CN104394878A - 用于治疗周围血管疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗周围血管疾病(PVD)的组合物和方法。特别地，本发明提供了基于使用血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂的用于治疗严重肢体缺血及相关疾病、病症或病况的组合物和方法。

Description

用于治疗周围血管疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月10日提交的美国临时专利申请序号61/597,223和2012年10月30日提交的美国临时专利申请序号61/720,301的优先权，这两项申请的全部内容均通过引用并入本申请。
序列表
本说明书涉及于2013年2月7日以文件名为“Sequence_Listing”的ASCII.txt的电子形式提交的序列表。该.txt文件于2013年1月31日生成，大小为39KB。所述序列表的全部内容通过引用并入本申请。
背景
周围血管疾病(PVD)通常的特征为心脏或脑以外的血管部分或完全阻塞，周围血管疾病可能由动脉粥样硬化、炎症过程引起，结果导致狭窄、栓塞或血栓形成，以及其他疾病。周围动脉疾病(PAD)是PVD的一种形式，其中存在流向各种内脏和/或肢体的动脉血供部分或完全阻塞。PAD的风险因素包括血液胆固醇升高、糖尿病、吸烟、高血压、缺乏运动和肥胖。据信在50岁以上的人士中约有5％患有PAD。PAD的症状取决于动脉阻塞的位置和程度。PAD最常见的症状是间歇性跛行，表现为在行走时出现疼痛(通常在小腿)而在休息时疼痛消失。随着时间的推移，PAD的严重程度增加，运动持续较短时间后就出现症状。当PAD变得更加严重时，症状可以包括夜间疼痛和痉挛，足部或脚趾疼痛或刺痛，当将腿部抬高时疼痛加重并且当将腿部垂下(例如在床沿外)时疼痛消失，以及溃疡不愈合。PAD最终会达到严重肢体缺血(CLI)阶段，其特征通常为皮肤生疮(sore)不愈合、溃疡、坏疽和/或四肢感染。在很多情况下，可能需要截肢。
PVD(例如PAD)可以通过改变生活方式、药物、血管成形术和相关疗法或手术治疗。尽管这些疗法缓解症状，并且甚至可以改善生存，但是其均不能逆转疾病过程并且直接修复持久损伤。血管生成(angiogenesis)受损是缺血性疾病的特征之一。治疗性血管生成的最确定的靶点是VEGF及其受体。然而，缓解缺血的临床试验是令人失望的。因此，对PVD(例如PAD如CLI)或与受损的血管生成相关的其他疾病、病症或病况的治疗仍是主要的尚未被满足的医疗需求。
发明概述
除了其他以外，本发明提供了一种改进的和更有效的治疗周围血管疾病(PVD)如严重肢体缺血(CLI)以及与血管生成受损相关的其他疾病、病症或病况的基于血管紧张素(1-7)肽或其功能等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂的疗法。本发明部分地基于预料不到的发现，该发现是在动物后肢缺血模型中给予称为血管紧张素(1-7)的短的七氨基酸肽能够有效地恢复血流，改善肢体功能和减少缺血性截肢。这一发现特别令人惊讶，因为在本发明之前，据报道血管紧张素(1-7)通过减少血管内皮生长因子-A而具有显著的抗血管生成活性，血管内皮生长因子-A是一种主要的促血管生成蛋白(参见，Soto-Pantoja D.R.等，“Angiotensin-(1-7)inhibits tumorangiogenesis in human lung cancer xenografts with a reduction in vascular endothelial growthfactor,”(血管紧张素(1-7)通过减少血管内皮生长因子在人肺癌移植瘤中抑制肿瘤血管生成)Mol.Cancer Ther.,2009；8(6):1676-83)。然而，如在下述实施例章节中所详细描述的，本申请发明人成功地证明了在动物后肢缺血模型中给予与天然存在的血管紧张素(1-7)相同的具有7个氨基酸的血管紧张素肽能够有效地恢复血流，从而改善肢体功能，减少组织坏死和缺血性截肢。因此，与此前的报道相反，本发明提供了一种基于血管紧张素的疗法，所述疗法能够用于刺激治疗性的血管生成以及治疗严重肢体缺血和与血管生成受损相关的其他疾病、病症或病况。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤：向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素(1-7)肽的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞，其中所述血管紧张素(1-7)肽以治疗有效量给予，以使得周围血管疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低或推迟发作。如本申请所使用的，术语“血管紧张素(1-7)肽”指天然存在的血管紧张素(1-7)和天然存在的血管紧张素(1-7)的任意功能性等价物、类似物或衍生物。如本申请所使用的，“肽”和“多肽”是可以互换使用的术语，指通过肽键键合在一起的两个或更多个氨基酸。如本申请所使用的，术语“肽”和“多肽”包含线形肽和环肽。
在各种实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的功能性等价物。在某些实施方式中，所述功能性等价物是线形肽。
在一些实施方式中，线形肽含有分别包含在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少4、5或6个氨基酸的序列，在其中所述至少4、5或6个氨基酸分别维持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置，并且各线形肽还具有促血管生成活性。在各种实施方式中，所述至少4、5或6个氨基酸分别还保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对间距。
在一些实施方式中，所述线形肽含有4-25个氨基酸(例如4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7个氨基酸)。
在某些实施方式中，所述线形肽是所述天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。在各种实施方式中，所述线形肽含有在天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。在某些实施方式中，所述线形肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:4)或氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ ID NO:5)。
在各种实施方式中，所述功能性等价物是环肽。在某些实施方式中，所述环肽包含在氨基酸之间的连接。在一些实施方式中，所述连接位于与天然存在的血管紧张素(1-7)中的Tyr4和Pro7的位置对应的残基上。在某些实施方式中，所述连接是硫醚桥。在各种实施方式中，所述环肽包含以其他方式(otherwise)与天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列，或者所述环肽包含正亮氨酸(Nle)取代天然存在的血管紧张素(1-7)中Val3的位置。在一些实施方式中，所述环肽是具有下式结构的4,7-环化血管紧张素(1-7)：
在各种实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种化学修饰以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，所述一种或多种化学修饰包含聚乙二醇化。
在某些实施方式中，所述心脏和脑以外的一种或多种组织包括个体的一个或多个肢体。
在各种实施方式中，所述周围血管疾病是周围动脉疾病。在一些实施方式中，所述周围动脉疾病是严重肢体缺血。在某些实施方式中，所述周围血管疾病是急性缺血、慢性缺血或糖尿病性血管病。在一些实施方式中，所述糖尿病性血管病是肾病和/或神经病。
在各种实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽在心脏和脑以外的一种或多种组织中诱导和/或增加血管生成和/或血管化。在某些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽在心脏和脑以外的一种或多种组织中降低和/或推迟细胞死亡。在一些实施方式中，所述细胞死亡是凋亡或坏死。在某些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽在心脏和脑以外的一种或多种组织中增加和/或增强细胞存活。
在各种实施方式中，所述治疗有效量的血管紧张素(1-7)肽足以使流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流的部分或完全阻塞减少。在一些实施方式中，所述治疗有效量的血管紧张素(1-7)肽足以在心脏和脑以外的一种或多种组织中减少或推迟组织损伤。在某些实施方式中，所述治疗有效量的血管紧张素足以改善心脏和脑以外的一种个或多种组织的功能。
在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽通过胃肠外给药。在某些实施方式中，所述胃肠外给药选自静脉内、皮内、吸入、透皮(局部)、皮下和/或透粘膜给药。在各种实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽通过口服给药。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽与环糊精联合给药。在某些实施方式中，其中所述血管紧张素(1-7)肽每两个月、每个月、每三周、每两周、每周、每日给药或以可变间隔给药。
可以预见到各种实施方式可能使用不同量的血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，给予的血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-1,000μg/kg/天(例如，范围是约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-500μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-100μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量范围是约1-60μg/kg/天。在一些实施方式中，给予的所述血管紧张素(1-7)肽的有效剂量选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/kg/天。
在某些实施方式中，将促血管生成剂与血管紧张素(1-7)肽联合给药。在一些实施方式中，在心脏和脑以外的一种或多种组织进行血管或血管内操作。
在另一个方面，本发明提供了使用血管紧张素转化酶2(ACE2)治疗周围血管疾病的方法。在一些实施方式中，本发明提供了治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤：向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素转化酶2(ACE2)的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞。在一些实施方式中，以治疗有效量给予ACE2，以使得周围血管疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低或推迟发作。
在另一个方面，本发明提供了使用血管紧张素转化酶2(ACE2)活化剂治疗周围血管疾病的方法。在一些实施方式中，本发明提供了治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤：向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素转化酶2(ACE2)活化剂的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞。在一些实施方式中，适宜的ACE2的活化剂是三氮脒(DIZE)和/或1-[(2-二甲基氨基)乙基氨基]-4-(羟基甲基)-7-[(4-甲基苯基)磺酰氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮(XNT)。在一些实施方式中，以治疗有效量给予ACE2活化剂以使得所述周围血管疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低或推迟发作。
在另一个方面，本发明提供了使用血管紧张素(1-7)受体激动剂治疗周围血管疾病的方法。在一些实施方式中，本发明提供了治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤：向患有周围血管疾病的个体给予包括血管紧张素(1-7)受体激动剂的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞。在一些实施方式中，适宜的血管紧张素(1-7)受体激动剂具有下式结构
在一些实施方式中，以治疗有效量给予血管紧张素(1-7)受体激动剂以使得所述周围血管疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低或推迟发作。
在本申请中，除非另有说明，使用“或”表示“和/或”。如本申请中所使用的，术语“包含”以及该术语的变体，如“包括”和“含有”，并不旨在排除其他添加物、成分、整体或步骤。如在本申请中所使用的，术语“约”和“近似”所表达的意义相同。本申请中带有或不带有约/近似的所有数字表示包含相关领域普通技术人员可以理解的任何正常的波动。在某些实施方式中，除另有说明或从上下文中显而易见(除了当这些数字将超过可能数值的100％时)，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任意方向(高于或低于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小幅度以内的数值范围。
下文的详细描述、附图和权利要求清楚地描述了本发明的其他特征、目的和优势。但应理解，说明本发明实施方式的详细描述、附图和权利要求仅具有说明性，并不具有限制性。本领域技术人员可清楚地理解本发明范围内的各种变化和修改。
附图的简要说明
附图仅用于说明目的，而并非限制。
图1描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性体重测量结果。
图2描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性血流测量结果。
图3描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体坏死评分。
图4描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体截肢动力学。
图5描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体功能性评分。
图6描述了在接受TXA127或DPBS载剂的小鼠中使用“末次测量结转”方法分析的诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体功能性评分。
图7描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性体重测量结果。
图8描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性血流测量结果。
图9描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体功能性评分。
图10描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后49天的示例性毛细血管密度测量结果。
图11描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性体重测量结果。
图12描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性血流测量结果。
图13描述了在接受PanCyte或DPBS载剂的小鼠中诱导后肢缺血后一直到49天的示例性肢体功能性评分。
定义
为了使本发明更加易于理解，下面对某些术语进行了定义。下列术语和其他术语的额外的定义将在说明书中阐述。
急性：本申请中使用的术语“急性”当与组织损伤和相关疾病、病症或病况联用时，具有医药领域任意一个技术人员理解的含义。例如，该术语通常指疾病、病症或病况的症状突然或严重发作。在一些实施方式中，急性损伤是由缺血或创伤性事件导致。通常地，术语“急性”是与术语“慢性”相对使用的。
激动剂：本申请中使用的术语“激动剂”指对目标蛋白的功能具有正向影响的任意分子。在一些实施方式中，激动剂直接或间接地加强、增强、活化和/或增加目标蛋白的活性。在特定的实施方式中，激动剂直接与目标蛋白相互作用。此类激动剂可以是例如蛋白、化学化合物、小分子、核酸、抗体、药物、配体或其他试剂。
动物：本申请中使用的术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方式中，非人动物为哺乳动物(如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆体。
近似或约：本申请中使用的术语“近似”或“约”适用于一个或多个目标值，是指与所述参考值近似的数值。在某些实施方式中，除另有说明或从上下文中显而易见(除了当这些数字将超过可能数值的100％时)，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任意方向(高于或低于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小幅度以内的数值范围。
生物活性：在本申请中的短语“生物活性”是指在生物系统中特别是在生物体中具有活性的任何试剂的一种特性。例如，给予生物体的一种试剂对此生物体具有生物作用，则认为此试剂具有生物活性。在特定的实施方式中，若一种肽具有生物活性，具有所述肽至少一种生物活性的肽的部分一般称为“生物活性”部分。在某些实施方式中，若某种肽并不具有内在的生物活性，但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用，则认为这种肽具有生物活性。
运载体或稀释剂：在本申请中所用的术语“运载体”和“稀释剂”是指用于制备药物制剂的药学上可接受的(如给予人体时安全无毒)的运载体或稀释用的物质。示例性的稀释剂包含无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。示例性的运载体包括用于制备片剂或胶囊制剂的或用于制备吸入制剂的配制品，下文中将更加详细地讨论。
慢性：本申请中使用的术语“慢性”当与组织损伤和相关疾病、病症或病况联用时，具有医药领域任意一个技术人员理解的含义。通常地，术语“慢性”指涉及持续和/或复发症状的疾病、病症或病况。慢性疾病、病症或病况通常在很长的一段时间内发展。术语“慢性”是与术语“急性”相对使用的。在一些实施方式中，慢性疾病、病症或病况是细胞退化的结果。在一些实施方式中，慢性疾病、病症或病况是年龄相关的细胞退化的结果。
对照：在本申请中使用术语“对照”具有其所属领域理解的含义，即针对比较结果的标准。通常地，通过分离变量来使用对照以增加实验中的完整性，从而得出关于此类变量的结论。在一些实施方式中，对照是与测试反应或试验同时进行以提供比较因素的反应或试验。在一项实验中，应用所述“测试”(即测试的变量)。在第二项实验中，不应用所述“对照”即测试的变量。在一些实施方式中，对照是历史对照(即预先进行的检测或试验，或预先公知的量或结果)。在一些实施方式中，对照是或包含打印的或以其他方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些实施方式中，对照也被称为参照。
严重肢体缺血：在本申请中使用的术语“严重肢体缺血”或“CLI”通常指特征为提供给个体四肢(例如，手、脚、腿)的血液或氧气受限的病况，所述病况可能导致在四肢中的组织受损或功能障碍。严重肢体缺血可能是由任意的各种各样的因素引起，如周围动脉疾病(PAD)，除了其他症状以外可以导致严重疼痛、皮肤溃疡或生疮，并且在一些情况下导致截肢。严重肢体缺血的特征可以为一个或多个四肢血管收缩、血栓形成或栓塞。正常接受血液供应的四肢的任意组织均能够出现严重肢体缺血。
粗品：在本申请中使用的术语“粗品”当与生物样品联用时指基本上处于未精制状态的样品。例如，粗样品可以是细胞裂解物或活检组织样品。粗样品可以存在于溶液中或以干制剂形式存在。
糖尿病性血管病：在本申请中使用的术语“糖尿病性血管病”指与由糖尿病引起的血管(特别是动脉)阻塞的发展相关的疾病、病症或病况。糖尿病性血管病能够在全身发展。在一些实施方式中，如本申请所使用的糖尿病性血管病在心脏和脑以外的一种或多种组织中发展。在一些实施方式中，糖尿病性血管病还可以包括肾病(肾脏疾病)、神经病(引起脚趾或足部保护性感觉丧失的神经本身的病况)。糖尿病性血管病的示例性症状可以包括但不限于视力模糊、面部或肢体水肿或者意外的体重增加、足部生疮、手或脚的感觉丧失或有灼烧感、当行走时腿部疼痛以及高血压。患有糖尿病性血管病的患者最终会发展为组织坏死，这被称为坏疽。其能够导致感染并最终截肢。
剂型：在本申请中使用的术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理上不连续单位。各单位含有经预先确定的活性物质的量，经计算此数量能够产生所需的治疗作用。但是应理解，组合物的总剂量应由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
功能障碍：在本申请中使用的术语“功能障碍”是指异常功能。分子(如蛋白)的功能障碍可能是由与此分子相关的活性的增加或降低引起的。分子的功能障碍可能是由与分子本身相关的缺陷引起的，也可能是由与直接或间接作用于此分子或调节此分子的其他分子相关的缺陷引起的。
功能等价物或衍生物：在本申请中使用的术语“功能等价物”或“功能衍生物”，是指在氨基酸序列的功能衍生物的范围内保有与原始序列基本相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等价物可以是天然衍生物或合成制备物。示例性的功能衍生物包含具有一个或多个氨基酸取代、缺失或增加的氨基酸序列，条件是仍保持所述蛋白的生物活性(例如其作为Mas受体的激动剂)。用于取代的氨基酸与被取代的氨基酸理想地具有相似的理化性质。理想的相似理化性质包含电荷、蓬松度、疏水性、亲水性等的相似性。
改善、增加或减少：在本申请中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”，或在语法上等同的术语，是指与基线测量结果有关的数值，所述基线测量如本申请所述的在开始治疗前同一个体的测量，或在未接受本申请所述的治疗的对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是指与接受治疗的个体患有相同形式的疾病、并与接受治疗的个体年龄相仿的个体(以确保在所治疗个体与对照个体中所述疾病的阶段是可比的)。
体外：在本申请中使用的术语“体外”是指在人工环境(如在试管或反应器、在细胞培养物等)中发生的事件，而非在多细胞生物体中发生的事件。
体内：在本申请中使用的术语“体内”是指在多细胞生物体(例如人体和非人动物)中发生的事件。在基于细胞的系统中，此术语可用于表示在活细胞(相对于如体外系统)中发生的事件。
缺血：在本申请中使用的术语“缺血”(也拼写为“ischaemia”)通常指血液或氧气供应受限，这可以导致组织的损伤或功能障碍。缺血可能由任意的各种各样的因素引起，如在血管中的因子、血液凝块、血压急剧下降、隔室压力增加和/或创伤。术语“缺血”如本申请所使用的也指在身体或组织的给定部分中的局部贫血，这可以由例如血管收缩、血栓形成或栓塞造成。正常接受血液供应的任意组织均能够出现缺血。
分离的：在本申请中使用的术语“分离的”是指(1)从在最初生产时具有相关性(不论是在自然界还是和/或在实验环境中)的至少部分成分中分开的物质和/或实体，和/或(2)人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。经分离的物质和/或实体可以是从与其初始相关的其他成分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％中分开。在一些实施方式中，经分离的试剂的纯度超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本100％或100％。如本申请中所使用的，若一种物质基本不含其他成分，则认为所述物质是“纯的”。本申请中使用的术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。
周围血管疾病：在本申请中使用的术语“周围血管疾病”或“PVD”指由位于心脏和脑以外(例如不在冠状动脉、主动脉弓血管或脑内)的血管(例如动脉)的部分或完全阻塞引起的疾病、病症或病况。在本申请中使用的术语“周围动脉疾病”或“PAD”指PVD的一种形式，在其中向位于心脏和脑以外(例如不在冠状动脉、主动脉弓血管或脑内)的一种或多种组织如内脏和/或肢体提供血液供应的动脉的部分或全部阻塞。在本申请中使用的周围血管疾病包括糖尿病性血管病。参见“糖尿病性血管病”的定义。
稳定性：在本申请中使用的术语“稳定的”指在较长的一段时间内治疗剂维持其治疗效果(例如全部或大部分其预期的生物活性和/或生理化学完整性)的能力。可以在较长的一段时间内(例如至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更长)评估治疗剂的稳定性和药物组合物维持这种治疗剂稳定性的能力。在某些实施方式中，已将如本申请所述的药物组合物制剂以使得在制剂中的一种或多种治疗剂能够稳定，或者延缓或阻止其降解。在制剂背景下，稳定的制剂是在贮存和加工(如冻/融、机械混合和冻干)期间在其中的所述治疗剂基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性。
对象：在本申请中使用的术语“对象”是指人或任何非人动物(如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包含产前和产后的形态。在许多实施方式中，对象是人类。对象可为患者，即去往医师处诊断或治疗疾病的人。本申请中使用的术语“对象”与“个体”或“患者”的用法可互换。对象可以患有或易患有某种疾病或病症，但可能显示或可能未显示出所述疾病或病症的症状。
基本上：在本申请中使用的术语“基本上”是指显示出目标特性或属性的完全或接近完全的范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象极少(若有)达到完全和/或向完全趋近，或者达到或避免绝对结果。因此，本申请中使用术语“基本上”体现了许多生物和化学现象中固有完全性的潜在的缺乏。
患有：个体“患有”疾病、病症和/或病况是指所述个体已确诊或显示出所述疾病、病症和/病况的一种或多种症状。
易患：个体“易患”疾病、病症和/或病况是指所述个体尚未确诊所述疾病、病症和/病况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或病况的个体可能未显示出所述疾病、病症和/或病况的症状。在一些实施方式中，易患疾病、病症、病况或事件(例如缺血性中风)的个体可能具有下列一种或多种特征：(1)与所述疾病、病症和/或病况的发展相关的基因突变；(2)与所述疾病、病症和/或病况的发展相关的基因多态性；(3)与所述疾病、病症和/或病况相关的蛋白表达和/或活性的增加和/或下降；(4)与所述疾病、病症、病况和/或事件的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)已进行移植、计划进行移植或需要移植。在一些实施方式中，“易患”疾病、病症和/或病况的个体将发展为该疾病、病症和/或病况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或病况的个体将不会发展为该疾病、病症和/或病况。
治疗有效量：本申请中使用的术语治疗剂的“治疗有效量”是指给予患有或易患疾病、病症和/或病况的对象的量足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或病况的症状的发作。本领域的普通技术人员应理解治疗有效量通常是以包含至少一个单位剂量的给药方案来给药的。
治疗剂：在本申请中使用的短语“治疗剂”指当给予对象时具有治疗作用和/或引起所需的生物学和/或药理学作用的任意试剂。在一些实施方式中，本发明的治疗剂指根据本发明的肽抑制剂或其衍生物。
治疗：本申请中使用的术语“治疗”“处理”或“医治”是指用于使特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟发作、减轻严重程度和/或降低发生率的任何方法。可以向未显示出疾病体征和/或仅显示出疾病早期体征的对象给予治疗，以降低对象发展成与疾病相关的病理学的风险。
某些实施方式的详述
除了其他以外，本发明提供了用于治疗周围血管疾病(PVD)(如严重肢体缺血)及相关疾病、病症或病况的基于血管紧张素(1-7)肽或其功能等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂的改进的组合物和方法。
下列章节中详述了发明的各个方面。章节的使用并不意味着限制发明。各章节可适用于发明的任意方面。在本发明中，除另有说明，使用“或者”表示“和/或”。
血管紧张素(1-7)肽
本申请中所用的术语“血管紧张素(1-7)肽”同时是指天然存在的血管紧张素(1-7)和天然存在的血管紧张素(1-7)的任意功能等价物、类似物或衍生物。本申请中使用的术语“肽”和“多肽”是可互换使用的术语并且指由肽键键合在一起的两个或更多个氨基酸。在本申请中使用的术语“肽”和“多肽”包括线形肽和环肽。术语“血管紧张素(1-7)”、“血管紧张素-(l-7)”和“Ang-(1-7)”可互换使用。
天然存在的血管紧张素(1-7)
天然存在的血管紧张素(1-7)(也称为Ang-(1-7))是如下所示的七个氨基酸的肽：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)
其是肾素-血管紧张素系统的一部分并且是从前体(也称为血管紧张素原)转换生成的，血管紧张素原是一种主要由肝脏组成性产生并释放至循环中的α-2-球蛋白。血管紧张素原是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族的成员并且也已知血管紧张素原是肾素底物。人血管紧张素原的长度为452个氨基酸，但其他物种具有各种大小的血管紧张素原。通常，前12个氨基酸是对血管紧张素活性最重要的：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7-Phe8-His9-Leu10-Val11-Ile12(SEQ ID NO:2)
不同类型的血管紧张素可通过各种酶的作用形成。例如，血管紧张素(1-7)可通过血管紧张素转化酶2(ACE 2)的作用生成。参见下文中的“血管紧张素转化酶2(ACE2)”章节。
血管紧张素(1-7)是Mas受体的内源性配体。Mas受体是包含七个跨膜区的G蛋白偶联受体。文申请中使用的术语“血管紧张素(1-7)受体”包含G蛋白偶联的Mas受体。
本申请中使用的术语“天然存在的血管紧张素(1-7)”包含由天然来源纯化的任意血管紧张素(1-7)肽以及与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列的任意重组产生或化学合成的肽。
血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物
在一些实施方式中，适用于本发明的血管紧张素(1-7)肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物。本申请中使用的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物是指与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列，并基本保留了与天然存在的血管紧张素(1-7)相同或相似的活性的任意肽。例如，在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物具有使用本申请中所述或本领域中已知的方法测量的促血管生成活性，或例如一氧化氮释放、血管舒张、内皮功能改善、抗利尿的活性，或本申请中讨论的其他对血管生成可产生积极影响的性质之一。在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物可连接至或活化血管紧张素(1-7)受体(如G蛋白偶联的Mas受体)，如根据使用本申请中所述或本领域公知的多种检测所测量的。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也是指血管紧张素(1-7)的类似物或衍生物或功能等价物。
通常，血管紧张素(1-7)的功能等价物与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相似的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的血管紧张素(1-7)的功能等价物包含天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的七个氨基酸中的至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个、至少7个)氨基酸的序列，其中所述至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个或至少7个)氨基酸保持了他们在天然存在的血管紧张素(1-7)中的相对位置和/或间距。
在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也包含含有与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列具有至少50％(如至少50％、60％、70％、80％或90％)一致性序列的任意肽。可通过氨基酸序列比对来确定氨基酸序列的一致性百分比。可按照本领域技术人员的多种方式进行氨基酸序列比对，例如使用公众可获得的电脑软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员能够确定用于测量比对的适宜参数，包括获得要对比的序列全长的最大比对所需的任意算法。优选WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列一致性(Altschul等，Methods in Enzymology 266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用数个检索参数，大部分设置为缺省值。可调参数的数值设置如下：重叠跨距＝1，重叠分数＝0.125，字串阈值(word threshold)(T)＝11。HSP评分(S)和HSP S2参数为动态的数值，由程序自身根据特定序列的组成来确定，然而最小值可以被调整并按上文所述来设置。
在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物包含在天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物可通过取代、增加和/或缺失来改变氨基酸序列来获得。例如，天然存在的血管紧张素(1-7)(SEQ ID NO:1)的序列中的一个或多个氨基酸残基可被具有相似极性的另一个氨基酸取代，作为功能等价物，产生沉默改变。序列内氨基酸的取代可选择此氨基酸所属类别的其他成员。例如正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。无电荷极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。负电荷(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可分类为非极性氨基酸家族或无电荷(中性)极性氨基酸家族。一个氨基酸家族内的取代一般称为保守性取代。例如，肽抑制剂的氨基酸序列可被修饰或取代。
血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物和衍生物示例在下文标题为“示例性血管紧张素(1-7)肽”的章节中描述。
血管紧张素(1-7)肽可以为任何长度。在一些实施方式中，根据本发明的血管紧张素(1-7)肽可以含有例如4-25个氨基酸(如4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7个氨基酸)。在一些实施方式中，根据本发明的血管紧张素(1-7)肽可以含有5-25个氨基酸残基，如5-20、5-15或5-10个氨基酸残基。在一些实施方式中，根据本发明的血管紧张素(1-7)肽含有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基。
在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种修饰，以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，适宜的修饰选自聚乙二醇化、乙酰化、糖基化、生物素化、使用D-氨基酸和/或非天然氨基酸取代，以及/或肽的环化。
本申请中使用的术语“氨基酸”最为宽泛的含义是指可掺入一条多肽链的任何化合物和/或物质。在某些实施方式中，氨基酸具有H2N-C(H)(R)-COOH的通式结构。在某些实施方式中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，氨基酸是合成或非天然的氨基酸(例如，α,α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸)；在一些实施方式中，氨基酸为D-氨基酸；在某些实施方式中，氨基酸为L-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中常见的二十种标准氨基酸的任意一种，包括经天然掺入肽中的L-氨基酸和D-氨基酸。“非标准”或“非常规氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是否合成制备或由自然来源获得的。本申请中使用的“合成或非天然氨基酸”包含经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。肽中包含羧基末端和/或氨基末端氨基酸在内的氨基酸，可进行甲基化、酰胺化、乙酰化修饰，和/或使用可改变肽的循环半衰期而对其活性没有不良影响的其他化学基团取代修饰。非常规或非天然氨基酸的示例包括但不限于瓜氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基苏氨酸(MeBmt)、N-甲基-亮氨酸(MeLeu)、氨基异丁酸、抑胃酶氨酸和N-甲基-丙氨酸(MeAla)。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”的用法可与“氨基酸残基”互换，可指游离氨基酸和/或肽上的氨基酸残基。从使用该术语的上下文可显而易见该术语是指代游离氨基酸还是肽的残基。
在某些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含一个或多个L-氨基酸、D-氨基酸和/或非天然氨基酸。
除了仅仅包含天然存在的氨基酸的肽以外，本发明还包含模拟肽(peptidomimetic)或肽类似物。制药业常使用肽类似物作为与模板肽具有类似性质的非肽药物。这种非肽化合物被称为“肽模拟物”或模拟肽(Fauchere等，Infect.Immun.54:283-287(1986)；Evans等，J.Med.Chem.30:1229-1239(1987))。与具有疗效的肽结构上有关的肽模拟物可用作生产等价物，或者产生增强的疗效或预防效果。一般而言，模拟肽与例如天然存在的受体结合多肽的范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物或药理学活性的多肽)结构相似，但其中一个或多个肽连接被例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-等连接任选地取代，取代的方法是本领域熟知的(Spatola,Peptide BackboneModifications(肽骨架修饰),Vega Data,1(3):267(1983)；Spatola等，Life Sci.38:1243-1249(1986)；Hudson等，Int.J.Pept.Res.14:177-185(1979)；和Weinstein.B.,1983,Chemistry and Biochemistry,of Amino Acids,Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学),Weinstein编,纽约的MD公司(Marcel Dekker))。这种肽模拟物与天然存在的多肽相比可以具有显著的优势，包括生产成本下降、化学稳定性提高、药理性质(如半衰期、吸收、效能、有效性等)增强，抗原性降低等。
血管紧张素(1-7)肽也包含其他类型的肽衍生物，所述衍生物包含不是肽的正常组成部分的附加化学部分，但前提是所述衍生物保持了所需的肽功能活性。此类衍生物的示例包括(1)氨基末端或另一个游离氨基的N酰基衍生物，其中所述酰基可以是链烷酰基(alkanoyl)(如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(如苯甲酰基)或保护基团如F-moc(芴基甲基-O-CO-)；(2)羧基末端或另一个游离羧基或羟基的酯；(3)羧基末端或另一个游离羧基的酰胺，所述酰胺由与氨或适当的胺反应而生成；(4)磷酸化的衍生物；(5)与抗体或其他生物配体偶联的衍生物及其他类型的衍生物；以及(6)与聚乙二醇(PEG)链偶联的衍生物。
Ang-(1-7)肽可通过本领域技术人员公知的任意肽合成方法来获得，包括合成(例如专用(exclusive)固相合成、部分固相合成、片段缩合法、经典溶液合成、自然化学连接)以及重组技术。例如，肽和肽的衍生物可以通过固相肽合成法来获得，简要而言，此法由将C末端氨基酸的羧基偶联至树脂(如二苯甲基胺树脂、氯甲基化树脂、羟甲基树脂)和连续添加N-α保护的氨基酸来组成。保护基团可以为本领域公知的任意这种基团。在向不断增长的链中增加各个新的氨基酸之前，去除此前向链中添加的氨基酸的保护基团。此种固相合成已在下列文献中公开：Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964)；Vale等，Science 213:1394-1397(1981)，美国专利号4,305,872和4,316,891，Bodonsky等Chem.Ind.(伦敦),38:1597(1966)；以及Pietta和Marshall，Chem.Comm.650(1970)，由Lubell等，在“Peptides”ScienceofSynthesis(“肽”合成的科学)21.11,ChemistryofAmides(酰胺化学).斯图加特的Thieme公司,713-809(2005)中进行的技术综述。向适当的树脂上偶联氨基酸也是本领域公知的方法，并在美国专利号4,244,946(在Houver-Weyl,MethodsofOrganicChemistry(有机化学方法)，卷E22a.Synthesisof PeptidesandPeptidomimetics(肽和模拟肽的合成),MurrayGoodman主编，斯图加特的Thieme公司纽约2002进行了综述)中公开。
除另有定义以外，本文中使用的科学和技术术语以及命名法与本发明相关的领域普通技术人员通常理解的意义相同。总体而言，细胞培养、感染、分子生物学方法等过程是本领域中的常用方法。这种标准技术可在参考手册如Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(现在分子生物学指南)，纽约的WI公司(WileyInterscience),2001；以及Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),2001中找到。
在制备Ang-(1-7)肽的任何过程中，可能需要保护所有相关分子的敏感性反应基团。可通过常规的保护基团来达到此种目的，所述保护基团例如在下列文献中所述的保护基团：T.W.Greene & P.G.M.Wuts的Protective Groups In Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，1991,纽约的约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)；以及Sewald和Jakubke的Peptides:chemistry and Biology(肽：化学和生物学)，2002,魏茵海姆的Wiley-VCH公司，第142页。例如，α氨基保护性基团包含酰基型保护性基团(如三氟乙酰基、甲酰基、乙酰基)、脂肪族聚氨酯保护性基团(如t-叔丁氧羰基(BOC)、环己氧基羰基)、芳香族聚氨酯型保护性基团(例如芴基-9-甲氧基-羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、Cbz衍生物)和烷基型保护性基团(如三苯甲基、苄基)。氨基酸侧链保护性基团包含苄基(对于Thr和Ser)，Cbz(Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys)、甲基乙基、环己基(Asp、His)、BOC(Arg、His、Cys)等。所述保护基团可使用本领域公知方法在方便的后续阶段中去除。
此外，Ang-(1-7)肽可按照FMOC方案在有机相中使用保护性基团合成。理想的是，所述肽使用高效液相(HPLC)在C18色谱柱中以70％的收率纯化，并使用10％-60％的乙腈梯度洗脱。肽的分子量可通过质谱法进行确证(在Fields G.B.的“Solid-PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)”Methods in Enzymology(酶学方法).卷289,学术出版社(Academic Press),1997中进行了综述)。
或者，Ang-(1-7)肽可在重组系统中使用例如编码多肽的多核苷酸序列来制备。应理解，多肽可以包含在同一多肽中一种以上的上述修饰。
虽然肽在体外可有效地引起生物学活性，但所述肽的体内有效性可能因蛋白酶的存在而下降。血清蛋白酶具有特异性的底物要求。底物必须同时具有L氨基酸和以供断裂的肽键。此外，肽链端解酶代表了在血清中蛋白酶活性的最主要成分，肽链端解酶通常对肽的第一个肽键产生作用，并且需要游离的N末端(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。鉴于此，使用经修饰的肽常更有优势。经修饰的肽保留了原始L氨基酸肽产生血管紧张素(1-7)所需生物活性的结构特性，但具有不易被蛋白酶和/或肽链端解酶断裂的优势。
可使用相同类型的D氨基酸系统性取代共有序列中的一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)以生成更为稳定的肽。因此，本发明中的肽衍生物或模拟肽可全部为L、全部为D或由D和L混合的、具有正向序列或反向序列的肽。N末端或C末端D氨基酸的存在增加了肽的体内稳定性，因为肽酶不能使用D氨基酸作为底物(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。反向D肽是指包含D氨基酸的肽，所述肽以与包含L-氨基酸的肽的相反的序列来排列。因此L-氨基酸肽的C末端残基变为D氨基酸肽的N末端，以此类推。反向D肽保留了与L氨基酸肽相同的二级构象，以及因此具有的相似活性，但在体外和体内对酶降解的抗性更高，因此比原始肽具有更强的疗效(Brady和Dodson,Nature 368:692-693(1994)；Jameson等，Nature368:744-746(1994))。类似地，可使用标准方法来生成反向L肽，其中母体肽的C末端取代反向L肽的N末端。可以预见的是，不具有显著二级结构(如短肽)的L氨基酸肽的反向L肽保留了与L氨基酸肽相同的间距和侧链构象，因此常与原始的L氨基酸肽具有相似的活性。此外，反向肽可包含L氨基酸和D氨基酸的结合。氨基酸间的间距以及侧链的构象可以得到保留，从而产生与原始的L氨基酸肽相似的活性。
另一种通过作用于肽的N末端或C末端残基产生肽酶抗性的有效方法是在肽末端添加化学基团，以使得经修饰的肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在肽的一个或两个末端进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-末端糖基化，已显示出增加了人血清中肽的稳定性(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。其他增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于，添加N-末端烷基，所述烷基由从一到二十个碳的低级烷基组成，例如乙酰基，和/或添加C末端酰胺或经取代的酰胺基团。特别地，本发明包括经修饰的肽，所述肽由带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺基团的肽组成。
在肽的子序列中使用非天然存在的氨基酸取代天然氨基酸也可使肽产生蛋白水解抗性。此种取代如通过肽链端解酶作用于N末端而不影响生物活性使肽产生蛋白水解抗性。非天然存在的氨基酸的例子包含α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-氨基酸和β-甲基氨基酸。在本发明中有用的氨基酸类似物可包括但不限于β-丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、o-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和其他非常规氨基酸。此外，使用非天然存在的氨基酸合成肽是本领域的常规技术。
此外，可使用本领域熟知的方法产生包含共有序列的或基本相同的共有序列变体的限制性肽(constrained peptide)(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387-418(1992))。例如，限制性肽可通过添加能够形成二硫桥的半胱氨酸残基而生成环肽来产生。可将环肽构建成没有游离N或C末端。因此尽管这种肽易于被不能剪切肽末端的肽链内切酶水解，但是不易于被肽链端解酶水解。具有N末端或C末端D氨基酸的肽的氨基酸序列以及环肽的氨基酸序列通常分别与其相应肽的序列相同，除了存在N末端或C末端的D氨基酸残基或其环状结构以外。
环肽
在一些实施方式中，天然存在的Ang(1-7)的功能性等价物、类似物或衍生物是环肽。本申请中使用的环肽具有两个非相邻残基间的分子内共价键。此分子内的键可以为主链与主链、侧链与主链或侧链与侧链间的键(即线形肽的末端官能团和/或末端或内侧残基的侧链官能团可以连接形成环化)。典型的分子内键包括二硫键、酰胺键和硫醚键。多种环化多肽的方法是本领域熟知的，可以对这种肽进行多种其他修饰。对于一般性的讨论，参见国际专利公开号WO 01/53331和WO 98/02452，其内容均通过引用并入本申请。此类环化键合和其他修饰也可用于本发明的环肽和衍生化合物。
本文中所述的环肽可包含L氨基酸残基、D氨基酸残基或其任意组合。氨基酸可以是天然或非天然来源，只要分子中存在至少一个氨基和至少一个羧基；一般优选α和β氨基酸。环肽也可以含有一种或多种稀有氨基酸(例如4-羟脯氨酸或羟赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物，例如具有C-末端羧酸酯酯化(如苄基、甲基或乙基酯)或酰胺化和/或具有N末端氨基修饰(如乙酰化或烷氧基羰基化)的氨基酸，带有或不带有多种侧链修饰和/或取代(如甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基化等)。适当的衍生物包含具有N-乙酰基(代表环化前的线形肽N末端的氨基被乙酰化)和/或C末端酰胺基(即环化前的线形肽的羧基末端被酰胺化)的氨基酸。环肽中可存在的普通氨基酸以外的残基包括但不限于青霉胺、β,β-四亚甲基半胱氨酸、β,β-环戊烷半胱氨酸、β-巯基丙酸、β,β-环戊烷-β-巯基丙酸、2-巯基苯、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、α-氨基己二酸、间-氨基甲基苯甲酸以及α,β-二氨基丙酸。
在合成带有或不带有N-乙酰化和/或C-酰胺化的线形肽后，可采用本领域技术人员熟知的任意多种技术来进行环化。在一个实施方式中，在反应性的氨基酸侧链间产生键合。例如，可通过任意多种方法使肽氧化使得包含两个含有巯基残基的线形肽形成二硫桥。在一种此类方法中，可使用碱性或中性的水性介质，在数天时间内，通过巯基的空气氧化产生二硫连接。对所用的肽进行高度稀释使得聚集和分子间副反应最小化。另一种方法是，使用强氧化剂如I2和K3Fe(CN)6来形成二硫连接。本领域的那些普通技术人员将理解必须谨慎操作以防止将Met、Tyr、Trp或His敏感侧链氧化。在进一步的实施方式中，可通过形成酰胺键完成环化。例如，可在末端官能团(即环化前的线形肽的氨基末端和羧基末端)间形成肽键。在另一个此类的实施方式中，线形肽含有D-氨基酸。或者，可以通过带有或不带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺的、连接一个末端和一个残基侧链或使用两个侧链来实现环化。能够形成内酰胺键的残基包含赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、α-氨基己二酸、间-氨基甲基苯甲酸、α,β-二氨基丙酸、谷氨酸或天冬氨酸。形成酰胺键的方法通常为本领域熟知。在一个此类方法中，碳二亚胺介导的内酰胺的形成可以通过羧酸与DCC、DIC、ED AC或DCCI反应，以形成O-酰基脲，然后O-酰基脲能够立即与游离氨基反应来完成环化。或者，可使用叠氮化物的方法完成环化，其中反应性的叠氮化物中间体可由烷基酯通过酰肼产生。或者，可以使用经活化的酯类来完成环化。酯类的烷氧基碳上存在吸电子取代基增加了酯对氨解的敏感性。对-硝基苯酚、N-羟基化合物以及多卤代苯酚的酯的高反应性使得这些“活性酯”可用于合成酰胺键。在进一步的实施方式中，在含巯基残基侧链和适当衍生后的α-氨基酸之间可形成硫醚连接。举例如下，赖氨酸侧链可通过碳二亚胺偶联的方法(DCC、EDAC)被偶联至溴乙酸，然后与上文所述的任何包含巯基残基的侧链反应来形成硫醚连接。为了形成二甲基二硫醚(dithioether)，任意两种含巯基侧链可与二溴乙烷和二异丙胺在DMF中反应。
示例性的血管紧张素(1-7)肽
线形血管紧张素(1-7)肽
在某些方面，本发明提供了线形血管紧张素(1-7)肽。如上文所述，天然存在的血管紧张素(1-7)的结构如下：
Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)
通常使用式(I)表示本发明的肽和肽的类似物或其药学上可接受的盐：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7(SEQ ID NO:3)。
Xaa1是任意氨基酸或二羧酸。在某些实施方式中，Xaa1是Asp、Glu、Asn和Acpc(1-氨基环戊烷羧酸)、Ala、Me2Gly(N,N-二甲基甘氨酸)、Pro、Bet(甜菜碱、1-羧基-N,N,N-四甲基氢氧化铵五水合物(N,N,N-trimethylmethanaminium hydroxide))、Glu、Gly、Asp、Sar(肌氨酸)或Suc(琥珀酸)。在某些此种实施方式中，Xaa1是带负电荷的氨基酸，例如Asp或Glu，通常为Asp。
Xaa2是Arg、Lys、Ala、Cit(瓜氨酸)、Orn(鸟氨酸)、乙酰化Ser、Sar、D-Arg和D-Lys。在某些实施方式中，Xaa2是带正电荷的氨基酸例如Arg或Lys，通常为Arg。
Xaa3是Val、Ala、Leu、Nle(正亮氨酸)、Ile、Gly、Lys、Pro、羟Pro(羟脯氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、Acpc或Tyr。在某些实施方式中，Xaa3是脂肪族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Val或Nle。
Xaa4是Tyr、Tyr(PO3)、Thr、Ser、高Ser(高丝氨酸)、氮杂Tyr(氮杂-α1-高-L-酪氨酸)或Ala。在某些实施方式中，Xaa4是羟基取代的氨基酸例如Tyr、Ser或Thr，通常为Tyr。
Xaa5是Ile、Ala、Leu、norLeu、Val或Gly。在某些实施方式中，Xaa5是芳香族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Ile。
Xaa6是His、Arg或6-NH2-Phe(6-氨基苯丙氨酸)。在某些实施方式中，Xaa6是全部或部分带正电荷的氨基酸如Arg或His。
Xaa7是Cys、Pro或Ala。
在某些实施方式中，Xaa1-Xaa7中的一个或多个与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa1-Xaa7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa1-Xaa6中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。
在某些实施方式中，Xaa3是Nle。当Xaa3是Nle时，Xaa1-Xaa2和Xaa4-7中的一个或多个任选地与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa1-Xaa2和Xaa4-7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa1-Xaa2和Xaa4-7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同，从而产生氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方式中，肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ IDNO:4)。
在某些实施方式中，肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys(SEQ IDNO:5)或Asp1-Arg2-Val3-ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ ID NO:6)。
示例性的环状血管紧张素(1-7)肽
在某些方面，本发明提供了包含连接的环状血管紧张素(1-7)(Ang-(1-7))肽类似物，所述连接例如在Ang的Tyr4和Pro7位置的相应氨基酸侧链之间的连接。这些肽的类似物一般包含7个氨基酸残基，但也可包含可裂解序列。如下文的更加详细的描述，本发明包括片段和类似物，其中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸(包含片段)取代。此类片段或类似物的一个示例为Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ IDNO:22)，其中Ser4与Cys7之间形成连接。
虽然下面的章节描述了本发明在位置4和位置7间的硫醚键连接残基，应理解其他连接(如上文所述)可以替代硫醚桥且其他残基可以被环化。硫醚桥也可称为单硫桥，或者在Ala-S-Ala中，称为羊毛硫氨酸桥。包含硫醚桥的肽可由具有下式之一的两个氨基酸形成：
在这些式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地为-H、烷基(如C1-C6烷基、C1-C4烷基)或芳烷基，其中所述烷基和芳烷基基团任选地被一个或多个卤素、-OH或–NRR’基团取代(其中R和R’独立地为–H或C1-C4烷基)。在某些实施方式中，R1、R2、R3、R4、R5和R6分别独立地为-H或-CH3，例如全部为–H。
在某些实施方式中，本发明提供了包含如式(I)所示的硫醚桥的血管紧张素类似物或衍生物。通常，R1、R2、R3和R4独立地选自-H和-CH3。包含如式(I)所示的硫醚桥的肽可通过例如羊毛硫抗生素(lantibiotic)酶或通过二硫化物脱出硫来生产。在一个实施例中，脱出硫的二硫化物可通过位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-半胱氨酸或通过位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-青霉胺形成(参见如Galande,Trent和Spatola(2003)Biopolymers 71,534-551)。
在其他实施方式中，两个氨基酸间的连接可以为式(II)或式(III)中所示的桥。包含如式(II)所示的硫醚桥的肽可以通过例如在位置4的D-高半胱氨酸和在位置7的L-半胱氨酸形成的二硫化物脱出的硫来制备。类似的，包含如式(III)所示的硫醚桥的肽可以通过例如位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-高半胱氨酸形成的二硫化物脱出的硫来制备。
如上文所述，本发明的血管紧张素类似物和衍生物的长度和氨基酸组成不同。本发明的血管紧张素类似物和衍生物优选具有生物活性或者是可通过蛋白水解活化(例如通过裂解2个氨基酸将具有10个氨基酸的血管紧张素(I)转化为活性片段)的无活性的前体分子。血管紧张素类似物或衍生物的大小可以改变，但一般是约5至10个氨基酸，只要所述包含3-7Nle-硫醚-环结构的“核心”五聚体片段包含在内即可。本发明的类似物或衍生物的氨基酸序列可以改变，通常只要其具有生物活性或可通过蛋白水解来活化即可。可使用本领域公知的方法来确定类似物或衍生物的生物活性，所述方法包括放射配体结合研究、体外细胞激活检测和体内实验。例如可参见Godeny和Sayeski,(2006)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.291:C1297-1307；Sarr等，Cardiovasc.Res.(2006)71:794-802；以及Koziarz等，(1933)Gen.Pharmacol.24:705-713。
仅肽的长度可变的血管紧张素类似物和衍生物包括下列：
命名为[Cyc4-7]Ang(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-7)(Asp1-Arg2-Val3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7,SEQ ID NO:7)。
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(1-10)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素I(Ang-(1-10))(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His9-Leu10,SEQ ID NO:8)；
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(1-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素II(Ang-(1-8))(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8,SEQ ID NO:9)；
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(2-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素III(Ang-(2-8))(Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8,SEQ ID NO:10)；
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(3-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素IV(Ang-(3-8))(Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8,SEQ ID NO:11)；
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-7)(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7,SEQ ID NO:12)；以及
命名为[Nle3,Cyc4-7]Ang(1-9)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素(1-9)(Asp1-Arg2-Nle3-Cyc4-Ile5-His6-Cyc7-Phe8-His9,SEQ ID NO:13)。
这些类似物可具有式(I)-(III)中所示硫醚桥之一作为Cyc4-7部分，例如，其中Cyc4和Cyc7可由式(I)表示，这样其中R1-R4各为–H或–CH3，通常为-H。
与天然血管紧张素肽的氨基酸序列相比，Cyc4-7类似物的位置4和位置7处的氨基酸经过修饰以允许引入上文所述的硫醚-环结构。除了血管紧张素类似物的长度以外，位置3、位置4和位置7以外的其他位置的氨基酸可以与天然存在的肽相同或不同，通常前提是只要类似物保留生物功能即可。对于无活性前体类似物，像[Cyc4-7]血管紧张素(l-10)，生物功能是指类似物对血管紧张素转化酶具有易感性或指片段自身的生物活性这两种情况之一或全部，所述血管紧张素转化酶可将类似物裂解成为生物活性片段(如血管紧张素(1-8)或血管紧张素(1-7))。在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物不具有内在功能但具有抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用。
在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物可由式(IV)表示：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cyc4-Xaa5-Xaa6-Cyc7(IV,SEQ ID NO:14)
Xaa1是任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸例如Glu或Asp，更通常为Asp。
Xaa2是带正电荷的氨基酸，例如Arg或Lys，通常为Arg。
Xaa3是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Val。
Cyc4与Cyc7结合形成硫醚桥。Cyc4可以为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc4(与Cyc7一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH3，特别是–H。
Xaa5是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Ile。
Xaa6是His。
Cyc7与Cyc4结合形成硫醚桥，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc7可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc7的示例(与Cyc4一起)如式(II)、(III)和(IV)所示。通常，式(II)、(III)和(IV)中的R基为–H或–CH3，特别是–H。
在某些实施方式中，一个或多个Xaa1-Xaa6(Cyc4和Cyc7除外)与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa1-Xaa6中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa1-Xaa6中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。
在某些实施方式中，Cyc4和Cyc7独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，环状类似物可具有由-Ala4-S-Ala7-(式(I)，其中R1-R4各为-H)；-Ala4-S-Abu7-(式(I)：R1-R3为-H且R4为-CH3)或-Abu4-S-Ala7-(式(I)：R1、R3和R4为–H且R2为–CH3)形成的硫醚连接。环状类似物的特定示例包含-Abu4-S-Ala7-或-Ala4-S-Ala7-连接。
在某些实施方式中，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Abu4-Ile5-His6-Ala7(SEQ ID NO:15)或氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ala4-Ile5-His6-Ala7(SEQ ID NO:16)的血管紧张素(1-7)类似物，所述类似物由下面的结构图表示：
在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物可由下面的式(IV)表示：
Xaa1-Xaa2-Nle3-Cyc4-Xaa5-Xaa6-Cyc7-Xaa8-Xaa9-Xaa10(IV,SEQ ID NO:17)
如上文所述，Xaa1、Xaa2、Xaa8、Xaa9和Xaa10中的一个或多个在某些实施方式中缺失。例如，(1)Xaa10缺失，(2)Xaa9和Xaa10缺失，(3)Xaa8、Xaa9和Xaa10缺失，(4)Xaa1缺失，(5)Xaa1和Xaa10缺失，(6)Xaa1、Xaa9和Xaa10缺失，(7)Xaa1、Xaa8、Xaa9和Xaa10缺失，(8)Xaa1和Xaa2缺失，(9)Xaa1、Xaa2和Xaa10缺失，(10)Xaa1、Xaa2、Xaa9和Xaa10缺失或(11)Xaa1、Xaa2、Xaa8、Xaa9和Xaa10缺失。对于这些实施方式中的各个实施方式，剩余的氨基酸具有下列值。
Xaa1，存在时可为任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸如Glu或Asp，更通常为Asp。
Xaa2，存在时为带正电荷的氨基酸如Arg或Lys，通常为Arg。
Nle3为正亮氨酸。
Cyc4与Cyc7结合形成硫醚桥。Cyc4可以为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc4(与Cyc7一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH3，特别是–H。
Xaa5为脂肪族氨基酸如Leu、Nle、Ile或Val，通常为Ile。
Xaa6为His。
Cyc7与Cyc4结合形成硫醚键，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc7可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc7(与Cyc4一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基为–H或–CH3，特别是–H。
Xaa8存在时为除Pro以外的氨基酸，通常为Phe或Ile。在某些实施方式中，Ile产生血管紧张素(1-8)抑制剂。在某些实施方式中，Phe保持了血管紧张素(1-8)或血管紧张素(1-10)的生物活性。
Xaa9存在时为His。
Xaa10存在时为脂肪族残基，例如Ile、Val或Leu，通常为Leu。
在某些实施方式中，Xaa1-Xaa10的一个或多个(Nle3、Cyc4和Cyc7除外)与天然存在的血管紧张素(包含血管紧张素(1-7)、血管紧张素(1-8)、血管紧张素(1-9)、血管紧张素(1-10)、血管紧张素(2-7)、血管紧张素(2-8)、血管紧张素(2-9)、血管紧张素(2-10)、血管紧张素(3-8)、血管紧张素(3-9)和血管紧张素(3-10))中相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，除了一个或两个以外，Xaa1-Xaa10(对于存在的那些而言)中的全部均与天然存在的血管紧张素的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa1-Xaa10(对于存在的那些而言)中的全部均与天然存在的血管紧张素中的相应氨基酸相同。
在某些实施方式中，Cyc4和Cyc7独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，所包含的为含有由-Ala4-S-Ala7-(式(I)，其中R1-R4各为-H)；-Ala4-S-Abu7-(式(I)：R1-R3为-H且R4为-CH3)或-Abu4-S-Ala7-(式(I)：R1、R3和R4为–H且R2为–CH3)形成的硫醚桥的环状类似物。特定的环状类似物包含-Abu4-S-Ala7-或-Ala4-S-Ala7-连接。
特别地，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Abu4-Ile5-His6-Ala7(SEQ ID NO:18)或氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Ala4-Ile5-His6-Ala7(SEQ ID NO:19)的血管紧张素(1-7)类似物或衍生物。
在另一方面，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有血管紧张素(1-8)拮抗活性的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物，特别是具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Abu4-Ile5-His6-Ala7-Ile8(SEQ ID NO:20)或氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Ala4-Ile5-His6-Ala7-Ile8(SEQ ID NO:21)的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物。
烷基是直链或支链的完全饱和的非芳香族烃。通常，直链或支链烷基具有1个至约20个碳原子，优选1个至约10个。直链或支链烷基的示例包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。
芳烷基是被芳基取代的烷基。芳香(芳)基包含碳环芳香基例如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基团也包含稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包含苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
血管紧张素(1-7)受体激动剂
本发明还涉及血管紧张素(1-7)受体激动剂在治疗周围血管疾病中的用途。本文所述的术语“血管紧张素(1-7)受体激动剂”包含对血管紧张素(1-7)受体(特别是G蛋白偶联的Mas受体)功能具有正向影响的任何分子。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂直接或间接增强、加强、激活和/或增加血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)活性。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂与血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)直接相互作用。此类激动剂可为肽或非肽，包含如蛋白、化合物、小分子、核酸、抗体、药物、配体或其他试剂。
示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为1-(对-噻吩基苄基)咪唑。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂或其药学上可接受的盐的示例如结构式(IV)所表示：
其中：
R1是卤素、羟基、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C8)-烷氧基，其中1至6个碳原子被杂原子O、S或NH(优选O)取代，被饱和的环状醚如四氢吡喃或四氢呋喃取代的(C1-C4)-烷氧基，O-(C1-C4)-烯基、O-(C1-C4)-烷基芳基，或未被取代的或被选自卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基和三氟甲基的取代基取代的芳氧基；
R2是CHO、COOH或(3)CO-O-(C1-C4)-烷基；
R3是(C1-C4)-烷基或芳基；
R4是氢、卤素(氯、溴、氟)或(C1-C4)-烷基；
X是氧或硫；
Y是氧或-NH-；
R5是氢、(C1-C6)-烷基；或(C1-C4)-烷基芳基，其中当Y是-NH-时R5是氢；以及
R6是(C1-C5)-烷基。
在某些实施方式中，当R2是COOH或CO-O-(C1-C4)-烷基时R1不是卤素。
在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂为AVE 0991，5-甲酰基-4-甲氧基-2-苯基-1[[4-[2-(乙基氨基羰基亚磺酰氨基(sulfonamido))-5-异丁基-3-噻吩基]-苯基]-甲基]-咪唑，其可由下面的结构表示：
另一个示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为对-噻吩苄基酰胺。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂或其药学上可接受的盐的示例如下面的结构式(V)所示：
其中：
R1是未被取代的或由选自NH2、卤素、O-(C1-C3)-烷基、CO-O-(C1-C3)-烷基和CO2H的基团取代的(C1-C5)-烷基，(C3-C8)-环烷基、(C1-C3)-烷基-(C3-C8)-环烷基，未被取代的或由选自卤素和O-(C1-C3)-烷基的基团取代的(C6-C10)-芳基，(C1-C3)-烷基-(C6-C10)-芳基，其中所述芳基未被取代的或被选自卤素和O-(C1-C3)-烷基的基团取代、(C1-C5)-杂芳基或(C1-C3)-烷基-(C1-C5)-杂芳基；
R2是氢，未被取代的或被选自卤素和O-(C1-C3)-烷基的基团取代的(C1-C6)-烷基，(C3-C8)-环烷基，(C1-C3)-烷基-(C3-C8)-环烷基，未被取代的或被由选自卤素、O-(C1-C3)-烷基和CO-O-(C1-C3)-烷基的基团取代的(C6-C10)-烷基，或者未被取代的或由选自卤素和O-(C1-C3)-烷基的基团取代的(C1-C3)-烷基-(C6-C10)-芳基；
R3是氢、COOH或COO-(C1-C4)-烷基；
R4是氢、卤素；或(C1-C4)-烷基；
R5是氢或(C1-C6)-烷基；
R6是氢、(C1-C6)-烷基、(C1-C3)-烷基-(C3-C8)-环烷基或(C2-C6)-烯基；以及
X是氧或NH。
血管紧张素-(1-7)受体激动剂的其他示例如美国专利号6,235,766和6,538,144中所述，其内容通过引入并入本申请。
上文中所述的各种血管紧张素(1-7)受体激动剂可以以药学上可接受盐的形式存在。本申请中使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留了肽或等价物化合物所需活性但优选对肽或使用此肽的系统的其他成分的活性不产生不良影响的盐类。此种盐类的示例为与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。盐也可与有机酸形成，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、褐藻酸、聚谷氨酸等。使用阳离子材料形成的盐可使用这些无机酸和有机酸的共轭碱。还可使用例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍等多价金属阳离子或通过N,N’-二苄乙烯二胺或乙二胺或其组合形成的有机阳离子(例如鞣酸锌盐)形成盐。优选无毒的、在生理学上可接受的盐。
可以通过常规方法形成所述的盐，如通过将游离酸或游离碱形式的产物与适宜的酸或碱的一种或多种等价物在所述盐不溶的溶剂或介质中或在溶剂如水中反应，然后真空或通过冷冻干燥，或者通过在适宜的离子交换树脂上将现有的盐的阳离子与另一种阳离子交换除去水。
烷基是直链或支链的完全饱和的非芳香族烃。通常，直链或支链烷基具有1个至约20个碳原子，优选1个至约10个。直链或支链烷基的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。
烯基是包含一个或多个双键的直链或支链非芳香烃。通常，直链或支链烯基具有2至约20个碳原子，优选2至约10个。直链和支链烯基的示例包括乙烯基、正丙烯基、正丁烯基。
芳香(芳)基包括碳环芳香基如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基也包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
芳烷基是被芳基取代的烷基。芳香(芳)基包括碳环芳香基例如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基团也包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
血管紧张素转化酶2(ACE2)
本发明还涉及血管紧张素转化酶2(ACE2)在治疗周围血管疾病中的用途。ACE2是参与肾素-血管紧张素-醛固酮(aldoterone)系统的酶。ACE2通常以膜锚定糖蛋白的形式在各种器官如心脏、肾脏、肝脏和肺以及血管中表达。ACE2是一种羧肽酶，其裂解多种肽底物，包括爱帕林(apelin)、缓激肽、血管紧张素I，血管紧张素I被裂解为血管紧张素1-9，以及AngII，AngII被裂解为Ang 1-7。在本申请中使用的术语“ACE2活性”指能够将AngII转化为Ang 1-7的ACE2酶或多肽。
通常，人野生型ACE2具有805个氨基酸残基，包括信号序列(氨基酸1-17，在下表1中以下划线表示)和C-末端疏水性末端，其参与膜锚定(在下表1中以粗体表示)。在一些实施方式中，除去C-末端的疏水性残基导致蛋白的溶解性增加。人野生型ACE2的mRNA和氨基酸序列的GenBank登录号分别为AB046569和BAB40370，并且如下表1所示。
表1：人ACE2
因此，在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶是全长的成熟的人ACE2蛋白(SEQ ID NO:25)。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶是成熟的ACE2酶，所述酶包含达到与全长前体ACE2(SEQ ID NO:26)中的氨基酸740对应的残基。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶是成熟的ACE2酶，所述酶包含达到与全长前体ACE2(SEQ ID NO:27)中的氨基酸615对应的残基。在一些实施方式中，适宜的ACE2酶可以是成熟人ACE2酶的同源物或类似物。例如，成熟ACE2酶的同源物或类似物可以是修饰的成熟人ACE2酶，所述酶与野生型或天然存在的ACE2蛋白(例如SEQ ID NO:25)相比含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，但保留了基本的ACE2酶的活性。因此，在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶与成熟人ACE2蛋白(SEQ ID NO:25)或蛋白片段(SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27)基本上是同源的。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:25具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶与成熟ACE2蛋白(SEQ ID NO:25)或蛋白片段(SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27)基本上是相同的。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:25或其蛋白片段(SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的一致性。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2酶含有成熟人ACE2蛋白的片段或部分。
在美国公开号2011/0020315、美国公开号2011/033524和美国公开号2010/0316624中提供了ACE2核苷酸和氨基酸序列的其他示例，其全部内容均通过引用并入本申请。
在一些实施方式中，适于本发明的ACE2是天然存在的ACE2酶的片段，其保留了显著的ACE2活性，即能够将Ang II转化为Ang 1-7。在一些实施方式中，与野生型人ACE2酶活性相比适于本发明的ACE2酶保留了50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％或更高的活性。
在一些实施方式中，ACE2是ACE2酶的可溶性形式。例如，在一些实施方式中，ACE2是ACE2酶缺乏部分或全部C-末端疏水区的片段。还可以通过糖基化影响蛋白的溶解度。人野生型ACE2的可溶性部分具有7个N-糖基化位点，在这些位点糖基化可以增加该蛋白的溶解度。在一些实施方式中，适于本发明的ACE2具有与对照相比使得该蛋白的溶解度增加的糖基化类型。在一些实施方式中，至少1、2、3、4、5、6或7个ACE2N-糖基化位点被糖基化。在各种实施方式中，ACE2酶的糖组分占ACE2总重量的10％、15％、20％或25％以上，在一些实施方式中，一个或多个糖基化位点被唾液酸化(sialyse)。例如，在一些实施方式中，对应于位置53、90、103、322、432、546和/或690的一个或多个天冬酰胺残基被单、二、三或四唾液酸化。在一些实施方式中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的所述氨基酸被单、二、三或四唾液酸化。
ACE2存在于以Ang II作为底物的所有哺乳动物中。应当认识到适宜的ACE2可以来自任意生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、灵长类或牛等等。
在一些实施方式中，ACE2酶通过重组生产。可以使用任意的表达系统重组生产酶。仅举几个例子，公知的表达系统包括例如卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，适于本发明的酶在哺乳动物细胞中生产。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性例子包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l,ECACCNo:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6,CruCell公司，荷兰的莱顿)；经SV40转染的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(用于在悬浮培养基中生长的293或293细胞亚克隆，Graham等,J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(HepG2)。
ACE2活化剂
本发明还涉及ACE2活化剂在治疗周围血管疾病中的用途。在本申请中使用的术语“ACE2活化剂”包含在ACE2的功能中具有正面影响的任意分子。在一些实施方式中，ACE2活化剂直接或间接地加强、增强、活化和/或增加ACE2的活性。在一些实施方式中，ACE2活化剂直接与ACE2相互作用。此类acACE2活化剂可以是肽或非肽。在一些实施方式中，ACE2活化剂是小分子。各种ACE2活化剂是本领域所公知的并且可以根据本发明使用。例如，三氮脒(Diminazene Aceturate)(DIZE)：
和1-[(2-二甲基氨基)乙基氨基]-4-(羟基甲基)-7-[(4-甲基苯基)磺酰氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮(XNT)：
已显示出作为ACE2活化剂的功能；参见例如Gjymishka等，“Diminazene Aceturate isan ACE2Activator and a Novel Hypertensive Drug”(三氮脒是ACE2活化剂和新型降压药)FASEB J.241032.3(2010)和Ferreira等，“Evidence for Angiotensin-convertingEnzyme 2as a Therapeutic Target for the Prevention of Hypertension”(血管紧张素转化酶2作为用于预防高血压的治疗性靶点的证据)Am.J.Respir.Crit.Care Med.179:1048(2009)，其全部内容均通过引用并入本申请。例如在WO 2004/000365和美国专利号6,194,556中公开了适宜的ACE2活化剂或ACE2激动剂的其他示例，其内容均通过引用并入本申请。
治疗应用
在一些实施方式中，本发明提供了使用血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂治疗周围血管疾病(PVD)及相关疾病、病症和病况的方法。不希望受到任何特定理论或假设的束缚，可以预见到血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂可以在靶组织中通过刺激治疗性血管生成改善血流和功能的恢复。
在某些实施方式中，本发明的方法和组合物用于刺激由周围血管疾病、病症或病况导致的缺血损伤的组织和/或细胞的修复。在一些实施方式中，本发明的方法和组合物用于刺激在由缺血如缺血性中风导致的急性病况中的组织损伤的修复。通过非限制性示例的方式，本发明的方法和组合物可以用于治疗周围血管疾病，如周围动脉疾病(PAD)，特别是严重肢体缺血(CLI)。在本申请中使用的术语“严重肢体缺血”或“CLI”通常特征为提供给个体四肢(例如，手、脚、腿)的血液或氧气受限的病况，所述病况可能导致在四肢中的组织受损或功能障碍。严重肢体缺血可能是由各种各样的因素引起，如周围动脉疾病(PAD)，并且可以导致严重疼痛、皮肤溃疡或生疮，并且在一些情况下导致截肢。严重肢体缺血特征可以为一个或多个四肢血管收缩、血栓形成或栓塞。正常接受血液供应的四肢的任意组织均能够出现严重肢体缺血。
在一些实施方式中，本发明的方法和组合物用于治疗糖尿病性血管病。在本申请中使用的术语“糖尿病性血管病”指与由糖尿病引起的血管(特别是动脉)阻塞的发展相关的疾病、病症或病况。糖尿病性血管病能够在全身发展。在一些实施方式中，如本申请所使用的糖尿病性血管病在心脏和脑以外的一种或多种组织发展。在一些实施方式中，本发明的方法和组合物用于治疗糖尿病性血管病的特殊类型，如肾病(肾脏疾病)、和/或神经病(引起脚趾或足部保护性感觉丧失的神经本身的病况)。糖尿病性血管病的示例性症状可以包括但不限于视力模糊、面部或肢体水肿或者意外的体重增加、足部生疮、手或脚的感觉丧失或有灼烧感、当行走时腿部疼痛以及高血压。患有糖尿病性血管病的患者最终会发展为组织坏死，这被称为坏疽。这能够导致感染并最终截肢。
周围血管疾病
除了其他以外，本发明的方法和组合物用于治疗或改善周围血管疾病。在本申请中使用的术语“周围血管疾病”或“PVD”指位于心脏和脑以外的血管的疾病。
在一些实施方式中，治疗指在对象中使周围动脉疾病部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、推迟发作、降低严重程度和/或发生率。在本申请中使用的术语“周围动脉疾病”或“PAD”指PVD的一种形式，其中存在向各种内脏和/或肢体提供血液供应的动脉部分或完全阻塞。在一些实施方式中，治疗指在对象中使严重肢体缺血部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、推迟发作、降低严重程度和/或发生率。在本申请中使用的术语“严重肢体缺血”或“CLI”通常特征为提供给个体四肢(例如，手、臂、脚、腿)的血液或氧气受限的病况，所述病况可以导致在四肢中的组织受损或功能障碍。严重肢体缺血可能是由各种各样的因素引起，如周围动脉疾病(PAD)，并且可以导致严重疼痛、皮肤溃疡或生疮，并且在一些情况下导致截肢。严重肢体缺血的特征可以为一个或多个四肢血管收缩、血栓形成或栓塞。正常接受血液供应的四肢的任意组织均能够出现严重肢体缺血。
在一些实施方式中，治疗指在患有周围血管疾病、病症或病况的对象中改善血流。应当认识到能够使用任意可用的方法和/或仪器来测量血流。例如，在一些实施方式中，使用激光多普勒测量血流。应当认识到能够在治疗前和/或后任意适宜的时间测量血流。例如，在一些实施方式中，在治疗第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天或第49天中的一天或多天测量血流。在一些实施方式中，血流测量结果用在疾病和/或受损组织中的血流与在正常组织中的血流比表示。在一些实施方式中，在疾病和/或受损组织中的血流与在同一个体的正常组织中相比高出20％、高出30％、高出40％、高出50％、高出60％或高出65％。在一些实施方式中，平均来说，在疾病和/或受损组织中的血流每周增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更多。
在一些实施方式中，治疗指在疾病和/或受损组织中减少或阻止坏死(例如增加缺血评分)。例如，在一些实施方式中，通过对疾病和/或受损组织中缺血严重程度的宏观评估确定坏死。应当认识到能够通过任意适当的方法确定坏死。例如，在一些实施方式中，指定坏死区域的形态分级，如Goto等(Tokai J Exp Clin Med,31(3):128,2006)公开的那些。小鼠中坏死区域的示例性形态分级见下表2。
表2：
等级 描述
0 无坏死
1 坏死限于脚趾(失去脚趾)
2 坏死延伸至足背(失去足部)
3 坏死延伸至小腿(失去膝盖)
4 坏死延伸至大腿(失去全部后肢)
在一些实施方式中，坏死区域的形态分级降低约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更多个等级。在一些实施方式中，坏死区域的形态分级降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更多。
在一些实施方式中，治疗指改善肢体功能。应当认识到能够使用任意适当的方法和/或仪器来测量肢体功能。例如，在一些实施方式中，通过对缺血肢体受损使用情况的半定量评估确定肢体功能(参见例如Stabile等，Circulation 108(2):205,2003)。在小鼠中肢体功能的示例性评估量表见下表3。应当认识到对在人中肢体功能的评估与在小鼠中具有相关性。
表3：
等级 描述
0 弯曲脚趾以对抗轻扯尾部
1 跖屈
2 没有拖动但无跖屈
3 拖动足部
在一些实施方式中，肢体功能坏死区域的等级降低约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更多个等级。在一些实施方式中，肢体功能的等级降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更多。
药物组合物
药物组合物可为多种形式，包括口服剂型、局部乳剂、局部贴剂、离子导入形式、栓剂、鼻腔喷雾和吸入器、滴眼剂、眼内注射形式、贮库形式(depot form)以及可注射和输液(infusible)溶液。制备药物组合物的方法是本领域公知的。
药物组合物通常包含有效量的本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)以达到所需的治疗效果，同时避免或最小化有害副作用。本申请中提供了活性剂的药学上可接受的制剂和盐，并且所述制剂和盐是本领域熟知的。对于给予多肽等而言，选择所需的给药量使得其具有治疗作用但具有很少或没有有害副作用。用于有效治疗特定疾病、病状或病况的治疗性或药物组合物的量取决于疾病的性质和严重程度、作用靶点、对象的体重、对象特殊的饮食、合并用药、给药途径和本领域技术人员公知的其他因素。临床医师可根据常规因素调整采用的剂量，所述因素例如疾病的程度和对象的不同参数。可以从体外或动物模型检测系统中获得的剂量响应曲线推测得到有效剂量(参见例如在美国卫生与公众服务部，食品和药品管理局以及药物评估和研究中心的“行业指导原则：在成年健康志愿者首次临床试验的治疗中估计最大安全初始剂量”中描述的，药理和毒理，2005年7月,其全部内容通过引用并入本申请)。
各种递送系统是公知的并且能够用于给予本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)或含有活性剂的药物组合物。可以通过任意适宜的途径给予本申请所述的药物组合物，包括静脉内或肌内注射、脑室内或鞘内注射(用于中枢神经系统给药)、口服、局部、皮下、肺内(例如吸入)、结膜下、眼内、或通过鼻内、皮内、舌下、阴道、直肠或硬膜外途径。
本领域熟知的其他递送系统可用于本申请所述的药物组合物的递送，例如通过水溶液，包封在微粒或微囊中。本发明的药物组合物也可在控释系统中递送。例如，可使用的聚合物材料(参见如Smolen和Ball，Controlled Drug Bioavailability(受控的药物生物利用度),Drug product design and performance(药物产品设计和表现)，1984,约翰威利父子公司；Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(药物递送系统),pharmacology and toxicology series(药理学和毒理学系列)，2003，第二版，CRRC出版社)。或者，可使用泵(Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574(1989))。本申请所述组合物也可偶联至一类生物可降解聚合物上以实现药物受控释放，例如聚乳酸、聚原酸酯、交联两亲性嵌段共聚物和水凝胶、聚羟基丁酸和聚二氢吡喃。
如上文所述，药物组合物理想地包括药学上可接受的运载体。术语运载体是指给予肽、肽衍生物或模拟肽时使用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。此类药物运载体包括无菌液体(如水)和油，包括矿物油、植物油(例如大豆油或玉米油)、动物油或人工合成的油。水性甘油和葡萄糖溶液以及盐溶液也可用作本发明药物组合物的液体运载体。运载体的选择取决于本领域所公知的因素，例如肽、肽衍生物或模拟肽的性质，其溶解性和其他生理特性以及递送和应用的靶点。适当药物运载体的示例见Alfonso R.Gennaro的Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：科学与药学应用),2003，第21版，麦克出版公司(MackPublishingCompany)。此外，口服给药的适当运载体是本领域公知的并在如美国专利号6,086,918、6,673,574、6,960,355和7,351,741以及W02007/131286中描述，其公开的内容通过引用并入本申请。
可掺入药物制剂的其他药学上适宜的材料包括吸收促进剂(包括用于增强细胞旁吸收的成分)、pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、分散剂、调味剂、着色剂和润湿剂。
适当的药物赋形剂的示例包括水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙二醇、乙醇、单硬脂酸甘油酯、明胶、淀粉(如米粉)、白垩、硬脂酸钠、麦芽、氯化钠等。包含血管紧张素多肽的药物组合物可为溶液、胶囊、片剂、乳剂、凝胶、粉剂持续释放制剂等形式。所述组合物可为栓剂剂型，具有传统粘合剂和运载体例如甘油三酯(见AlfonsoR.Gennaro的Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：科学与药学应用),2003，第21版，麦克出版公司)。此类组合物包含治疗有效量的治疗性组合物以及适当量的运载体，以提供于对象给药的适当形式。设计制剂以适合给药模式和作用靶点(如特定的器官或细胞类型)。
包括如本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)的药物组合物也包括制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与游离的氨基形成的盐和与游离羧基反应的盐。无毒碱金属、碱土金属和铵盐常用于制药工业中，包括由本领域熟知方法制备的钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵和鱼精蛋白锌盐。还包括无毒性的酸加成盐，通常由本发明的化合物与适当的有机或无机酸反应来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、戊酸盐、草酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐(tysolate)、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、萘磺酸盐等。
根据本发明可用的填充剂或粘合剂的示例包括阿拉伯胶、海藻酸、磷酸钙(二元)、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、糊精、葡萄糖结合剂(dextrate)、蔗糖、甲基纤维素、预胶化淀粉、硫酸钙、直链淀粉、甘氨酸、皂土、麦芽糖、山梨醇、乙基纤维素、磷酸氢二钠、磷酸二钠、焦亚硫酸二钠、聚乙烯醇、明胶、葡萄糖、瓜尔胶、液体葡萄糖、可压缩糖、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、海藻酸钠、西黄蓍胶微晶纤维素、淀粉以及玉米蛋白。在某些实施方式中，填充剂或粘合剂是微晶纤维素。
可使用的崩解剂的示例包括海藻酸、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素(低取代)、微晶纤维素、粉状纤维素、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、甲基纤维素、聚克立林钾、聚维酮、海藻酸钠、羟乙酸淀粉钠、淀粉、焦亚硫酸二钠(disodium disulfite)、依地酸二钠(disodium edathamil)、依地酸二钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)交联的聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羧甲基淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素。
润滑剂的示例包括硬脂酸钙、菜籽油、硬脂酸棕榈酸甘油酯、氢化植物油(I型)、氧化镁、硬脂酸镁、矿物油、泊咯沙姆、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸富马酸钠、硬脂酸、滑石以及硬脂酸锌、甘油二十二烷酸酯(behapate)、十二烷基硫酸镁、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、苯甲酸钠/乙酸钠(联用)，DL-亮氨酸。
硅流速调节剂的示例包括胶体二氧化硅、硅酸镁铝和瓜尔胶。另一种最优选的硅流速调节剂为二氧化硅。
稳定剂的示例包括阿拉伯胶、白蛋白、聚乙烯醇、海藻酸、皂土、磷酸二钙、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、胶体二氧化硅、环糊精、单硬脂酸甘油酯、羟丙基甲基纤维素、三硅酸镁、硅酸镁铝、丙二醇、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、巴西棕榈蜡、黄原胶、淀粉、硬脂酸盐、硬脂酸、硬脂酸单甘油酯和十八烷醇。
在一些实施方式中，本发明涉及含有本申请所述活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)的口服制剂。例如，本申请所述的药物组合物可以包含环糊精或环糊精衍生物。环糊精通常由五个或更多个1->4连接的α-D-吡喃葡萄糖苷单元组成。通常，环糊精含有很多葡萄糖单体，在一个环中为6至8个单元，形成圆锥形(α-环糊精：6元糖环分子，β-环糊精：7元糖环分子，γ-环糊精：8元糖环分子)。在美国专利号7,723,304，美国专利公开号2010/0196452和美国专利公开号2010/0144624中公开了示例性的环糊精和环糊精衍生物，其全部内容均通过引用并入本申请。例如，在一些实施方式中，根据本发明的环糊精是烷基化环糊精、羟烷基化环糊精或酰化环糊精。在一些实施方式中，环糊精是羟丙基β-环糊精。示例性的环糊精衍生物参见Szejtli, J. Chem Rev, (1998), 98, 1743-1753；以及Szente, L和Szejtli, J., Advance DrugDelivery Reviews, 36 (1999) 17-28，其全部内容均通过引用并入本申请。环糊精衍生物的示例包括甲基化环糊精(例如RAMEB；随机甲基化β-环糊精)；羟烷基化环糊精(羟丙基-β-环糊精和羟丙基γ-环糊精)；乙酰化环糊精(乙酰基-γ-环糊精)；反应性环糊精(氯三嗪基β-环糊精)和支链环糊精(葡萄糖基和麦芽糖基β-环糊精)；乙酰基-γ-环糊精；乙酰基-β-环糊精、磺丁基-β环糊精、硫酸化α-, β-和γ-环糊精；磺烷基化环糊精和羟丙基β-环糊精。
剂量
通常，以0.001至100mg/kg/天范围的用量向所述对象给予本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)。例如，在一些实施方式中，向所述对象给予约0.01mg/kg/天至约25mg/kg/天、约1mg/kg/天至约20mg/kg/天、0.2mg/kg/天至约10mg/kg/天、约0.02mg/kg/天至约0.1mg/kg/天或约1mg/kg/天至约100mg/kg/天。在一些实施方式中，以约10μg/kg/天、50μg/kg/天、100μg/kg/天、200μg/kg/天、300μg/kg/天、400μg/kg/天、500μg/kg/天、600μg/kg/天、700μg/kg/天、800μg/kg/天、900μg/kg/天或1000μg/kg/天的量向所述对象给予本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)。
在一些实施方式中，以范围为约1-1,000μg/kg/天(例如范围为约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg/天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)的有效剂量范围给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-500μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-100μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以范围为约1-60μg/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。在一些实施方式中，以选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000ug/kg/天的有效剂量给予所述血管紧张素(1-7)肽。
在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂的治疗有效量可以是范围为约10-1,000mg的量(例如约20mg–1,000mg、30mg–1,000mg、40mg–1,000mg、50mg–1,000mg、60mg–1,000mg、70mg–1,000mg、80mg–1,000mg、90mg–1,000mg、约10-900mg、10-800mg、10-700mg、10-600mg、10-500mg、100-1000mg、100-900mg、100-800mg、100-700mg、100-600mg、100-500mg、100-400mg、100-300mg、200-1000mg、200-900mg、200-800mg、200-700mg、200-600mg、200-500mg、200-400mg、300-1000mg、300-900mg、300-800mg、300-700mg、300-600mg、300-500mg、400mg–1,000mg、500mg–1,000mg、100mg-900mg、200mg–800mg、300mg–700mg、400mg–700mg和500mg–600mg)。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂以或高于约10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg的量存在。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂以或低于约1000mg、950mg、900mg、850mg、800mg、750mg、700mg、650mg、600mg、550mg、500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg、150mg或100mg的量存在。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。
在其他实施方式中，治疗有效量可以是例如约0.001mg/kg重量至500mg/kg重量，例如从约0.001mg/kg重量至400mg/kg重量，从约0.001mg/kg重量至300mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至200mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至100mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至90mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至80mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至70mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至60mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至50mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至40mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至30mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至25mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至20mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至15mg/kg重量、从约0.001mg/kg重量至10mg/kg重量。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。
在另一个实施方式中，治疗有效量可以是例如约0.0001mg/kg重量至0.1mg/kg重量，例如从约0.0001mg/kg重量至0.09mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.08mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.07mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.06mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.05mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至约0.04mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.03mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.02mg/kg重量，从约0.0001mg/kg重量至0.019mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.018mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.017mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.016mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.015mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.014mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.013mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.012mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.011mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.01mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.009mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.008mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.007mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.006mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.005mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.004mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.003mg/kg重量、从约0.0001mg/kg重量至0.002mg/kg重量。在一些实施方式中，所述治疗有效剂量可以是0.0001mg/kg重量、0.0002mg/kg重量、0.0003mg/kg重量、0.0004mg/kg重量、0.0005mg/kg重量、0.0006mg/kg重量、0.0007mg/kg重量、0.0008mg/kg重量、0.0009mg/kg重量、0.001mg/kg重量、0.002mg/kg重量、0.003mg/kg重量、0.004mg/kg重量、0.005mg/kg重量、0.006mg/kg重量、0.007mg/kg重量、0.008mg/kg重量、0.009mg/kg重量、0.01mg/kg重量、0.02mg/kg重量、0.03mg/kg重量、0.04mg/kg重量、0.05mg/kg重量、0.06mg/kg重量、0.07mg/kg重量、0.08mg/kg重量、0.09mg/kg重量或0.1mg/kg重量。根据所述个体的需求，针对特定个体的有效剂量可以随时间改变(例如增加或减少)。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一个剂量中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。
V.试剂盒
在某些实施方式中，本发明还提供了试剂盒或其他生产物品，包含本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)、给药工具和/或使用说明书。例如，试剂盒或其他生产物品可以包括容器、导管和在给药中使用的任意其他物品、装置或设备。适当的容器包括如瓶子、小瓶、注射器(如预装注射器)、安瓿、套筒、储液器或二室注射器。这些容器可以由多种材质(例如玻璃或塑料)制成。在某些实施方式中，容器是预装注射器。适当的预装注射器包括但不限于带有烤硅酮涂层的硼硅酸盐玻璃注射器、带有喷涂硅酮的硼硅酸盐玻璃注射器或不带有硅酮的塑料树脂注射器。
通常，容器包含制剂和容器上或与容器相连的标签，所述制剂含有本申请所述的活性剂(例如血管紧张素(1-7)肽或其功能性等价物、类似物或衍生物，血管紧张素(1-7)受体激动剂，ACE2和/或ACE2活化剂)，所述容器可以说明如本申请所述的重构和/或使用的方法。
实施例
实施例1：在慢性后肢缺血的动物模型中血管紧张素(1-7)治疗改善血流和肢体功能
本实施例证明了血管紧张素(1-7)能够用于有效地治疗缺血性疾病。在这个实施例中，使用具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)的线形血管紧张素肽TXA127作为例子以评估血管紧张素(1-7)在小鼠后肢缺血模型中的治疗效果。
后肢缺血模型
在此前已经描述了稳定的后肢缺血模型并且通常其特征为具有用于检验各种治疗效果的均一的缺血损伤(Goto等，Tokai J Exp Clin Med,31(3):1282006；Kang Y等，PLoS One.2009；4(1):e4275))。在本实施例中使用的在小鼠中的后肢缺血模型涉及股动脉近端的两个结扎和在两个结扎之间的切开。该手术导致血流阻塞并且随后导致严重的缺血损伤(Goto等；Kang等)。在这个实验中，使用健康的成年雌性Balb/c小鼠。使用此前已描述的方案在小鼠中诱导后肢缺血。简言之，保持Balb/c雌性小鼠自由摄取标准饮食和水。将小鼠麻醉并在腹股沟区域的皮肤上开一个切口。使用6-0号丝线将股动脉结扎两次并在结扎位点之间横断，随后使用4-0号丝线缝合伤口并使小鼠恢复。
给予TXA 127
以即用溶液的形式提供血管紧张素(1-7)多肽组合物(TXA127)和载剂对照(DPBS)并且保存在4℃下直至使用。从第1天(诱导缺血24小时后)开始每日皮下注射TXA127(500μg/kg)直至研究结束。阴性对照小鼠皮下注射载剂。表4提供了动物的分组情况。
表4：分组
缺血的评估
体重
在手术前和手术后每周一次测量动物的体重。
血流
在手术前和手术后第1、7、15、21、28、35、42和49天使用非接触激光多普勒测量动物两侧腿部的血流。血流测量结果以缺血肢体的流量与正常肢体的流量之比表示。
缺血严重程度的宏观评估
使用如表5中所示的坏死区域形态分级(Goto等，Tokai J Exp Clin Med,31(3):1282006)，在手术后每周一次对缺血肢体进行宏观评估。
表5：坏死区域的形态分级
等级 描述
0 无坏死
1 坏死限于脚趾(失去脚趾)
2 坏死延伸至足背(失去足部)
3 坏死延伸至小腿(失去膝盖)
4 坏死延伸至大腿(失去全部后肢)
肢体功能和缺血损伤的体内评估
使用表6中所示的分级方法(Stabile等，Circulation 108(2):2052003)在手术后每周一次对缺血肢体受损使用的情况进行半定量评估。
表6：肢体功能的评估
等级 描述
0 弯曲脚趾以对抗轻扯尾部
1 跖屈
2 没有拖动但无跖屈
3 拖动足部
在部分或全部肢体截肢的情况下将肢体功能分级为“不适用”。在此类情况下的血流测量结果将不包括在统计分析中。
组织固定
在将动物处死当天，取下缺血和对照腿的股四头肌并固定在4％的福尔马林缓冲液中以供分析。
结果
使用采用本申请所述的方法产生的稳定的严重缺血模型来评估重复皮下给药后TXA 127的血管生成疗效。
体重
示例性的体重分布汇总于图1。在整个研究中，未观察到动物的体重存在具有统计学意义的显著差异。
血流
从第35天至第49天研究结束时，与载剂(对照)处理的动物组(1F)相比，在TXA 127处理的动物组(2F)中观察到血流出现具有统计学意义的显著改善。示例性的结果汇总于图2。
图2的统计分析是使用针对重复检测的双因素ANOVA，随后的帮费罗尼(Bonferroni)事后检验来进行。对对照组1F和TXA 127处理组的比较显示在第35天时存在具有统计学意义的显著差异(p<0.001)。
体内缺血严重程度评估
使用对坏死区域的等级形态分级，在第7天和第49天对缺血肢体进行评估。在两个动物组中均可见肢体截肢——在对照组1F中为60％和在TXA 127处理组2F中为48％。缺血严重程度在对照组和TXA 127处理组也存在差异。与对照处理组相比，在TXA 127处理组中可见严重程度降低的明显趋势。这些结果汇总于图3。而且，如图4所示，在TXA 127处理组中大部分肢体截肢仅发生在诱导后肢缺血后第35天(其中0％表示无截肢，并且降低反映了在整个研究中截肢增加)。
体内肢体功能评估
从第7天至第49天通过使用等级功能性分级对缺血肢体受损使用的情况进行了半定量评估。诱导后肢缺血后达49天时，与载剂或对照处理组(1F)相比，在TXA127处理组(2f)中可见肢体功能的改善。然而，该差异不具有统计学意义。这些结果汇总于图5。如图6所示，当使用“末次测量结转”分析法时该趋势达到统计学意义。
图6的统计学分析使用“末次测量结转”方法，所述方法使用针对重复检测的双因素ANOVA，随后进行帮费罗尼(Bonferroni)事后检验。对对照组1F与TXA 127处理组2F进行比较显示在第49天时出现具有统计学意义的差异(p<0.01)。
综上所述，这些结果表明TXA127通过刺激血流和组织修复，能够有效地治疗缺血性疾病。例如，发现皮下给予TXA127使血流恢复至其正常值的71％。血流灌注恢复与其他发现一致显示TXA127处理改善肢体功能并减少缺血性截肢。而且，TXA127处理还缓解了已处于缺血性应激的肢体的损伤。这些发现表明血管紧张素(1-7)能够用于治疗性血管生成，以治疗各种缺血性疾病如严重肢体缺血和其他周围血管疾病。
实施例2：在慢性后肢缺血的动物模型中PanCyte治疗改善血流和肢体功能
本实施例证明了PanCyte能够用于有效地治疗缺血性疾病。在这个实施例中，使用具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ ID NO:22)的环状血管紧张素肽作为例子以评估PanCyte在小鼠后肢缺血模型中的治疗效果。
共使用了49只雌性小鼠，将其分成3组：16只在1F组、17只在2F组和16只在3F组。组数和动物总数基于此前的研究确定，已证明这为足以获得指示性/有意义信息的每组最小动物数。表7显示了各组的设计。
表7—分组设计
后肢缺血模型
在本实施例中使用的模型与实施例1相同。简言之，在本实施例中使用的小鼠后肢缺血模型涉及股动脉近端的两个结扎和在两个结扎之间的切开。该手术导致血流阻塞并且随后导致严重的缺血损伤(Goto等；Kang等)。在这个实验中，使用健康的成年雌性Balb/c小鼠。使用此前已描述的方案在小鼠中诱导后肢缺血。简言之，保持Balb/c雌性小鼠自由摄取标准饮食和水。将小鼠麻醉并在腹股沟区域的皮肤上开一个切口。使用6-0号丝线将股动脉结扎两次并在结扎位点之间横断，随后使用4-0号丝线缝合伤口并使小鼠恢复。
给予PanCyte
以即用溶液的形式提供血管紧张素(1-7)多肽组合物(PanCyte)和载剂对照(DPBS)并且保存在4℃下直至使用。从第1天(诱导缺血24小时后)开始每日皮下注射PanCyte(500μg/kg或50μg/kg)直至研究结束。阴性对照小鼠皮下注射载剂。
缺血的评估
体重
在手术前和手术后每周一次测量动物的体重。
血流
在手术前和手术后第1、7、15、21、28、35、42和49天使用非接触激光多普勒测量动物两侧腿部的血流。血流测量结果以缺血肢体的流量与正常肢体的流量之比表示。
缺血严重程度的宏观评估
使用如上表5中所示的坏死区域形态分级，在手术后每周一次对缺血肢体进行宏观评估。
肢体功能和缺血损伤的体内评估
使用上表6中所示的分级方法，在手术后每周一次对缺血肢体受损使用的情况进行半定量评估。
在部分或全部肢体截肢的情况下将肢体功能分级为“不适用”。在此类情况下的血流测量结果将不包括在统计分析中。
组织固定
在将动物处死当天，取下缺血和对照腿的股四头肌并固定在2.5％的多聚甲醛缓冲液或锌固定液中以供分析。
结果
使用采用本申请所述的方法产生的稳定的严重缺血模型来评估重复皮下给药后PanCyte的血管生成疗效。
体重
示例性的体重如图7所示。在整个研究中，未观察到动物的体重存在具有统计学意义的显著差异。
血流
从第21天至第49天研究结束时，与载剂处理对照(1F)相比，在PanCyte处理的动物组(2F和3F)中观察到血流出现具有统计学意义的显著改善(图8)。
图8中所示数据的统计学分析是使用针对重复检测的双因素ANOVA，随后的帮费罗尼(Bonferroni)事后检验来进行。对对照组1F和PanCyte处理组2F和3F的比较显示从第21天至第49天存在具有统计学意义的显著差异(p<0.05-0.001)。
肢体功能评估
使用等级功能性分级，在第7天至第49天对缺血肢体受损使用的情况进行半定量评估。在后肢缺血后第28天时与对照组1F的动物相比，在使用PanCyte 500μg/kg处理的2F组中观察到了肢体功能的改善(见图9)。
毛细血管密度
肌肉样本的切片来自各组6-7只动物的相同区域。在显微镜下在来自不同切片的共计12个随机区域中计数毛细血管。密度以每个视野区域毛细血管的平均数量表示。在处理开始49天后使用PanCyle的治疗显著增加了毛细血管的数量。在两个处理组的动物中均可见该作用(图10)。
该实施例表明SC给予50μg/kg或500μg/kg的PanCyte均可以使缺血性事件后的血流恢复至其正常值的85％。而且，组织学分析显示与对照组相比，在使用PanCyte处理的两个动物组中毛细血管密度均增加。综上所述，这些结果表明PanCyte能够通过刺激血流和组织修复来有效地治疗缺血性疾病。这些发现表明PanCyte能够用于治疗性血管生成以治疗各种缺血性疾病如严重肢体缺血和其他周围血管疾病。
实施例3：在慢性后肢缺血的动物模型中低剂量PanCyte和连续输注治疗改善血流和肢体功能
本实施例证明了1μg/kg和50μg/kg之间剂量的PanCyte能够用于有效地治疗缺血性疾病。在这个实施例中，使用具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ ID NO:22)的环状血管紧张素肽以评估PanCyte在小鼠后肢缺血模型中的治疗效果。
共使用了98只雌性小鼠，将其分成3组：15只在1F组、17只在2F组、17只在3F组、16只在4F组、17只在5F组和16只在6F组。组数和动物总数基于此前的研究确定，已证明这为足以获得指示性/有意义信息的每组最小动物数。表8显示了各组的设计。
表8-分组设计
后肢缺血模型
除非另有明示，本实施例使用的模型和操作与实施例1和2中的那些相同。
给予PanCyte
以即用溶液的形式提供血管紧张素(1-7)多肽组合物(PanCyte，环化的Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys(SEQ ID NO:22))和载剂对照(DPBS)并且保存在4℃下直至使用。在2F-5F组中，从第1天(诱导缺血24小时后)开始每日皮下注射PanCyte(1μg/kg、5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg)直至研究结束。在6F组中，将渗透Alzet泵植入皮下并在研究期间提供连续的PanCyte释放。阴性对照小鼠皮下注射载剂(DPBS)。
结果
使用采用本申请所述的方法产生的稳定的严重缺血模型来评估重复皮下给药后PanCyte的血管生成效果。
体重
示例性的体重如图11中所示。在整个研究中，未观察到体重存在具有统计学意义的显著差异。
血流
从研究第14天开始直至第49天研究结束时，与载剂处理对照(1F)相比，在使用Alzet泵连续给予PanCyte处理的动物组(6F)中观察到了血流出现具有统计学意义的显著改善(见图12)。在使用相似剂量PanCyte处理但是通过每日注射给予的5F组中，从第35天至第49天与对照相比，观察到了血流的显著改善。在其他处理组中，在第42天和第49天时血流的改善达到了具有统计学意义的显著性(2F、3F和4F组)。
肢体功能评估
使用等级功能性分级，在第7天至第49天对缺血肢体受损使用的情况进行半定量评估。在后肢缺血后第14天和第21天时与对照组(1F)的动物相比，在使用PanCyte1μg/kg处理的组(2F)和在连续输注的组(6F)中可见肢体功能的改善(见图13)。
该实施例表明PanCyte可以是针对治疗性血管生成的有效治疗方法。为了评估PanCyte在缺血组织中的剂量依赖性治疗性活性，使用了公认的小鼠后肢缺血模型。该实施例表明皮下给予PanCyte以剂量依赖性的方式使血流恢复至其正常值的84％。在该实施例检测的组中，在使用Alzet泵连续给予PanCyte处理的动物中观察到了特别好和较早的血液灌注恢复。
等价物和范围
本领域的技术人员将能够理解，或能够使用不超出常规实验的方法来确定本申请所描述的特定实施方式的多种等价物。本发明的范围并不旨在限于上述说明书，而是如所附的权利要求书中所示。
本领域的技术人员将能够理解，或能够使用不超出常规实验的方法来确定，根据本发明的特定实施方式的多种等价物。本发明的范围并不旨在限于上述说明书，而是如所附的权利要求书中所示。
除非有相反的指示或者在上下文中另有明示，在权利要求书中的冠词如“一种”、“一个”和“所述”可以指一个或多于一个。除非在上下文中有相反的或其他明确的指示，否则权利要求或说明书中在一组的一个或多个成员间包括“或者”表明一个、多于一个或全部的组成员存在、用于给定的产品或过程或者与给定的产品或过程相关。本发明包含实施方式，其中恰好该组的一个成员存在、用于给定的产品或过程，或者与给定的产品或过程相关。本发明包含实施方式，其中多于一个或全部组成员存在、用于给定的产品或过程，或者与给定的产品或过程相关。此外，应理解本发明包含所有变更、组合和置换，其中将一个或多个所列举的权利要求中的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等引入另一个权利要求。例如，可以对从属于另一个权利要求的任意权利要求进行修改以引入一个或多个限制，所述限制见于从属于相同基础权利要求的任意其他权利要求。而且，当权利要求描述组合物时，应理解其包括使用所述组合物用于本申请所公开的任意目的的方法，以及包括根据本申请所公开的任意制备方法或本领域公知的其他方法制备所述组合物的方法，除非另有明示或除非本领域的普通技术人员认为其存在明显的矛盾或不一致之处。
当元素以列表列出，如在马库什组的形式，应理解也公开了元素的各个亚组，且任何元素均可从该组中去除。应理解，在通常情况下，当发明或发明的方面包含特定的元素、特性等时，本发明某些实施方式或本发明的方面由或基本由这些元素、特征等组成。为了简单起见，没有在本申请中特别地列出每种情况的实施方式。还应注意术语“含有”旨在是开放式的并且允许包括其它元素或步骤。
当给出范围时，包括端点。此外，还应理解除非另有明示或从上下文和本领域普通技术人源的理解是显而易见的，在本发明的不同实施方式中，以范围表示的值可以表示为所述范围内的任意特定值或子范围至所述范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明示。
此外，应理解落入现有技术中的本发明的任意特定实施方式均可以从任意一个或多个权利要求中明确地排除。因为将此类实施方式视为是本领域普通技术人员公知的，可以将其排除即使在本申请中没有明确地指出将其排除。可以出于任何原因将本发明组合物的任意特定实施方式(例如任意细胞类型；任意神经元细胞系统；任意突触囊泡循环的报告子；任意电刺激系统；任意成像系统；任意突触囊泡循环检测；任意突触囊泡循环调节剂；任意使用方法等)从任意一个或多个权利要求中排除，无论其是否与存在现有技术相关。
参考文献的并入
本申请中引用的所有出版物和专利文件均通过引用整体并入本申请，其程度与将各个单独的出版物或专利文件的内容并入本申请相同。

Claims (48)

1.一种治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤
向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素(1-7)肽的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞，其中所述血管紧张素(1-7)肽以治疗有效量给予，以使得周围血管疾病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低或推迟发作。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的功能性等价物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述功能性等价物是线形肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述线形肽包含含有天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少4个氨基酸的序列，
其中所述至少4个氨基酸保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置，
而且其中所述线形肽具有促血管生成活性。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述线形肽包含含有天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少5个氨基酸的序列，
其中所述至少5个氨基酸保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置，
而且其中所述线形肽具有促血管生成活性。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述线形肽包含含有天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少6个氨基酸的序列，
其中所述至少6个氨基酸保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置，
而且其中所述线形肽具有促血管生成活性。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其中所述至少4、5或6个氨基酸分别进一步保持其在天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对间距。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的方法，其中所述线形肽包含4-25个氨基酸。
10.根据权利要求4-9中任意一项所述的方法，其中所述线形肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。
11.根据权利要求4-9中任意一项所述的方法，其中所述线形肽包含在天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述线形肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Nle3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:4)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述线形肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-Ile5-His6-Cys7(SEQ ID NO:5)。
14.根据权利要求3所述的方法，其中所述功能性等价物是环肽。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述环肽包含在氨基酸之间的连接。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述连接位于与天然存在的血管紧张素(1-7)中的Tyr4和Pro7的位置对应的残基上。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述连接是硫醚桥。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的方法，其中所述环肽包含以其他方式与天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求14-17中任意一项所述的方法，其中所述环肽包含正亮氨酸(Nle)取代天然存在的血管紧张素(1-7)中Val3的位置。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述环肽是具有下式结构的4,7-环化血管紧张素(1-7)：
21.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种化学修饰以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种化学修饰包含聚乙二醇化。
23.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述心脏和脑以外的一种或多种组织包括个体的一个或多个肢体。
24.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述周围血管疾病是周围动脉疾病。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述周围动脉疾病是严重肢体缺血。
26.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述周围血管疾病是急性缺血。
27.根据权利要求1-25中任意一项所述的方法，其中所述周围血管疾病是慢性缺血。
28.根据权利要求1-25中任意一项所述的方法，其中所述周围血管疾病是糖尿病性血管病。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述糖尿病性血管病是肾病。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述糖尿病性血管病是神经病。
31.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)在心脏和脑以外的一种或多种组织中诱导和/或增加血管生成和/或血管化。
32.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)在心脏和脑以外的一种或多种组织中减少和/或推迟细胞死亡。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞死亡是凋亡。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞死亡是坏死。
35.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)在心脏和脑以外的一种或多种组织中增加和/或增强细胞存活。
36.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述治疗有效量的血管紧张素(1-7)足以使流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流的部分或完全阻塞减少。
37.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述治疗有效量的血管紧张素(1-7)足以在心脏和脑以外的一种或多种组织中减少或推迟组织损伤。
38.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述治疗有效量的血管紧张素足以改善心脏和脑以外的一种或多种组织的功能。
39.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)通过胃肠外给药。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述胃肠外给药选自静脉内、皮内、吸入、透皮(局部)、皮下和/或透粘膜给药。
41.根据权利要求1-38中任意一项所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)通过口服给药。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述组合物还包含环糊精。
43.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)每两个月、每个月、每三周、每两周、每周、每日给药或以可变间隔给药。
44.根据前述任意一项权利要求所述的方法，所述方法还包括联合给予促血管生成剂和血管紧张素(1-7)。
45.根据前述任意一项权利要求所述的方法，所述方法还包括在心脏和脑以外的一种或多种组织进行血管或血管内操作。
46.一种治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤
向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素转化酶2(ACE2)的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞。
47.一种治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤
向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素转化酶2(ACE2)活化剂的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞，
其中所述ACE2的活化剂是三氮脒(DIZE)和/或1-[(2-二甲基氨基)乙基氨基]-4-(羟基甲基)-7-[(4-甲基苯基)磺酰氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮(XNT)。
48.一种治疗周围血管疾病的方法，所述方法包括如下步骤
向患有周围血管疾病的个体给予包含血管紧张素(1-7)受体激动剂的药物组合物，所述周围血管疾病的特征为流向心脏和脑以外的一种或多种组织的血流被部分或完全阻塞，
其中所述血管紧张素(1-7)受体激动剂具有下式结构
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