CN104837485A - 血管紧张素在治疗脑部病况中的用途 - Google Patents

Abstract

除了其他方面，本申请还提供了用于治疗脑部病况的方法和组合物。在一些实施方式中，所述方法包括通过静脉内或皮下给药途径给予患有或易于出现脑部病况的对象血管紧张素(1-7)肽。

Description

血管紧张素在治疗脑部病况中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年10月2日提交的美国临时专利申请序号61/708,793，2012年10月30日提交的美国临时专利申请序号61/720,299的优先权，这两项申请的全部内容均通过引用并入本申请。

背景

中枢神经系统的正常运转在任何动物中都是必需的。特别是脑损伤，如由缺血性或出血性中风导致的，可能具有突发性的和潜在的致死性作用。治疗或预防脑损伤事件的一个障碍是血脑屏障，血脑屏障是脑内相邻毛细血管内皮细胞紧密连接的集合。这些连接阻止了大部分物质穿过，除非其具有较高的脂溶性或能够特异性地被转运通过血脑屏障。结果，在脑内通过常规优选途径如通过静脉内或皮下给药给予治疗剂并观察到治疗效果是极其困难的。

发明概述

除了其他方面，本发明提供了用于治疗脑部病况的方法和组合物，所述脑部病况包括但不限于：中风、血管性痴呆和外伤性脑损伤。如下述章节的实施例中描述的，本发明部分地基于令人吃惊的发现，全身给予(如皮下给予)血管紧张素(1-7)肽(例如PanCyte)能够在大鼠缺血性中风模型中改善神经和运动功能。在本发明之前，人们认为血管紧张素(1-7)不能穿过血脑屏障，因而不得不进行脑血管内(ICV)给药或使用复杂的方法如使用引起Ang(1-7)过表达的慢病毒感染的造血干细胞，其能够穿过血脑屏障。Mecca等，Cerebroprotection by Angiotensin-(1-7)in Endothelin-1-Induced Ischaemic Stroke(血管紧张素-(1-7)在内皮素-1-诱导的缺血性中风中的脑部保护作用),(2011)Exp Physiol.201196(10):1084-1096。尚无研究人员发现血管紧张素(1-7)肽或非肽血管紧张素-(1-7)激动剂通过全身途径(例如皮下或静脉内)给药能够到达脑内特别是受损的脑组织而达到治疗水平。

在一些实施方式中，本发明提供了治疗脑部病况的方法，所述方法包括通过全身给药给予患有或易于出现脑部病况的对象血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，适于本发明的全身给药是静脉内给药。在一些实施方式中，适于本发明的全身给药是皮下给药。在一些实施方式中，适于本发明的全身给药是口服给药。在一些实施方式中，适于本发明的全身给药不包括脑室内给药。在一些实施方式中，所述脑内病况选自中风、血管性痴呆和外伤性脑损伤。在一些实施方式中，所述中风是缺血性中风。在一些实施方式中，所述中风是出血性中风。

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽通过连续输注给药。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽在给药间隔给药。例如，所述血管紧张素(1-7)肽可以每日3次、每日2次、每日1次、每周2次、每周1次、每月3次、每月2次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每月1次、每两个月1次、每3个月1次、每4个月1次、每5个月1次、每6个月1次给药或以不定期的间隔给药。

可以预见到各种实施方式可能使用不同量的血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，给予的血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-1,000μg/kg/天(例如，范围是约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-500μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-100μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-60μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/kg/天。

还可以预见到可以将不同的血管紧张素(1-7)肽用于不同实施方式中。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽是SEQ ID NO:1的功能等价物。在一些实施方式中，所述功能等价物是线形肽。在一些实施方式中，所述线形肽包含包括在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中至少4个、至少5个或至少6个氨基酸的序列，其中所述至少4个、5个或6个氨基酸保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置。在一些实施方式中，所述线形肽含有4-25个氨基酸。在一些实施方式中，所述线形肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。在一些实施方式中，所述线形肽含有在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中，所述线形肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ ID NO:6)。

在一些实施方式中，所述功能等价物是环肽。在一些实施方式中，所述环肽包含氨基酸之间的连接。在一些实施方式中，所述连接位于天然存在的血管紧张素(1-7)的Tyr⁴和Pro⁷位置对应的残基。在一些实施方式中，所述连接是硫醚桥。在一些实施方式中，所述环肽包含以其他方式与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述环肽包含正亮氨酸(Nle)，其取代了天然存在的血管紧张素(1-7)中Val³的位置。在一些实施方式中，所述环肽是具有下式结构的4,7-环化血管紧张素(1-7)：Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ ID NO:22)。在一些实施方式中，所述环肽是具有下式结构的4,7-环化血管紧张素(1-7)：

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种化学修饰以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，所述一种或多种化学修饰包含聚乙二醇化。

在一些实施方式中，本发明提供了治疗脑部病况的方法，所述脑部病况包括但不限于：中风、血管性痴呆和外伤性脑损伤，所述方法包括给予患有或易于出现一种或多种脑部病况的对象血管紧张素(1-7)受体激动剂。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。在一些实施方式中，所述非肽激动剂是具有下述结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

如在本申请中所使用的，术语“约”和“近似”所表达的意义相同。本申请中带有或不带有约/近似的所有数字表示包含相关领域普通技术人员可以理解的任何正常的波动。

下文的详细描述清楚地描述了本发明的其他特征、目的和优势。但应理解，说明本发明实施方式的详细描述仅具有说明性，并不具有限制性。本领域技术人员可以从该详细描述中清楚地理解本发明范围内的各种变化和修改。

附图简要说明

图1显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且给予一些量的PanCyte 14或49天的大鼠的跨步测试(step test)结果的示例性柱状图。

图2显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且给予一些量的PanCyte 14或49天的大鼠的前肢放置测试(forelimb placement test)结果的示例性柱状图。

图3显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且给予一些量的PanCyte 14或49天的大鼠的身体摆动测试(body swing test)结果的示例性柱状图。

图4显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且给予一些量的PanCyte 14或49天的大鼠的神经测试(经改良的神经评分评分量表)结果的示例性柱状图。

图5显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予TXA127、PanCyte或线形PanCyte 28天的大鼠的跨步测试(step test)结果的示例性柱状图。

图6显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予TXA127、PanCyte或线形PanCyte 28天的大鼠的前肢放置测试(forelimb placement test)结果的示例性柱状图。

图7显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予TXA127、PanCyte或线形PanCyte 28天的大鼠的身体摆动测试(body swing test)结果的示例性柱状图。

图8显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予TXA127、PanCyte或线形PanCyte 28天的大鼠的神经测试(经改良的神经评分评分量表)结果的示例性柱状图。

图9显示了在皮下注射给予TXA127、PanCyte或线形PanCyte 28天的动物中比较同侧和对侧之间的血液灌注比以及血管直径的示例性柱状图。

图10显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予PanCyte或AVE0991 28天的大鼠的跨步测试(step test)结果的示例性柱状图。

图11显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予PanCyte或AVE0991 28天的大鼠的前肢放置测试(forelimb placement test)结果的示例性柱状图。

图12显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予PanCyte或AVE0991 28天的大鼠的身体摆动测试(body swing test)结果的示例性柱状图。

图13显示了比较经暂时性脑部中动脉栓塞处理并且皮下给予PanCyte或AVE0991 28天的大鼠的神经测试(经改良的神经评分评分量表)结果的示例性柱状图。

定义

为了使本发明更加易于理解，下面先对某些术语进行了定义。下列术语和其他术语的其他定义将在说明书中阐述。

动物：本申请中使用的术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方式中，非人动物为哺乳动物(如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆体。

近似或约：本申请中使用的术语“近似”或“约”适用于一个或多个目标值，是指与所述参考值近似的数值。在某些实施方式中，除另有说明或从上下文中显而易见(除了当这些数字将超过可能数值的100％时)，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任意方向(高于或低于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小幅度以内的数值范围。

生物活性：本申请使用的短语“生物活性”是指在生物系统中特别是在生物体中具有活性的任何试剂的一种特性。例如，给予生物体的一种试剂对此生物体具有生物作用，则认为此试剂具有生物活性。在特定的实施方式中，若一种肽具有生物活性，具有所述肽至少一种生物活性的肽的部分一般称为“生物活性”部分。在某些实施方式中，若某种肽并不具有内在的生物活性，但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用，则认为这种肽具有生物活性。

脑部病况——如在本申请中使用的，“脑部病况”是指导致对象脑部的至少一部分出现损伤和/或功能障碍的任意疾病、病症或事件。脑部病况的非限制性示例包括：中风(缺血性和出血性)、血管性痴呆和外伤性脑损伤。

运载体或稀释剂：在本申请中所用的术语“运载体”和“稀释剂”是指用于制备药物制剂的药学上可接受的(如给予人体时安全无毒)的运载体或稀释用的物质。示例性的稀释剂包含无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。

剂型：在本申请中使用的术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理上不连续单位。各单位含有经预先确定的活性物质的量，经计算此数量能够产生所需的治疗作用。但是应理解，组合物的总剂量应由主治医师在合理的医学判断范围内决定。

剂量方案：作为在本申请中使用的术语“剂量方案”(或“治疗方案”)指独立地给予对象的单位剂量(通常是一个以上)的集合，其通常由时间段所分隔。在一些实施方式中，给定的治疗剂具有推荐的剂量方案，其可能涉及一个或多个剂量。在一些实施方式中，剂量方案包含多个剂量，其彼此之间由相同长度的时间段所分隔；在一些实施方式中，剂量方案包含多个剂量和分隔各剂量的至少两个不同的时间段。在一些实施方式中，在预定的时间段内连续地给予所述治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂每日一次(QD)或每日两次(BID)给药。

功能等价物或衍生物：在本申请中使用的术语“功能等价物”或“功能衍生物”，是指在氨基酸序列的功能衍生物的范围内保有与原始序列基本相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等价物可以是天然衍生物或合成制备物。示例性的功能衍生物包含具有一个或多个氨基酸取代、缺失或增加的氨基酸序列，条件是仍保持所述蛋白的生物活性。用于取代的氨基酸与被取代的氨基酸理想地具有相似的理化性质。理想的相似理化性质包含电荷、蓬松度、疏水性、亲水性等的相似性。

改善、增加或减少：在本申请中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”，或在语法上等同的术语，是指与基线测量结果有关的数值，所述基线测量如本申请所述的在开始治疗前同一对象的测量，或在未接受本申请所述的治疗的对照对象(或多个对照对象)中的测量。“对照对象”是指与接受治疗的对象患有相同形式的疾病、并与接受治疗的对象年龄大约相同的对象。

体外：在本申请中使用的术语“体外”是指在人工环境(如在试管或反应器、在细胞培养物等)中发生的事件，而非在多细胞生物体中发生的事件。

体内：在本申请中使用的术语“体内”是指在多细胞生物体(例如人体和非人动物)中发生的事件。在基于细胞的系统中，此术语可用于表示在活细胞(相对于如体外系统)中发生的事件。

分离的：在本申请中使用的术语“分离的”是指(1)从在最初生产时具有相关性(不论是在自然界还是和/或在实验环境中)的至少部分成分中分开的物质和/或实体，和/或(2)人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。经分离的物质和/或实体可以是从与其初始相关的其他成分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％中分开。在一些实施方式中，经分离的试剂的纯度超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本100％或100％。如本申请中所使用的，若一种物质基本不含其他成分，则认为所述物质是“纯的”。本申请中使用的术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。

阻止：在本申请中使用的术语“阻止”或“防止”当与疾病、病症和/或病况的发生连用时，指降低发展成所述疾病、病症和/或病况的风险。参见“风险”的定义。

多肽：在本申请中使用的术语“多肽”指彼此之间通过肽键连接在一起的氨基酸的序列链。该术语用于指任意长度的氨基酸链，但是本领域的普通技术人员将理解该术语不限于指长链，其还可以指包含通过肽键连接的两个氨基酸的最短链。如本领域技术人员所公知的，可以对多肽进行处理和/或修饰。

蛋白：在本申请中使用的术语“蛋白”指作为离散的单元发挥功能的一个或多个多肽。如果单一多肽是离散的功能单元并且不需要与其他多肽永久的或暂时性的物理结合以形成离散的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用。如果所述离散的功能单元由在物理上彼此结合的一个以上多肽组成，则该术语“蛋白”指在物理上偶联的并且作为离散的单元在一起发挥功能的多个多肽。

风险：结合上下文理解，疾病、病症和/或病况的“风险”包括特定个体将发展未疾病、病症和/或病况(例如中风)的可能性。在一些实施方式中，风险以百分率表示。在一些实施方式中，风险从0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90至达到100％。在一些实施方式中，风险以相对于与对照样品或对照样品的组相关的风险的风险表示。在一些实施方式中，对照样品或对照样品的组具有已知的疾病、病症、病况和/或事件(例如中风)的风险。在一些实施方式中，对照样品或对照样品的组来自于与特定个体具有可比性的个体。在一些实施方式中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。

稳定性：在本申请中使用的术语“稳定的”指在较长的一段时间内治疗剂维持其治疗效果(例如全部或大部分其预期的生物活性和/或生理化学完整性)的能力。可以在较长的一段时间内(例如至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更长)评估治疗剂的稳定性和药物组合物维持这种治疗剂稳定性的能力。在某些实施方式中，已将如本申请所述的药物组合物制剂以使得在制剂中的一种或多种治疗剂能够稳定，或者延缓或阻止其降解。在制剂背景下，稳定的制剂是在贮存和加工(如冻/融、机械混合和冻干)期间在其中的所述治疗剂基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性。

对象：在本申请中使用的术语“对象”是指人或任何非人动物(如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包含产前和产后的形态。在许多实施方式中，对象是人类。对象可为患者，即去往医师处诊断或治疗疾病的人。本申请中使用的术语“对象”与“个体”或“患者”的用法可互换。对象可以患有或易患有某种疾病或病症，但可能显示或可能未显示出所述疾病或病症的症状。

基本上：在本申请中使用的术语“基本上”是指显示出目标特性或属性的完全或接近完全的范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象极少(若有)达到完全和/或向完全趋近，或者达到或避免绝对结果。因此，本申请中使用术语“基本上”体现了许多生物和化学现象中固有完全性的潜在的缺乏。

患有：个体“患有”疾病、病症和/或病况是指所述个体已确诊或显示出所述疾病、病症和/病况的一种或多种症状。

易患：个体“易患”疾病、病症和/或病况是指所述个体尚未确诊所述疾病、病症和/病况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或病况的个体可能未显示出所述疾病、病症和/或病况的症状。在一些实施方式中，易患疾病、病症、病况或事件(例如缺血性中风)的个体可能具有下列一种或多种特征：(1)与所述疾病、病症和/或病况的发展相关的基因突变；(2)与所述疾病、病症和/或病况的发展相关的基因多态性；(3)与所述疾病、病症和/或病况相关的蛋白表达和/或活性的增加和/或下降；(4)与所述疾病、病症、病况和/或事件的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)已进行移植、计划进行移植或需要移植。在一些实施方式中，“易患”疾病、病症和/或病况的个体将发展为该疾病、病症和/或病况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或病况的个体将不会发展为该疾病、病症和/或病况。

治疗有效量：本申请中使用的术语治疗剂的“治疗有效量”是指给予患有或易患疾病、病症和/或病况的对象的量足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或病况的症状的发作。本领域的普通技术人员应理解治疗有效量通常是以包含至少一个单位剂量的给药方案来给药的。

治疗：本申请中使用的术语“治疗”“处理”或“医治”是指用于使特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟发作、减轻严重程度和/或降低发生率的任何方法。可以向未显示出疾病体征和/或仅显示出疾病早期体征的对象给予治疗，以降低对象发展成与疾病相关的病理学的风险。

某些实施方式的详述

除了其他以外，本发明提供了用于治疗或降低由损伤或脑组织病症导致的脑部病况风险的改进的组合物和方法。

下列章节中详述了发明的各个方面。章节的使用并不意味着限制发明。各章节可适用于发明的任意方面。在本发明中，除另有说明，使用“或者”表示“和/或”。

脑部病况

中风

脑部对其氧气供应的扰乱非常敏感。持续仅几秒钟的缺氧和缺血就能够引起症状，如果该状况持续数分钟，则其可能会导致不可逆的神经损伤。因此，在美国中风是导致严重的、长期残疾和导致死亡的重要原因。中风也是医药行业重要的负担，据估计每年用于由中风导致的残疾的卫生事业费总计约530亿美元。

有两种类型的中风：缺血性和出血性。缺血性中风涉及向脑组织供血的一个或多个血管的阻塞，例如由动脉粥样硬化血栓或栓塞导致的阻塞。缺血性中风(脑缺血)占全部中风的约88％，这使得缺血性中风成为最常见的脑血管损伤类型之一。脑内的缺血性病况会迅速导致神经元死亡，其通常会导致永久性的感觉运动缺陷。在本申请中将出血性中风定义为在颅穹窿中的任意位置血液的蓄积。出血性中风可能是由多种原因引起，包括由扩张性血肿导致的损伤，扩张性血肿能够破坏组织或使组织变形。

在缺血性和出血性中风的治疗中的主要障碍是对将到达受影响组织的治疗剂的递送。由于血脑屏障的作用，仅少数化合物能够进入其中并作用于脑组织。过去，使用脑室内(ICV)递送的方法递送化合物如血管紧张素(1-7)。令人惊讶的是，本发明的实施方式，包括下文所述的示例性血管紧张素(1-7)肽能够穿过血脑屏障，而无需复杂的递送系统如经修饰的干细胞等。而且，在一些实施方式中，可以通过静脉内或皮下途径递送血管紧张素(1-7)肽。

血管性痴呆

血管性痴呆是位列阿尔茨海默氏病之后的第二常见的痴呆形式。血管性痴呆可能是脑内血液输送的问题引起，如由缺血性或出血性中风或由引起脑内出现损伤的其他原因导致。造成血管性痴呆的其他原因包括淀粉样脑血管病、高胆固醇血症、糖尿病或心血管病。还将由一种或多种中风引起的痴呆称为“单一梗塞痴呆”或“多重梗塞痴呆”，取决于导致其的根本原因。

对血管性痴呆的治疗主要集中在通过使用抗血小板药物和改变生活习惯(改变饮食、戒烟等)阻止进一步的脑血管损伤。还探索将胆碱酯酶抑制剂如加兰他敏用于这种临床情况，但是这种类型的治疗关注于维持脑内乙酰胆碱的功能，其并不会恢复或产生改善的和持续的血液供应。因此，本发明的实施方式代表了一种新型静脉内和皮下疗法，所述疗法的目标是改善所述疾病的潜在病因而非控制症状或将剩余组织来源最大化。

外伤性脑损伤

外伤性脑损伤(TBI)是当突发引起脑损伤的外伤时发生的一种形式的获得性脑损伤。当头部突然和猛烈地撞击物体时(反之亦然)，或当物体刺穿头骨并进入脑组织时能够导致TBI。TBI的症状可以是轻度、中度或重度，这取决于脑损伤的程度。轻度TBI患者可能仍具有意识或者可能经历几秒钟或几分钟的意识丧失。轻度TBI的其他症状包括头痛、混乱、头晕目眩、头晕、视力模糊或眼部疲劳、耳鸣、口中有不好的味道、疲劳或嗜睡、睡眠类型改变、行为或情绪改变以及记忆力、注意力、关注力或思考能力出现问题。中度或重度TBI患者可能显示出这些相同的症状，但是还可能具有更加严重的或不停的头痛、反复恶心或呕吐、抽搐或癫痫发作、不能从睡眠中醒来、单眼或双眼瞳孔扩散、言语不清、四肢无力或麻木、协调障碍以及混乱、不安或躁动加重。

对于TBI的治疗主要集中在阻止进一步的损伤或并发症上。在治疗TBI中主要关注的方面包括保证脑部和身体其他部位适宜的氧气供应，维持适当的血流和控制血压。通常，TBI患者在病情稳定后的主要治疗为涉及在物理治疗、职业治疗、言语/语言治疗、心理/精神病学和社会支持方面个体化定制治疗程序的康复疗法。本发明的实施方式为这些患者提供了一种新的疗法。

血管紧张素(1-7)肽

本申请中所用的术语“血管紧张素(1-7)肽”同时是指天然存在的血管紧张素(1-7)和天然存在的血管紧张素(1-7)的任意功能等价物、类似物或衍生物。本申请中使用的术语“肽”和“多肽”是可互换使用的术语并且指由肽键键合在一起的两个或更多个氨基酸。在本申请中使用的术语“肽”和“多肽”包括线形肽和环肽。术语“血管紧张素(1-7)”、“血管紧张素-(l-7)”和“Ang-(1-7)”可互换使用。

天然存在的血管紧张素(1-7)

天然存在的血管紧张素(1-7)(也称为Ang-(1-7))是如下所示的七个氨基酸的肽：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)

其是肾素-血管紧张素系统的一部分并且是从前体(也称为血管紧张素原)转换生成的，血管紧张素原是一种主要由肝脏组成性产生并释放至循环中的α-2-球蛋白。血管紧张素原是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族的成员并且也已知血管紧张素原是肾素底物。人血管紧张素原的长度为452个氨基酸，但其他物种具有各种大小的血管紧张素原。通常，前12个氨基酸是对血管紧张素活性最重要的：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰-Val¹¹-Ile¹²(SEQ ID NO:2)

不同类型的血管紧张素可通过各种酶的作用形成。例如，血管紧张素(1-7)可通过血管紧张素转化酶2(ACE 2)的作用生成。

血管紧张素(1-7)是Mas受体的内源性配体。Mas受体是包含七个跨膜区的G蛋白偶联受体。本申请中使用的术语“血管紧张素(1-7)受体”包含G蛋白偶联的Mas受体。

本申请中使用的术语“天然存在的血管紧张素(1-7)”包含由天然来源纯化的任意血管紧张素(1-7)肽以及与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列的任意重组产生或化学合成的肽。

血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物

在一些实施方式中，适用于本发明的血管紧张素(1-7)肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物。本申请中使用的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物是指与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列，并基本保留了与天然存在的血管紧张素(1-7)相同或相似的活性的任意肽。例如，在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物具有使用本申请中所述或本领域中已知的方法测量的促血管生成活性，或例如一氧化氮释放、血管舒张、内皮功能改善、抗利尿的活性，或本申请中讨论的其他对血管生成可产生积极影响的性质之一。在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物可连接至或活化血管紧张素(1-7)受体(如G蛋白偶联的Mas受体)，如根据使用本申请中所述或本领域公知的多种检测所测量的。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也是指血管紧张素(1-7)的类似物或衍生物或功能等价物。

通常，血管紧张素(1-7)的功能等价物与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相似的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的血管紧张素(1-7)的功能等价物包含天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的七个氨基酸中的至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个、至少7个)氨基酸的序列，其中所述至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个或至少7个)氨基酸保持了他们在天然存在的血管紧张素(1-7)中的相对位置和/或间距。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也包含含有与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列具有至少50％(如至少60％、70％、80％或90％)一致性序列的任意肽。可通过氨基酸序列比对来确定氨基酸序列的一致性百分比。可按照本领域技术人员的多种方式进行氨基酸序列比对，例如使用公众可获得的电脑软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员能够确定用于测量比对的适宜参数，包括获得要对比的序列全长的最大比对所需的任意算法。优选WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列一致性(Altschul等，Methods in Enzymology266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用数个检索参数，大部分设置为缺省值。可调参数的数值设置如下：重叠跨距＝1，重叠分数＝0.125，字串阈值(word threshold)(T)＝11。HSP评分(S)和HSP S2参数为动态的数值，由程序自身根据特定序列的组成来确定，然而最小值可以被调整并按上文所述来设置。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物包含在天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物可通过取代、增加和/或缺失来改变氨基酸序列来获得。例如，天然存在的血管紧张素(1-7)(SEQ ID NO:1)的序列中的一个或多个氨基酸残基可被具有相似极性的另一个氨基酸取代，作为功能等价物，产生沉默改变。序列内氨基酸的取代可选择此氨基酸所属类别的其他成员。例如正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。无电荷极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。负电荷(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可分类为非极性氨基酸家族或无电荷(中性)极性氨基酸家族。一个氨基酸家族内的取代一般称为保守性取代。例如，肽抑制剂的氨基酸序列可被修饰或取代。

血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物和衍生物示例在下文标题为“示例性血管紧张素(1-7)肽”的章节中描述。

血管紧张素(1-7)肽可以为任何长度。在一些实施方式中，根据本发明的血管紧张素(1-7)肽可以含有例如4-25个氨基酸(如4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7个氨基酸)。在一些实施方式中，所述线形肽含有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种修饰，以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，适宜的修饰选自聚乙二醇化、乙酰化、糖基化、生物素化、使用D-氨基酸和/或非天然氨基酸取代，以及/或肽的环化。

本申请中使用的术语“氨基酸”最为宽泛的含义是指可掺入一条多肽链的任何化合物和/或物质。在某些实施方式中，氨基酸具有H₂N-C(H)(R)-COOH的通式结构。在某些实施方式中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，氨基酸是合成或非天然的氨基酸(例如，α,α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸)；在一些实施方式中，氨基酸为d-氨基酸；在某些实施方式中，氨基酸为l-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中常见的二十种标准氨基酸的任意一种，包括经天然掺入肽中的l-氨基酸和d-氨基酸。“非标准”或“非常规氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是否合成制备或由自然来源获得的。本申请中使用的“合成或非天然氨基酸”包含经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。肽中包含羧基末端和/或氨基末端氨基酸在内的氨基酸，可进行甲基化、酰胺化、乙酰化修饰，和/或使用可改变肽的循环半衰期而对其活性没有不良影响的其他化学基团取代修饰。非常规或非天然氨基酸的示例包括但不限于瓜氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基苏氨酸(MeBmt)、N-甲基-亮氨酸(MeLeu)、氨基异丁酸、抑胃酶氨酸和N-甲基-丙氨酸(MeAla)。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”的用法可与“氨基酸残基”互换，可指游离氨基酸和/或肽上的氨基酸残基。从使用该术语的上下文可显而易见该术语是指代游离氨基酸还是肽的残基。

在某些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含一个或多个L-氨基酸、D-氨基酸和/或非天然氨基酸。

除了仅仅包含天然存在的氨基酸的肽以外，本发明还包含模拟肽(peptidomimetic)或肽类似物。制药业常使用肽类似物作为与模板肽具有类似性质的非肽药物。这种非肽化合物被称为“肽模拟物”或模拟肽(Fauchere等，Infect.Immun.54:283-287(1986)；Evans等，J.Med.Chem.30:1229-1239(1987))。与具有疗效的肽结构上有关的肽模拟物可用作生产等价物，或者产生增强的疗效或预防效果。一般而言，模拟肽与例如天然存在的受体结合多肽的范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物或药理学活性的多肽)结构相似，但其中一个或多个肽连接被例如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH₂SO-、-CH(OH)CH₂-、-COCH₂-等连接任选地取代，取代的方法是本领域熟知的(Spatola,Peptide Backbone Modifications(肽骨架修饰),Vega Data,1(3):267(1983)；Spatola等，Life Sci.38:1243-1249(1986)；Hudson等，Int.J.Pept.Res.14:177-185(1979)；和Weinstein.B.,1983,Chemistry and Biochemistry,ofAmino Acids,Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学),Weinstein编,纽约的MD公司(Marcel Dekker))。这种肽模拟物与天然存在的多肽相比可以具有显著的优势，包括生产成本更经济、化学稳定性提高、药理性质(如半衰期、吸收、效能、有效性等)增强，抗原性降低等。

血管紧张素(1-7)肽也包含其他类型的肽衍生物，所述衍生物包含不是肽的正常组成部分的附加化学部分，但前提是所述衍生物保持了所需的肽功能活性。此类衍生物的示例包括(1)氨基末端或另一个游离氨基的N酰基衍生物，其中所述酰基可以是链烷酰基(alkanoyl)(如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(如苯甲酰基)或保护基团如F-moc(芴基甲基-O-CO-)；(2)羧基末端或另一个游离羧基或羟基的酯；(3)羧基末端或另一个游离羧基的酰胺，所述酰胺由与氨或适当的胺反应而生成；(4)磷酸化的衍生物；(5)与抗体或其他生物配体偶联的衍生物及其他类型的衍生物；以及(6)与聚乙二醇(PEG)链偶联的衍生物。

Ang-(1-7)肽可通过本领域技术人员公知的任意肽合成方法来获得，包括合成(例如专用(exclusive)固相合成、部分固相合成、片段缩合法、经典溶液合成、自然化学连接)以及重组技术。例如，肽和肽的衍生物可以通过固相肽合成法来获得，简要而言，此法由将C末端氨基酸的羧基偶联至树脂(如二苯甲基胺树脂、氯甲基化树脂、羟甲基树脂)和连续添加N-α保护的氨基酸来组成。保护基团可以为本领域公知的任意这种基团。在向不断增长的链中增加各个新的氨基酸之前，去除此前向链中添加的氨基酸的保护基团。此种固相合成已在下列文献中公开：Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964)；Vale等，Science 213:1394-1397(1981)，美国专利号4,305,872和4,316,891，Bodonsky等Chem.Ind.(伦敦),38:1597(1966)；以及Pietta和Marshall，Chem.Comm.650(1970)，由Lubell等，在“Peptides”Science of Synthesis(“肽”合成的科学)21.11,Chemistry of Amides(酰胺化学).斯图加特的Thieme公司,713-809(2005)中进行的技术综述。向适当的树脂上偶联氨基酸也是本领域公知的方法，并在美国专利号4,244,946(在Houver-Weyl,Methods of Organic Chemistry(有机化学方法)，卷E22a.Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(肽和模拟肽的合成),Murray Goodman主编，斯图加特的Thieme公司纽约2002进行了综述)中公开。

除另有定义以外，本文中使用的科学和技术术语以及命名法与本发明相关的领域普通技术人员通常理解的意义相同。总体而言，细胞培养、感染、分子生物学方法等过程是本领域中的常用方法。这种标准技术可在参考手册如Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(现在分子生物学指南)，纽约的WI公司(WileyInterscience),2001；以及Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress),2001中找到。

在制备Ang-(1-7)肽的任何过程中，可能需要保护所有相关分子的敏感性反应基团。可通过常规的保护基团来达到此种目的，所述保护基团例如在下列文献中所述的保护基团：T.W.Greene&P.G.M.Wuts的Protective Groups In Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，1991,纽约的约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)；以及Sewald和Jakubke的Peptides:chemistry and Biology(肽：化学和生物学)，2002,魏茵海姆的Wiley-VCH公司，第142页。例如，α氨基保护性基团包含酰基型保护性基团(如三氟乙酰基、甲酰基、乙酰基)、脂肪族聚氨酯保护性基团(如t-叔丁氧羰基(BOC)、环己氧基羰基)、芳香族聚氨酯型保护性基团(例如芴基-9-甲氧基-羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、Cbz衍生物)和烷基型保护性基团(如三苯甲基、苄基)。氨基酸侧链保护性基团包含苄基(对于Thr和Ser)，Cbz(Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys)、甲基乙基、环己基(Asp、His)、BOC(Arg、His、Cys)等。所述保护基团可使用本领域公知方法在方便的后续阶段中去除。

此外，Ang-(1-7)肽可按照FMOC方案在有机相中使用保护性基团合成。理想的是，所述肽使用高效液相(HPLC)在C18色谱柱中以70％的收率纯化，并使用10％-60％的乙腈梯度洗脱。肽的分子量可通过质谱法进行确证(在Fields G.B.的“Solid-PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)”Methods in Enzymology(酶学方法).卷289,学术出版社(Academic Press),1997中进行了综述)。

或者，Ang-(1-7)肽可在重组系统中使用例如编码多肽的多核苷酸序列来制备。应理解，多肽可以包含在同一多肽中一种以上的上述修饰。

虽然肽在体外可有效地引起生物学活性，但所述肽的体内有效性可能因蛋白酶的存在而下降。血清蛋白酶具有特异性的底物要求。底物必须同时具有L氨基酸和以供断裂的肽键。此外，肽链端解酶代表了在血清中蛋白酶活性的最主要成分，肽链端解酶通常对肽的第一个肽键产生作用，并且需要游离的N末端(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。鉴于此，使用经修饰的肽常更有优势。经修饰的肽保留了原始L氨基酸肽产生血管紧张素(1-7)所需生物活性的结构特性，但具有不易被蛋白酶和/或肽链端解酶断裂的优势。

可使用相同类型的D氨基酸系统性取代共有序列中的一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)以生成更为稳定的肽。因此，本发明中的肽衍生物或模拟肽可全部为L、全部为D或由D和L混合的、具有正向序列或反向序列的肽。N末端或C末端D氨基酸的存在增加了肽的体内稳定性，因为肽酶不能使用D氨基酸作为底物(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。反向D肽是指包含D氨基酸的肽，所述肽以与包含L-氨基酸的肽的相反的序列来排列。因此L-氨基酸肽的C末端残基变为D氨基酸肽的N末端，以此类推。反向D肽保留了与L氨基酸肽相同的二级构象，以及因此具有的相似活性，但在体外和体内对酶降解的抗性更高，因此比原始肽具有更强的疗效(Brady和Dodson,Nature 368:692-693(1994)；Jameson等，Nature368:744-746(1994))。类似地，可使用标准方法来生成反向L肽，其中母体肽的C末端取代反向L肽的N末端。可以预见的是，不具有显著二级结构(如短肽)的L氨基酸肽的反向L肽保留了与L氨基酸肽相同的间距和侧链构象，因此常与原始的L氨基酸肽具有相似的活性。此外，反向肽可包含L氨基酸和D氨基酸的结合。氨基酸间的间距以及侧链的构象可以得到保留，从而产生与原始的L氨基酸肽相似的活性。

另一种通过作用于肽的N末端或C末端残基产生肽酶抗性的有效方法是在肽末端添加化学基团，以使得经修饰的肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在肽的一个或两个末端进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-末端糖基化，已显示出增加了人血清中肽的稳定性(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。其他增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于，添加N-末端烷基，所述烷基由从一到二十个碳的低级烷基组成，例如乙酰基，和/或添加C末端酰胺或经取代的酰胺基团。特别地，本发明包括经修饰的肽，所述肽由带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺基团的肽组成。

在肽的子序列中使用非天然存在的氨基酸取代天然氨基酸也可使肽产生蛋白水解抗性。此种取代如通过肽链端解酶作用于N末端而不影响生物活性使肽产生蛋白水解抗性。非天然存在的氨基酸的例子包含α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-氨基酸和β-甲基氨基酸。在本发明中有用的氨基酸类似物可包括但不限于β-丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、o-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和其他非常规氨基酸。此外，使用非天然存在的氨基酸合成肽是本领域的常规技术。

此外，可使用本领域熟知的方法产生包含共有序列的或基本相同的共有序列变体的限制性肽(constrained peptide)(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387-418(1992))。例如，限制性肽可通过添加能够形成二硫桥的半胱氨酸残基而生成环肽来产生。可将环肽构建成没有游离N或C末端。因此尽管这种肽易于被不能剪切肽末端的肽链内切酶水解，但是不易于被肽链端解酶水解。具有N末端或C末端D氨基酸的肽的氨基酸序列以及环肽的氨基酸序列通常分别与其相应肽的序列相同，除了存在N末端或C末端的D氨基酸残基或其环状结构以外。

环肽

在一些实施方式中，天然存在的Ang(1-7)的功能性等价物、类似物或衍生物是环肽。本申请中使用的环肽具有两个非相邻残基间的分子内共价键。此分子内的键可以为主链与主链、侧链与主链或侧链与侧链间的键(即线形肽的末端官能团和/或末端或内侧残基的侧链官能团可以连接形成环化)。典型的分子内键包括二硫键、酰胺键和硫醚键。多种环化多肽的方法是本领域熟知的，可以对这种肽进行多种其他修饰。对于一般性的讨论，参见国际专利公开号WO 01/53331和WO 98/02452，其内容均通过引用并入本申请。此类环化键合和其他修饰也可用于本发明的环肽和衍生化合物。

本文中所述的环肽可包含L氨基酸残基、D氨基酸残基或其任意组合。氨基酸可以是天然或非天然来源，只要分子中存在至少一个氨基和至少一个羧基；一般优选α和β氨基酸。环肽也可以含有一种或多种稀有氨基酸(例如4-羟脯氨酸或羟赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物，例如具有C-末端羧酸酯酯化(如苄基、甲基或乙基酯)或酰胺化和/或具有N末端氨基修饰(如乙酰化或烷氧基羰基化)的氨基酸，带有或不带有多种侧链修饰和/或取代(如甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基化等)。适当的衍生物包含具有N-乙酰基(代表环化前的线形肽N末端的氨基被乙酰化)和/或C末端酰胺基(即环化前的线形肽的羧基末端被酰胺化)的氨基酸。环肽中可存在的普通氨基酸以外的残基包括但不限于青霉胺、β,β-四亚甲基半胱氨酸、β,β-环戊烷半胱氨酸、β-巯基丙酸、β,β-环戊烷-β-巯基丙酸、2-巯基苯、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、α-氨基己二酸、间-氨基甲基苯甲酸以及α,β-二氨基丙酸。

在合成带有或不带有N-乙酰化和/或C-酰胺化的线形肽后，可采用本领域技术人员熟知的任意多种技术来进行环化。在一个实施方式中，在反应性的氨基酸侧链间产生键合。例如，可通过任意多种方法使肽氧化使得包含两个含有巯基残基的线形肽形成二硫桥。在一种此类方法中，可使用碱性或中性的水性介质，在数天时间内，通过巯基的空气氧化产生二硫连接。对所用的肽进行高度稀释使得聚集和分子间副反应最小化。或者，使用强氧化剂如I₂和K₃Fe(CN)₆来形成二硫连接。本领域的那些普通技术人员将理解必须谨慎操作以防止将Met、Tyr、Trp或His敏感侧链氧化。在进一步的实施方式中，可通过形成酰胺键完成环化。例如，可在末端官能团(即环化前的线形肽的氨基末端和羧基末端)间形成肽键。在另一个此类的实施方式中，线形肽含有D-氨基酸。或者，可以通过带有或不带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺的、连接一个末端和一个残基侧链或使用两个侧链来实现环化。能够形成内酰胺键的残基包含赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、α-氨基己二酸、间-氨基甲基苯甲酸、α,β-二氨基丙酸、谷氨酸或天冬氨酸。形成酰胺键的方法通常为本领域熟知。在一个此类方法中，碳二亚胺介导的内酰胺的形成可以通过羧酸与DCC、DIC、ED AC或DCCI反应，以形成O-酰基脲，然后O-酰基脲能够立即与游离氨基反应来完成环化。或者，可使用叠氮化物的方法完成环化，其中反应性的叠氮化物中间体可由烷基酯通过酰肼产生。或者，可以使用经活化的酯类来完成环化。酯类的烷氧基碳上存在吸电子取代基增加了酯对氨解的敏感性。对-硝基苯酚、N-羟基化合物以及多卤代苯酚的酯的高反应性使得这些“活性酯”可用于合成酰胺键。在进一步的实施方式中，在含巯基残基侧链和适当衍生后的α-氨基酸之间可形成硫醚连接。举例如下，赖氨酸侧链可通过碳二亚胺偶联的方法(DCC、EDAC)被偶联至溴乙酸，然后与上文所述的任何包含巯基残基的侧链反应来形成硫醚连接。为了形成二甲基二硫醚(dithioether)，任意两种含巯基侧链可与二溴乙烷和二异丙胺在DMF中反应。

示例性的血管紧张素(1-7)肽

在某些方面，本发明提供了线形血管紧张素(1-7)肽。如上文所述，天然存在的血管紧张素(1-7)的结构如下：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)

可以使用下述序列表示本发明的肽和肽的类似物：

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Xaa⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Xaa⁷(SEQ ID NO:4)。

Xaa¹是任意氨基酸或二羧酸。在某些实施方式中，Xaa¹是Asp、Glu、Asn和Acpc(1-氨基环戊烷羧酸)、Ala、Me₂Gly(N,N-二甲基甘氨酸)、Pro、Bet(甜菜碱、1-羧基-N,N,N-四甲基氢氧化铵五水合物(N,N,N-trimethylmethanaminium hydroxide))、Glu、Gly、Asp、Sar(肌氨酸)或Suc(琥珀酸)。在某些此种实施方式中，Xaa¹是带负电荷的氨基酸，例如Asp或Glu，通常为Asp。

Xaa²是Arg、Lys、Ala、Cit(瓜氨酸)、Orn(鸟氨酸)、乙酰化Ser、Sar、D-Arg和D-Lys。在某些实施方式中，Xaa²是带正电荷的氨基酸例如Arg或Lys，通常为Arg。

Xaa³是Val、Ala、Leu、Nle(正亮氨酸)、Ile、Gly、Lys、Pro、羟Pro(羟脯氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、Acpc或Tyr。在某些实施方式中，Xaa³是脂肪族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Val或Nle。

Xaa⁴是Tyr、Tyr(PO₃)、Thr、Ser、高Ser(高丝氨酸)、氮杂Tyr(氮杂-α¹-高-L-酪氨酸)或Ala。在某些实施方式中，Xaa⁴是羟基取代的氨基酸例如Tyr、Ser或Thr，通常为Tyr。

Xaa⁵是Ile、Ala、Leu、norLeu、Val或Gly。在某些实施方式中，Xaa⁵是芳香族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Ile。

Xaa⁶是His、Arg或6-NH₂-Phe(6-氨基苯丙氨酸)。在某些实施方式中，Xaa⁶是全部或部分带正电荷的氨基酸如Arg或His。

Xaa⁷是Cys、Pro或Ala。

在某些实施方式中，Xaa¹-Xaa⁷中的一个或多个与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa¹-Xaa⁷中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa⁶中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Xaa³是Nle。当Xaa³是Nle时，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中的一个或多个任选地与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同，从而产生氨基酸序列

Asp¹-Arg²-Nle³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:5)。

在某些实施方式中，肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ IDNO:6)或Asp¹-Arg²-Val³-ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方式中，如本申请所述的线形血管紧张素(1-7)肽是具有序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷-Phe⁸-His⁹(SEQ ID NO:22)的肽，其等同于Ang(1-9)的序列。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽是Ang(1-9)的衍生物。对于示例性Ang(1-9)肽，包括Ang(1-9)的衍生物，参见美国专利公开号2012/0172301，其公开的内容通过引用并入本申请。

在一些实施方式中，线形血管紧张素(1-7)肽是具有氨基酸序列Ala¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:23)的肽。来源于SEQ ID NO:23的其他序列可以参见欧洲专利申请2,264,048，其公开的内容通过引用并入本申请。

示例性的环状血管紧张素(1-7)肽

在某些方面，本发明提供了包含连接的环状血管紧张素(1-7)(Ang-(1-7))肽类似物，所述连接例如在Ang的Tyr⁴和Pro⁷位置的相应氨基酸侧链之间的连接。这些肽的类似物一般包含7个氨基酸残基，但也可包含可裂解序列。如下文的更加详细的描述，本发明包括片段和类似物，其中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸(包含片段)取代。此类类似物的一个示例为Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ ID NO:6)，其中Ser⁴与Cys⁷之间形成连接。

虽然下面的章节描述了本发明在位置4和位置7间的硫醚键连接残基，应理解其他连接(如上文所述)可以替代硫醚桥且其他残基可以被环化。硫醚桥也可称为单硫桥，或者在Ala-S-Ala中，称为羊毛硫氨酸桥。包含硫醚桥的肽可由具有下式之一的两个氨基酸形成：

在这些式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地为-H、烷基(如C₁-C₆烷基、C₁-C₄烷基)或芳烷基，其中所述烷基和芳烷基基团任选地被一个或多个卤素、-OH或–NRR’基团取代(其中R和R’独立地为–H或C₁-C₄烷基)。在某些实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶分别独立地为-H或-CH₃，例如全部为–H。

在某些实施方式中，本发明提供了包含如式(I)所示的硫醚桥的血管紧张素类似物或衍生物。通常，R¹、R²、R³和R⁴独立地选自-H和-CH₃。包含如式(I)所示的硫醚桥的肽可通过例如羊毛硫抗生素(lantibiotic)酶或通过二硫化物脱出硫来生产。在一个实施例中，脱出硫的二硫化物可通过位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-半胱氨酸或通过位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-青霉胺形成(参见如Galande,Trent和Spatola(2003)Biopolymers 71,534-551)。

在其他实施方式中，两个氨基酸间的连接可以为式(II)或式(III)中所示的桥。包含如式(II)所示的硫醚桥的肽可以通过例如在位置4的D-高半胱氨酸和在位置7的L-半胱氨酸形成的二硫化物脱出的硫来制备。类似的，包含如式(III)所示的硫醚桥的肽可以通过例如位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-高半胱氨酸形成的二硫化物脱出的硫来制备。

如上文所述，本发明的血管紧张素类似物和衍生物的长度和氨基酸组成不同。本发明的血管紧张素类似物和衍生物优选具有生物活性或者是可通过蛋白水解活化(例如通过裂解2个氨基酸将具有10个氨基酸的血管紧张素(I)转化为活性片段)的无活性的前体分子。血管紧张素类似物或衍生物的大小可以改变，但一般是约5至10个氨基酸，只要所述包含3-7Nle-硫醚-环结构的“核心”五聚体片段包含在内即可。本发明的类似物或衍生物的氨基酸序列可以改变，通常只要其具有生物活性或可通过蛋白水解来活化即可。可使用本领域公知的方法来确定类似物或衍生物的生物活性，所述方法包括放射配体结合研究、体外细胞激活检测和体内实验。例如可参见Godeny和Sayeski,(2006)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.291:C1297-1307；Sarr等，Cardiovasc.Res.(2006)71:794-802；以及Koziarz等，(1933)Gen.Pharmacol.24:705-713。

仅肽的长度可变的血管紧张素类似物和衍生物包括下列：

命名为[Cyc^4-7]Ang(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-7)(Asp¹-Arg²-Val³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷,SEQ ID NO:7)。

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(1-10)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素I(Ang-(1-10))(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰,SEQ ID NO:8)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(1-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素II(Ang-(1-8))(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQ ID NO:9)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(2-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素III(Ang-(2-8))(Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQ ID NO:10)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(3-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素IV(Ang-(3-8))(Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQ ID NO:11)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-7)(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷,SEQ ID NO:12)；以及

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang(1-9)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-9)(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹,SEQ ID NO:13)。

这些类似物可具有式(I)-(III)中所示硫醚桥之一作为Cyc^4-7部分，例如，其中Cyc⁴和Cyc⁷可由式(I)表示，这样其中R¹-R⁴各为–H或–CH₃，通常为-H。

与天然血管紧张素肽的氨基酸序列相比，Cyc^4-7类似物的位置4和位置7处的氨基酸经过修饰以允许引入上文所述的硫醚-环结构。除了血管紧张素类似物的长度以外，位置3、位置4和位置7以外的其他位置的氨基酸可以与天然存在的肽相同或不同，通常前提是只要类似物保留生物功能即可。对于无活性前体类似物，像[Cyc^4-7]血管紧张素(l-10)，生物功能是指类似物对血管紧张素转化酶具有易感性或指片段自身的生物活性这两种情况之一或全部，所述血管紧张素转化酶可将类似物裂解成为生物活性片段(如血管紧张素(1-8)或血管紧张素(1-7))。在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物不具有内在功能但具有抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用。

在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物可由式(IV)表示：

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷(IV,SEQ ID NO:14)

Xaa¹是任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸例如Glu或Asp，更通常为Asp。

Xaa²是带正电荷的氨基酸，例如Arg或Lys，通常为Arg。

Xaa³是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Val。

Cyc⁴与Cyc⁷结合形成硫醚桥。Cyc⁴可以为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc⁴(与Cyc⁷一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH₃，特别是–H。

Xaa⁵是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Ile。

Xaa⁶是His。

Cyc⁷与Cyc⁴结合形成硫醚桥，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc⁷可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc⁷的示例(与Cyc⁴一起)如式(I)、(II)、(III)和(IV)所示。通常，式(I)、(II)、(III)和(IV)中的R基为–H或–CH₃，特别是–H。

在某些实施方式中，一个或多个Xaa¹-Xaa⁶(Cyc⁴和Cyc⁷除外)与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa¹-Xaa⁶中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa⁶中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Cyc⁴和Cyc⁷独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，环状类似物可具有由-Ala⁴-S-Ala⁷-(式(I)，其中R¹-R⁴各为-H)；-Ala⁴-S-Abu⁷-(式(I)：R¹-R³为-H且R⁴为-CH₃)或-Abu⁴-S-Ala⁷-(式(I)：R¹、R³和R⁴为–H且R²为–CH₃)形成的硫醚连接。环状类似物的特定示例包含-Abu⁴-S-Ala⁷-或-Ala⁴-S-Ala⁷-连接。

在某些实施方式中，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQ ID NO:15)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQ ID NO:16)的血管紧张素(1-7)类似物，所述类似物由下面的结构图表示：

在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物可由下面的式(V)表示：

Xaa¹-Xaa²-Nle³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷-Xaa⁸-Xaa⁹-Xaa¹⁰(V,SEQ ID NO:17)

如上文所述，Xaa¹、Xaa²、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰中的一个或多个在某些实施方式中缺失。例如，(1)Xaa¹⁰缺失，(2)Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(3)Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(4)Xaa¹缺失，(5)Xaa¹和Xaa¹⁰缺失，(6)Xaa¹、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(7)Xaa¹、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(8)Xaa¹和Xaa²缺失，(9)Xaa¹、Xaa²和Xaa¹⁰缺失，(10)Xaa¹、Xaa²、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失或(11)Xaa¹、Xaa²、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失。对于这些实施方式中的各个实施方式，剩余的氨基酸具有下列值。

Xaa¹，存在时可为任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸如Glu或Asp，更通常为Asp。

Xaa²，存在时为带正电荷的氨基酸如Arg或Lys，通常为Arg。

Nle³为正亮氨酸。

Cyc⁴与Cyc⁷结合形成硫醚桥。Cyc⁴可以为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc⁴(与Cyc⁷一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH₃，特别是–H。

Xaa⁵为脂肪族氨基酸如Leu、Nle、Ile或Val，通常为Ile。

Xaa⁶为His。

Cyc⁷与Cyc⁴结合形成硫醚键，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc⁷可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc⁷(与Cyc⁴一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基为–H或–CH₃，特别是–H。

Xaa⁸存在时为除Pro以外的氨基酸，通常为Phe或Ile。在某些实施方式中，Ile产生血管紧张素(1-8)抑制剂。在某些实施方式中，Phe保持了血管紧张素(1-8)或血管紧张素(1-10)的生物活性。

Xaa⁹存在时为His。

Xaa¹⁰存在时为脂肪族残基，例如Ile、Val或Leu，通常为Leu。

在某些实施方式中，Xaa¹-Xaa¹⁰的一个或多个(Nle³、Cyc⁴和Cyc⁷除外)与天然存在的血管紧张素(包含血管紧张素(1-7)、血管紧张素(1-8)、血管紧张素(1-9)、血管紧张素(1-10)、血管紧张素(2-7)、血管紧张素(2-8)、血管紧张素(2-9)、血管紧张素(2-10)、血管紧张素(3-8)、血管紧张素(3-9)和血管紧张素(3-10))中相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa¹-Xaa¹⁰(对于存在的那些而言)中的全部均与天然存在的血管紧张素的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa¹⁰(对于存在的那些而言)中的全部均与天然存在的血管紧张素中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Cyc⁴和Cyc⁷独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，所包含的为含有由-Ala⁴-S-Ala⁷-(式(I)，其中R¹-R⁴各为-H)；-Ala⁴-S-Abu⁷-(式(I)：R¹-R³为-H且R⁴为-CH₃)或-Abu⁴-S-Ala⁷-(式(I)：R¹、R³和R⁴为–H且R²为–CH₃)形成的硫醚桥的环状类似物。特定的环状类似物包含-Abu⁴-S-Ala⁷-或-Ala⁴-S-Ala⁷-连接。

特别地，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQ ID NO:18)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQ ID NO:19)的血管紧张素(1-7)类似物或衍生物。

在另一方面，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有血管紧张素(1-8)拮抗活性的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物，特别是具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷-Ile⁸(SEQ ID NO:20)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷-Ile⁸(SEQ ID NO:21)的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物。

烷基是直链或支链的完全饱和的非芳香族烃。通常，直链或支链烷基具有1个至约20个碳原子，优选1个至约10个。直链或支链烷基的示例包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。

芳烷基是被芳基取代的烷基。芳香(芳)基包含碳环芳香基例如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基团也包含稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包含苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。

Ang(1-7)受体激动剂

在一些实施方式中，本发明提供了治疗脑部病况的方法，所述方法包括给予患有或易于出现一种或多种脑部病况的对象血管紧张素(1-7)受体激动剂。本文所述的术语“血管紧张素(1-7)受体激动剂”包含对血管紧张素(1-7)受体(特别是G蛋白偶联的Mas受体)功能具有正向影响的任何分子。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂直接或间接增强、加强、激活和/或增加血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)活性。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂与血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)直接相互作用。此类激动剂可为肽或非肽，包含如蛋白、化合物、小分子、核酸、抗体、药物、配体或其他试剂。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。

示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为1-(对-噻吩基苄基)咪唑。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂或其药学上可接受的盐的示例如结构式(VI)所表示：

其中：

R¹是卤素、羟基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₈)-烷氧基，其中1至6个碳原子被杂原子O、S或NH(优选O)取代，被饱和的环状醚如四氢吡喃或四氢呋喃取代的(C₁-C₄)-烷氧基，O-(C₁-C₄)-烯基、O-(C₁-C₄)-烷基芳基，或未被取代的或被选自卤素、(C₁-C₃)-烷基、(C₁-C₃)-烷氧基和三氟甲基的取代基取代的芳氧基；

R²是CHO、COOH或(3)CO-O-(C₁-C₄)-烷基；

R³是(C₁-C₄)-烷基或芳基；

R⁴是氢、卤素(氯、溴、氟)或(C₁-C₄)-烷基；

X是氧或硫；

Y是氧或-NH-；

R⁵是氢、(C₁-C₆)-烷基；或(C₁-C₄)-烷基芳基，其中当Y是-NH-时R⁵是氢；以及

R⁶是(C₁-C₅)-烷基。

在某些实施方式中，当R²是COOH或CO-O-(C₁-C₄)-烷基时R¹不是卤素。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂为AVE 0991，5-甲酰基-4-甲氧基-2-苯基-1[[4-[2-(乙基氨基羰基亚磺酰氨基(ethylaminocarbonylsulfonamido))-5-异丁基-3-噻吩基]-苯基]-甲基]-咪唑，其可由下面的结构表示：

另一个示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为对-噻吩苄基酰胺。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂或其药学上可接受的盐的示例如下面的结构式(VII)所示：

其中：

R¹是未被取代的或由选自NH₂、卤素、O-(C₁-C₃)-烷基、CO-O-(C₁-C₃)-烷基和CO₂H的基团取代的(C₁-C₅)-烷基，(C₃-C₈)-环烷基、(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基，未被取代的或由选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₆-C₁₀)-芳基，(C₁-C₃)-烷基-(C₆-C₁₀)-芳基，其中所述芳基未被取代的或被选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代、(C₁-C₅)-杂芳基或(C₁-C₃)-烷基-(C₁-C₅)-杂芳基；

R²是氢，未被取代的或被选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₁-C₆)-烷基，(C₃-C₈)-环烷基，(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基，未被取代的或被由选自卤素、O-(C₁-C₃)-烷基和CO-O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₆-C₁₀)-烷基，或者未被取代的或由选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₁-C₃)-烷基-(C₆-C₁₀)-芳基；

R³是氢、COOH或COO-(C₁-C₄)-烷基；

R⁴是氢、卤素；或(C₁-C₄)-烷基；

R⁵是氢或(C₁-C₆)-烷基；

R⁶是氢、(C₁-C₆)-烷基、(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基或(C₂-C₆)-烯基；以及

X是氧或NH。

血管紧张素-(1-7)受体激动剂的其他示例如美国专利号6,235,766中所述，其内容通过引入并入本申请。

上文中所述的各种血管紧张素(1-7)受体激动剂可以以药学上可接受盐的形式存在。本申请中使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留了肽或等价物化合物所需活性但优选对肽或使用此肽的系统的其他成分的活性不产生不良影响的盐类。此种盐类的示例为与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。盐也可与有机酸形成，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、褐藻酸、聚谷氨酸等。使用阳离子材料形成的盐可使用这些无机酸和有机酸的共轭碱。还可使用例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍等多价金属阳离子或通过N,N’-二苄乙烯二胺或乙二胺或其组合形成的有机阳离子(例如鞣酸锌盐)形成盐。优选无毒的、在生理学上可接受的盐。

可以通过常规方法形成所述的盐，如通过将游离酸或游离碱形式的产物与适宜的酸或碱的一种或多种等价物在所述盐不溶的溶剂或介质中或在溶剂如水中反应，然后真空或通过冷冻干燥，或者通过在适宜的离子交换树脂上将现有的盐的阳离子与另一种阳离子交换除去水。

烷基是直链或支链的完全饱和的非芳香族烃。通常，直链或支链烷基具有1个至约20个碳原子，优选1个至约10个。直链或支链烷基的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。

烯基是包含一个或多个双键的直链或支链非芳香烃。通常，直链或支链烯基具有2至约20个碳原子，优选2至约10个。直链和支链烯基的示例包括乙烯基、正丙烯基、正丁烯基。

芳香(芳)基包括碳环芳香基如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基也包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。

芳烷基是被芳基取代的烷基。

制剂

根据本发明的方法，本发明的如本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂可以单独给予对象(例如，作为纯化的肽或化合物)，或者作为如本申请所述的组合物或药物的组分(例如，在生产用于治疗所述疾病的药物中)。可以将所述组合物与生理上可接受的运载体或赋形剂配制以制备药物组合物。所述运载体和组合物可以是无菌的。所述制剂应为适宜的给药模式，例如静脉内或皮下给药。配制组合物的方法是本领域公知的(例如参见Remington's Pharmaceuticals Sciences(雷明顿药物科学)，第17版，Mack Publishing Co.,(Alfonso R.Gennaro编辑)(1989))。

适宜的药学上可接受的运载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐、醇类、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇类、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖类如甘露醇、蔗糖或其他、右旋糖、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，及其组合。如有需要，可以将所述药物制剂与助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色和/或芳香物质等)混合，所述助剂不与活性化合物发生不利的反应或干扰其活性。在一个优选的实施方式中，使用适于静脉内给药的水溶性运载体。

所述组合物或药物如有需要还可以含有少量的润湿或乳化剂或者pH缓冲剂。所述组合物可以是液态溶液、混悬剂、乳剂、持续释放剂型或粉剂。还可以使用常规的粘合剂和运载体如甘油三酯将所述组合物制成栓剂。

可以根据制备适于给予人类的药物组合物的常规程序配制所述组合物或药物。例如，在一个优选的实施方式中，用于静脉内给药的组合物通常是无菌等渗水性缓冲溶液。必要时，所述组合物还可以含有增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。在通常情况下，所述成分在单位剂型中单独或混合在一起提供，例如在熔封容器如标示活性剂量的安瓿或sachette中的冻干粉末或无水浓缩物。当所述组合物通过输注给予时，可以将其分散于含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶中。当所述组合物通过注射给予时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以使得在给药前将所述成分混合。

可以本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些，如源于盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，和与游离羧基形成的那些，如源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

可以通过任意适宜的途径给予本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂(或者含有本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的组合物或药物)。在一些实施方式中，本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂通过皮下给药。将在本申请中使用的术语“皮下组织”定义为紧邻皮肤下方的疏松的、不规则的结缔组织层。例如，所述皮下给药可以通过将组合物注入某区域进行，所述区域包括但不限于腿部区域、腹部区域、臀部区域或肩胛区域。在一些实施方式中，本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂通过静脉内给药。或者，可以通过吸入、胃肠外、皮内、透皮、直肠内或经粘膜给予本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂(或者含有本申请所述的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的组合物或药物)。如有需要，可以同时使用一种以上途径。

在一些实施方式中，以治疗有效量和/或根据与特定的所需后果(例如治疗缺血性中风或使其风险降低)相关的给药方案给予组合物。

根据本发明给予的特定剂量或量是可以改变的，例如，取决于所需后果的性质和/或程度、特定给药途径和/或时间和/或一种或多种性质(例如体重、年龄、个人病史、一般性质、生活方式参数、心脏缺陷的严重程度和/或心脏缺陷的风险水平等或者其组合)。此类剂量或量可以由本领域的普通技术人员确定。在一些实施方式中，根据标准临床技术确定适宜的剂量或量。例如，在一些实施方式中，适宜的剂量或量是足以将疾病严重性指数评分降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％或更多的剂量或量。例如，在一些实施方式中，适宜的剂量或量是足以将疾病严重性指数评分降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％的剂量或量。替代地或附加地，在一些实施方式中，通过使用一种或多种体外或体内测定以辅助鉴定将给予的所需的或最佳的剂量范围或量以确定适宜剂量或量。

在不同实施方式中，给予治疗有效量的Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂。在本申请中使用的术语“治疗有效量”是主要基于本发明的药物组合物中含有的治疗剂的总量确定的。在通常情况下，治疗有效量足以产生对对象有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在疾病或病况)。在一些特定的实施方式中，将给予的适宜剂量或量可以由从体外或动物模型检测系统中得到的剂量响应曲线推断得到。

血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂，包括其衍生物、类似物和/或盐的治疗有效剂量的量在不同实施方式中可以以变化的量存在。例如，在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽的治疗有效量可以在下述范围内变动：约10-1000mg的量(例如约20mg–1,000mg、30mg–1,000mg、40mg–1,000mg、50mg–1,000mg、60mg–1,000mg、70mg–1,000mg、80mg–1,000mg、90mg–1,000mg、约10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、200-1000mg、200-900mg、200-800mg、200-700mg、200-600mg、200-500mg、200-400mg、300-1000mg、300-900mg、300-800mg、300-700mg、300-600mg、300-500mg、400mg–1,000mg、500mg–1,000mg、100mg-900mg、200mg–800mg、300mg–700mg、400mg–700mg和500mg–600mg)。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂以或比约10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg高的量存在。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂以或比约1000mg、950mg、900mg、850mg、800mg、750mg、700mg、650mg、600mg、550mg、500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg、150mg或100mg低的量存在。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在其他实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约0.001mg/kg重量至500mg/kg重量，例如从约0.001mg/kg重量至400mg/kg重量，从约0.001mg/kg重量至300mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至200mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至100mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至90mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至80mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至70mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至60mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至50mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至40mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至30mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至25mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至20mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至15mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至10mg/kg重量。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在另一个实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约0.001mg/kg重量至约1mg/kg重量，例如从约0.001mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约1mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.01mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约1mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.02mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约1mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.03mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约1mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.04mg/kg重量至约0.5mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约1mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约0.9mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约0.8mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约0.7mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约0.6mg/kg重量、从约0.05mg/kg重量至约0.5mg/kg重量。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在另一个实施方式中，治疗有效量可以是例如约0.0001mg/kg重量至0.1mg/kg重量，例如从约0.0001mg/kg重量至0.09mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.08mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.07mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.06mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.05mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至约0.04mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.03mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.02mg/kg重量，从约0.0001mg/kg重量至0.019mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.018mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.017mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.016mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.015mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.014mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.013mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.012mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.011mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.01mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.009mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.008mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.007mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.006mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.005mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.004mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.003mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.002mg/kg重量。在一些实施方式中，所述治疗有效剂量可以是0.0001mg/kg重量、0.0002mg/kg重量、0.0003mg/kg重量、0.0004mg/kg重量、0.0005mg/kg重量、0.0006mg/kg重量、0.0007mg/kg重量、0.0008mg/kg重量、0.0009mg/kg重量、0.001mg/kg重量、0.002mg/kg重量、0.003mg/kg重量、0.004mg/kg重量、0.005mg/kg重量、0.006mg/kg重量、0.007mg/kg重量、0.008mg/kg重量、0.009mg/kg重量、0.01mg/kg重量、0.02mg/kg重量、0.03mg/kg重量、0.04mg/kg重量、0.05mg/kg重量、0.06mg/kg重量、0.07mg/kg重量、0.08mg/kg重量、0.09mg/kg重量或0.1mg/kg重量。根据所述个体的需求，针对特定个体的有效剂量可以随时间改变(例如增加或减少)。

在一些实施方式中，以范围为约1-1,000μg/kg/天(例如范围为约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg/天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)的有效剂量范围给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-500μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-100μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-60μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000ug/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。

给药方案

不同的实施方式可以包括不同给药方案。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂通过连续输注给药。在一些实施方式中，所述连续输注是静脉内的。在其他实施方式中，所述连续输注是皮下的。替代地或附加地，在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂每两个月1次、每月1次、每月两次、每3周1次、每2周1次、每周1次、每周两次、每周3次、每日1次、每日两次或者以其他临床上所需的给药方案给药。用于单一对象的给药方案不需要以固定的间隔，其可以随着时间的推移而改变，这取决于所述患者的需求。

联合疗法

在一些实施方式中，Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂将作为联合疗法的一部分使用。可以将任意公知的用于一种或多种脑部病况的治疗剂或疗法与本申请所述的一种或多种Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂联用。可以与一种或多种Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂作为联用疗法使用的示例性化合物包括但不限于溶栓化合物、抗氧剂或其他活性氧试剂、干扰素β-1a(例如Avonex、Rebif、CinnoVex、ReciGen)、干扰素β-1b(Betaseron)、格拉默醋酸盐(Copaxone)、米托蒽醌(Novantrone)、那他珠单抗(Tysabri)、芬格莫德(Gilenya)(首个可口服的)和特立氟胺(Aubagio)或其组合。

试剂盒

在一些实施方式中，本发明还提供了试剂盒或其他制品，所述试剂盒或其他制品含有Ang(1-7)肽、血管紧张素(1-7)受体激动剂，或者含有其的制剂，并且提供其重构(如果是冻干的)和/或使用说明书。试剂盒或其他制品可以包括容器、注射器、药瓶以及用于给药(例如皮下，或通过吸入)的任意其他物品、装置或设备。适宜的容器包括例如瓶、药瓶、注射器(例如预充式注射器)、安瓿、药匣、储库或二室注射器给药系统(lyo-jects)。所述容器可以由多种材料制成如玻璃或塑料。在一些实施方式中，容器是预充式注射器。适宜的预充式注射器包括但不限于具有经烧制的硅酮涂层的硼硅酸盐玻璃注射器、喷雾了硅酮的硼硅酸盐玻璃注射器或者不含硅酮的塑料树脂注射器。

在通常情况下，所述容器可以含有制剂和在其上或与之配合的标签，所述标签可以作为重构和/或使用的指示。例如，所述标签可以指示按照如上文所述的方法将所述制剂重构成浓缩物(concentrations)。所述标签还可以指示所述制剂用于或旨在用于例如皮下给药。在一些实施方式中，容器可以含有包含Ang(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的单剂量稳定制剂。在不同实施方式中，单剂量稳定制剂以比约15ml、10ml、5.0ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0ml或0.5ml小的体积存在。或者，容器中含有的制剂可以是多次使用的药瓶，其使得所述制剂能够重复给药(例如给药2-6次)。试剂盒或其他制品还可以包括另一个容器，所述容器含有稳定的稀释剂(例如BWFI、盐水、缓冲盐水)。在将所述稀释剂与所述制剂混合后，在所述重构制剂中的蛋白终浓度在通常情况下将为至少1mg/ml(例如至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml)。试剂盒或其他制品还可以包括市售和从用户的角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和对用途进行说明的使用说明书。在一些实施方式中，试剂盒或其他制品可以包括自我给药说明。

实施例

实施例1：连续PanCyte给药

已将若干动物模型用于研究脑缺血以试图了解其病理生理过程和用于鉴定能够将缺血性损伤的严重程度降至最低的治疗策略。局部缺血会导致局部脑梗死，其可以由脑部中动脉栓塞(MCAO)诱导产生。将MCAO大鼠模型作为人脑半球梗死的模型已被广泛接受。经MCAO后，在由脑部中动脉输送的血管区域中出现随着时间和空间变化的皮质和纹状体梗死。

在过去若干年间，已搜集到了在中风动物研究中关于行为评估的丰富的证据，包括缺血性中风MCAO大鼠模型。认为行为改善是潜在疗法效能研究的可靠参数。

对于中风血管并发症的理想疗法应是在缺血组织中促进血管新生的非侵袭性方法。本发明的实施方式提供了这种治疗性疗法。血管紧张素(1-7)肽与内皮细胞的细胞表面结合在体外能够挽救那些细胞使其免于凋亡，诱导其增殖、迁移和形成小血管。

在这个实施例中，使用MCAO大鼠模型，利用若干公认的行为评价方法，评估血管紧张素(1-7)肽例如PanCyte在改善栓塞后功能方面的剂量依赖性效能。

根据国立卫生研究院(NIH)和实验动物评估和认可委员会(AAALAC)的指导原则进行动物操作。将动物饲养在尺寸为35×30×15cm的聚丙烯笼中(5只/笼)，所述笼具有便于颗粒饲料和在塑料瓶中的饮用水取食的不锈钢上盖(top grill)；垫料：使用蒸汽灭菌的清洁稻壳(Harlan,Sani-chip cat#:2018SC+F)作为垫料并且所述垫料与笼子一起至少每周更换两次。在这个实施例中，共使用60只大鼠并且在研究开始时每只大鼠的重量为约300克。

动物自由取食市售啮齿动物饲料(Teklad经认证的全价18％蛋白饲料，目录号#：106S8216)。动物自由饮用按照PharmaSeed SOP No.214(水系统)从市政供水系统获得的酸化饮用水(pH在2.5和3.5之间)。动物饲养在具有充足新鲜空气供应(每小时最少15次换气)的空调和过滤(HEPA F6/6)的标准实验室条件下。将动物保持在气候控制的环境中。将动物保持在温度范围为约20–24℃，相对湿度范围为30–70％和12小时明暗交替。在接收时对动物进行检视并针对发病或死亡的任何指征每日对动物进行检视。对发现处濒死状况的动物和显示出严重疼痛和持续性严重痛苦(如呼吸困难、侧卧(lateral recumbency)、痉挛、瘫痪或不能够到食物或水)指征的动物进行安乐死。

在本实施例中，将执行暂时脑部中动脉栓塞(tMCAO)程序的日期定义为本研究的“第1天”。在手术当天，使用混有70％N₂O和30％O₂的4％的异氟烷诱导麻醉和1.5-2％的异氟烷维持麻醉。

根据R.Schmid-Elsaesser等描述的方法进tMCAO程序。简言之，通过中线颈部切开暴露右侧CCA(颈总动脉)并从分支处至颅底部小心地将其与周围的神经和筋膜剥离。然后分离ECA(颈外动脉)的枕动脉分支，将这些分支剥离并凝固。进一步延舌根和上颌动脉分支远端将ECA剥离和凝固，然后分离它们。将ICA(颈内动脉)分离并小心地将其与附近的迷走神经分离，使用5-0号尼龙缝线(SMI,Belgium)在其源头近端结扎翼腭动脉。接下来，使用4-0号丝质缝线松系在固定的ECA残端周围，并使用4cm长的4-0号单纤维丝尼龙缝线(在插入前，使用火焰将缝线的端部烧平，并使用聚赖氨酸涂覆所述缝线)经由近端ECA插入ICA，并且从此处进入大脑动脉环(circleof Willis)并有效地阻塞MCA。缝合手术伤口并将动物送回其笼中使其从麻醉状态中恢复。阻塞一个半小时后将大鼠再次麻醉，将单纤维丝抽出以导致再灌注，缝合手术伤口并将大鼠送回其笼中。

在再灌注24小时后，使用改良的神经学分级评分(mNRS)对动物进行评价。仅将总体评分≥10的动物纳入本研究。在第2天根据mNRS结果将动物分配至测试组，以使得各组之间具有相似的大鼠行为分布。从第2天术后24小时开始，在每只动物皮下植入Alzet渗透泵并连续给予其PanCyte(2.5mg/ml或25mg/ml在PBS中；SEQ IDNO:6)进行治疗。分组情况见表1：

表1–分组

跨步测试(在第8天、第15天、第22天、第29天和第36天评估)

在跨步测试中检测动物的前肢运动失能情况。通过使用单手固定其后肢抓住动物并且不使用另一只手控制前肢，而是令未束缚的前爪接触桌子。在两个前肢的正手&反手方向使动物沿着桌子表面侧移时(在约5秒内移动85cm)，计数调整的步数。图1显示了在第8、15、22、29和36天时的跨步测试结果。在此项测试中对四组进行了分析：对照组(仅给予PBS 49天)、给予50μg/kg PanCyte 49天的组、给予500μg/kgPanCyte 49天的组和给予50μg/kg PanCyte 14天的组。数据显示与对照动物相比给予PanCyte的各组动物在第22天时大鼠的行为出现有益的改善，并且这种效果持续至第36天，其具有增加的统计学显著性。此外，给予50μg/kg剂量PanCyte 49天的组的行为也显著优于在第15天时的对照，而给予500μg/kg PanCyte 49天或50μg/kg PanCyte14天的组具有改善的趋势，但是在这些特定实验的该时间点未达到具有统计学显著性的水平。

前肢放置(在第8天、第15天、第22天、第29天和第36天评估)

肢体放置测试分为前肢和后肢测试。对于前肢放置测试而言，测试者使大鼠保持接近桌面并且记录大鼠将前肢置于桌面上以响应胡须、视觉、触觉或本体感受刺激的能力。类似地，对于后肢放置测试而言，测试者评估大鼠将后肢置于桌面上以应答触觉和本体感受刺激的能力。从各种模式的感觉输入获得单独的子评分并加入总分中(对于前肢放置测试而言：0＝正常，12＝最大的损伤；对于后肢放置测试而言：0＝正常；6＝最大的损伤)。评分以0.5分的增量按照如下方式给出：前肢放置测试：胡须放置(0-2)、视觉放置-向前(0-2)、向侧(0-2)；触觉放置-背部(0-2)、侧部(0-2)；本体感受放置(0-2)；总计0-12。图2显示了在第8、15、22、29和36天的前肢放置测试结果。在此项测试中对四组进行了分析：对照组(仅给予PBS 49天)、给予50μg/kg PanCyte 49天的组、给予500μg/kg PanCyte 49天的组和给予50μg/kg PanCyte14天的组。数据显示与对照动物相比给予PanCyte的各组动物在第29天时该检测的行为出现有益的改善，并且这种效果持续至第36天。而且，给予50μg/kg剂量PanCyte14天的组的行为在第15天开始时显著优于对照动物，而其他治疗组具有相同趋势，但是直至该实验的第29天才达到具有统计学显著性。

身体摆动测试(在第8天、第15天、第22天、第29天和第36天评估)

在距离其尾根部约1英寸的位置抓住大鼠。然后将其抬高至距离桌子表面上1英寸的位置。将大鼠保持在垂直轴，将垂直轴定义为其左侧或右侧均不超过10°。无论大鼠将其头部移出垂直轴的哪一侧均记录为摆动。在尝试进行另一个摆动之前，大鼠必须返回垂直位置以便进行将计数的下次摆动。共计数20次摆动。正常大鼠通常向两侧具有相等数量的摆动。局灶缺血后，大鼠趋向于向对侧摆动(在本实施例中为左侧)。身体摆动评分以向右侧占总摆动的百分率计。图3显示了在第8、15、22、29和36天时的身体摆动测试结果。在此项测试中对四组进行了分析：对照组(仅给予PBS 49天)、给予50μg/kg PanCyte 49天的组、给予500μg/kg PanCyte 49天的组和给予50μg/kgPanCyte 14天的组。数据显示与对照组相比给予PanCyte的各组在第36天测试时行为均出现有益的改善，与本实验的对照相比给予50μg/kg PanCyte 14天的组在第29天开始时显示出具有统计学显著性。与对照组相比所有治疗组从第8天开始均显示出评分改善趋势。

mNRS评估(在第1天、第8天、第15天、第22天、第29天和第36天评估)

由不知道所给予的药物/剂量的人员负责进行经改良的神经学分级评分(mNRS)(盲态测试)。mNRS能够以标度为0至18个可能的点进行神经评分。与较低评分的大鼠相比，具有较高评分的动物显示出更严重的症状和残疾。图4显示了在第1、8、15、22、29和36天时的mNRS评估结果。在此项测试中对四组进行了分析：对照组(仅给予PBS 49天)、给予50μg/kg PanCyte 49天的组、给予500μg/kg PanCyte 49天的组和给予50μg/kg PanCyte 14天的组。数据显示与对照组相比给予PanCyte的各组在第29天进行测试时行为均出现有益的改善。除了第29和36天以外，在本实验中给予50μg/kg PanCyte 49天的组在第8和15天时显示出行为具有统计学的改善，和给予500μg/kg PanCyte 49天的组在第22天时显示出行为具有统计学的改善。

实施例2：对TXA127、PanCyte或线形PanCyte给药的比较

除非另有明示，动物模型、手术程序以及动物护理程序和条件均与上文实施例1中描述的相同。在该实施例中，共使用了105只动物，表2中显示了该研究的动物分组情况：

表2-动物分组

*＝使用Alzet泵连续皮下给药的大鼠

在再灌注后24小时采用经改良的神经学分级评分(mNRS)对动物进行评分。仅将总体评分≥10的动物纳入本研究。在第2天根据mNRS结果将动物分配至测试组，以使得各组之间具有相似的大鼠行为分布。从第2天术后24小时开始，在第4、5和7组动物皮下植入Alzet渗透泵并分别给予500μg/kg TXA127(SEQ ID NO:1)、500μg/kg PanCyte(环化的SEQ ID NO:6)或50μg/kg线形PanCyte(SEQ ID NO:6)进行治疗。从第2天手术后24小时开始，在第4、5和7组的动物皮下植入Alzet渗透泵并分别给予500μg/kg TXA127(SEQ ID NO:1)、500μg/kg PanCyte(环化的SEQ IDNO:6)或50μg/kg线形PanCyte(SEQ ID NO:6)进行治疗。在第2、3和6组中的动物每日通过皮下注射给予500μg/kg或1,000μg/kg TXA127或者500μg/kg PanCyte。第1组的动物每日皮下注射给予PBS(载剂)。

跨步测试(在手术前、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第49天进行评估)

在跨步测试(ST)中检测动物的前肢运动失能情况。通过使用单手固定其后肢抓住动物并且不使用另一只手控制前肢，而是令未束缚的前爪接触桌子。在两个前肢的正手&反手方向使动物沿着桌子表面侧移时(在约5秒内移动85cm)，计数调整的步数。图5显示了与载剂对照条件相比手术后第21天在所有实验条件下使用TXA127、PanCyte或线形Pancyte治疗的大鼠均显示出显著的行为改善。早在手术后第14天就观察到了改善的趋势。值得注意的是，尽管仅给予了50μg/kg的线形PanCyte，但是其结果基本上等价于高达TXA127或PanCyte的10倍。

前肢放置(在手术前、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第49天进行评估)

对于前肢放置测试而言，测试者使大鼠保持接近桌面并且记录大鼠将前肢置于桌面上以响应胡须、视觉、触觉或本体感受刺激的能力(0＝正常，12＝损伤最大)。评分以0.5分的增量给出(见下文)。通常情况下，在中风后第1个月肢体放置行为出现缓慢且稳定的恢复。图6显示了从第14天开始并且持续至研究期间与载剂对照相比在所有治疗条件下均观察到行为的显著改善。尽管线形PanCyte组暴露的剂量远低于其他实验组，但是线形PanCyte组又出现了最佳性能，特别是从第35天开始。

身体摆动(在手术前、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第49天进行评估)

在距离其尾根部约1英寸的位置抓住大鼠。然后将其抬高至距离桌子表面上1英寸的位置。将大鼠保持在垂直轴，将垂直轴定义为其左侧或右侧均不超过10°。无论大鼠将其头部移出垂直轴的哪一侧均记录为摆动。在尝试进行另一个摆动之前，大鼠必须返回垂直位置以便进行将计数的下次摆动。共计数20次摆动。正常大鼠通常向两侧具有相等数量的摆动。局灶缺血后，大鼠趋向于向对侧摆动(在本实施例中为左侧)。身体摆动评分以向右侧占总摆动的百分率计。通常地，在中风后第1个月期间身体摆动评分自发地部分恢复(接近50％)。图7显示了与载剂对照相比1,000μg/kg TXA127、TXA Alzet、PanCyte Alzet、500μg/kg PanCyte和线形PanCyte组在第28天时均显示出显著的性能改善。500μg/kg TXA127组未显示出显著的结果直至第35天。在第21天1,000μg/kg TXA127、TXA Alzet、PanCyte Alzet和线形PanCyte组均显示出改善，所有实验组在第14天时显示出改善趋势。在第49天时，TXA 1,000g/kg、TXA Alzet和线形PanCyte组均显示出接近正常(未损伤的)水平的行为。

mNRS评估(在手术前、第1天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第49天进行的评估)

由不知道所给予的药物/剂量的人员负责进行经改良的神经学分级评分(mNRS)(盲态测试)。mNRS能够以标度为0至18个可能的点进行神经评分。与较低评分的大鼠相比，具有较高评分的动物显示出更严重的症状和残疾。图8显示了与载剂对照相比各实验组在第14天时显示出显著的行为改善。在研究期间能维持观察到行为改善。

这些结果显示TXA127、PanCyte和线形PanCyte均是较强的治疗候选物，其能够显著改善动物中风后的行为。除了上文讨论的行为益处以外，使用激光多普勒根据公知的方案测定了在第50天时各非Alzet组中的血流和血管直径。结果如图9所示，结果显示在第50天时与对照动物相比在所有评估治疗组中的动物均显示出显著的血管直径和血流增加。特别地，线形PanCyte显示出具有显著改善的治疗潜能，其甚至超出了该实施例中检测的其他有效疗法。这些结果是特别令人惊讶的，因为PanCyte和线形PanCyte之间的差异仅为PanCyte是环化的，而线形PanCyte不是。通常认为肽的环化由于使其对蛋白酶降解具有更高抗性因而使肽在体内更加有效。然而，在本实施例中线形PanCyte在较低剂量50μg/kg下几乎具有相等效果(与500μg/kg的PanCyte相比)。

实施例3：PanCyte和AVE0991给药的比较

除非另有明示，动物模型、手术程序以及动物护理程序和条件均与上文实施例1中描述的相同。在该实施例中，共使用了75只动物，表3中显示了该研究的动物分组情况：

表3-动物分组

在再灌注后24小时采用经改良的神经学分级评分(mNRS)对动物进行评分。仅将总体评分≥10的动物纳入本研究。在第2天根据mNRS结果将动物分配至测试组，以使得各组之间具有相似的大鼠行为分布。从第2天术后24小时开始，每日通过皮下注射给予第2、3和4组的动物PanCyte或AVE0991。在第5组中的动物每日灌胃给予AVE0991两次和第1组(载剂对照)中的动物每日通过皮下注射给予载剂。

跨步测试(在手术前、第15天、第22天和第29天进行评估)

在跨步测试(ST)中检测动物的前肢运动失能情况。通过使用单手固定其后肢抓住动物并且不使用另一只手控制前肢，而是令未束缚的前爪接触桌子。在两个前肢的正手&反手方向使动物沿着桌子表面侧移时(在约5秒内移动85cm)，计数调整的步数。图10显示了与载剂对照相比PanCyte和AVE0991的治疗在第22天时产生显著改善并且其持续至第29天，在第15天时改善趋势变得明显。

前肢放置(手术前、第15天、第22天和第29天进行的评估)

对于前肢放置测试而言，测试者使大鼠保持接近桌面并且记录大鼠将前肢置于桌面上以响应胡须、视觉、触觉或本体感受刺激的能力(0＝正常，12＝损伤最大)。评分以0.5分的增量给出(见下文)。通常情况下，在中风后第1个月肢体放置行为出现缓慢且稳定的恢复。图11显示了与载剂对照相比使用PanCyte和AVE0991治疗在第22天时产生显著的行为改善并且其持续至第29天。值得注意的是，给予50mkgAVE0991的动物在第15天时显示出具有统计学上的显著的行为改善，而其他组包括高达AVE0991为10倍的组(500mkg)均仅显示出改善的趋势。

身体摆动(在手术时，第15天、第22天和第29天进行评估)

在距离其尾根部约1英寸的位置抓住各只大鼠。然后将其抬高至距离桌子表面上1英寸的位置。将大鼠保持在垂直轴，将垂直轴定义为其左侧或右侧均不超过10°。无论大鼠将其头部移出垂直轴的哪一侧均记录为摆动。在尝试进行另一个摆动之前，大鼠必须返回垂直位置以便进行将计数的下次摆动。共计数20次摆动。正常大鼠通常向两侧具有相等数量的摆动。局灶缺血后，大鼠趋向于向对侧摆动(在本实施例中为左侧)。身体摆动评分以向右侧占总摆动的百分率计。图12显示了与载剂对照相比使用PanCyte或AVE0991治疗(通过灌胃)在第22天时显示出显著改善。在第22天时皮下给予AVE0991显示出改善趋势。

mNRS评估(在手术前、第2天、第15天、第22天和第29天进行评估)

由不知道所给予的药物/剂量的人员负责进行经改良的神经学分级评分(mNRS)(盲态测试)。mNRS能够以标度为0至18个可能的点进行神经评分。与较低评分的大鼠相比，具有较高评分的动物显示出更严重的症状和残疾。图13显示了与载剂对照相比给予PanCyte和AVE0991(通过灌胃)在第22天时行为产生显著改善，而皮下给予AVE0991具有改善趋势。在第29天时，与载剂对照相比所有治疗组的行为均显示出显著改善。最早在第15天所有治疗组均显示出改善趋势。

该实施例显示了AVE0991也是治疗中风较强的治疗候选物，其为在治疗2-3周内使对象恢复提供了显著的益处。

等价物和范围

本领域的技术人员将能够理解，或能够使用不超出常规实验的方法来确定本申请所描述的特定实施方式的多种等价物。本发明的范围并不旨在限于上述说明书，而是如下述权利要求书中所示：

Claims (29)

1.一种治疗脑部病况的方法，所述方法包括

通过静脉内或皮下给药途径给予患有或易于出现脑部病况的对象血管紧张素(1-7)肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脑部病况选自中风、血管性痴呆和外伤性脑损伤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述中风是缺血性中风、出血性中风或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽不在脑室内给药。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽通过连续输注给药。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽每月给药3次。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽每月给药2次。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽每月给药1次。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围为约1-1,000ug/kg/天给药。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围为约50-500ug/kg/天给药。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围为约1-60ug/kg/天给药。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是SEQ ID NO:1的功能等价物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述功能等价物是线形肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述线形肽包含含有天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少4个氨基酸的序列，其中所述至少4个氨基酸保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述线形肽含有4-25个氨基酸。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述线形肽是所述天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述线形肽含有在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述线形肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQ ID NO:6)。

20.根据权利要求13所述的方法，其中所述功能等价物是环肽。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述环肽包含氨基酸之间的连接。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述连接位于与天然存在的血管紧张素(1-7)中Tyr⁴和Pro⁷的位置对应的残基。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述连接是硫醚桥。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述环肽包含以其他方式与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。

25.根据权利要求20所述的方法，其中所述环肽是如下式所示的4,7-环化血管紧张素(1-7)：

26.根据权利要求13所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种化学修饰以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种化学修饰包含聚乙二醇化。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述非肽激动剂是具有下述结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。