CN101573373A - 环状血管紧张素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血管紧张素的类似物，特别是涉及具有Ang(1－8)激动或拮抗活性的环化类似物以及具有激动或拮抗活性的环化Ang(1－7)类似物，它们与其线性对应物相比，表现出较强的蛋白水解抗性。本发明提供了一种环状血管紧张素肽类似物，包含对应于天然存在的血管紧张素中的位置Tyr4和Pro7的氨基酸之间的硫醚桥键。本发明还提供了这些类似物在治疗例如高血压中的用途。

Description

环状血管紧张素类似物
技术领域
本发明涉及血管紧张素类似物，特别是涉及具有Ang(1-8)受体激动和/或拮抗活性或Ang(1-7)受体激动或拮抗活性的环状类似物，它们与其线性对应物相比表现出更强的蛋白水解抗性。尤其是，本发明涉及具有Ang(1-8)受体拮抗活性和Ang(1-7)受体激动活性的环状类似物。还提供了该环状肽类似物的治疗性应用。
背景技术
八肽血管紧张素-II(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)，也称为Ang II或Ang(1-8)，是最古老的肽激素之一，已知其具有与内分泌相关或与中枢和外周神经系统有关的多种生物学作用。
Ang(1-8)具有多种生理作用，可调节血管紧张度、激素分泌、组织生长和神经活动。它具有全身和局部作用，通过四种类型的受体促进细胞生长和分化。可用于组织修复和发育中。Ang(1-8)的拮抗剂可通过抑制血管生成而应用于抗肿瘤行为(Escobar et al 2004Current Vascular Pharmacology 2，385-399)。肾素血管紧张素系统(RAS)的受体可能与干细胞的分化相关(Ozturk et al 2004 Medicalhypotheses 63，866-874)。Ang(1-8)受体阻滞剂(blocker)广泛用于心脏和肾衰竭以及高血压。
Ang(1-8)是一种强有效的升压剂，其在血压调节、总血容量保持和盐内稳态中均具有重要作用。此外，其与醇脱氢酶(ADH)的释放、细胞生长和交感系统的刺激有关。多种Ang(1-8)的拮抗剂是有效的降压剂。肾素-血管紧张素系统的功能不足大大促进了高血压和心血管以及肾病症(包括左心室肥大、脉管系统结构改变、新内膜形成、肾硬化等)的形成。
来自多个实验室的结构-活性关系研究已经揭示了活性Ang(1-8)分子的单个氨基酸残基的拓扑学贡献(Regoli et al.，(1974)Pharmacol.Rev.26，69-123；Kholsa et al.，(1974)Structure-activity relationship in angiotensin II analogs.In Handbook Exp.Pharmacol.-Angiotensin(Page，LH.& Bumpus，F.M.，eds)，pp.126-161.Springer-Verlag，Berlin；Cordopatis et al.(1999)InBioactive Peptides in Drug Discovery and Design.Medical Aspects(Matsoukas，J.& Mavromoustakos，T.，eds)，pp.25-32.IOS Press，Amsterdam，NL)。这些研究已经包括了理论、物理化学和光谱研究，且已经得到了溶液中的Ang(1-8)结构的多个模型。
Ang(1-8)通过利用血管内皮的血管紧张素-I转化酶(ACE)的作用将前体十肽血管紧张素-I(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu；本文中也称为Ang I或Ang(1-10))转化为Ang(1-8)而生成。经过ACE水解，无活性的Ang(1-10)转化为生物学活性的Ang(1-8)。这两个肽在长度和其C末端性质方面存在差异；Ang(1-8)缺乏His-Leu末端二肽。Ang(1-10)在循环中通过来自肾的肾素对其底物的作用而产生，其底物称为α2-球蛋白或血管紧张素原，在肝脏中生成(Do et al.，J.Biol.Chem.262，1037-1043)。
ACE是通过ACE抑制剂药物灭活的靶标，该药物降低血管紧张素II的生成速率。肾素-血管紧张素系统在血压控制以及体液和电解质内稳态中发挥关键作用。除了Ang(1-8)，还鉴定了Ang(1-10)的几种其他切割产物，例如Ang(1-9)、Ang(1-7)、AngIII(Ang(2-8))和AngIV(Ang(3-8))。
血管紧张素-(1-7)(Ang(1-7))，是肾素-血管紧张素肽家族中的一个有生物活性的七肽成员，其在多个水平拮抗RAS系统。作为ACE的一个底物，Ang(1-7)与Ang I和缓激肽竞争降解，从而抑制AngII形成并增强缓激肽活性。还发现Ang(1-7)通过非竞争性阻断AT1受体和直接刺激血管紧张素2型(AT2)受体而阻断Ang II的有害作用。尽管最初开发的ACE抑制剂是为了抑制AngII的形成，但它们在心血管疾病中的有益作用部分归属于所导致的Ang(1-7)水平的提高。ACE抑制剂处理，尽管对循环的Ang II的量的作用有限，但可将Ang(1-7)水平增加10至25倍。
静脉输注Ang(1-7)可抑制与球囊-导管损伤相关的平滑肌细胞增殖(Strawn W.B.et al.Angiotensin(1-7)reduces smooth musclegrowth after vascular injury，Hypertension 33：207-11，1999)。Ang(1-7)还对抗在培养的VSMC中对AngII的促有丝分裂反应。而且，通过与其近期发现的Ang(1-7)受体相互作用，Ang(1-7)通过刺激一氧化氮释放而具有血管舒张作用。
过去几年内，Ang(1-7)已经成为人们特别感兴趣的一种血管紧张素，因为它的心血管和压力感受性反射作用抵消了Ang(1-8)的那些作用。特异于该七肽的独特血管紧张素结合位点以及利用选择性Ang(1-7)拮抗剂的研究表明存在独特的Ang(1-7)受体。Santos RA，et al.(Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Jun 26)证实，由Mas原癌基因编码的G蛋白耦联受体的遗传缺失消除了Ang(1-7)与小鼠肾的结合。因此，Mas缺陷型小鼠在急性水负荷后彻底缺乏Ang(1-7)的抗利尿作用。Ang(1-7)结合至Mas-转染的细胞并诱发花生四烯酸释放。此外，Mas缺陷型主动脉也丧失了它们的Ang(1-7)诱导的舒张反应。总的来说，这些发现将Mas鉴定为Ang(1-7)的一种功能性受体，且提供了用于这种生物学活性肽的生理作用的清楚的分子基础。
已证明，Ang(1-8)和Ang(1-7)均可促进组织修复，如在皮肤伤口愈合中(Yahata et al(2006)J Biol.Chem 281，13209-13216)和动脉支架植入后(Langeveld et al(2005)Hypertension 45，138-141)。而且，已经证实了在化疗过程中对骨髓抑制的有益作用，与Ang(1-8)相比，Ang(1-7)不具有有害的升高血压特性。这使得人们非常感兴趣将尤其是Ang(1-7)及其类似物用于这些应用。
已报道了Ang(1-7)和Ang(1-8)在多种其他疗效中发挥作用。Ang(1-7)可以在患有新诊断的乳腺癌患者的化疗前后发挥有益的作用(Rodgers et al 2006 Cancer Chemother Pharmacol 57，559-568)，并且其在体外可抑制肺癌(Gallagher & Tallant.2004.Carcinogenesis 25，2045-2052)。Ang(1-7)通过减少环氧合酶-2而抑制人类腺癌异种移植物在裸小鼠中的生长(Menon，Soto-Pantaja，Callahan，Clin，Ferrario，Tallant & Gallagher 2007 Cancer Res.67：2809-15)。血管紧张素(1-7)可阻止糖尿病诱导的心血管功能障碍(Benter，Yousif，Cojocel，Al-Maghrebi，Diz 2007 Am J HeartCirc Physiol 292，H666-72)。
Ang(1-8)在体内通过位于红细胞和多数组织的血管床中的血管紧张素酶降解为血管紧张素III(Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；或Ang(2-8))。在人体内，其半衰期为1-2分钟。血管紧张素III具有血管紧张素II40％的升压活性，但具有100％的醛固酮生成活性。
血管紧张素IV(Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；或Ang(3-8))是六肽，与血管紧张素III一样，其具有较低的活性。
血管紧张素II、III和IV在全身具有多种效应。例如，因为它们是强有效且直接的血管收缩剂，可收缩动脉和静脉并增加血压，因此具有心血管效应。血管紧张素II通过血小板的粘附和聚集以及PAI-1和PAI-2的生成而具有促血栓形成的效果。人们认为血管紧张素II可能是血管和心肌肥大的一个原因。
此外，Ang(1-8)通过大脑的穹隆下器官(SFO)增加渴感、降低压力感受器反射的反应并增加对盐的需求。其增加在垂体后叶中的ADH以及垂体前叶中的ACTH的分泌。其还可通过对节后交感纤维的直接作用而增强去甲肾上腺素的释放。
Ang(1-8)还可作用于肾上腺皮质，使其释放醛固酮，其为一种可使肾保钠排钾的激素。血浆血管紧张素II水平升高是月经周期的黄体期期间醛固酮水平升高的原因。
Ang(1-8)还对脉管系统具有营养作用，促进动脉壁中肌肉的生长。还认为其能促进血管生成，即其引起新形成组织的血管化。
此外，Ang(1-8)对近端小管具有直接作用，以增加Na+吸收。尽管其通过间接(通过交感作用)和直接刺激肾小球膜细胞收缩而轻微抑制肾小球滤过作用，但其整体作用是通过借助输出性肾收缩(efferent renal constriction)来增加肾脏灌注压而增加肾小球滤过率。
很明显，血管紧张素激素肽的家族与介导重要的生理效应相关。因此，开发具有激动剂或拮抗剂活性的可用作治疗剂的血管紧张素类似物已受到了很多人的关注。然而，小的线性肽的医学和工业应用因其稳定性差而严重受限。在肽药物设计领域，人们已熟知，线性肽的环化可诱导结构刚性，从而防止降解。此外，如果仔细设计而不引起活性肽构象的显著变化，则与其线性对应物相比，环状肽的刚性结构可增强对选定靶分子的结合亲和性。而且，环状类似物在具有用作药物的潜能的非肽模拟物的设计和合成中可作为重要的中间体。
在过去几十年中，已经有大量的环化方法应用于单环和双环肽的制备。在许多情况下，目的是通过降低构象稳定性而探查靶肽的生物活性构象，或者产生代谢更加稳定的化合物。二硫化物和酰胺环化是其中最常用的单环化方法(Hruby et al.，Biochem J.1990 Jun1；268(2)：249-62)，但还采用了其他策略，包括例如硫醚环化(Fenget al.，Organic Lett.1999，1，121；Jones et al.，Tetrahedron Lett.1998，39，6107；WO93/03056)。
本领域中已经描述了多种不同构象受限的环化Ang(1-8)类似物。在其他方法中，可通过利用该肽分子中不同位置处的半胱氨酸部分的二硫键法或通过酰胺键法而实现环化。参见例如Miura etal.，J Biol Chem.1999 Mar 12；274(11)：7103-10；Miranda et al.，Braz JMed Biol Res.1988；21(5)：903-14；Spear et al.，J Med Chem.1990Jul；33(7)：1935-40；Nikiforovich et al.，Biochemistry.1994Mar29；33(12)：3591-8；Zhang et al.，J Med Chem.1996 Jul5；39(14)：2738-44)。Poleyava等(Bioorg Med Chem.2001Jun；9(6)：1639-47)披露了一种受限的环状Ang II类似物，具有连接该肽的位置3和5处的Lys-Glu对的内酰胺桥，且在位置8处具有Ile，发现该类似物是Ang II的一种抑制剂。Lindmann等(Bioorg MedChem.2001 Mar；9(3)：763-72)描述了包含亚甲基-二硫醚桥的环状12、13和14个原子的环形AngII类似物。
其他结构活性研究还阐述了C末端残基Phe对Ang(1-8)的激动活性的重要性。用脂肪族氨基酸例如Ile替代Phe8，得到一种拮抗剂[Sar1-Ile8]AngII，也称为Sarilesin(Mavromoustakos et al.，J.Med.Chem.，1999，42，1714；Ganter et al.，J.Med.Chem.1995，38，4660)。突变研究也表明，Phe8位置的芳香性对于受体激活非常重要(Roumelioti et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10，1)。
发明内容
上文阐述了人们对开发新型血管紧张素类似物的浓厚兴趣。本发明者旨在设计并合成其他的表现出生物活性且代谢稳定的血管紧张素类似物。尤其是，他们旨在提供Ang(1-8)和Ang(1-7)类似物，与它们的线性对应物相比，其表现为对蛋白水解性降解的抵抗性增强，同时保持生物活性，所述生物活性为相同类型或不同类型。另一个目的是将Ang激动剂转化成Ang拮抗剂，或者反之亦然。
这些目的由以下的令人惊异的发现而满足，即在对应于天然存在的血管紧张素(例如Ang(1-8)或Ang(1-10))中的位置4和7的氨基酸Tyr4和Pro7之间引入硫醚-环结构，得到一种对蛋白酶抗性增强的生物活性血管紧张素类似物。
治疗性Ang-类似物或其前体的蛋白水解抗性增大，实现了高的多的治疗能力、更小的剂量和/或更小的给药频率，且可实现有效的口服给药。此外，稳定性的总体增加，可使该肽类似物的保存期增长。
因此，本发明提供了一种环状血管紧张素肽类似物，其包含在对应于线性天然血管紧张素如人类Ang I(Ang(1-10))中的位置Tyr4和Pro7的氨基酸之间的一个硫醚桥键。
生物活性血管紧张素类似物在位置4和7(除非另有指明，本文中提到的所有位置均对应于在天然Ang中的编号)的氨基酸经修饰成为环状结构，在之前尚未披露过。实际上，令人非常吃惊的是，由于下列原因，Tyr4的修饰未消除血管紧张素的生物活性。累积的AngII实验证据支持一种生物活性构象，其特征在于Tyr羟基、His咪唑与Phe羧酸酯之间的电荷中继系统(与在丝氨酸蛋白酶中发现的系统类似)，以及表明起活性作用的三联关键氨基酸Tyr4-His6-Phe8的环簇(ring cluster)。该环簇构象可得到新型受限AngII环状类似物[Sar1-Lys3-Glu5]AngII的设计和合成的支持(Matsoukas et al.Bioorg.Med.Chem.2000，8，1)。
此外，已报道了在Ang(1-8)的Tyr4和Phe8分别与Ang II I型(AT1)受体的Asn111和His256之间的相互作用对于激动活性是必需的(Noda et al.，(1996)Biochemistry，35，16435)。Miura等(1999，J.Biol.Chem.，Vol.274，No.11，pp.7103)随后报道了在激活受体方面重要的首先是芳香性，其次是Tyr4侧链的大小。位置4或8的β-环己基丙氨酸取代，阻碍了受体的配体依赖性激活。
考虑到上文的Tyr4对于血管紧张素功能是关键的证据，很显然，本发明的发现在位置4和7处引入硫醚环结构没有损害生物活性是出乎意料的。表达“没有损害生物活性”用来表示环状类似物在体外和/或体内均具有至少部分活性。定性来说，该活性的性质可以等同于线性对应物的性质，例如，具有激动活性的线性Ang(1-7)肽经环化而可产生更加稳定的激动剂，或者该活性可以是不同的，例如，当通过在位置4和7处的残基加以环化时，线性激动剂则变为拮抗剂。定量来说，应注意，对于环状类似物，活性无需如其线性对应物那么高；如果其稳定性高于其线性对应物1000倍，那么即便环引入后丧失90％的活性仍然可以得到非常有用的肽。
硫醚桥也称为单硫桥(monosulfide bridge)或者在Ala-S-Ala中，称为羊毛硫氨酸桥。包含硫醚桥的肽可由具有下列通式中任何一个的两个氨基酸形成：
通式A
Figure A20078003441900151
通式B：
Figure A20078003441900152
通式C：
Figure A20078003441900153
其中，R1、R2、R3、R4和R5独立地选自-H、低级(例如，C1-C10)烷基或芳烷基。在一个优选的实施方式中，R1、R2、R3、R4和R5独立地选自-H和CH3。
在一个实施方式中，本发明提供一种包含根据通式A的硫醚桥的肽，即，其中在位置4和7的氨基酸之间的键具有-RCR1-S-R2CR3-的含义，其中R、R1、R2和R3独立地选自-H、低级(例如，C1-C10)烷基或芳烷基。优选地，R、R1、R2和R3独立选自-H和CH3。包含根据通式A的硫醚桥的肽可通过例如抗生合成酶或通过从二硫化物挤出硫而制备。挤出硫的二硫化物可通过位置4的D-半胱氨酸与位置7的L-半胱氨酸或通过位置4的一个D-半胱氨酸与位置7的L-青霉胺而形成[Galande，Trent and Spatola2003 Biopolymers 71，534-551]。
可替代地，所述两个氨基酸的键可由RCR1-R2CR3-S-R4CR5(通式B)或RCR1-S-R4CR5-R2CR3(通式C)，其中R、R1、R2、R3、R4和R5独立地表示-H、低级(例如，C1-C10)烷基或芳烷基。包含根据通式B的硫醚桥的肽可例如通过二硫化物挤出硫而制备，其中该二硫化物由位置4的D-同型半胱氨酸与位置7的L-半胱氨酸形成[Galande，Trent and Spatola 2003 Biopolymer 71，534-551]。同样，包含根据通式C的硫醚桥的肽可例如通过二硫化物的硫挤出反应而制备，其中该二硫化物由位置4的D-半胱氨酸与位置7的L-同型半胱氨酸形成[Galande，Trent and Spatola 2003 Biopolymer71，534-551]。
本发明的肽类似物可以很方便地在生物系统，特别是利用(细菌)宿主细胞的抗生合成酶系统而制备。因此，包含根据通式A的硫醚桥的肽是优选的。
术语“环状血管紧张素肽类似物”是指任何具有生物活性和/或能够选择性结合受体的血管紧张素类似物，或者其可经蛋白水解而活化的无活性前体，例如，以一种类似于Ang(1-10)转化为活性片段的方式。该类似物通常将不包含与血管紧张素功能和/或加工不相关的氨基酸序列，如抗生合成酶前导肽序列。肽类似物的大小可以变化但变化范围在4-10个氨基酸之间，只要包含含有4-7个硫醚-环结构的“核心”四聚体区段。优选类似物包含4-8个氨基酸，更优选5-8个氨基酸。在一个特定方面，该类似物由7个氨基酸残基(优选对应于天然Ang(1-7)中那些氨基酸残基)构成。
本发明的类似物的氨基酸序列可以变化，只要其具有生物学活性(激动性或拮抗性)，或者可以通过蛋白水解而活化。类似物的生物学活性可利用本领域中已知的方法确定，包括放射性配体结合研究、体外细胞活化测定以及体内实验。参见例如Koziarz et al.，1993 Gen.Pharmacol.24，705-713；Lemos et al 2005 J CardiovascPharmacol 46，274-279；Santos et al 2003 PNAS 100：8258-8263；Godeny and Sayeski 2006 Am J Physiol CellPhysiol.；291(6)：C1297-307；Sarr et al.，Cardiovasc Res.2006 Sep1；71(4)：794-802；；Silva et al 2007 Peptides 28，702-707。
在一个实施方式中，本发明提供一种源于天然血管紧张素I(Ang(1-10))的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(1-10)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种源于天然血管紧张素II(Ang(1-8))的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(1-8)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种源于天然血管紧张素III(Ang(2-8))的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(2-8)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种源于天然血管紧张素IV(Ang(3-8))的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(3-8)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种源于天然Ang(1-7)的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(1-7)。
在另一个实施方式中，本发明提供一种源于天然Ang(1-9)的4，7-环化类似物，指定为[Cyc4-7]Ang(1-9)。
表达“源于”的意思是指该肽的序列基本上对应于天然线性Ang肽的序列。与天然血管紧张素肽的氨基酸序列相比，在[Cyc4-7]类似物的位置4和7的氨基酸经修饰以允许引入硫醚-环结构(见上文)。如可以理解的，在其他位置的氨基酸可以相同或者它们可以不同，只要该类似物具有生物学活性。优选地，除了残基4和7之外，0、1或2个残基不同于相应天然序列中存在的残基，较优选为0或1个残基。
环状类似物的功能可以与其线性对应物的功能相同(例如，激动剂仍为激动剂)或相反(例如，激动剂变成拮抗剂)。在无活性前体的类似物如[Cyc4-7]Ang(1-10)的情况下，生物学功能表示其对(ACE-)酶的易感性及其片段的生物学活性，而(ACE-)酶可将无活性前体的类似物转化为生物学活性片段(例如Ang(1-8)或Ang(1-7))。
多个研究者的结构-活性关系研究已经揭示了单个氨基酸残基对天然血管紧张素活性的贡献(参见Spyroulias et al.Eur.J.Biochem.270，2163，以及这篇文章中引用的参考文献)。这些结果可用来预测本发明的类似物中指定氨基酸可被改变但不丧失生物学活性的程度。
例如，已发现Ang(1-8)中位置1处的氨基酸对于其活性并不关键，但其优选是带负电的氨基酸，更优选Asp。
位置2的氨基酸优选是带正电荷的氨基酸，优选Arg。
位置3的氨基酸优选是脂肪族残基，例如Ile或Val，优选Val。
位置5的氨基酸优选是脂肪族残基，例如Ile或Val，优选Ile。
根据以下发现，即累积性破坏His6咪唑UV照射消除了Ang(1-8)的活性(Samanen et al.，J.Med.Chem.31，737-741)，位置6的氨基酸优选是His。
[Cyc4-7]Ang(1-9)中的位置8或者[Cyc4-7]Ang(1-10)中的位置9的氨基酸优选不同于Pro，以允许蛋白水解激活。Poleyava等(Bioorg Med Chem.2001 Jun；9(6)：1639-47)披露了受限的环状Ang(1-8)类似物是Ang(1-8)的一种抑制剂，其中该类似物具有连接在位置3和5的Lys-Glu对的内酰胺桥且在位置8具有Ile。因此，本发明的[Cyc4-7]类似物可设计为在位置8具有脂肪族残基，优选Ile，以赋予对Ang(1-8)，例如类似物[Cyc4-7]Ang(1-8)F8I的抑制作用。为了维持Ang(1-10)的生物学活性，优选位置8是Phe残基。
对于所述类似物中的每一种来说，位置9的优选氨基酸是His。
对于所述类似物中的每一种来说，位置10的优选氨基酸是脂肪族残基，例如Ile、Val或Leu，其中优选Leu。
如可以理解的，类似物可以对于以任何组合的每一个氨基酸位置包含以上优选的残基。
因此，本发明提供一种环状血管紧张素肽类似物，其包含在对应于线性八肽血管紧张素II(Ang(1-8))中的位置Tyr4和Pro7的氨基酸之间的硫醚桥键，所述类似物具有通式[Cyc4-7]Xaa1-10、[Cyc4-7]Xaa1-9、[Cyc4-7]Xaa1-8、[Cyc4-7]Xaa1-7、[Cyc4-7]Xaa2-8或[Cyc4-7]Xaa3-8，其中，如果适用，
Xaa1是任何氨基酸，优选带负电荷的氨基酸，更优选Asp；
Xaa2是带正电荷的氨基酸，优选Arg；
Xaa3是脂肪族氨基酸，如Ile、Val，优选Val；
Xaa5是脂肪族氨基酸，如Ile、Val，优选Ile；
Xaa6是His；
Xaa8不同于Pro，优选Phe；
Xaa9不同于Pro，优选His；
Xaa10是脂肪族氨基酸，如Ile、Leu、Val，优选Leu；
通式[Cyc4-7]Xaa1-10指的是由氨基酸Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10构成的肽，其中该肽通过Xaa4和Xaa7环化。同样，通式[Cyc4-7]Xaa2-8指的是由氨基酸Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7构成的肽，其中该肽通过Xaa4和Xaa7环化。同样，通式[Cyc4-7]Xaa2-8指的是由氨基酸Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8构成的肽，其中该肽通过Xaa4和Xaa7环化。
在一个实施方式中，所述肽类似物具有通式[Cyc4-7]Xaa1-10、[Cyc4-7]Xaa1-9、[Cyc4-7][Cyc4-7]Xaa1-8、[Cyc4-7]Xaa1-7、[Cyc4-7]Xaa2-7、[Cyc4-7]Xaa3-7、[Cyc4-7]Xaa2-8或[Cyc4-7]Xaa3-8，其中，除Xaa4和Xaa7之外，所述残基中除三个之外全部、优选除两个之外全部、更优选除一个之外全部等同于天然存在的Ang(1-10)中的残基，即其中Xaa1是Asp、Xaa2是Arg、Xaa3是Val、Xaa5是Ile、Xaa6是His、Xaa8是Phe、Xaa9是His、Xaa10是Leu。在一个特定方面，所述肽类似物具有通式[Cyc4-7]Xaa1-10、[Cyc4-7]Xaa1-9、[Cyc4-7][Cyc4-7]Xaa1-8、[Cyc4-7]Xaa1-7、[Cyc4-7]Xaa2-7、[Cyc4-7]Xaa3-7、[Cyc4-7]Xaa2-8或[Cyc4-7]Xaa3-8，其中Xaa1是Asp、Xaa2是Arg、Xaa3是Val、Xaa5是Ile、Xaa6是His、Xaa8是Phe、Xaa9是His、Xaa10是Leu。
在一个优选实施方式中，该肽具有通式[Cyc4-7]Xaa1-7。如下文所示，这种Ang(1-7)类似物具有Ang(1-8)拮抗和Ang(1-7)激动活性，且与未修饰的线性Ang(1-7)相比，其还具有增强的蛋白水解抗性。迄今为止，尚未描述过Ang(1-7)的构象受限的类似物。本发明的研究发现即可以对7个氨基酸中的两个加以修饰(即侧链中近30％发生改变)而不丧失生物学活性，是出乎意料的。而且，未预料到引入4，7-硫醚环后对蛋白水解酶的抗性增加。
在根据通式[Cyc4-7]Xaa1-10、[Cyc4-7]Xaa1-9、[Cyc4-7][Cyc4-7]Xaa1-8、[Cyc4-7]Xaa1-7、[Cyc4-7]Xaa2-7、[Cyc4-7]Xaa3-7、[Cyc4-7]Xaa2-8或[Cyc4-7]Xaa3-8的肽类似物中，残基Xaa4和Xaa7一起形成硫醚桥。优选地，Xaa4是D-立体异构体和/或Xaa7是L-立体异构体。更优选地，Xaa4是D-立体异构体且Xaa7是L-立体异构体。所述硫醚桥例如与上文指出的通式A、B或C一致。优选通式A。
在一个实施方式中，在位置4和7的氨基酸独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，除了在位置4和7上均存在Abu。因此，本发明涵盖这样的环状类似物，其包含由-Ala4-S-Ala7-(通式A：R、R1、R2和R3为H)；-Ala4-S-Abu7-(通式A：R、R1为H，R2和R3中的一个为H，而另一个为CH3)或-Abu4-S-Ala7-(通式A：R和R1中的一个为H，而另一个为CH3；R2和R3为H)形成的硫醚键。特定的环状类似物包含-Abu4-S-Ala7-或Ala4-S-Ala7-键(还可参见图7)。
在一个特定方面，血管紧张素类似物选自由下列4，7-硫醚环化肽组成的组：
[Cyc4-7]Ang(1-10)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His-Leu
[Cyc4-7]Ang(1-9)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His
[Cyc4-7]Ang(1-8)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe
[Cyc4-7]Ang(1-8)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Ile
[Cyc4-7]Ang(1-7)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala
[Cyc4-7]Ang(2-7)类似物Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala
前提条件是Abu不同时存在于位置4和7处。换句话说，该肽不包含两个Abu(2-氨基丁酸)残基。
在一个优选方面，该类似物选自由[Cyc4-7]Ang(1-10)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His-Leu、[Cyc4-7]Ang(1-9)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His、
[Cyc4-7]Ang(1-8)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe、
[Cyc4-7]Ang(1-7)类似物Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala和
[Cyc4-7]Ang(2-7)类似物Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala组成的组。
特别地，本发明提供一种Ang(1-7)类似物，其在位置4和位置7之间具有硫醚桥，且具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala、Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala或氨基酸序列Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala。这些类似物拮抗由天然血管紧张素(1-8)引起的气管平滑肌收缩。该活性可与天然线性Ang(1-7)肽DRVYIHP的活性比拟。令人吃惊地发现，这些类似物还引起Sprague Dawley大鼠主动脉由苯肾上腺素所诱发的收缩的血管舒张，表明环的引入保持了Ang(1-7)受体的激动活性。
本领域中已经描述了对线性Ang(1-7)的位置7处的Pro残基的修饰。Santos等(Proc Natl Acad Sci USA 2003；100：8258-63)证实了，其中位置7处的原始Pro残基被D-Ala取代的Ang(1-7)肽被转化为Ang(1-7)受体拮抗剂。另一个研究(Da Silva et al.Peptides 28(2007)，702-707)同样证实了其中位置7处的原始L-Pro被D-Pro取代的线性Ang(1-7)肽在Sprague Dawley大鼠中发挥Ang(1-7)受体拮抗剂的作用，可能是上述Santos等的研究(其涉及中华仓鼠卵巢细胞)中不同的Ang(1-7)受体。鉴于这些已公开的数据，本发明的发现即在4，7-环状Ang(1-7)中的位置7处引入实质性修饰后仍保持Ang(1-7)激动剂活性，因此令人极度吃惊。
在另外一个实施方式中，本发明提供一种血管紧张素(1-8)类似物，其具有Ang(1-8)受体拮抗活性且具有序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala-Ile。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的4，7-环状血管紧张素类似物、或者其药学上可接受的盐或复合物，以及一种药学上可接受的载体。
如本文中使用的，“可接受的盐”指可使该肽或等同化合物保持期望的活性，但优选不会对该肽或系统(其使用该肽)其他组分的活性造成有害影响的盐。这样的盐的实例是用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐。盐还可用有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、扑酸(pamoic acid)、褐藻酸、聚谷氨酸等形成。盐可用多价金属阳离子诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍等或者用从N，N’-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子、或者它们的组合(例如丹宁酸锌盐)形成。优选无毒、生理上可接受的盐。
所述盐可通过常规方法而形成，例如通过使产物的游离酸或游离碱基形式与在溶剂或介质(所述盐在其中是不可溶的)或者溶剂如水(其随后在真空中或通过冷冻-干燥而去除)中的该恰当酸或碱的一种或多种等价物发生反应，或者通过在合适离子交换树脂上使现存盐中的阳离子交换为另一种阳离子。
一方面，本发明提供一种用于治疗或预防涉及不希望的血管收缩的疾病的方法，包括给予对其有需要的个体治疗有效量的根据本发明的具有Ang(1-8)拮抗活性的血管紧张素类似物、或者其药学可接受的盐或复合物。所述个体优选是人类个体，例如，人类高血压或哮喘患者。
优选地，所述组合物包含具有Ang(1-8)受体拮抗和/或Ang(1-7)受体激动活性的环状类似物。因此，类似物可具有Ang(1-8)拮抗活性，例如通过阻滞Ang(1-8)受体，和/或其可具有Ang(1-7)激动活性，例如通过结合Ang(1-7)受体，特别是Mas受体并联合随后的信号传递。Ang(1-8)拮抗活性并不一定暗示Ang(1-7)激动活性，反之亦然。
本领域的技术人员将能够利用本领域中已知的方法确定本发明的类似物是否具有Ang(1-8)拮抗或激动活性。如下文所表明的，荷兰猪的气管环可用来确定类似物诱发气管平滑肌收缩的能力(激动活性的指征)或者类似物抑制由“正常”Ang(1-8)诱发气管平滑肌收缩的能力，这是拮抗活性的指征。而且还表明，Sprague Dawley大鼠主动脉环可用来确定Ang(1-7)类似物导致使苯肾上腺素所诱发的收缩的舒张的能力。其他类型的分析例如体外细胞激活分析，可用来确定血管紧张素类似物的药理性质。在体内，Ang(1-7)类似物对血压降低的效应可在静注该类似物后有效测定。
Ang(1-7)受体激动活性优选定义为能够舒张用苯肾上腺素预先收缩的离体主动脉环。一个特定方面，本发明提供一种药物组合物，包含本发明的4，7-环状血管紧张素类似物、或者其药学可接受盐或复合物，以及一种药学上可接受的载体，其中与天然Ang(1-7)相比，所述类似物表现出的血管舒张效应至少强1.2倍，如利用通过与10-7.5M苯肾上腺素孵育而预先收缩的离体主动脉环所确定的。
如将理解的，任何已知或待发现的天然存在的Ang(1-7)的治疗或预防性用途将受益于本发明的发现，即可制备一种具有Ang(1-7)样活性的更稳定类似物。本文提供的Ang(1-7)类似物(即具有Ang(1-7)受体激动活性的4，7环状肽)的有益应用包括包括治疗高血压和治疗不希望的气管收缩。其他有益应用是组织修复、保护骨髓免受细胞生长抑制剂(cytostatica)影响、抗肿瘤性应用和抗炎性应用。
在一个特定方面，本发明涉及具有Ang(1-7)受体激动活性的4，7-环状肽类似物加速创伤愈合的用途。如上文指出的，Ang(1-7)和Ang(1-8)均能够诱导组织修复。然而，Ang(1-7)及其类似物在诱发高血压方面弱于Ang(1-8)。有利地，这样的类似物组成用于加速创伤愈合的组合物的基础，该组合物包括至少一种对于加速创伤愈合有效的类似物。优选地，该组合物为基质或胶束溶液的形式。该环状Ang(1-7)类似物可与伤口敷料一起应用。本文提供了一种用于加速哺乳动物的创伤组织表皮再生的方法，包括在所述创伤组织使用对所述加速有效的一定量的具有Ang(1-7)受体激动活性的4，7-环状肽类似物。
根据本发明的方法，将按照本发明的4，7-环状Ang(1-7)类似物，如具有在位置4和位置7之间的硫醚桥且具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala、Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Abu或氨基酸序列Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala的Ang(1-7)类似物，以足以提高组织愈合速度的量施用于创伤组织。纳摩尔水平的该类似物在体内即可显著加速愈合速度。对于任何特定活性剂，通过实验可以很容易确定用于特定剂型的最佳浓度。通常，适于依照本发明使用的活性剂的量范围为从约0.0001μg-约10mg/kg体重。
本发明的类似物可在多种溶液中应用。依照本发明使用的恰当溶液是无菌的，溶解足量的肽，且对创伤组织无害。
可采用任何类型的应用方法，只要其能够使该活性类似物在一段时间内流入组织内。例如，水性溶液可通过纱布绷带或通管使用于创伤组织，或者这样的溶液经配制使得可实现定时灌注(利用例如脂质体、软膏剂、胶束等)。用于生产这些具有本发明的类似物的制剂的方法对于本领域中的技术人员是显而易见的。所采用的活性剂的特定浓度并不是关键，因为即使当该类似物以纳摩尔量存在时，也可观察到组织修复效应。优选地，所采用的基质或胶束溶液中，该活性血管紧张素类似物以至少30mg/ml的浓度存在。在所描述的实例中有利使用的特定基质溶液是半固态聚乙二醇聚合物，其由Hydro Med Sciences，New Brunswick，N.J以商标Hydron出售。另一种优选溶液是一种由BASF，Ludwigshafen，Germany以商品名Pluronics F108出售的胶束溶液。在室温条件下，该溶液是液体，但当用于温热的组织时，该溶液形成凝胶，其可使活性剂灌入创伤组织内达几天的时间。其他优选的制剂包括羧甲基纤维素制剂(如本文实例中所采用的)、类晶体制剂(例如盐水、Ringer’s乳酸盐溶液、磷酸盐缓冲盐水等)、粘弹剂、聚乙二醇、聚丙二醇和伤口敷料(例如绷带等)。该溶液可在治疗溃疡、病变、损伤、糖尿病性溃疡、烧伤、外伤、淤积性溃疡、牙周病症、裂伤和其他病症中局部使用于表面创伤组织。另外，腹膜内创伤组织如创伤性手术引起的创伤可利用根据本发明的组合物进行治疗以加速愈合。例如，在手术切除结肠节段或其他组织后，手术平面可在闭合手术部位之前涂布活性环状类似物的溶液，以加速内部毛细管灌注和愈合。此外，可通过注射或其他方式皮下给予活性剂而增加局部愈合速度。
根据本发明的环状Ang(1-7)受体激动剂的另一个特定应用涉及防止再狭窄。已证实，Ang(1-7)受体激动剂可用来通过将它们递送至治疗部位而防止血管支架植入后的再狭窄(参见例如WO2006047289)。因此，本发明的具有Ang(1-7)受体激动剂活性的稳定4，7-环状类似物的另一种有益的应用涉及通过将血管紧张素(1-7)受体的一种或多种激动剂递送至治疗部位而抑制血管平滑肌细胞增生。例如，本发明提供了一种药物洗脱医疗装置，特别是血管支架，其具有含环状血管紧张素(1-7)类似物的控释聚合物涂层。此外，本发明提供了至少一种具有Ang(1-7)受体激动剂活性的4，7-环状血管紧张素类似物在制造用于治疗哺乳动物受损血管内皮细胞功能的药剂中的应用，其中所述药剂从可植入医疗装置的表面释放。例如，本发明提供一种提供有4，7-环状Ang(1-7)类似物的血管支架，该类似物具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala、Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Abu或氨基酸序列Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala。
本文还提供了根据本发明的具有Ang(1-8)受体拮抗活性的血管紧张素类似物或者其药学可接受盐或复合物在用于制造治疗涉及不希望血管收缩的疾病的药剂中的用途。在一个实施方式中，该Ang(1-8)拮抗剂是具有在位置8的脂肪族残基(优选Ile)的4，7-环状Ang(1-8)类似物，如本文中提供的。有几种疾病，其中发生了不希望的血管收缩或不希望的气管收缩。例如，本发明提供了一种具有Ang II拮抗活性的[Cyc4-7]类似物用于高血压或心衰治疗的用途。另一个实例是4，7-环状Ang(1-7)或拮抗性4，7-环状血管紧张素(1-8)用于治疗哮喘或其他不希望的气管收缩病例的用途。
该Ang II拮抗剂在急性和慢性先天性心衰的处理、继发性醛甾酮过多症、原发性和继发性肺醛甾酮过多症、原发性和继发性肺动脉高压、肾衰、肾血管性高血压、眼内高压和视网膜血流受损的治疗，以及血管紊乱如偏头痛或雷诺氏病的处理中也很有价值。本发明的类似物对于这些以及类似病症的应用对于本领域技术人员来说将非常明显。
在高血压和其他临床病症的处理中，本发明的类似物可以组合物如口服给药的片剂、胶囊或酏剂、直肠给药的栓剂、胃肠外或肌内给药的无菌溶液或悬液等使用。所述肽还可通过干燥或液态吸入性喷雾进入肺内给药。非常感兴趣的是将该给药途径用于气管舒张。然而，也适用于全身递送所述肽(由Gonda，J Aerosol Medicine19；47-53(2006)综述)。
根据本发明的类似物可以将提供最适药效的剂量给予需要这种治疗的患者(动物和人类)。尽管该剂量将依赖疾病的性质和严重度、患者的体重、患者随后遵循的特殊饮食、同时用药和本领域技术人员将认识到的其他因素而随患者发生变化，但剂量范围通常将为约1-1000mg/患者/天，其可以单次或多次剂量给与。优选地，该剂量范围将为约2.5-250mg/患者/天；较优选约2.5-75mg/患者/天。
根据本发明的肽及其药学上可接受的盐和复合物可以常规药物组合物的形式用于药理学用途。本文中，术语根据本发明所述肽的“药学上可接受的复合物”用来指与某些例如有机材料(赋予该肽以缓释活性)一起形成的复合化合物。这些化合物的典型代表是明胶、羧甲基纤维素、褐藻酸酯、聚(磷酸氟代乙炔)(poly(fluoroethinephosphate))、氨基酸聚合物或其他聚合物和共聚物。作为药学上可接受的盐，可使用常规的药学上可接受的酸加成盐如乙酸盐。
药物组合物包含根据本发明所述的化合物，其与适于肠内或胃肠外给药的有机或无机载体形成混合物。因此，药物组合物可配制成固态冻干物，其中，多种不与肽发生反应的惰性化合物例如烃可用作载体。当药物组合物配制为稀释或浓缩的悬液或乳液时，它们还可包含多种防腐剂和稳定剂。
包含根据本发明的具有Ang(1-8)受体拮抗或Ang(1-7)受体激动活性的类似物的药物组合物可用于肾性高血压的差异化检测以及用于每一种由肾血压增高引起的综合征的治疗。
本发明的化合物还可与其他抗高血压药如α-甲基多巴和/或利尿药(diuretics)如氢氯噻嗪和/或血管紧张素转化酶抑制剂如依那普利和/或钙通道阻滞剂如硝苯地平和/或Ang II受体拮抗剂(AT1或AT2受体拮抗剂)一起给药使用。[Cyc4，7]Ang(1-7)还可与Ang(1-8)拮抗剂一起应用。这是由于涉及不同受体的事实。Ang(1-8)对AT1或AT2受体发挥作用，而Ang(1-7)对MAS受体发挥作用。通常，当单独给予时，用于这些组合的单独日剂量可从最低临床推荐剂量的约1/5至这些药剂(entity)的最大推荐剂量水平的范围。这些剂量范围可根据允许分次日剂量的单位基准进行调整，且如上文指出的，该剂量将随疾病的性质和严重度、患者体重、特定饮食和其他因素而变化。典型地，这些组合物可配制成如下文讨论的药物组合物。
约1-100mg类似物或者类似物的混合物或者其生理上可接受的盐可与生理上可接受的媒介物、载体、赋形剂、粘结剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等以公认的药学惯例要求的单位剂型相混合。这些组合物或制剂中活性物质的量是获得指定范围内的合适剂量的量。
下面举例说明可掺入片剂、胶囊等中的佐剂：粘合剂如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如微晶纤维素；崩解剂如玉米淀粉、预胶化淀粉、褐藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂如薄荷、冬青或樱桃的油。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，其还可包含液态载体如脂肪油。多种其他材料还可作为涂层而存在或以其他方式修饰该剂量单位的物理形式。例如，片剂可涂布虫胶、糖或这二者。糖浆或酏剂可包含所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、染料以及调味剂如樱桃或柑橘调味剂。
用于注射的无菌组合物可根据传统药学惯例通过将该类似物溶解或悬浮于媒介物如注射用水、天然植物油(如麻油、椰子油、花生油、棉花籽油等)、或合成的脂肪媒介物如油酸乙酯等中进行配制。如有需要，可掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
根据本发明的Ang(1-8)受体拮抗性类似物，例如4，7-环状Ang(1-7)或4，7-环状Ang(1-8)Phe8Ile，对于治疗眼内压升高也非常有用，且可利用典型的药物制剂如片剂、胶囊、血管注射剂，以及溶液、软膏剂、植入物、凝胶剂等形式的局部眼用制剂给予需要该治疗的患者。通常，按重量计算，制备用来治疗眼内压的药物制剂包含的本发明所述化合物占约0.9％-15％，优选0.5％-2％。
本发明的另一个方面涉及本发明的稳定化Ang类似物用于刺激或激活未成熟细胞例如骨髓细胞、组织修复中涉及的细胞等。已证实(参见例如US 6,011,015)，Ang(1-8)或者其具有Ang(1-8)受体激动活性的类似物可用于促进哺乳动物的卵子受精。在该种类型的血管紧张素类似物的应用中，Ang(1-7)表现出作为Ang(1-8)受体激动剂而非Ang(1-8)受体拮抗剂的作用。因此，本发明的激动性4，7-环状血管紧张素类似物可用于促进哺乳动物的卵子特别是人类卵子受精。特别地，其提供Ang(1-8)和Ang(1-7)类似物增强精子活力的用途。因此，本发明还涉及一种促进哺乳动物卵子体外受精的方法，包括向包含卵母细胞和精子的介质中加入4，7-环状Ang(1-8)或Ang(1-7)类似物或者其盐。
具有Ang(1-8)样活性的环状类似物的另一种应用涉及通过诱导周围健康组织中的血管收缩而瞬时刺激血流入肿瘤或局部感染区域内。这对于受影响位置的靶向药物递送非常有用。
附图说明
图1
比较天然和含硫醚环的血管紧张素对蛋白酶的抗性。图1A：天然(未填充圆)和含羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-8)(填充方格)；图1B：天然-(未填充圆)和含羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)(填充方格)。实验细节在实施例1的正文中叙述。
图2
在位置4和7之间含有硫醚桥的环状血管紧张素(1-7)可完全抗ACE。
A：利用4nM ACE分解天然Ang(1-7)(未填充圆)或在位置4和7之间具有桥的含甲基羊毛硫氨酸Ang(1-7)(填充方格)。
B：通过与4nM ACE一起孵育而从天然Ang(1-7)(未填充圆)以及从含甲基羊毛硫氨酸的Ang(1-7)(填充方格)形成Ang(1-5)。
C：利用8nM ACE分解天然Ang(1-7)(未填充圆)或在位置4和7之间具有桥的含甲基羊毛硫氨酸Ang(1-7)(填充方格)或者含羊毛硫氨酸的Ang(1-7)(未填充三角形)。
D：通过与8nM ACE一起孵育而从天然Ang(1-7)(未填充圆)、从含甲基羊毛硫氨酸的Ang(1-7)(填充方格)或从含羊毛硫氨酸的Ang(1-7)(未填充三角形)形成Ang(1-5)。图2B中描绘的实验对应于图2A；而图2D则对应于图2C。
图A-D中的所有点均为两次测定的平均值。与图2A和图2C中描绘的天然Ang(1-7)降解连锁的是形成一种分解产物，天然Ang(1-5)。如果是含硫醚环的Ang(1-7)，则不形成该分解产物。实验细节在实施例2的正文中叙述。
图3
通过大鼠(同时灌注天然Ang(1-7)和含甲基羊毛硫氨酸的Ang(1-7))血浆的maldi TOF谱图证实含硫醚环的血管紧张素(1-7)的体内稳定性。
在2小时内，用同时含两种化合物：100μM天然Ang(1-7)以及100μM在位置4和7之间具有硫醚桥的含甲基羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)的溶液以1mL/小时的速度灌注大鼠(Sprague Dawley)。含甲基羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)的溶液利用表达抗生合成酶的乳酸乳球菌(L.lactis)制备，如实施例1中所述。Maldi TOF分析在血浆样品上进行，如实施例3中所述。未稀释样品(上谱图，箭头处为826.06Da质量峰)和100倍稀释的样品(下谱图，箭头处为826.47Da质量峰)均给出了恰当质量的峰，即对应于完整的含甲基羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)(理论质量M+H+等于825.9758)，天然血管紧张素(1-7)根本未检测到。在对照实验中，离体状态下将天然血管紧张素(1-7)与大鼠血浆混合，使得随后可检测天然血管紧张素(1-7)(未示出)。实验细节在实施例3的正文中叙述。
图4
环状Ang(1-7)诱发的主动脉环的血管舒张。
天然Ang(1-7)以及具有硫醚桥位置4(D-Ala)和7(Ala)的Ang(1-7)类似物(图7中化合物I的立体异构体)对Sprague Dawley大鼠主动脉环的血管舒张效应。
叉(×)代表对照；未填充圆：天然Ang(1-7)；填充方格：硫醚Ang(1-7)。每一个点均表示来自4只大鼠的数据的均值±标准差。实验细节在实施例4的正文中叙述。
图5
利用Ang(1-7)和环状Ang(1-7)降低Ang(1-8)诱发的气管收缩。
由天然血管紧张素(1-8)(叉，×)、加入天然血管紧张素(1-7)后由天然血管紧张素(1-8)(未填充圆)、加入含羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)(位置4和7之间具有硫醚)后由天然血管紧张素(填充方格)诱发的荷兰鼠气管收缩。数值为4次独立实验的均值。实验细节在实施例5的正文中叙述。
图6A
天然Ang(1-7)和环状Ang(1-7)(cAng(1-7))静脉内推注对平均动脉血压(MAP)的效应。
盐水预处理(白色柱)和拮抗剂A799预处理(黑色柱)。受试：5-8只小鼠。
图6B
天然Ang(1-7)和环状Ang(1-7)(cAng(1-7))静脉内推注对平均动脉血压(MAP)恢复至处理前水平的效应。
盐水预处理(白色柱)和Ang(1-7)拮抗剂A799预处理(黑色柱)。*P＜0.05vs.Ang-(1-7)盐水组。受试：5-8只小鼠。
图7
利用硫醚桥在位置4和7处的血管紧张素(1-7)的羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸类似物([Cyc4-7]Ang(1-7)；化合物C、F和I)、血管紧张素(1-8)([Cyc4-7]Ang(1-8)；化合物A、D和G)以及F8I血管紧张素(1-8)([Cyc4-7]Ang(1-8)F8I；化合物B、E和H)。采用传统的单字母代码表示每一个位置的氨基酸。Abu是2-氨基丁酸。羊毛硫氨酸是Ala-S-Ala，甲基羊毛硫氨酸是Abu-S-Ala或Ala-S-Abu。每一种结构中的硫原子均可氧化一次或两次。
具体实施方式
本发明将通过下列实例进一步解释说明。
实施例1：在位置4至位置7之间引入硫醚环，增强了血管紧张素(1-8)和血管紧张素(1-7)的蛋白水解抗性。
天然血管紧张素(1-8)和血管紧张素(1-7)均为线性肽，由于快速蛋白水解性分解，半衰期较短。本实施例描述了在Ang(1-7)和Ang(1-8)中对应于Ang(1-8)位置4和7的氨基酸(即Tyr4和Pro7)之间引入硫醚环，分别得到具有序列Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala的[Cyc4-7]Ang(1-7)(图7中的化合物I)和具有序列Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala-Phe的[Cyc4-7]Ang(1-8)(图7中的化合物A)。
利用包含几种类型蛋白水解酶的猪器官组织匀浆，证实与其非环状的线性对应物相比，[Cyc4-7]Ang(1-8)和[Cyc4-7]Ang(1-7)对酶分解的抗性增加。
实验步骤
环化的Ang(1-7)通过生物学和化学途径生成，而环化的Ang(1-8)则通过生物学途径生成。
[Cyc4-7]Ang(1-8)和[Cyc4-7]Ang(1-7)的生物学生成。
包含4，7-甲基羊毛硫氨酸硫醚环的环状血管紧张素(1-8)和血管紧张素(1-7)类似物[图7：化合物A、B、C、G、H、I]的生成从设计编码各个肽的寡核苷酸开始。位置4的氨基酸是Thr或Ser，而位置7是Cys。将用于单个血管紧张素的遗传密码融合于尼生素(乳链球菌素，nisin)前导肽的编码序列和尼生素肽的N-末端部分之后(17-21aa)。一方面考虑到该肽的生成水平，另一方面考虑到脱水/硫醚环形成的程度，该融合步骤证实可得到最好的结果(而非，例如，直接融合于前导肽之后)。引入蛋白水解的切割位点，能够使血管紧张素从融合的尼生素部分释放(即胰蛋白酶(Arg/Lys)或因子Xa(IEGR))。
将用于包含血管紧张素的融合肽的遗传密码(包括因子Xa位点：前导肽-ITSISLCTPGCKTGALMIEGRDRV[T/S]IHC(F))置于滚环质粒上(处于尼生素启动子控制之下)，且在存在另一种包含成熟基因nisB和nisC以及转运基因nisT(处于相同的启动子控制下)的质粒(θ复制)时，由宿主生物乳酸乳球菌(菌株NZ9000)生成。
从在丰富GM17培养基中过夜(o/n)的预培养物中，将1/50的体积转移至补充0.12M MOPS的MM培养基(过滤除菌)(参见Kluskens et al.，2005)。立即用尼生素诱导，然后过夜培育(16-18h)。离心(10,000rpm，20min，8℃)得到上清，其后过滤(0.2μm)。将上清用洗涤缓冲液(50mM乳酸)1∶1稀释，通过将共1L混合物在5mL离子交换层析柱(HiTrap，Amersham)上以5mL/min的速度流动而减少体积。用5倍洗涤缓冲液冲洗后，用洗脱缓冲液(50mM乳酸，1M NaCl)洗脱该肽。该肽洗脱出大概5-10ml。
洗脱出的肽(例如5mL)利用PD10柱(Amersham)脱盐，其通常得到7mL溶液形式的脱盐肽。该脱盐肽o/n冷冻-干燥，其得到的量通常为约10mg干重/L。
然后利用前面所提到酶中的一种来酶切该融合肽，使肽从前导-尼生素片段释放。通常，利用5-10单位的酶(肠激酶，因子Xa)或5μg胰蛋白酶/ml反应体积切割5mg干燥的融合肽。切割于23℃o/n进行(因子Xa)，如果采用胰蛋白酶，则于37℃持续4-6h。所有的反应均在Tris缓冲液(100mM Tris，pH8.0，100mM NaCl，2mMCaCl2)中进行。
酶促切割的肽利用反相柱(C18)通过HPLC纯化。将样品置于200μL的总体积中，其含10％乙腈(ACN)/0.1％TFA。利用10％-90％的梯度CAN，将该肽与其他肽片段分开。随后将纯化的样品真空干燥，并利用Lowry法测定蛋白浓度，并与BSA或短但更类似的肽的标准曲线进行比较。
当用Maldi-TOF质谱测定时，可通过18Da的质量漂移而观察到Ser/Thr脱水。此外，采用乙硫醇加成，其中游离脱氢残基与乙硫醇发生反应，引起+62Da/脱水残基的质量漂移。
硫醚环的存在可通过CDAP(1-氰-4-二甲氨基嘧啶)的化学加成的缺失而证实，如果不存在该环，其将与可用的半胱氨酸残基(其不参与硫醚环)发生反应，且随后将引起+25Da的质量漂移。
为了按照上述步骤生物合成位置8为异亮氨酸的Ang(1-8)类似物，有利的是修饰位置3(Val)和/或5(Ile)的氨基酸以获得正确的脱水和环形成。天然Ang(1-8)序列中存在的Val3可用Ile取代。天然Ang(1-8)序列中存在的Ile5可用Val取代。可能有用的肽序列包括DRITVHCI和DRITIHCI。
[Cyc4-7]Ang(1-7)的化学合成
合成了下列肽：H-Asp-Arg-Val-(D-)-Cys-Ile-His-Cys-OH。硫醚的生成(羊毛硫氨酸)如Galande等((2003)Biopolymers 71(5)，534-551)所述而实施。简单而言，将11.5mg的粗肽制剂(其为约50％的纯度)溶于10mL用N2(g)饱和的milliQ中。加入5小滴25％的NH4OH，并将该溶液在15mL Greiner管中于37℃孵育40小时。将该溶液在真空离心干燥机(speed-vac)中干燥以去除氨，随后溶于含0.2％三氟醋酸的milliQ中。通过反相HPLC在C18柱上利用梯度milliQ(0.1％TFA)和乙腈(0.1％TFA)纯化该硫醚肽(Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala；硫醚桥4-7)。收集对应于预期质量811Da的峰，将其干燥并溶于milliQ中。以BSA作为标准，通过Lowry测定肽的浓度。共得到1.9mg含硫醚环的肽。
天然(即线性)Ang(1-8)肽从Sigma(St Louis，MO，USA)获得，天然Ang(1-7)则从Bachem AG，Bubendorf，Switserland获得，均为即用型化合物。
测定蛋白水解抗性
将血管紧张素(野生型或环化的类似物，化学合成的[Cyc4-7]Ang(1-7)或生物合成的[Cyc4-7]Ang(1-8))加入猪肝脏(0.2μmol血管紧张素/mg肝脏组织匀浆)、猪肾(0.2μmol血管紧张素/mg肾组织匀浆)、猪胰腺(0.2μmol血管紧张素/mg胰腺组织匀浆)的组织匀浆或者血浆(1μmol血管紧张素/ml)中，并于37℃，pH7.4或pH5，孵育不同的时间，最长达30个小时。该反应通过100℃5分钟而终止。残余的完整血管紧张素的量通过RP-HPLC用C18柱、流动相梯度和214nm检测光测定。
结果
在位置4和7之间引入硫醚环，在所检测的全部组织匀浆中均得到稳定性较高的血管紧张素(1-8)和血管紧张素(1-7)。在Ang(1-8)中引入4，7硫醚桥，显著增加了pH 7.4时其在肝脏、肾或胰腺组织匀浆中的半衰期。
在pH 7.4和pH 5下测定Ang(1-7)的稳定性，后一个pH模拟溶酶体的pH。在pH 7.4，由于4，7-环化，血管紧张素(1-7)的半衰期增加2(肝脏)倍、6(肾)倍和多于18(胰腺)倍。在pH 5，在肝脏组织匀浆中，引入环将半衰期增加5倍(表1A、1B；图1A和1B)。
表1
A)Ang(1-8)
Figure A20078003441900391
B)Ang(1-7)
Figure A20078003441900392
结论
与其天然线性对应物相比，Ang(1-7)和Ang(1-8)的4，7-环状类似物显示出对酶分解的抗性显著增强。
实施例2.包含硫醚环的血管紧张素完全抗ACE。
在体内，ACE通过在位置5和6的氨基酸之间切割该肽而有力地促使天然血管紧张素(1-7)的分解。考虑到本发明所述环化的类似物中位置4和7之间的硫醚桥，我们假设该硫醚桥赋予对蛋白水解性降解的抗性。在本实施例中，我们体外研究了含或不含硫醚环的血管紧张素对血管紧张素转化酶(ACE)的抗性。
方法：来自猪肾的血管紧张素转化酶(ACE)，SIGMA，在图2A和2B中以4nM的终浓度应用，在图2C和2D中则以8nM的终浓度应用。天然Ang(1-7)从Bachem购得。所有的实验均在37℃水浴中平行进行，孵育则在含100mM Tris-HCl、300mM NaCl、10μMZn，pH8.3的缓冲液中进行。含硫醚环的血管紧张素利用含尼生素修饰和转运酶NisBTC的乳酸乳球菌，通过细菌生成而得到。天然血管紧张素(1-7)、含羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)以及含甲基羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)中每一种均以50μM的浓度应用。羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸变异体在位置4和7之间均具有硫醚桥。反应通过100℃5分钟而终止，并置于冰上。样品于4℃以14000rpm离心10min，并通过RP-HPLC定量。利用Maldi TOF质谱鉴定HPLC的峰。所有的点均为两次测定的均值。
结果。图2A表明，与4nM ACE一起孵育26小时后，甲基羊毛硫氨酸变异体未发生降解(填充方格)，而天然血管紧张素(1-7)则完全分解(未填充圆)。ACE分解天然血管紧张素(1-7)导致形成血管紧张素(1-5)(图2B，未填充圆)。硫醚血管紧张素(1-7)与ACE一起孵育则未出现Ang(1-5)(图2B和2D中x-轴上的填充方格)。甚至在ACE浓度高两倍时，也未观察到硫醚桥接的血管紧张素类似物的分解(图2C，填充方格和未填充三角形)，而天然血管紧张素则快速分解(图2C，未填充圆)。而且，天然血管紧张素(1-7)的分解与血管紧张素(1-5)同时出现，后者为ACE活性的初级分解产物(图2D，未填充圆)。硫醚血管紧张素(1-7)与ACE一起孵育后，未观察到Ang(1-5)(图2D填充方格和未填充三角形)。这些数据证明了硫醚桥接的血管紧张素类似物的额外抗性。
实施例3：含硫醚环的Ang(1-7)在体内高度稳定。
在本实施例中，我们研究了在连续静脉内灌注的过程中，大鼠体内的肽稳定性。我们证实了，Ang(1-7)中桥接位置4和7的硫醚环在体内也赋予了蛋白水解抗性，而无硫醚环的对应线性血管紧张素则快速降解。
实验
整个研究过程中，雄性Sprague Dawley大鼠保持于O2/异氟烷(1.5-2％)麻醉状态。采用颈静脉导管并将其连接于含0.9％生理盐水的注射器。将该注射器固定于灌注泵上，流速设定为1mL/小时。同时，采用颈动脉导管并将其连接于含0.9％生理盐水的注射器。随后大鼠通过在阴茎静脉中注射而肝素化。30分钟后，用含100μM天然Ang(1-7)和100μM含甲基羊毛硫氨酸的Ang(1-7)类似物的混合物的注射器更换该灌注泵的注射器。流速设定为1mL/小时。通过颈动脉采取血液，该血液样品于4℃以13000RPM离心5分钟。将5μL血浆加入45μL MQ水中。该混合物煮沸5分钟，然后置于冰上10分钟。其后，该混合物在Eppendorf离心机中以14000rpm离心10分钟，然后将上清在真空离心干燥机中干燥、重悬于数μl中并加入Maldi标板中用于Maldi TOF分析。
结果
在120min时采的样品中检测硫醚环化的血管紧张素。未稀释样品(上谱图，箭头处为826.06Da的质量峰)和100倍稀释的样品(下谱图，箭头处为826.47Da的质量峰)均给出了恰当质量的峰，即对应于完整的含甲基羊毛硫氨酸的血管紧张素(1-7)(理论质量M+H+等于825.9758)，天然血管紧张素(1-7)则根本未检测到。在对照实验中，离体状态下将天然血管紧张素(1-7)与大鼠血浆混合，使得随后可检测天然血管紧张素(1-7)(未示出)。这些数据证实，在体内硫醚桥的血管紧张素(1-7)非常稳定，而天然血管紧张素(1-7)则快速而完全分解。
结论
这些数据示出，环状硫醚Ang(1-7)的有效期延长。较高的血浆水平提供具有更好生物可利用度的硫醚肽，从而增加治疗潜能。
实施例4：含硫醚环的血管紧张素(1-7)比天然血管紧张素(1-7)更有效地引起血管舒张。
本实施例证实了含硫醚环的血管紧张素(1-7)(该环从位置4到7)具有Ang(1-7)激动活性。在Sprague Dawley大鼠内皮完整的主动脉环(其已预先与苯肾上腺素接触)，含硫醚环的血管紧张素(1-7)以浓度依赖性方式引起舒张，且比天然血管紧张素(1-7)更有效。
实验
雄性Sprague Dawley大鼠的主动脉环用于收缩和舒张的等长测定。在Krebs溶液(pH7.5)中，该环处于1.3g或13mN的等长张力下，该溶液包含(mM)：NaCl(117.50)、KCl(5.6)、CaCl2.2H2O(2.52)、MgSO4.7H2O(1.18)、NaH2PO4(1.28)、NaHCO3(25)、D-葡萄糖.H2O，其持续充以5％CO2和95％O2。为了检测Ang(1-7)的血管舒张效应，在下列每一种处理的过程中：对照(H2O)、渐增的含硫醚环的Ang(1-7)(10-10-10-6M)和渐增的天然Ang(1-7)(10-10-10-6M)，每一只大鼠的主动脉环均分为3组，用于三重评价对PE(10-7.5M)诱导的收缩峰的反应。
结果
天然Ang(1-7)(图4，未填充圆)和位置4-7具有羊毛硫氨酸的含硫醚环-Ang(1-7)(图4，填充方格)，均引起苯肾上腺素收缩的主动脉舒张。图4，无肽的阴性对照用叉：×表示。环化的Ang(1-7)类似物的血管舒张效应明显较强，与天然Ang(1-7)相比，有效度高出约2倍。
实施例5：4，7-环化的Ang(1-7)拮抗Ang(1-8)诱发的气管平滑肌的收缩。
本实施例证实，环化的Ang(1-7)阻止Ang(1-8)诱导的气管环收缩。与天然Ang(1-7)类似，4，7-环化的Ang(1-7)拮抗Ang(1-8)诱导的气管平滑肌收缩。
实验
在等张(或等渗)器官浴槽装置中，制备正常荷兰猪的气管环用于收缩测定。该实验于37℃在持续充以5％CO2和95％O2的Krebs溶液(pH 7.4)中实施。首先，利用异丙肾上腺素10-7M建立最大舒张，随后用Krebs溶液冲洗(3次)直至达到稳定张力，然后利用醋甲胆碱10-7M测定最大收缩。冲洗后，在存在或不存在线性Ang(1-7)或4，7-环化的Ang(1-7)的情况下，给予渐增浓度(10-10-10-6M)的天然Ang(1-8)。该4，7-环化的Ang(1-7)通过生物学方法或硫挤出反应获得，如实施例1中所述。通过生物学方法或化学方法制备的环化肽给出了极为类似的结果。Ang(1-7)或其环化类似物在渐增剂量的Ang(1-8)之前20分钟加入。
结果
该4，7-环状Ang(1-7)类似物将Ang(1-8)诱发的气管平滑肌最大收缩减少24％。线性Ang(1-7)引起的减少类似(减少21％，与环化Ang(1-7)无显著性差异)。(表2，图5)。
表2：[Cyc4-7]Ang(1-7)拮抗由天然Ang(1-8)诱发的气管平滑肌收缩。
  血管紧张素   平均收缩[％]   SD   SEM   与Ang(1-8)相比的P值
  Ang(1-8)   24.21   4.58   1.53
  Ang(1-7)+Ang(1-8)   19.04   5.81   2.42   0.05
  [Cyc4-7]Ang(1-7)+Ang(1-8)   18.32   4.06   1.66   0.02
结论
在位置4和7之间引入硫醚环以稳定Ang(1-7)，产生了生物活性肽类似物，其为一种用于治疗目的极富吸引力的类似物，例如用于治疗肺疾患或病症。
实施例6：含硫醚环的Ang(1-7)在降低血压方面比其线性对应物更有效。
在本实施例中，我们在麻醉小鼠中研究了静脉内推注环化Ang(1-7)对MAP(平均动脉血压)的效应。我们证实环化Ang(1-7)比天然线性肽能更加有效的降低MAP。此外，给予环化Ang(1-7)之后，MAP恢复至正常的速度较慢。
实验
在整个研究过程中，CD1小鼠(35-40g)一直处于戊巴比妥麻醉下。左颈静脉和右颈动脉插管，分别用于注射肽和记录血液动力学参数。推注100μl盐水或1μmol/L A779后5分钟，经颈静脉推注0.6μmol/L天然线性Ang(1-7)或4，7-环状Ang(1-7)，体积为100μl。所有的肽均悬浮于盐水中，血压和心率记录至少15分钟。
结果
如图6A和B中所示，静脉内推注0.06nmol Ang(1-7)引起麻醉小鼠MAP的瞬时下降。
利用硫醚环桥的氨基酸4和7的环化Ang(1-7)，与其天然肽相比，在降低MAP方面显示高出约2倍的有效性。观察MAP的恢复时间，这表明，环化Ang(1-7)不仅在MAP降低的程度方面而且在MAP降低的时程方面均具有更强的效应。推注环状Ang(1-7)后，MAP在多于3分钟之后回至正常，而线性肽注射后，MAP恢复时间仅2分钟。环化肽的两种增强效应均可由其对蛋白水解性降解尤其是ACE降解的抗性来解释。然而，由于构象受限的环化肽与受体相互作用改善而引起的活性增强，如由主动脉收缩数据表明的(实施例4)，也可发挥作用。
至于线性肽，环化Ang(1-7)的MAP效应受到A779的有效阻抑，而A779是一种由Ang(1-7)构成的mas-受体拮抗剂，其中Pro7被D-Ala取代，这证明环化Ang(1-7)降低MAP的活性是mas-受体激动的结果。
结论
这些数据证实，Ang(1-7)的环化通过mas-受体引起了较强且持续较长的降低MAP效应。这些体内数据表明该环化的化合物具有治疗价值。

Claims (21)

1.一种由4-10个氨基酸构成的环状血管紧张素肽类似物，包含在对应于天然存在的血管紧张素中的位置Tyr4和Pro7的氨基酸侧链之间的硫醚桥键。
2.根据权利要求1所述的类似物，所述类似物是血管紧张素I(Ang(1-10))、血管紧张素II(Ang(1-8))、血管紧张素III(Ang(2-8))、血管紧张素IV(Ang(3-8))、Ang(1-7)或Ang(1-9)。
3.根据权利要求2所述的类似物，所述类似物是Ang(1-7)的类似物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的类似物，其中在对应于位置Tyr4和Pro7的氨基酸之间的硫醚桥键具有以下通式：
A)
Figure A2007800344190002C1
B)
Figure A2007800344190002C2
或者
C)
Figure A2007800344190003C1
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地选自-H、低级(例如，C1-C10)烷基或芳烷基，优选地，其中R1、R2、R3、R4和R5独立地选自H和CH3。
5.根据权利要求4所述的类似物，其中，所述硫醚桥具有所述通式A，优选地，其中R1、R2和R3独立地选自H和CH3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的类似物，所述类似物具有通式Xaa1-10、Xaa1-9、Xaa1-8、Xaa1-7、Xaa2-7、Xaa2-8或Xaa3-8，优选Xaa1-7，其中
Xaa1是任何氨基酸，优选带负电荷的氨基酸，更优选Asp
Xaa2是带正电荷的氨基酸，优选Arg
Xaa3是脂肪族氨基酸，优选Val
Xaa5是脂肪族氨基酸，优选Ile
Xaa6是His
Xaa8是不同于Pro的氨基酸，优选Phe
Xaa9是不同于Pro的氨基酸，优选His
Xaa10是脂肪族氨基酸，优选Leu。
7.根据权利要求6所述的类似物，其中，Xaa4是D-立体异构体。
8.根据权利要求6或7所述的类似物，其中，Xaa7是L-立体异构体。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的类似物，其中，Xaa1是Asp，Xaa2是Arg，Xaa3是Val，Xaa5是Ile，Xaa6是His，Xaa8是Phe，Xaa9是His，Xaa10是Leu。
10.根据前述权利要求中任一项所述的类似物，所述类似物选自由以下构成的组：
Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His-Leu([Cyc4-7]Ang(1-10))、
Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Phe-His([Cyc4-7]Ang(1-9))、
Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala-Ile([Cyc4-7]Ang(1-8)F8I)、
Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala([Cyc4-7]Ang(2-7))以及
Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala([Cyc4-7]Ang(1-7))，前提条件是所述肽不包含两个Abu(2-氨基丁酸)残基。
11.药物组合物，包含根据权利要求1-10中任一项所述的环状血管紧张素类似物、或其药学上可接受的盐或复合物，以及药学上可接受的载体。
12.一种可植入的医疗装置，优选血管支架，提供有根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物、或者其药学上可接受的盐或复合物。
13.用于治疗或预防涉及有害的血管收缩的疾病或紊乱的方法，包括给予对其有需要的个体治疗有效剂量的根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性和/或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物，或者其药学上可接受的盐或复合物。
14.用于治疗或预防涉及有害的气管收缩的疾病或紊乱的方法，包括给予对其有需要的个体治疗有效剂量的根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性和/或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物，或者其药学上可接受的盐或复合物。
15.用于治疗癌症的方法，包括给予对其有需要的个体治疗有效剂量的根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性和/或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物，或者其药学上可接受的盐或复合物。
16.用于加速组织修复的方法，包括给予对其有需要的个体治疗有效剂量的根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物，或者其药学上可接受的盐或复合物。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性和/或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物或者其药学上可接受的盐或复合物在制造用于治疗或预防涉及有害的血管收缩的疾病或紊乱的药物中的应用，其中所述疾病或紊乱优选涉及有害的血管收缩的肾或心血管病如高血压、心脏衰竭或糖尿病导致的心血管功能障碍。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物或者其药学上可接受的盐或复合物在制造用于治疗或预防涉及有害的气管收缩的疾病或紊乱的药物中的应用，优选地，其中所述疾病或紊乱是气道高反应性、气道重塑或其他肺梗阻相关的疾病如哮喘、COPD或慢性肺梗阻疾病。
19.根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-8)受体拮抗活性或Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物或者其药学上可接受的盐或复合物在制造用于治疗癌症，优选乳腺癌、肺癌或腺癌的药物中的应用。
20.根据权利要求1-10中任一项所述的具有Ang(1-7)受体激动活性的环状血管紧张素类似物或者其药学上可接受的盐或复合物在制造用于治疗提高组织愈合速度的药物中的应用。
21.根据权利要求12-16中任一项所述的方法或者根据权利要求17-20中任一项所述的应用，其中所述具有Ang(1-8)拮抗活性或Ang(1-7)激动活性的血管紧张素类似物是[Cyc4-7]Ang(1-7)，优选具有氨基酸序列Asp-Arg-Val-Abu/Ala-Ile-His-Abu/Ala。
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