取3次的平均数，得出一烧杯的卵数，然后推算总的产卵量。

受精率的计算方法：舀取孵化1天后的卵细胞，计算1000粒卵细胞的受精卵数，用受精卵数除以统计卵数既得受精率。

孵化率的计算方法：用得到的下塘水花总数除以孵化卵的总数，既得孵化率。

二、实验结果

表1 草亲鱼用发酵中药微生物制剂对于草亲鱼产卵和抗病力的影响：

注：尾数仅指雌鱼数量，每公斤产卵量仅计算雌鱼。

该实验使用草亲鱼用发酵中药微生物制剂后，首次催产，低质中药发酵实验组相对于低值饵料对照组产卵量提高了15.5%,高质中药实验组和高质中药发酵实验组相对于高质饵料对照组分别提高了2%和3.8%，第二次催产，低质中药发酵实验组相比较低值饵料对照组提高了28.1%，高质中药实验组和高质中药发酵实验组相比较高质饵料对照组分别提高了22.6%和40%。第一次产卵时，受精率，低质中药发酵实验组相对于低值饵料对照组提高了12.3%，高质中药实验组和高质中药发酵实验组相对于高质饵料对照组提高了4%和7.1%，第二次产卵时受精率低质中药发酵实验组相对于低值饵料对照组提高了26.1%，而高质中药实验组和高质中药发酵实验组相对于高质饵料对照组分别提高了17.5%和33.9%。孵化率首次催产低质中药发酵实验组相对于低值饵料对照组孵化率提高了24%，高质中药实验组和高质中药发酵实验组相对于高质饵料对照组分别提高了12%和24.7%。第二次催产低质中药发酵实验组相对于低值饵料对照组孵化率提高了111.6%，高质中药实验组和高质中药发酵实验组相对于高质饵料对照组分别提高了30.5%和74%。说明本发明复方中药对于提高草鱼产卵量、受精率和孵化率具有明显作用，且中药经发酵后作用更为明显；微生物对中药的破壁结果观察，如图1所示，可以看出中药经微生物作用后，细胞壁明显被破坏，大大促进草鱼对中药成分的有效吸收；发酵中药复方对于营养条件不良的草亲鱼作用更为明显，对于二次催产的效果优于第一次催产。产卵间隔天数从55-65天缩短至30-49天，投喂高质饵料的草亲鱼均没有死亡，而低值饵料组第二次催产后死亡2尾，说明发酵中药微生物制剂具有缩短二次产卵间隔时间，促进性腺成熟，提高草鱼抗病能力，降低死亡率的作用。

本发明所述的所述的米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母为常用菌种，均采用市场上购得的菌种，本发明的技术方案不依赖菌种的特定菌株，经多次试验，从不同保藏机构和生物制品企业购得菌种均能达到预定效果。

Claims (10)

1.一种草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、微生物的活化和培养：分别将米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母进行活化培养和扩大培养后，得到米曲霉种子液、枯草芽孢杆菌种子液、植物乳杆菌种子液和产朊假丝酵母种子液，备用；

步骤二、按照重量份数取黄芪50-90份，党参20-40份，白术15-25份，熟地30-50份，当归20-40份，白芍10-30份，羊红膻20-40份，杜仲10-30份，淫羊藿10-30份，菟丝子10-20份，女贞子20-40份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽10-30份，茯苓10-20份，香附10-30份，益母草10-30份和川芎5-15份，除去所取中药中的杂质，晾晒，粉碎过40目筛，混合均匀，得到中药粉，备用；

步骤三、固体发酵培养基的配制：分别取豆粕粉64-80份，玉米芯颗粒60-80份，麸皮130-160份，矿物盐溶液100份和上述准备好的中药粉450-490份，加入340-400份自来水或蒸馏水，混合均匀后装入固态好氧发酵罐中，蒸汽灭菌15分钟后，温度降至40℃，得到固体发酵培养基，备用；

所述矿物盐溶液的组成成分，按照重量份数包括磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份，硫酸镁0.06-0.07份和100份水；

步骤四、好氧发酵：在上述装入固体发酵培养基的固态好氧发酵罐中接入上述米曲霉种子液或米曲霉干曲12-15份，产朊假丝酵母种子液12-15份，混合均匀，控制温度为30-34℃，在发酵罐中通灭菌空气或氧气发酵8h后，分别接入24-30份枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液36-45份，搅拌均匀，继续通灭菌空气或氧气发酵36h-48h；

步骤五、厌氧发酵：停止通入灭菌空气或氧气，控制温度为34-37℃，继续发酵32-40h，既得草亲鱼用发酵中药微生物制剂。

2.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述中药粉，按照重量份数包括黄芪70-80份，党参30-35份，白术15-25份，熟地40-45份，当归30-35份，白芍20-25份，羊红膻30-35份，杜仲20-25份，淫羊藿20-25份，菟丝子15-18份，女贞子30-32份，枸杞子20-40份，陈皮20-40份，谷芽20-25份，茯苓15-18份，香附10-30份，益母草20-25份和川芎10-12份。

3.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述米曲霉的活化培养和扩大培养方法为：

步骤一、活化培养：将米曲霉接入试管固体斜面察氏培养基中，在30℃下培养4-6天，待斜面长满黄绿色孢子为止，得到活化培养后米曲霉；

所述察氏培养基，每升培养基中包括硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g和琼脂20g，余量为水；

步骤二、扩大培养：将米曲霉三角瓶种子扩大培养基混合均匀，粉碎，过4mm筛，加入蒸馏水，使培养基含水量的质量百分比为80-90%，然后取20g含水量的质量百分比为80-90%的米曲霉三角瓶种子扩大培养基装入250mL三角瓶中，灭菌后接入2-3环活化培养后米曲霉，置于30-32℃培养4-5天，制得孢子数在40-80亿/g的米曲霉干曲，倒入经事先灭菌过地装有1%葡萄糖溶液的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，即为米曲霉种子液；

所述米曲霉三角瓶种子扩大培养基中各成分的质量百分比为：麸皮80%，面粉10%，豆饼10%。

4.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的活化培养和扩大培养方法为：

步骤一、活化培养：将保存的枯草芽孢杆菌菌种取出，放入37℃培养箱中4-6小时，接入装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后摇床转速200rpm，37℃培养24小时，得到活化培养后枯草芽孢杆菌；

所述牛肉膏蛋白胨培养基，每升培养基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，余量为水，pH值7.2-7.5；

步骤二、扩大培养：取活化培养后枯草芽孢杆菌，按照活化培养后枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌扩大培养基的质量比为1:100的比例，接入装有50mL枯草芽孢杆菌扩大培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200rpm，37℃培养24小时，所得培养物中枯草芽孢杆菌数为10⁹个/mL；添加枯草芽孢杆菌扩大培养基调整活菌数使枯草芽孢杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即得到枯草芽孢杆菌种子液；

所述枯草芽孢杆菌扩大培养基，每升培养基中含有玉米粉10g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，碳酸钙5g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.2g，水合硫酸锰0.2g，余量为水， pH值7.0-7.5。

5.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于： 所述植物乳杆菌的活化和扩大培养方法为：

步骤一、活化培养：将保存的植物乳杆菌取出，放入37℃培养箱中4-6小时后，接入MRS培养基中， 接种量为1-3接种环，置于5℃静止培养18-24小时；

所述MRS培养基，每升培养基中含有蛋白陈10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，1.0mL吐温80，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，余量为水；

步骤二、扩大培养：将活化培养的植物乳杆菌，按照活化培养的植物乳杆菌和植物乳杆菌扩大培养基的质量比为1:50的比例，接种于植物乳杆菌扩大培养基中，34-37℃静止培养24h，添加植物乳杆菌扩大培养基调整活菌数使植物乳杆菌数为3-8×10⁸个/mL，即为植物乳杆菌种子液；

所述植物乳杆菌扩大培养基中各成分的质量百分比为，豆芽汁5%，番茄汁10%，马铃薯5%，蔗糖2%，食盐4%，水74%。

6.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于： 所述产朊假丝酵母的活化和扩大培养方法为：

步骤一、活化培养：将产朊假丝酵母取出放入30℃培养箱中4-6小时，接入装有50mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为1-3接种环；然后置于30℃，摇床转速160 rpm /min，培养18-24小时，得到活化后产朊假丝酵母菌液；

所述YPD液体培养基，每升培养基中含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，余量为水；

步骤二、扩大培养：将活化培养的产朊假丝酵母菌液接种到装有50mL 产朊假丝酵母扩大液体培养基的250mL三角瓶中，接种量为产朊假丝酵母扩大液体培养基体积的2%；然后置于摇床转速160 rpm /min，温度30℃条件下培养18-24h后，添加产朊假丝酵母扩大液体培养基，调整浓度使产朊假丝酵母菌数3-8×10⁸个/mL，得到产朊假丝酵母种子液；

所述产朊假丝酵母扩大液体培养基：每升培养基中包括葡萄糖100g，硫酸铵20g，尿素10g，酵母膏2g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁1.2g，余量为水，pH值为5.5。

7.如权利要求3-6其中之一所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母的活化培养和扩大培养方法为，将米曲霉菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉或产朊假丝酵母菌粉，倒入装有质量分数为1%葡萄糖水溶液和8-10粒玻璃珠的三角瓶中，在摇床上震荡，充分打散菌粉，调整浓度，使米曲霉孢子数为3-8×10⁷个/mL，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌数为3-8×10⁸个/mL，即得到米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或产朊假丝酵母菌种子液。

8.如权利要求1-6其中之一所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所制得的发酵中药微生态制剂活菌总数≥10⁸个/g，水分≤10%；在饲料中用量为饲料质量的0.5-1%。

9.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述矿物盐溶液的制备方法为，称取磷酸二氢钾0.3-0.4份，磷酸氢二钾0.6-0.7份，氯化钠0.4-0.5份和硫酸镁0.06-0.07份装入容器中，倒入100份自来水或蒸馏水，充分融化，即得到矿物盐溶液。

10.如权利要求1所述的草亲鱼用发酵中药微生物制剂的制备方法，其特征在于：所述玉米芯颗粒的制备方法为，选择洁净、干燥、无霉菌污染的玉米芯，在粉碎机中粉碎成直径5-10mm的小块，即得到玉米芯颗粒。