CN104849380A - 一种测定水产品接触材料中芳香胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定水产品接触材料中芳香胺的方法，该方法包括样品前处理、样品的固相萃取回收以及加压毛细管电色谱分离，加压毛细管电色谱中毛细管电色谱柱为EP-100-20/45-3-C18，流动相为甲醇和磷酸氢二钾水溶液，采用梯度洗脱，240nm波长下加压2～10kv。与现有技术相比，该方法线性关系良好，R2>0.99，5种芳香胺的检出限在1.0-4.0mg/L之间，方法的回收率大于70.1%，相对标准偏差（RSD）<5.7%，简便、快速且灵敏度高，因此可用于水产品接触材料中芳香胺含量的快速检测。

Description

一种测定水产品接触材料中芳香胺的方法

技术领域

本发明涉及水产品中有害化学成分分析测定技术领域，具体涉及一种测定水产品接触材料中芳香胺的方法。

背景技术

芳香胺（Aromatic amine）是一种重要的化工原料，被广泛应用于化学染料和包装材料中，是一类被人们熟知的有毒有害物质。芳香胺及其衍生物具有诱变因子，可以通过吸入、食入或透过皮肤吸收而导致中毒，能通过形成高铁血红蛋白，造成人体血液系统损害，也可以直接作用于肝细胞，引起中毒性肝损害，其中一些芳香胺衍生物还具有致癌和致突变的作用，即使在低浓度下，对动物和人体都具有致癌性。

水产品中芳香胺的主要来源是与之接触的材料，接触材料中若存在芳香胺类物质，很容易在特定条件下迁移至水产品中，对消费者的身体健康带来非常大的安全隐患。近年来，国际上对芳香胺的污染问题越来越重视，欧盟规定使用芳香族异氰酸酯为原料和偶氮染料的食品接触材料不可释放出芳香胺类物质(以苯胺计)，2007年颁布的新指令2007/19/EC中更新其检出限为0.01mg/kg(以苯胺计)。目前，芳香胺迁移量的检测技术主要为气相色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、色谱质谱联用、毛细管电泳法等。气相色谱和高效液相色谱法灵敏度较高，对芳香胺进行分离检测可以实现自动化操作，简便易行，而色谱质谱联用技术则使检测的灵敏度更上了一个台阶。但是，由于采用上述方法对芳香胺进行检测时，通常需要进行衍生化，过程非常繁琐，不易进行。毛细管电色谱检测技术则主要应用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相可以说是HPLC（高效液相色谱法）和HPCE（高效毛细管电泳）的有机结合，它不仅克服了HPLC中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展，而且柱内无压降，使峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于HPCE水平的高柱效，同时还具备了HPLC的选择性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种简便、快速且灵敏度高的测定水产品接触材料中芳香胺的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种测定水产品接触材料中芳香胺含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）水产品接触材料洗净，晾干后称重，根据接触材料重量，将接触材料按照0.5g接触材料/100～110ml水的比例放入水中浸泡，密封后放入89℃～90℃水浴内，1h后根据需要取出适量浸泡液，待冷却至室温后备用；

（2）将上述浸泡液的pH值调至6～10，接着将浸泡液以0.8～1.2ml/min的流速，匀速通过活化后的固相萃取柱，该浸泡液从固相萃取柱流出后，用超纯水进行清洗，抽干后再加入2～10ml洗脱溶剂进行洗脱，收集适量洗脱液，用氮吹仪吹至近干，定容至1ml，过0.22μm滤膜后，置于样品瓶中备用；

（3）上述样品采用加压毛细管电色谱仪进行检测，其中所用毛细管电色谱柱为EP-100-20/45-3-C18，柱温为常温，流动相为甲醇和磷酸氢二钾水溶液，该流动相的pH值为4～8，流动相中磷酸氢二钾浓度为5mmol/L～50mmol/L；

梯度洗脱条件为：0～6min，流动相中甲醇含量65%～70%，6～30min，流动相中甲醇含量70%～90%，流动相的流速均为0.04ml/min；

其他检测条件：同时紫外检测波长为240nm，外加分离电压范围为2～10kv。

上述芳香胺为苯胺（Aniline）、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、邻甲氧基苯胺(o-Methoxyaniline)、对氯苯胺(p-Chloroaniline)以及3,3’-二甲基联苯胺(3,3’-DimethvlbenzidineF)。

由于芳香胺中带有氨基，因此浸泡液的pH值会对固相萃取中芳香胺的吸附效果产生影响，本发明中浸泡液的pH值为9。

所述固相萃取柱为EnviTM-Chrom P柱，由于EnviTM-Chrom P柱采用苯乙烯二乙烯基苯作为填料，有较大数量的比表面积和较低的表面活性，能够提供一种理想的液液分配的支撑表面，使得芳香胺类物质有最大程度的回收率。

固相萃取中浸泡液的流速大小会对芳香胺的吸附和回收产生影响，作为优选，浸泡液在固相萃取柱中的流速为1ml/min。

固相萃取中洗脱溶剂的选择关系到能否将吸附在固相萃取柱上的芳香胺完全洗脱下来，所以洗脱溶剂的选择十分重要，本发明中洗脱溶剂为甲醇，且甲醇的用量为6ml，甲醇不仅能将上述5种芳香胺很好地洗脱下来，而且为第三步加压毛细管电色谱中的流动相之一，因此固相萃取中选用甲醇作为洗脱溶剂，进一步，选用的洗脱溶剂的用量为6ml，6ml的甲醇不仅能使5种芳香胺较好地洗脱下来，且在氮吹过程中损失较小。

所述流动相pH值为8，该流动相中磷酸氢二钾的浓度为20mmol/L，由于芳香胺为弱碱性物质，所以流动相的pH值对芳香胺的带电情况和电渗流有很大影响，pH值为8时，5种芳香胺均能较好地分离；缓冲盐对于毛细管电色谱系统的稳定以及目标化合物的分离起着重要作用，因此本发明中流动相中磷酸氢二钾的浓度选为20mmol/L。

分离电压产生的电渗流推动力是加压毛细管电色谱中目标分析物分离的主要动力之一，分离电压增大使得电渗流增大，目标分析物的保留时间减少，但分离电压过大，5中芳香胺的分离与基线的稳定情况受到影响，毛细管电色谱柱内焦耳热效应增加，使得分离效率降低，综上，本发明中外加分离电压为6kv。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中利用固相萃取-加压毛细管电色谱相结合的方法测定水产品接触材料中5种芳香胺类化合物的含量，其中，固相萃取能对五种芳香胺进行较好地回收和吸附，而加压毛细管电色谱中由于结合了HPLC的分离选择性和电渗流的推动力，5种芳香胺能够较好地分离，该方法线性关系良好，R²>0.99，5种芳香胺的检出限在1.0-4.0mg/L之间，方法的回收率大于70.1%，相对标准偏差（RSD）<5.7%，因此该方法简便、快速且灵敏度高，可用于水产品接触材料中芳香胺含量的快速检测。

附图说明

图1为实施例2中不同固相萃取小柱对五种芳香胺回收率的影响；

图2为实施例2中不同固相萃取洗脱溶剂的体积对五种芳香胺回收率的影响；

图3为实施例3中磷酸氢二钾pH值变化与五种芳香胺保留时间的关系；

图4为实施例3中不同分离电压对五种芳香胺分离效果的影响。

具体实施方式

以下通过实施例1～4结合附图对本发明在测定水产品接触材料中5种芳香胺的应用作进一步详细描述，该5种芳香胺分别为苯胺（Aniline）、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、邻甲氧基苯胺(o-Methoxyaniline)、对氯苯胺(p-Chloroaniline)以及3,3’-二甲基联苯胺(3,3’-DimethvlbenzidineF)。

实施例1：

将水产品接触材料洗净，晾干后称重，根据接触材料重量，将接触材料按照0.5g接触材料/100～110ml水的比例放入水中浸泡，本实施例中用于浸泡接触材料的水不少于500mL，密封后放入90℃水浴内，1h后取出400mL浸泡液，待冷却至室温后进行固相萃取。

实施例2：

选择EnviTM-Chrom P柱作为固相萃取柱，并依次使用5ml的甲醇和5ml的超纯水活化固相萃取柱。用NaOH溶液将实施例1中制得浸泡液pH值调至9，然后将该浸泡液以1ml/min的流速匀速通过活化后的固相萃取柱，该浸泡液从固相萃取柱流出后，用超纯水进行清洗，抽干后再加入6ml甲醇进行洗脱，收集适量洗脱液，用氮吹仪吹至近干，定容至1ml，过0.22μm滤膜后，置于样品瓶中备用。

本实施例中，在相同的实验条件下，对Supelco EnviTM-Chrom P柱（Chrom P）、DIKMA ProElut C18柱（C18）、Waters OASIS HLB Cartridge柱（HLB）以及CHROMABOND XTR柱（XTR）四种固相萃取小柱进行回收率实验，对其吸附效率进行比较。如图1所示，Supelco EnviTM-Chrom P柱的回收效率较好，且对芳香胺的吸附效果最佳，因此本发明选择Supelco EnviTM-Chrom P柱作为固相萃取柱。

固相萃取中洗脱溶剂的体积也会对实验结果产生重要影响，本实施例在甲醇的一定体积范围（2～10ml）内，分别选取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml来进行试验，由图2可知，6ml甲醇和8ml甲醇均能使五种芳香胺较好地洗脱下来，但8ml的洗脱液在氮吹过程中损失较大，因此选择6ml作为本发明固相萃取中的洗脱体积。

由于芳香胺带有氨基，本实施例研究了浸泡液pH值分别在6，7，8，9和10时固相萃取柱对于芳香胺吸附效果的影响。将400mL浸泡液用NaOH溶液分别调节pH值至6，7，8，9和10，接着在相同的洗脱溶剂、洗脱体积等萃取条件下进行固相萃取，考察不同pH对固相萃取吸附效率的影响。从表1可以看出，浸泡液pH值越高，5种芳香胺的回收率越高，当pH值达到9时，SupelcoEnviTM-Chrom P固相萃取小柱对于目标化合物的吸附作用最优，而当pH值调至10时，五种芳香胺的回收率呈下降趋势，所以本发明中将浸泡液的pH值调至9。

表1浸泡液pH值对固相萃取吸附效率的影响

实施例3：

将实施例2中制得的样品放入加压毛细管电色谱仪中进行检测，该加压毛细管电色谱仪包括两台高压输液模块、微流控模块、可变波长紫外检测器（90-800nm）以及高压电源模块(±30kV范围内)等；毛细管电色谱柱为EP-100-20/45-3-C18，该色谱柱的内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS，柱温为常温。流动相为甲醇和磷酸氢二钾水溶液，该流动相的pH值为8，流动相中磷酸氢二钾浓度为20mmol/L；梯度洗脱条件为：0～6min，流动相中甲醇含量65%～70%，6～30min，流动相中甲醇含量70%～90%，流动相的流速均为0.04ml/min。检测过程中，紫外检测波长为240nm，外加分离电压范围为6kv。

缓冲盐对于毛细管电色谱系统的稳定以及目标化合物的分离起着很重要的作用，本实施例在流动相梯度保持相同、分离电压设定为+6kV、泵流速设定为0.04ml/min的实验条件下，考察流动相中磷酸氢二钾缓冲液的浓度在5mmol/L-50mmol/L范围内（实验过程中pH值保持为8），分析物保留时间和分离效率的情况。由于随着磷酸氢二钾溶液浓度越高，毛细管电色谱柱内产生的焦耳热越大，电色谱基线越不稳定；同时，盐浓度越小，离子浓度也越小，电渗流反而越大，使得芳香胺在反向色谱柱上的保留时间减小，但同时考虑到盐浓度的选择应该要不影响五种芳香胺的分离效率，所以本实施例中磷酸氢二钾溶液浓度选择为20mmol/L。

由于芳香胺为弱碱性物质，流动相pH值对其带电情况和电渗流有很大影响，同时毛细管电色谱柱的pH值允许范围在2-9左右，因此本实施例研究当流动相pH值在4-8之间变化时，五种芳香胺保留时间的变化情况。实验结果如图3所示，各芳香胺的保留时间随pH值增大而减小，同时分离度也有所提高，在pH为8的缓冲溶液中，本实验中五种芳香胺均能较好地分离，综合考虑分析速度与色谱柱稳定性，本实施例采用pH值为8的磷酸氢二钾缓冲液。

分离电压产生的电渗流推动力是pCEC（加压毛细管电色谱）分离的主要动力之一，不同电压条件下芳香胺的保留时间不同。电压太低，芳香胺的保留时间延长，电压过高又会使毛细管中形成气泡，导致基线的噪音增大，所以选择合适的电压十分重要。在流动相梯度、缓冲盐浓度与pH值保持一致，泵流速设定为0.04ml/min的实验条件下，考察分离电压分别为+2、+4、+6、+10kV时，五种芳香胺的毛细管电色谱分离情况，结果如图4。由图4可见，分离电压增大使得电渗流增大，分析物的保留时间减小，但分离电压过大，五种化合物的分离与基线的稳定情况明显受到了影响，毛细管电色谱柱内焦耳热效应增加，使分离效率降低。综合考虑上述因素的影响，本实施例选择+6kV的分离电压。

实施例4

由实施例1～3获得的优选方案对2-20mg/L浓度范围的3,3’-二甲基联苯胺(3,3’-DimethvlbenzidineF)、邻甲氧基苯胺(o-Methoxyaniline)、对氯苯胺(p-Chloroaniline)、苯胺（Aniline）和2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)等芳香胺溶液进行检测，其相关系数、线性范围和检出限如表2所示，由表2可以看出，采用该方法检测五种芳香胺其线性关系良好，相关系数不低于0.99，基于3倍信噪比的检出限在1.0至4.0mg/L之间，可见该方法分离效率良好，可以用于此五种芳香胺的检测。

表2五种芳香胺的线性和检出限

^a y:peak area;x:the concentration of analyst(mg/L).

^b limit of detection:S/N>3.

采用标准添加法对添加样品分别进行加标回收率和精密度试验，以观察该方法的准确性和重现性。在空白样品中添加三个不同浓度的混合标准溶液，按照优化后的方案进行回收率实验，同时每个添加浓度平行重复3次，计算回收率和精密度，结果见表3。

表3五种芳香胺的加标回收率和精密度

^a Standard deviation

由上可见，该方法的线性关系良好，R2>0.99，五种芳香胺的检出限在1.0-4.0mg/L之间，方法的回收率>70.1%，相对标准偏差（RSD）<5.7%。实验结果证明，加压毛细管电色谱法具有高效、快速、分离度好等优点，能满足水产品接触材料中芳香胺的分析要求。

上述各实施例中所用主要仪器与试剂如下：

TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪(上海通微分析技术有限公司)，包括两台高压输液模块，微流控模块，可变波长紫外检测器(190-800nm)，高压电源模块(±30kV范围内)；毛细管电色谱柱EP-100-20/45-3-C18：内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μmODS；D2F6020型真空干燥箱（宁波江南仪器厂），pH计(HORIBA公司），MTN-2800D干浴氮吹仪，ASE-12固相萃取仪，Supeleo EnviTM-Chrom P固相萃取小柱，DIKMAProElut C18固相萃取柱，Waters OASIS HLB Cartridge柱，CHROMABOND XTR柱；水产品接触材料购于舟山水产品市场。

甲醇、乙腈为高效液相色谱级，购置于美国Tedia公司；叔丁基甲醚、乙醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钾均为分析纯；芳香胺标准品（苯胺、2,6-二甲基苯胺、邻甲氧基苯胺、对氯苯胺、3,3’-二甲基联苯胺）纯度>99%，购置于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；实验用水均为超纯水。

Claims (8)

1.一种测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）水产品接触材料洗净，晾干后称重，根据接触材料重量，将接触材料按照0.5g接触材料/100～110ml水的比例放入水中浸泡，密封后放入89℃～90℃水浴内，1h后根据需要取出适量浸泡液，待冷却至室温后备用；

（2）将上述浸泡液的pH值调至6～10，接着将浸泡液以0.8～1.2ml/min的流速，匀速通过活化后的固相萃取柱，该浸泡液从固相萃取柱流出后，用超纯水进行清洗，抽干后再加入2～10ml洗脱溶剂进行洗脱，收集适量洗脱液，用氮吹仪吹至近干，定容至1ml，过0.22μm滤膜后，置于样品瓶中备用；

（3）上述样品放入加压毛细管电色谱仪中进行检测，其中所用毛细管电色谱柱为EP-100-20/45-3-C18，柱温为常温，流动相为甲醇和磷酸氢二钾水溶液，该流动相的pH值为4～8，流动相中磷酸氢二钾浓度为5mmol/L～50mmol/L；

梯度洗脱条件为：0～6min，流动相中甲醇含量65%～70%，6～30min，流动相中甲醇含量70%～90%，流动相的流速均为0.04ml/min；

其他检测条件：同时紫外检测波长为240nm，外加分离电压范围为2～10kv。

2.如权利要求1所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述芳香胺为苯胺、2,6-二甲基苯胺、邻甲氧基苯胺、对氯苯胺以及3,3’-二甲基联苯胺。

3.如权利要求2所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述浸泡液的pH值为9。

4.如权利要求3所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述固相萃取柱为EnviTM-Chrom P柱。

5.如权利要求4所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述浸泡液在所述固相萃取柱中的流速为1ml/min。

6.如权利要求5所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述洗脱溶剂为甲醇，且甲醇的用量为6ml。

7.如权利要求1～6任一权利要求所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述流动相pH值为8，该流动相中磷酸氢二钾的浓度为20mmol/L。

8.如权利要求1～6任一权利要求所述的测定水产品接触材料中芳香胺的方法，其特征在于：所述外加分离电压为6kv。